本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,具體地涉及煙粉虱med隱種高溫耐受相關(guān)基因特異性探針及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
煙粉虱(bemisiatabaci(gennadius))屬節(jié)肢動物門,昆蟲綱,半翅目,粉虱科,小粉虱屬,又稱棉粉虱或甘薯粉虱。
煙粉虱的最適發(fā)育溫度為26~30℃,發(fā)育臨界溫度在10.8~12.5℃之間,致死高溫區(qū)在37~42℃之間。17℃和35℃是煙粉虱正常生長發(fā)育的最低和最高的溫度極限。較強的溫度逆境適應(yīng)能力是煙粉虱在世界范圍內(nèi)廣泛分布的原因。隨著溫室效應(yīng)的增加,全球氣溫正逐年增高,煙粉虱較強的溫度逆境適應(yīng)能力使其能逐漸擴大保護地面積,這為其抵御溫度逆境、延續(xù)種群提供給了場所。
通過基因的mrna原位雜交可以解析基因在煙粉虱中定位和表達模式,有助于更深入了解目的基因的作用機制。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種煙粉虱med隱種高溫耐受相關(guān)基因的特異性探針。
本發(fā)明的再一目的是提供上述煙粉虱med隱種高溫耐受相關(guān)基因的特異性探針的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式,煙粉虱med隱種高溫耐受相關(guān)基因btdnmt3,該基因cdna全長核苷酸序列如seqidno.1所示,其編碼的氨基酸序列如seqidno.2所示。btdnmt3基因的表達直接降低了med隱種對高溫耐受性的能力。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式,所述煙粉虱med隱種高溫耐受相關(guān)基因的特異性探針通過以引物f:tccaaacacatttcgtcaag和r:tcgcaaataagaactactcctc擴增煙粉虱med隱種高溫耐受相關(guān)基因btdnmt3的cdna序列而得。
本發(fā)明還提供了上述特異性探針在原位雜交中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式,使用上述煙粉虱btdnmt3基因的特異性探針進行原位雜交的方法包括以下步驟:
(1)根據(jù)btdnmt3的cdna序列設(shè)計btdnmt3特異的探針序列,以cdna為模板,設(shè)計的f和r引物進行普通pcr產(chǎn)物擴增,f:tccaaacacatttcgtcaag
r:tcgcaaataagaactactcctc;
(2)合成btdnmt3的mrna原位雜交的探針,并將探針標(biāo)記上地高辛;
(3)檢測btdnmt3的mrna探針的原位雜交。
本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的mrna探針可以與組織中btdnmt3基因的mrna發(fā)生特異性的結(jié)合,從而方便準(zhǔn)確的觀察到組織中btdnmt3基因mrna水平的變化。本發(fā)明的btdnmt3的探針序列,對btdnmt3基因mrna的顯示有明確的特異性,實現(xiàn)了對btdnmt3基因mrna水平的顯示作用??梢詫⒈景l(fā)明的特異性探針直接用于成蟲進行原位雜交,省去了制作切片步驟,可以降低實驗的復(fù)雜性,減少實驗步驟,且具有較高的敏感度,有利于更方便快捷的檢測目的基因在蟲體的定位表達。
附圖說明
圖1顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的煙粉虱btdnmt3基因在雄蟲中的mrna原位表達的示意圖,箭頭所指位置是生殖部位。
圖2顯示根據(jù)本發(fā)明實施例的煙粉虱btdnmt3基因在雌蟲中的mrna原位表達的示意圖,箭頭所指位置是生殖部位。
具體實施方式
實施例1:煙粉虱med隱種btdnmt3基因全長cdna序列克隆
分別取不同溫度脅迫條件下煙粉虱成蟲200頭放入1.5ml的離心管,液氮冷凍后利用研磨棒將其研成粉末,然后提取rna,-80℃保存以備用。以cdna為模板,利用以下引物,pcr擴增煙粉虱med隱種btdnmt3基因的中間片段。
btdnmt3-f:ctactgctaaactccattcgc
btdnmt3-r:ctctgaaacacggtagtccc
根據(jù)所獲得的煙粉虱med隱種btdnmt3基因的中間片段序列,設(shè)計5’race和3’race特異性引物,pcr擴增btdnmt3基因的5’和3’端序列:
5’raceinnerprimer:ggaacctctgaaacacggtagtccccaa
5’raceouterprimer:ttgtgacacgcagtgacttcagtgataggt
3’raceinnerprimer:taaccaccaatccaaattccttgcggc
3’raceouterprimer:tggtttggggactaccgtgtttcagagg
獲得btdnmt3基因的cdna序列全長,得到btdnmt3基因4512bp序列,所得的基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列,包含653個核苷酸,該基因所編碼的酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。
實施例2:btdnmt3基因的表達特性分析
對btdnmt3進行不同組織的表達譜分析,實時熒光定量pcr結(jié)果表明,btdnmt3在頭部、胸部和腹部中均有表達,且在腹部顯著高表達。
對btdnmt3進行不同發(fā)育階段的表達譜分析,實時熒光定量pcr結(jié)果表明,btdnmt3在卵期、一齡、二齡、三齡、四齡、偽蛹、成蟲中具有表達。成蟲之前,在卵期高表達,后表達量逐漸降低,到成蟲再次高表達。
飼喂btdnmt3基因dsrna的煙粉虱med隱種的擊倒時間顯著低于飼喂dsegfp組和蔗糖組的擊倒時間(p<0.05);同時在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)blast顯示,所飼喂的靶序列片度為btdnmt3基因特有的序列,由此確保了干擾效果為煙粉虱med隱種的目的btdnmt3基因所產(chǎn)生,因此,說明btdnmt3基因在煙粉虱med隱種高溫耐受性中起著關(guān)鍵作用。
實施例3原位雜交
1、煙粉虱btdnmt3基因的特異性mrna原位雜交探針
(a)以cdna為模板,設(shè)計的f和r引物進行普通pcr產(chǎn)物擴增,f:tccaaacacatttcgtcaag;r:tcgcaaataagaactactcctc,
并對產(chǎn)物進行切膠回收與純化,用pgem-teasy感受態(tài)細胞,對純化后的pcr產(chǎn)物進行克隆并測序。將測序序列進行比對分析,所得克隆片段為目的基因的片段;
(b)挑取經(jīng)測序驗證的陽性克隆,按照axyprep質(zhì)粒dna小量試劑盒中的說明進行操作,提取重組質(zhì)粒;
(c)對重組質(zhì)粒進行酶切,采用的酶是sacⅱ。取酶切產(chǎn)物加入苯酚:氯仿:異丙醇混合物(25:24:1),劇烈震蕩1min后,4℃條件下12000rpm離心10min;轉(zhuǎn)移上清至無核酸酶的離心管中,加1/10體積的3m醋酸鈉,加2倍體積的冰無水乙醇輕輕混勻,-20℃靜置2.5小時后,4℃條件下14000rpm離心30min;棄上清液,用1ml80%的乙醇洗滌沉淀,反復(fù)顛倒洗滌沉淀,4℃條件下14000rpm離心10min;棄乙醇,風(fēng)干沉淀,加入depc-h2o,溶解沉淀,獲得線性化質(zhì)粒。
(2)將純化后的產(chǎn)物標(biāo)記上非放射性標(biāo)記物-地高辛。
(3)將探針純化。
加2uldnasei,37℃反應(yīng)15min,去除未反應(yīng)完全的dna模板;再加0.8ul0.5medta(ph=8.0)終止反應(yīng);加1/10體積的3m醋酸鈉,加2.5倍體積(125ul)冰冷的無水乙醇,-70℃冰箱放置過夜,取出后,4℃條件下14000rpm離心10min;棄上清液,用1ml75%的乙醇洗滌沉淀,反復(fù)顛倒洗滌沉淀,4℃條件下14000rpm離心10min;棄上清液,風(fēng)干沉淀,加入depc-h2o,溶解沉淀,獲得純化后的目的探針。
(4)檢測btdnmt3的mrna探針的原位雜交
(4-1)樣本搜集:在顯微鏡下分別挑取煙粉虱雌雄成蟲置于事先加入200ul1×pbs緩沖液的1.5ml無核酶的離心管中,用槍頭輕輕地反復(fù)吸打沖洗,然后吸出1×pbs緩沖液,將蟲體留于管中;
(4-2)取材后蟲體的固定:加入1ml卡諾氏固定液,在4℃條件下固定12h;
(4-3)蟲體的漂洗:移走上一步驟中的液體,保留蟲體于離心管中。加入200ul的50%乙醇進行搖洗,洗三次,每次5min;
(4-4)移走上一步驟中的液體,加入200ul的1×pbs-1%tritonx-100溶液,30℃搖洗30min;
(4-5)蟲體的褪色:移走上一步驟中的液體,加入1ml的6%h2o2的乙醇溶液,室溫下褪色2h;隨后,移走上一步驟中的液體,加入200ul的50%乙醇進行搖洗,洗三次,每次5min;
4-(6)蟲體的透化:移走上一步驟中的液體,加入200ul蛋白酶k,在56℃水浴條件下透化30min;隨后,移走上一步驟中的液體,加入200ul的50%乙醇進行搖洗,洗三次,每次5min;
(4-7)蟲體的再固定:移走上一步驟中的液體,加入1ml的4%多聚甲醛固定液固定液,在4℃條件下固定30min;隨后,移走上一步驟中的液體,加入200ul的50%乙醇進行搖洗,洗三次,每次5min;
(4-8)蟲體的預(yù)雜交:移走上一步驟中的液體,加入200ul的預(yù)雜交緩沖液,在55℃條件下預(yù)雜交15min;
(4-9)蟲體的雜交:移走上一步驟中的液體,加入300ul事先預(yù)熱的雜交液(探針濃度為5ng/ul),55℃℃避光孵育過夜。
(4-10)雜交后清洗:移走上一步驟中的液體,將蟲體置于一系列用2×ssc溶液配制的不同濃度的預(yù)雜交液進行處理,且在雜交溫度下進行。具體過程如下:分別于預(yù)雜交液:2×ssc=2:1、1:1、1:2的濃度配比下的溶液中各處理15min;后于2×ssc溶液中處理10min;
(4-11)蟲體的封閉:移走上一步驟中的液體,加入200ul按照1:5000的比例用anti-dig-ap于1×blockingreagent中的封閉液,在4℃條件下封閉過夜;
(4-12)移走上一步驟中的液體,加入200ul的1×pbs進行搖洗,洗三次,每次30min;隨后,移走上一步驟中的液體,加入200ul的ap緩沖液,靜置2次,每次10min;
(4-13)蟲體的顯色:移走上一步驟中的液體,在黑暗條件下,加入300ul的hnpp/fastred:ap=1:1:100顯色液,室溫顯色30min;
(4-14)封片:待顯色后,移走顯色液,終止反應(yīng),加入200ul的1×pbs進行搖洗,洗三次,每次5min;
(4-15)固定拍照:將蟲體用80%甘油固定,于digitalmicroscopevhx-2000下進行觀察并拍照。
由圖1、圖2可見btdnmt3在煙粉虱胸部和腹部均有表達,且在腹部靠近生殖部位表達量較強。
<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所
<120>煙粉虱med隱種高溫耐受相關(guān)基因特異性探針及其應(yīng)用
<160>2
<210>1
<211>4512
<212>dna
<213>煙粉虱
<400>1
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