本發(fā)明屬于生物學(xué)與食品安全分析領(lǐng)域，具體涉及一種磺胺嘧啶殘留的生物傳感探針及其檢測試劑盒制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)背景

獸藥濫用和違禁使用的現(xiàn)象愈演愈烈，其殘留不僅直接影響人類的身體健康(致癌、致畸、致敏、神經(jīng)毒性)，誘導(dǎo)某些菌種產(chǎn)生耐藥性，給人類生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害?；前粪奏?sulfadiazine，sdz)是人工合成的廣譜抗菌藥物，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌有抑制作用。由于該類藥物對于動物疾病的預(yù)防、治療具有較好的效果，因而在畜牧業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。sdz抗生素的不合理使用而導(dǎo)致其在動物源性食品中殘留，通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體產(chǎn)生一定的毒副作用，具有潛在的致癌性。為了保障動物用藥安全性和有效性，以及人類攝食動物性食品后的安全性，很多國家制定了抗生素的最高殘留限量(maximumresiduelimit，mrl)。加拿大、美國、歐盟規(guī)定了動物源性食品中磺胺類抗生素總量的最大殘留量為0.1mg/kg。我國規(guī)定動物性食品中sdz的mrls為0.1mg/kg。因此，為了提高動物源食品的安全性，建立高靈敏、高選擇的磺胺類抗生素檢測方法迫在眉睫。

常規(guī)檢測sdz殘留的方法有高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法，這些儀器檢測方法雖然準(zhǔn)確，但樣品前處理繁瑣、試劑消耗量大、檢測時間長、設(shè)備昂貴、需專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作、不適合進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測和大量樣品的篩選，難以滿足高通量多殘留快速檢測的需要。基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫分析方法，由于靈敏度高、操作簡便、成本低且適合現(xiàn)場快速檢測而越來越受到重視。但針對sdz靶標(biāo)的抗體需要一系列繁瑣復(fù)雜的動物體內(nèi)篩選過程，實(shí)驗(yàn)周期長，成本高，同時抗體容易變性，對檢測環(huán)境的要求很高?？贵w的制備過程不僅需要使用實(shí)驗(yàn)動物，且制備出的抗體很難被重復(fù)生產(chǎn)，批間差異明顯。因此，亟需開發(fā)靈敏、特異、快速的新型靶標(biāo)識別元件用于磺胺類等抗生素的檢測。

適配體(aptamer)作為一種抗體的替代物，由于其具有靶標(biāo)范圍廣，親和力強(qiáng)，結(jié)合強(qiáng)度高，特異性好，制備、修飾方便快速等優(yōu)點(diǎn)，為抗生素等靶標(biāo)的特異性檢測開辟了新的途經(jīng)。適配體是一類在體外通過指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(selex)篩選出的能與各種目標(biāo)分子高親和、高特異結(jié)合的單鏈dna或rna片段，可以通過自身折疊形成二級或三級結(jié)構(gòu)使其對特定靶標(biāo)(如金屬離子、小分子、蛋白、細(xì)胞等)有很強(qiáng)的親和力，作為分子識別的元件，而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床診斷和治療。在農(nóng)產(chǎn)品及食品質(zhì)量安全領(lǐng)域，已篩選到了針對真菌毒素、重金屬離子、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等污染物的適配體，建立了基于核酸適配體的檢測方法。

經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，倪娟佳在《學(xué)位論文》公開了“恩諾沙星和磺胺二甲嘧啶核酸適配體的篩選及化學(xué)發(fā)光檢測方法的研究”，篩選出能特異性識別sdz的核酸適配體，并分別建立了用于牛奶中磺胺二甲嘧啶殘留檢測的直接競爭化學(xué)發(fā)光分析方法。結(jié)果：其對磺胺二甲嘧啶檢測限為0.92ng/ml，ic50為5.61ng/ml，線性范圍為1.85-21.57ng/ml。該檢測限明顯低于目前國家限定的sdz殘留量。但該適配體特異性高，sdz沒有交叉反應(yīng)。并且該基于適配體的檢測方法主要是針對比較簡單生物基質(zhì)的檢測，而雞肉、雞蛋等復(fù)雜基質(zhì)成分的動物源性食品中若富含鹽離子(na⁺或k⁺)，將可能顯著改變反應(yīng)體系的離子濃度，使得該核酸適配體無法折疊成正確構(gòu)型，將直接導(dǎo)致核酸適配體無法與靶標(biāo)結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測方法的失敗。使得上述化學(xué)發(fā)光適配體分析方法應(yīng)用于動物源性食品臨床樣品檢測時受到了極大限制。

本發(fā)明篩選到可以與sdz高親和力結(jié)合的單鏈dna核酸適配體(aptamer)序列，建立了基于納米生物素(biotin)化sdz適配體傳感探針(biotin-sdzaptamer)識別的熒光檢測方法(檢測方法原理見圖1)，可用于動物源性食品中sdz殘留的快速、高靈敏度檢測，在臨床檢測中具有十分重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于核酸適配體特異性檢測sdz殘留的生物傳感探針及其檢測試劑盒制備方法和應(yīng)用。鑒于sdz分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了改良的瓊脂糖磁珠selex技術(shù)優(yōu)選sdz的方法，借助基于selex的組合化學(xué)技術(shù)，篩選得到能特異性識別sdz靶標(biāo)的dna適配體，其特征在于，所述適配體的核苷酸序列如s-sdzno.1所示。將sdz核酸適配體(sdzaptamer)通過納米生物素(biotin)粒子固定于其表面，以biotin-核酸適配體為傳感識別探針(biotin-sdzaptamer)，利用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，固化適配體探針，競爭識別檢測樣品中sdz和辣根過氧化物(hrp)標(biāo)記sdz(hrp-sdz)偶聯(lián)物，建立了用于sdz殘留檢測的直接競爭酶聯(lián)適體分析法(directcompetitiveenzyme-linkedaptamerassay，dc-elaa)，方法的具體原理及應(yīng)用見圖1。該適配體生物傳感方法，利用適配體傳感探針分別測試不同濃度靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分析熒光增強(qiáng)比例與靶標(biāo)物濃度之間的線性關(guān)系，優(yōu)化影響探針識別性能的因子，進(jìn)行探針對sdz靈敏特異間接測定。

該適配體是sdz的新型識別元件，具有穩(wěn)定性良好、靈敏度高、成本低、易制備、易修飾和標(biāo)記的高特異性的優(yōu)勢。

本發(fā)明篩選到可以與sdz高親和力結(jié)合的單鏈dna適配體序列，首次建立一種dc-elaa傳感探針檢測雞肉、雞蛋等動物源性組織中的sdz抗生素。

一種基于核酸適配體特異性檢測sdz的生物傳感探針試劑盒，包括biotin標(biāo)記sdz核苷酸適配體(biotin-sdzaptamer)稀釋液、sdz-hrp稀釋液、洗滌液和終止液；其特征在于所述biotin-sdzaptamer稀釋液包括探針；所述探針的核苷酸序列為s-sdzno.1。

5′-cgtacggtcgacgctagcttggccatcttggccgggataaggatccagccgttgtagatttgcggtagggaaacgtatcacgtggagctcggatcc-3′。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供如下：

一種sdz的核酸適體，其探針中單鏈dna片段(如核苷酸序列表中s-sdzno.1所示)，具體序列如下：5′-cgtacggtcgacgctagcttggccatcttggccgggataaggatccagccgttgtagatttgcggtagggaaacgtatcacgtggagctcggatcc-3′。

將上述單鏈dna片段進(jìn)行修改或改造得到的核酸適體衍生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述biotin-sdzaptamer由單鏈dna組成，且3'末端或5'末端標(biāo)標(biāo)記有biotin。

所述的核酸適體衍生物為核苷酸序列上結(jié)合有biotin納米標(biāo)記物。

所述探針由上述序列所示的單鏈dna組成，且5'末端標(biāo)記有biotin或3'末端標(biāo)記有biotin，所述biotin標(biāo)記核酸適配體序如下：5′-biotin-cgtacggtcgacgctagcttggccatcttggccgggataaggatccagccgttgtagatttgcggtagggaaacgtatcacgtggagctcggatcc-3′或5′-biotin-cgtacggtcgacgctagcttggccatcttggccgggataaggatccagccgttgtagatttgcggtagggaaacgtatcacgtggagctcggatcc-biotin-3′。

本發(fā)明還提供了一種sdz的核酸適體的制備方法，包括如下步驟：

(1)將sdz、磺胺間甲氧嘧啶分別和羧基瓊脂糖磁珠偶聯(lián)

分別將sdz、磺胺間甲氧嘧啶經(jīng)活化氨基后，取羧基瓊脂糖磁珠與活化的sdz、磺胺間甲氧嘧啶溶液混合，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)；獲得sdz、磺胺間甲氧嘧啶修飾的瓊脂糖磁珠偶聯(lián)物。

(2)單鏈dna文庫與相應(yīng)引物

隨機(jī)文庫為全長96bp的單鏈dna文庫(核苷酸序列表s-sdzno.2)：5′-cgtacggtcgacgctagc–n60-cacgtggagctcggatcc-3′，n60為60個堿基的隨機(jī)序列；上游引物(核苷酸序列表s-sdzno.3)為5′-cgtacggtcgacgctagc-3′，下游引物(核苷酸序列表s-sdzno.4)為5′-cacgtggagctcggatcc-3′。

(3)selex篩選sdz核酸適體的過程

①文庫的變性：將溶解的上述ssdna文庫置于95℃水浴中放置10-20min；

②反篩：取磺胺間甲氧嘧啶修飾的瓊脂糖磁珠，與變性的文庫混合，室溫孵育，反應(yīng)完畢，離心，保留上層清液，得到反篩未結(jié)合文庫；并且第一輪不做反篩；

③正篩：取sdz修飾的瓊脂糖磁珠加入上一步驟得到的反篩未結(jié)合文庫，在室溫孵育，反應(yīng)完畢，離心并棄去上層清液，得到正篩未結(jié)合文庫；

④洗提結(jié)合dna：將上一步驟得到的正篩未結(jié)合文庫用naoh洗提6次；

⑤純化洗提的dna：用nap-5寡核苷酸純化柱子對naoh洗提液進(jìn)行回收純化，以去除naoh及其他雜質(zhì)，得到的篩選產(chǎn)物dna溶液即為篩選一輪的適體，一輪篩選完畢；

⑥以篩選適體dna為模板，通過對稱pcr、鏈酶親和素瓊脂糖珠等技術(shù)獲得大量的dna，為下一輪篩選做準(zhǔn)備；

⑦重復(fù)上述步驟1-6,共篩選7輪；

(4)克隆測序

利用第7輪篩選產(chǎn)物通過無標(biāo)記的上、下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后將pcr產(chǎn)物進(jìn)行克隆，并隨機(jī)挑選若干個克隆進(jìn)行測序；最終選擇的核酸適體為上述的核酸適體。

本發(fā)明還提供了一種含有上述核酸適體或上述核酸探針的dc-elaa方法試劑盒。

本發(fā)明提供的核酸適體、核酸探針、或含有上述核酸適體、上述核酸探針dc-elaa試劑盒的應(yīng)用如下：

(1)鑒定雞肉、雞蛋樣品中是否存在sdz；

(2)測定雞肉、雞蛋樣品中sdz的濃度。

本發(fā)明還提供了一種檢測雞肉、雞蛋樣品中sdz含量的dc-elaa試劑盒，包括如下應(yīng)用操作程序：

(1)平衡：從冷藏環(huán)境中取出的試劑及樣品，應(yīng)于室溫(20-25℃)平衡約30min。

(2)配液：將pbs濃縮洗滌液用超純水作20倍稀釋成工作濃度洗滌液。

(3)準(zhǔn)備酶標(biāo)板：取96孔包被sav酶標(biāo)板，預(yù)設(shè)置空白、陰性、陽性對照各2孔。酶標(biāo)板包被方法：取鏈霉親和素(sav)溶解于pbs中，37℃放置1小時。加入戊二酸溶液，混勻。4℃放置2小時，將反應(yīng)液全量加至處理好的透析袋中，透析。將透析好的鏈霉親和素戊二酸復(fù)合物用包被緩沖液液稀釋1mg/ml,取稀釋好的鏈霉親和素戊二酸復(fù)合物加至酶標(biāo)板，每孔200μl，混勻，37℃包被過夜。包被酶標(biāo)板洗滌4次后備用。

(4)加樣：將預(yù)處理25μlbiotin-sdzaptamer探針、25μlsdz-hrp、50μl不同濃度sdz標(biāo)準(zhǔn)品混合均勻，37℃孵化60min，然后加入到洗滌后的酶標(biāo)板的凹槽。37℃孵化45min。

(5)洗板：棄去反應(yīng)液，洗滌3次，拍干。

(6)加底物：每孔再加入顯色劑a1和a2各100ml避光顯色30min。

(7)洗板：棄去反應(yīng)液，洗滌3次，拍干。

(8)終止：每孔加50μl終止液，混勻。

(9)測定：10分鐘內(nèi)以酶標(biāo)儀450nm雙波長測定各孔o(hù)d值，繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲。

測試待檢樣品過程，重復(fù)上述步驟(1)-(9)：將預(yù)處理25μlbiotin-sdzaptamer探針、25μlsdz-hrp、50μl待測組織處理樣品混合均勻，37℃孵化60min，然后加入到洗滌后的酶標(biāo)板的凹槽。37℃孵化45min后，棄去反應(yīng)液，洗滌3次，拍干后每孔再加入顯色劑a1和a2各100ml避光顯色30min，反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測溶液吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到待測試樣中sdz的含量。

其中：所述sdz檢測試劑盒由如下組分構(gòu)成：鏈霉親和素sav包被96孔或48孔酶標(biāo)板1塊，陰性對照1瓶，陽性對照1瓶，樣品稀釋液1瓶，biotin-sdzaptamer稀釋液1瓶，sdz-hrp稀釋液1瓶，洗滌液1瓶，顯色劑a1瓶，顯色劑a2瓶，終止液1瓶，說明書1份，不干膠封片3片。

上述酶標(biāo)板為透明聚苯乙烯96或48孔酶標(biāo)板，且其各孔包被有濃度為1μg/ml的包被sav，包被緩沖液為ph4.7～4.9磷酸鹽緩沖液稀釋；biotin-sdzaptamer稀釋液為標(biāo)記上了biotin的sdz核苷酸序列的溶液；sdz-hrp稀釋液為做了相適稀釋的sdz-hrp；顯色體系為3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)體系。陰性對照為sdz標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100ng/ml；陽性對照為100ng/ml磺胺間甲氧嘧啶。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明提供的試劑盒及方法具有檢測快速、穩(wěn)定、簡單等優(yōu)點(diǎn)，制得的核酸適體對sdz殘留檢測快速、靈敏度高、重復(fù)性好，特異性高，在食品安全快速檢測中有廣闊應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：檢測sdz殘留的biotin-sdzaptamer探針試劑盒及其應(yīng)用原理；

圖2：sdzaptamer的特異性分析；

圖3：利用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品所繪制dc-elaa標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

其中，圖1中，aptamer的中文意思是適配體，biotin的中文意思是生物素，sulfadiazine(sdz)的中文意思是磺胺嘧啶，feed的中文意思是飼料喂養(yǎng)，injection的中文意思是注射治療。

圖2中，1、sdz，2、磺胺間甲氧嘧啶，3、磺胺對甲氧嘧啶，4、磺胺二甲氧嘧啶，5、磺胺二甲嘧啶，6、磺胺喹噁啉，7、磺胺甲氧嗪，8、磺胺甲噁唑。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1制備sdz的核酸適體

(1)sdz和磺胺間甲氧嘧啶與瓊脂糖磁珠偶聯(lián)

取10mgsdz，首先溶于2ml的dmf中，待完全溶解后再加入2ml偶聯(lián)緩沖液，接著按順序在溶液中分別加入30mg的nhs(n-羥基硫代琥珀酰亞胺)和26mg的edc[1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺，再將nhs和edc完全溶解；溶液放置搖床中，4℃條件下反應(yīng)15min，活化sdz中的氨基；2ml氨基瓊脂糖磁珠用偶聯(lián)緩沖液洗滌3次后和上述活化的sdz溶液混合，放置于搖床中室溫條件下反應(yīng)2h；反應(yīng)完畢，將反應(yīng)物用酸堿交替的緩沖溶液洗滌5次，再用pbs洗5次，最后置于pbs中4℃保存；相同的方法用于磺胺間甲氧嘧啶和氨基瓊脂糖磁珠的偶聯(lián)反應(yīng)；

偶聯(lián)緩沖溶液：磷酸鹽緩沖溶液(0.1mmol/lpbs，na2hpo4，8mmol/l；kh2po4，2mmo1/l；nacl，140mmol/l；kc1，10mmol/l；ph7.2)；

酸性緩沖液：0.1m含0.5mnacl的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph＝4.0)；

堿性緩沖液：0.1m含0.5mnacl的硼酸-四硼酸鈉緩沖液(ph＝8.0)。

(2)單鏈dna文庫與相應(yīng)引物

隨機(jī)文庫為全長96bp的單鏈dna(ssdna)文庫(如核苷酸序列表s-sdzno.2)：5′-cgtacggtcgacgctagc–n60-cacgtggagctcggatcc-3′，兩端各18個固定堿基序列，n60為60個堿基的隨機(jī)序列；上游引物為(核苷酸序列表s-sdzno.3)5′-cgtacggtcgacgctagc-3′，下游引物為(核苷酸序列表s-sdzno.4)5′-cacgtggagctcggatcc-3′；上游標(biāo)記引物為5′-titf-cgtacggtcgacgctagc-3′，下游標(biāo)記引物為5′-biotin-cacgtggagctcggatcc-3′。

(3)selex篩選sdz核酸適體的過程

①文庫的變性：將上述的ssdna文庫在離心機(jī)離心10min，然后加入0.5ml結(jié)合緩沖溶液(20mmol/ltris-hcl，100mmol/lnacl，2mmol/lmgcl2，5mmol/lkc1，0.02％tween20，lmg/ml酵母trna，ph7.6)，于4℃放置2h使ssdna完全溶解；溶解的ssdna文庫置于95℃水浴中放置10min，然后拿到室溫自然冷卻；

②反篩：取一定量的磺胺間甲氧嘧啶修飾的瓊脂糖磁珠，用洗滌緩沖液(20mmol/ltris-hcl，100mmol/lnacl，2mmol/lmgcl2，5mmol/lkcl，0.02％tween20，ph7.6)洗三次；將上一步處理好的文庫和洗滌過的磺胺間甲氧嘧啶飾的瓊脂糖珠混合，室溫下在150rpm轉(zhuǎn)速的搖床中孵育50min；反應(yīng)完畢，離心，保留上層清液，得到反篩未結(jié)合文庫；第一輪不做反篩；

③正篩：取一定量的sdz修飾的瓊脂糖珠，用洗滌緩沖液洗三次；然后在瓊脂糖磁珠中加入前一步驟得到的反篩未結(jié)合文庫，搖勻后在室溫下，160rpm轉(zhuǎn)速的搖床中孵50min；反應(yīng)完畢，離心并棄去上層清液，得到正篩未結(jié)合文庫；

④洗提結(jié)合dna：用洗滌緩沖液洗滌正篩后的sdz修飾的瓊脂糖磁珠3次，便去除未結(jié)合的dna及結(jié)合能力弱的dna；洗滌每次加入0.5ml洗滌緩沖液，室溫?fù)u動5min，然后離心，棄去上清；再用naoh洗提2次，每次加0.25ml的2mol/lnaoh，置于95℃水浴中l(wèi)0min，然后離心保留上清；共得到洗提液0.5ml；

⑤純化洗提的dna：將洗提得到的含dna的naoh溶液加入到寡核苷酸純化柱子進(jìn)行脫鹽，然后收集0.5-1.5ml之間的濾液；得到的篩選產(chǎn)物dna濾液即為篩選一輪的適體，一輪篩選完畢；

⑥以篩選產(chǎn)物dna為模板，通過對稱pcr、鏈酶親和素瓊脂糖磁珠等技術(shù)獲得大量的dna，為下一輪做準(zhǔn)備；

⑦重復(fù)上述步驟1-6，進(jìn)行反復(fù)的篩選，直至篩選完成。

通過7輪的篩選之后，文庫中能與sdz結(jié)合的dna已達(dá)到飽和。

(4)克隆測序

利用第7輪篩選產(chǎn)物通過無標(biāo)記的上、下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后將pcr產(chǎn)物進(jìn)行克隆，隨機(jī)挑選若干個克隆進(jìn)行測序。

實(shí)施例2平衡解離常數(shù)的測定試驗(yàn)

合成測序得到的核酸適配體，用熒光方法測定其平衡解離常數(shù)kd。將合成的5'-fam標(biāo)記的核酸適體用結(jié)合緩沖液配置成不同濃度梯度溶液(0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，0.16，0.32和0.64μmol/l)取10μlsdz修飾的瓊脂糖珠，將200μl不同濃度梯度的5'-fam標(biāo)記的核酸適體和10μlsdz修飾的瓊脂糖珠混合，室溫孵育反應(yīng)30min，離心分離棄去未結(jié)合dna；再將瓊脂糖磁珠用結(jié)合緩沖液洗滌3次，每次用200μl結(jié)合緩沖液；再在95℃用100μl的2mol/lnaoh溶液洗提和sdz結(jié)合的dna，洗提2次，共得200μl洗提液；將不同的洗提液稀釋相同的倍數(shù)，然后置于96孔黑色熒光測定板，用酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度；熒光強(qiáng)度對核酸適體的濃度作圖，通過方程式y(tǒng)＝bmaxx/(kd+x)擬合出sdz適配體的解離常數(shù)。實(shí)驗(yàn)測定的kd結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選得到的適配體與sdz的親和力較高，kd最低，為0.16μmol，擬合曲線的r²＝0.9746，說明擬合良好。由sdz酸適體的kd值可知，sdz和核酸適體的結(jié)合能力較強(qiáng)。由于解離常數(shù)越低，親和力越高，因此，選擇該適配體進(jìn)行下一步特異性研究。

實(shí)施例3適配體特異性試驗(yàn)

取sdz、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用結(jié)合緩沖液稀釋至終濃度5μmol/l。取5μg核酸適配體溶解于100μl結(jié)合緩沖液中，95℃變性再迅速置于冰上10min,然后置室溫5min。取配制好的上述sdz等標(biāo)準(zhǔn)品溶液100μl至預(yù)處理好的核酸適配體溶液中，37℃孵化30min。然后將上述混合溶液加入sdz-瓊脂糖磁珠偶聯(lián)物，37℃孵化30min。取出孵化后的上清，用nanodrop測定上清中的ssdna的濃度。參考組選用不含藥物的結(jié)合緩沖液與預(yù)處理好的核酸適配體孵育(操作同步驟上述)，再將此孵化液加至dz-瓊脂糖磁珠偶聯(lián)物，37℃孵化30min。最后取出孵化后的上清，用nanodrop測定上清中的ssdna的濃度，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果如圖2所示，適配體對sdz的特異性很高，對結(jié)構(gòu)類似物(磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑)均無結(jié)合。將結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)核酸適配體對于sdz的比值與其他7種藥物的比值的差異顯著(p<0.05，進(jìn)一步證明了該結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用隨機(jī)文庫作為對照組，結(jié)果表明隨機(jī)文庫對這7種藥物均無結(jié)合。

實(shí)施例4基于sdz殘留dc-elaa檢測方法的建立

(1)取鏈霉親和素(sav)溶解于pbs中，37℃放置1小時。加入戊二酸溶液，混勻。4℃放置2小時，將反應(yīng)液全量加至處理好的透析袋中，透析。將透析好的鏈霉親和素戊二酸復(fù)合物用包被緩沖液液稀釋1mg/ml,取稀釋好的鏈霉親和素戊二酸復(fù)合物加至酶標(biāo)板，每孔200μl，混勻，37℃包被過夜。包被酶標(biāo)板洗滌4次后備用。

(2)將預(yù)處理25μlbiotin-sdzaptamer探針、25μlsdz-hrp、50μl不同濃度的sdz溶液(用pbs將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度：0,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30和100μg/l)標(biāo)準(zhǔn)品混合均勻，37℃孵化60min，然后加入到洗滌后的酶標(biāo)板的凹槽。37℃孵化45minn后，棄去反應(yīng)液，洗滌3次，拍干后每孔再加入顯色劑a1和a2各100ml避光顯色30min，反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)測試待檢樣品過程，重復(fù)上述步驟(2)：將預(yù)處理25μlbiotin-sdzaptamer探針、25μlsdz-hrp、50μl待測組織處理樣品混合均勻，37℃孵化60min，然后加入到洗滌后的酶標(biāo)板的凹槽。37℃孵化45min后，棄去反應(yīng)液，洗滌3次，拍干后每孔再顯色劑a1和a2各100ml避光顯色30min，反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測溶液吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到待測試樣中sdz的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品與空白標(biāo)準(zhǔn)品相對光密度值的百分率(b/b0％)為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的常用對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，繪制檢測試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程，進(jìn)行相關(guān)回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖3。通過對檢測限值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定傳感探針的檢測限。通過計(jì)算得到最低檢測線為：0.12ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度(ic50)為：3.2ng/ml。

實(shí)施例5基于sdz殘留檢測的biotin-sdzaptamer探針試劑盒的組裝

sdz檢測試劑盒的構(gòu)成：鏈霉親和素sav包被96孔或48孔酶標(biāo)板1塊，陰性對照1瓶，陽性對照1瓶，樣品稀釋液1瓶，biotin-sdzaptamer稀釋液1瓶，sdz-hrp稀釋液1瓶，洗滌液1瓶，顯色劑a1瓶，顯色劑a2瓶，終止液1瓶，說明書1份，不干膠封片3片。

上述酶標(biāo)板為透明聚苯乙烯96或48孔酶標(biāo)板，且其各孔包被有濃度為1μg/ml的包被sav，包被緩沖液為ph4.7～4.9磷酸鹽緩沖液稀釋；biotin-sdzaptamer稀釋液為標(biāo)記上了biotin的sdz核苷酸序列的溶液；sdz-hrp稀釋液為做了相適稀釋的sdz-hrp；顯色體系為3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)體系。陰性對照為sdz標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100ng/ml；陽性對照為100ng/ml磺胺間甲氧嘧啶。

biotin-sdzaptamer的制備：biotin-sdzaptamer序列如下：5′-biotin-cgtacggtcgacgctagcttggccatcttggccgggataaggatccagccgttgtagatttgcggtagggaaacgtatcacgtggagctcggatcc-3′。以上biotin-sdzaptamer由重慶若豐生物科技有限公司合成。biotin-sdzaptamer使用濃度為20nm。

sdz-hrp稀釋液的配制：sdz-hrp由重慶師范大學(xué)食品質(zhì)量與安全快速檢測協(xié)同創(chuàng)新中心制備，濃度為1:2000稀釋。

顯色劑a1為：檸檬酸鈉44.82克，檸檬酸3.2克，30％h2o20.6ml，超純水定容至1000ml。

顯色劑a2為：tmb0.4克，檸檬酸1.9克，乙二胺四乙酸鈉0.6g，丙三醇100ml，超純水定容至1000ml。

終止液：濃硫酸56ml，超純水定容至1000ml。

本發(fā)明的sdz檢測試劑盒的應(yīng)用及操作程序：

本發(fā)明還提供了一種檢測雞肉、雞蛋樣品中sdz含量的dc-elaa試劑盒，包括如下應(yīng)用操作程序：

(1)平衡：從冷藏環(huán)境中取出的試劑及樣品，應(yīng)于室溫(20-25℃)平衡約30min。

(2)配液：將pbs濃縮洗滌液用超純水作20倍稀釋成工作濃度洗滌液。

(3)準(zhǔn)備酶標(biāo)板：取96孔包被sav酶標(biāo)板，預(yù)設(shè)置空白、陰性、陽性對照各2孔。酶標(biāo)板包被方法：取鏈霉親和素(sav)溶解于pbs中，37℃放置1小時。加入戊二酸溶液，混勻。4℃放置2小時，將反應(yīng)液全量加至處理好的透析袋中，透析。將透析好的鏈霉親和素戊二酸復(fù)合物用包被緩沖液液稀釋1mg/ml,取稀釋好的鏈霉親和素戊二酸復(fù)合物加至酶標(biāo)板，每孔200μl，混勻，37℃包被過夜。包被酶標(biāo)板洗滌4次后備用。

(4)加樣：將預(yù)處理25μlbiotin-sdzaptamer探針、25μlsdz-hrp、50μl不同濃度sdz標(biāo)準(zhǔn)品混合均勻，37℃孵化30min，然后加入到洗滌后的酶標(biāo)板的凹槽。37℃孵化45min。

(5)洗板：棄去反應(yīng)液，洗滌3次，拍干。

(6)加底物：每孔再加入顯色劑a1和a2各100ml避光顯色30min。

(7)洗板：棄去反應(yīng)液，洗滌3次，拍干。

(8)終止：每孔加50μl終止液，混勻。

(9)測定：10分鐘內(nèi)以酶標(biāo)儀450nm雙波長測定各孔o(hù)d值，繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲。

實(shí)施例6試劑盒的特異性試驗(yàn)

用sdz殘留檢測dc-elaa方法分別檢測系列濃度的sdz，并繪制競爭抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算sdz的ic50值。同樣，計(jì)算其它磺胺類藥物(磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑)的ic50值。以sdz的交叉反應(yīng)率為100％，計(jì)算與其它磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率。同時用sdz殘留檢測dc-elaa方法分別檢測濃度1000ng/ml的其它藥物，如磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑。確定sdz殘留檢測dc-elaa方法的特異性。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算sdz的ic50值為3.2ng/ml。以磺胺間甲氧嘧啶的交叉反應(yīng)率為100％，其它磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率見表1。

表1dc-elaa方法與磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率

結(jié)果表明dc-elaa方法與磺胺間甲氧嘧啶(0.8％)、磺胺對甲氧嘧啶(0.5)、磺胺二甲氧嘧啶(0.3)交叉反應(yīng)率很低，與磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑的交叉反應(yīng)＜0.1％。說明dc-elaa方法具有好的特異性。

實(shí)施例7試劑盒添加回收試驗(yàn)

向經(jīng)高效液相色譜法檢測不含sdz的空白樣品(雞肉、雞肝和雞蛋)中，使其sdz含量分別為5ng/g、10ng/g、50ng/g，每個滴度設(shè)5個重復(fù)，樣品經(jīng)預(yù)處理后，用dc-elaa檢測方法進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算sdz含量及其回收率。

結(jié)果見表2。結(jié)果表明，sdz在不同樣品中回收率在77.4-115.5％范圍內(nèi)，變異系數(shù)均小于15％。

表2sdz在動物源性食品中的回收率

sequencelisting

<110>重慶師范大學(xué)

<120>基于核酸適配體特異性檢測磺胺嘧啶的生物傳感探針試劑盒及其應(yīng)用

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