本發(fā)明涉及一種sgrna導(dǎo)向序列及應(yīng)用。
背景技術(shù):
:近十年來出現(xiàn)了一種新的研究手段,可以幫助科研人員對各種細胞和各種生物體內(nèi)的幾乎任意基因進行人工操作。這種新技術(shù)就是我們常說的“基因組編輯技術(shù)”,zfn和talen都可以對dna進行各種遺傳修飾,這兩種核酸酶的作用機制都是先對dna雙鏈分子進行切割,形成dna雙鏈斷裂切口,然后激活細胞內(nèi)的非同源末端連接修復(fù)機制,或者同源重組修復(fù)機制,利用細胞自身的修復(fù)機制對dna進行遺傳學(xué)修飾。而最新出現(xiàn)的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)一經(jīng)出現(xiàn),便得到極大的發(fā)展及應(yīng)用。crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)是基于ii類crispr/cas系統(tǒng)改造而來的。cas9蛋白是唯一所需要的,用來介導(dǎo)外源dna沉默的cas蛋白。2013年1月,麻省理工學(xué)院以及哈佛醫(yī)學(xué)院同時再science上首次發(fā)表了使用crispr/cas系統(tǒng)對哺乳動物細胞進行基因編輯。在麻省理工學(xué)院的研究中,使用釀膿鏈球菌的ii類crispr/cas系統(tǒng),針對人的emx1位點設(shè)計的crrna能夠高效的在人的293ft細胞基因組的emx1位點上產(chǎn)生突變。針對該基因的不同pam序列設(shè)計crrna以及crrna與tracrrna嵌合在一起的chirna,對細胞進行基因編輯,crrna均能產(chǎn)生有效的突變,但可能由于rna的二級結(jié)構(gòu)的影響,并不是所有的chirna都能進行高效的位點突變,此外,利用該系統(tǒng)對基因組進行切割后,不僅能夠通過非同源性末端接合(nhej)的方式進行修復(fù),獲得在切割位點附近的堿基缺失或是插入,還可以通過同源重組修復(fù)(hdr)的方式,實現(xiàn)特異基因片段的重組,此外,通過針對同一基因的兩個位點設(shè)計crrna,可以成功的進行一段片段的基因敲除。使用ruvc結(jié)構(gòu)域突變的cas9蛋白也能夠通過同源重組的修復(fù)方式進行修復(fù),但無法獲得非同源性末端接合的突變。哈佛醫(yī)學(xué)院也獲得了類似的結(jié)果,且crispr/cas9系統(tǒng)的基因編輯效率與先前出現(xiàn)的talen效率類似,并能夠同時針對多個位點進行基因編輯。mc4r是第一個發(fā)現(xiàn)的與人類顯性遺傳疾病性肥胖相關(guān)的靶位點,yeo等首次在兩例早發(fā)性肥胖患者中發(fā)現(xiàn)了mc4r基因移碼突變后,mc4r在人類能量和體重調(diào)節(jié)中的重要性逐漸地被揭示。人mc4r突變研究表明,其顯性遺傳多由于單體不足所導(dǎo)致,在極少數(shù)個體中也可出現(xiàn)隱性遺傳的錯義突變。mc4r基因突變屬常染色體顯性遺傳,因此該基因具有表型的突變在人群中的發(fā)生率較高,迄今有近80例mc4r基因突變導(dǎo)致肥胖的病例報道,據(jù)估計bmi大于40的極度肥胖人群中有1%-4%是由于mc4r基因突變所致。在人類由mc4r基因突變引起的肥胖癥其表現(xiàn)型多種多樣,除了多食、肥胖外,并不伴發(fā)其他的內(nèi)分泌代謝異常,甲狀腺、腎上腺和生殖功能正常,不同于其他類型的單基因突變性肥胖。另外,mc4r基因多態(tài)性也可能與體脂分布及脂代謝相關(guān),體型缺陷mc4r導(dǎo)致的肥胖為青少年發(fā)病型,且女性的嚴重程度高于男性,其中大多數(shù)患者體脂分布有女性化傾向。在豬中對mc4r基因d298n突變位點進行了多態(tài)性分析,大白豬(引入品種)和北京黑豬(培育品種)含d298n位點等位突變所以瘦肉率高,肌內(nèi)脂肪含量低。mc4r基因d298n突變位點很可能與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)。以上研究表明mc4r可以作為與豬脂肪沉積性狀及肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明目的在于提供一種特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列及其應(yīng)用,該sgrna導(dǎo)向序列可以用于敲除豬mc4r基因,為制備轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列為mc4r-sgrna1,其核苷酸序列為:5’-tgtgcagtccgtaggtgctg-3’,如seqidno:1所示,位于基因mc4r外顯子。上述特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列在敲除豬mc4r基因中的應(yīng)用,具體方法如下:一、在豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列的5’端加上cacc得到正向寡核苷酸;同時根據(jù)導(dǎo)向序列獲得得其對應(yīng)的dna互補鏈,并且再起5’端加上aaac得到反向寡核苷酸;分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸,將合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸變性,退火,形成雙鏈;二、將步驟一制得的雙鏈dna與crispr/cas9載體連接,得到重組敲除表達載體;三、將步驟二制得的重組敲除表達載體轉(zhuǎn)染細胞,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,得到成功敲除igfbp3基因的細胞。進一步的,步驟二中所述的crispr/cas9載體為px330載體。進一步的,步驟三中所述轉(zhuǎn)染細胞的方法為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。進一步的,步驟三中所述篩選所用藥物為嘌呤霉素。進一步的,步驟三中所述的細胞為豬成纖維細胞。上述特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列在特異識別和靶向修飾豬mc4r基因中的應(yīng)用。上述特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列在構(gòu)建豬mc4r基因突變庫中的應(yīng)用。特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列,能產(chǎn)生基因插入突變、基因序列置換、基因序列缺失等多種類型mc4r基因突變體,可以在構(gòu)建豬mc4r基因突變庫中的應(yīng)用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明根據(jù)sgrna導(dǎo)向序列設(shè)計合成兩條單鏈核苷酸序列,退火形成雙鏈,然后與cas9載體連接,利用cas9載體將sgrna及crispr系統(tǒng)引入目標細胞中,cas9蛋白會在sgrna的引導(dǎo)下找到與其匹配的基因組dna序列,進行剪切,實現(xiàn)豬基因mc4r的敲除。(1)本發(fā)明利用質(zhì)粒載體px330將sgrna以及crispr系統(tǒng)引入細胞中,cas9蛋白會在sgrna的引導(dǎo)下找到與其匹配的dna序列,進行剪切。質(zhì)粒載體安全性高,不會引起細胞的免疫反應(yīng)。(2)本發(fā)明的載體中含有嘌呤霉素抗性基因,利用嘌呤霉素對細胞進行篩選,未轉(zhuǎn)入px330載體的細胞將在篩選過程中被淘汰。(3)本發(fā)明提供的特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列,可通過crispr/cas9系統(tǒng)敲除或編輯mc4r基因,進而消除mc4r的表達,為制備mc4r轉(zhuǎn)基因豬奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1是特異靶向豬mc4r基因的sgrna導(dǎo)向序列及其位置示意圖。圖2是pcr擴增豬mc4r基因外顯子片段電泳圖。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例做詳細說明,以下實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施,給出了詳細的實施方案和具體的操作過程,但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。以下實施例中所使用的細胞為原代培養(yǎng)豬成纖維細胞,px330,pegfp-c1載體購自addgene,內(nèi)切酶bbsi,bsmbi購自neb,g418和細胞培養(yǎng)基購自sigma。實施例1:(1)sgrna設(shè)計根據(jù)豬mc4r基因的基因組序列(geneid:nm214173),設(shè)計1個靶向豬mc4r基因的sgrna。20nt的寡核苷酸sgrna導(dǎo)向序列為:mc4r-sgrna1:5’-tgtgcagtccgtaggtgctg-3’,位于基因mc4r外顯子編碼區(qū)中;在其5’端加上cacc得到正向寡核苷酸序列;根據(jù)導(dǎo)向序列獲得其對應(yīng)的dna互補鏈,并且在其5’端加上aaac得到反向寡核苷酸。分別合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸,將合成的正向和反向sgrna寡核苷酸序列:95℃變性5min,72℃退火10min;退火后可以形成帶有粘性末端的雙鏈dna,具體寡核苷酸序列見表1。表1sgrna導(dǎo)向序列的寡核苷酸序列核苷酸序列(5’至3’)sg1-fcacctgtgcagtccgtaggtgctgsg1-raaaccagcacctacggactgcaca(2)構(gòu)建表達sgrna的載體質(zhì)粒載體px330載體有bbsi酶切位點,用bbsi酶切,其中,酶切體系為10μl體系:bbsi1μl;10×nebuffer1μl;質(zhì)粒2μl;ddh2o6μl;酶切條件為:37℃酶切過夜;將酶切后載體px330與步驟(1)制得的退火雙鏈利用t4連接酶進行連接,連接體系為10μl體系:px330載體2μl,退火雙鏈sgrna6μl,10nebt4dnaligasebuffer1μl,t4ligase1μl;連接條件為16℃連接過夜;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌dh5α,具體轉(zhuǎn)化方法為:-80℃取出感受態(tài)細菌dh5α,在冰浴溶解;然后100μl感受態(tài)細菌中加入10μl的上述連接產(chǎn)物,混勻后冰浴30min;42℃水浴100s熱激活,冰浴2min;然后加入900μlsoc培養(yǎng)基,37℃搖床60min;涂amp+(100μg/ml)固體soc培養(yǎng)基平板,37℃培養(yǎng)過夜,挑取陽性克隆,在soc液體培養(yǎng)基中37℃搖床過夜,之后用tiangen質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并測序驗證,得到表達sgrna的px330-mc4r-sg1質(zhì)粒載體。實施例2:(1)豬成纖維細胞的培養(yǎng)與凍存將豬胎兒置于國產(chǎn)大皿中加生理鹽水清洗5-6遍,清洗完畢后,去掉胎兒四肢、尾巴、頭和內(nèi)臟。將處理完的胎兒放于進口小皿中,用剪刀剪碎,剪至最大的組織塊為1mm3即可終止。加2ml0.25%的edta-trypsin于小皿中,并將小皿放于37度培養(yǎng)箱中消化25min后用4ml培養(yǎng)液dmem/f12(10%fbs)終止消化,并用巴斯德吸管吹打并吸出液體放于15ml離心管中,1000rpm,離心3min。離心完后,棄掉上清,加3ml培養(yǎng)液重懸,平均分在三個進口大皿中,進口大皿加8ml培養(yǎng)液dmem/f12(10%fbs)。第二天觀察細胞狀態(tài),如細胞量達到90%則按照1:3的比例傳代。如細胞量較少,則進行換液即可。一般豬胎兒成纖維細胞傳至1代長滿后即可凍存,凍存提前配好凍存液放于度中,再進行完常規(guī)的消化后用凍存液重懸,500ul分與凍存管中,并迅速將凍存管放在凍盒中,最后將凍存盒放于-80冰箱中過夜第二天,將凍存盒中的細胞導(dǎo)入進口液氮罐中即可。(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和陽性細胞篩選將重組質(zhì)粒px330-mc4r-sg1通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞,得到重組細胞。轉(zhuǎn)染的具體步驟參見脂質(zhì)體3000(invitrogen,貨號:11668019)操作說明書方法進行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后細胞利用2μg/ml的嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染后的細胞進行篩選,篩選持續(xù)48h后進行細胞恢復(fù)培養(yǎng),對篩選后的細胞進行培養(yǎng)并冷凍保存。(3)基因敲除效果鑒定根據(jù)所設(shè)計的sgrna序列設(shè)計鑒定引物,用于對敲除后目的片段進行鑒定,所設(shè)計的引物如表2所示:表2擴增mc4r片段的引物序列序列(5’至3’)mc4r-fcttaaatcaggtcagaggggatctcmc4r-rggagaaagtctcttatgcttgc利用takara公司takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkitver.5.0,codeno.9765.對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞進行基因組抽提,利用鑒定引物進行pcr鑒定。其pcr反應(yīng)體系為50μl體系:基因組dna1μl,2×pcrmix25μl,上下游引物各1μl,ddh2o22μl。pcr反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共33個循環(huán),之后72℃延伸10min。獲得的dna片段命名為mc4r-cds。pcr反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后,利用gelextractionkit(takara)進行膠回收,對膠回收產(chǎn)物進行測序分析,測序結(jié)果如圖2所示。測序結(jié)果表明細胞基因組在基因編輯處發(fā)生了突變,對照組與野生型基因組進行了對比沒有發(fā)生變化。本發(fā)明成功建立了敲除mc4r基因的豬成纖維細胞。當(dāng)前第1頁12