本申請要求2014年3月14日提交的美國臨時申請?zhí)?1/953,333；2014年9月17日提交的美國臨時申請?zhí)?2/051,579；2014年11月5日提交的美國臨時申請?zhí)?2/075,811；2014年11月5日提交的美國臨時申請?zhí)?2/075,816；以及2015年3月13日提交的美國臨時申請?zhí)?2/133,129的權(quán)益，其各自特此以引用的方式整體并入，包括所有表格、圖和權(quán)利要求。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開至少部分地涉及靶向遺傳突變和修飾，包括用于進(jìn)行所述突變和修飾的方法和組合物。

背景

以下論述僅提供來幫助讀者理解本公開，且并非承認(rèn)描述或構(gòu)成本公開的現(xiàn)有技術(shù)。

美國專利號6,271,360公開了用于通過引入編碼預(yù)定遺傳變化的寡脫氧核苷酸來在活細(xì)胞的靶基因中引入所述預(yù)定變化的方法和組合物。所述寡脫氧核苷酸是在哺乳動物、禽類、植物和細(xì)菌細(xì)胞中有效的。

美國專利號8,771,945公開了載體和載體系統(tǒng)，所述載體和載體系統(tǒng)中的一些編碼CRISPR復(fù)合物的一種或多種組分；以及用于設(shè)計(jì)和使用所述載體的方法。

美國專利號8,470,973“涉及用于通過多肽選擇性地識別DNA序列中的堿基對的方法，涉及特異性地識別DNA序列中的一個或多個堿基對的修飾的多肽，并且涉及進(jìn)行修飾以使得它能夠被多肽特異性地識別的DNA以及所述多肽和DNA在特異性DNA靶向中的用途，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞中的靶基因的表達(dá)的方法?！?/p>

概述

本文提供的包括用于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中的DNA中的靶向遺傳變化的方法和組合物。某些方面和實(shí)施方案涉及提高對基因組或其他核苷酸序列中的特定位置的修飾的靶向效率。如本文所述，引導(dǎo)對基因組的特異性變化的核酸可與不同方法組合以增強(qiáng)存在于被靶向以用于修飾的細(xì)胞中的天然修復(fù)系統(tǒng)的組分的可用性。

在第一方面，提供用于將基因修復(fù)寡核堿基(GRON)介導(dǎo)的突變引入至植物細(xì)胞中的靶脫氧核糖核酸(DNA)序列中的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法尤其可以包括在將GRON遞送至植物細(xì)胞中之前和/或同時在增加一種或多種細(xì)胞DNA修復(fù)過程的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞；和/或?qū)RON遞送至大于15個堿基長的植物細(xì)胞中，所述GRON任選地包含用于引入至靶DNA中的一個或多個；或兩個或更多個突變位點(diǎn)。

如本文使用的“基因修復(fù)寡核苷酸”或“GRON”意指能夠在某些條件下指導(dǎo)DNA序列中的單個(或在一些實(shí)施方案中多個)核苷酸缺失、插入或取代的寡核堿基(例如，混合雙鏈寡核苷酸、含非核苷酸的分子、單鏈寡脫氧核苷酸、雙鏈寡脫氧核苷酸以及其他基因修復(fù)分子)?；蚪M的這種寡核苷酸介導(dǎo)的基因修復(fù)編輯可包括基于非同源性的修復(fù)系統(tǒng)(例如，非同源末端連接)和基于同源性的修復(fù)系統(tǒng)(例如，同源導(dǎo)向修復(fù))。所述GRON通常被設(shè)計(jì)成與基因組靶標(biāo)對齊對準(zhǔn)，除了所設(shè)計(jì)的錯配。這些錯配可通過利用細(xì)胞的內(nèi)源性DNA修復(fù)系統(tǒng)中的一種或多種來識別和校正。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與生物體靶序列比較時，GRON或寡核苷酸可被設(shè)計(jì)為包含多個差異。這些差異可能并非都影響從所述靶序列翻譯的蛋白質(zhì)序列并且在一種或多種情況下被稱為沉默變化。GRON結(jié)構(gòu)、化學(xué)和功能的多種變化在本文其他地方描述。在各種實(shí)施方案中，如本文所用的GRON可具有一種或多種修飾。例如，如本文所用的GRON可具有將DNA修復(fù)機(jī)器吸引至靶向(錯配)位點(diǎn)和/或防止所述GRON的部分或全部(除了所需的靶向缺失、插入、取代等)重組至靶DNA序列的基因組DNA中和/或提高所述GRON的穩(wěn)定性的一種或多種修飾。

在各種實(shí)施方案中，GRON可具有RNA和DNA核苷酸和/或其他類型的核堿基。在一些實(shí)施方案中，所述DNA或RNA核苷酸中的一個或多個包含修飾。

一方面，提供一種引起植物細(xì)胞中的遺傳變化的方法，其中所述方法涉及使所述細(xì)胞暴露于DNA切割體和GRON，例如如本文所考慮進(jìn)行修飾的GRON。在一些實(shí)施方案中，所述GRON可如用Cy3基團(tuán)、3PS基團(tuán)、2’O-甲基或如本文所考慮的其他修飾進(jìn)行修飾。另一方面，提供一種包括DNA切割體和GRON的植物細(xì)胞，例如其中所述GRON如用Cy3基團(tuán)、3PS基團(tuán)、2’O-甲基或其他修飾進(jìn)行修飾。在一些實(shí)施方案中，所述DNA切割體是選自CRISPR、TALEN、鋅指、大范圍核酸酶以及DNA切割抗生素的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，所述DNA切割體是CRISPR。在一些實(shí)施方案中，所述DNA切割體是TALEN。在一些實(shí)施方案中，所述GRON是15與60個核堿基之間的長度；或30與40個核堿基之間的長度；或35與45個核堿基之間的長度；或20與70個核堿基之間的長度；或20與200個核堿基之間的長度；或30與180個核堿基之間的長度；或50與160個核堿基之間的長度；或70與150個核堿基之間的長度；或70與210個核堿基之間的長度；或80與120個核堿基之間的長度；或90與110個核堿基之間的長度；或95與105個核堿基之間的長度；或80與300個核堿基之間的長度；或90與250個核堿基之間的長度；或100與150個核堿基之間的長度；或100與200個核堿基之間的長度；或100與210個核堿基之間的長度；或100與300個核堿基之間的長度；或150與200個核堿基之間的長度；或200與300個核堿基之間的長度；或250與350個核堿基之間的長度；或50與110個核堿基之間的長度；或50與200個核堿基之間的長度；或150與210個核堿基之間的長度；或20與1000個核堿基之間的長度；或100與1000個核堿基之間的長度；或200與1000個核堿基之間的長度；或300與1000個核堿基之間的長度；或400與1000個核堿基之間的長度；或500與1000個核堿基之間的長度；或600與1000個核堿基之間的長度；或700與1000個核堿基之間的長度；或800與1000個核堿基之間的長度；或900與1000個核堿基之間的長度；或300與800個核堿基之間的長度；或400與600個核堿基之間的長度；或500與700個核堿基之間的長度；或600與800個核堿基之間的長度；或長于30個核堿基長；或長于35個核堿基長；或長于40個核堿基長；或長于50個核堿基長；或長于60個核堿基長；或長于65個核堿基長；或長于70個核堿基長；或長于75個核堿基長；或長于80個核堿基長；或長于85個核堿基長；或長于90個核堿基長；或長于95個核堿基長；或長于100個核堿基長；或長于110個核堿基長；或長于125個核堿基長；或長于150個核堿基長；或長于165個核堿基長；或長于175個核堿基長；或長于200個核堿基長；或長于250個核堿基長；或長于300個核堿基長；或長于350個核堿基長；或長于400個核堿基長；或長于450個核堿基長；或長于500個核堿基長；或長于550個核堿基長；或長于600個核堿基長；或長于700個核堿基長；或長于800個核堿基長；或長于900個核堿基長。

GRON可在靶基因的非編碼(NC)區(qū)域和編碼(C)區(qū)域兩者處靶向。作為舉例，圖27和28分別描繪適于將突變引入水稻基因組以便引入對ACC酶基因的以下氨基酸取代中的一個或多個的C-GRON和NC-GRON。慣例是使用用于來自作為參考的大穗看麥娘(blackgrass)(大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides)；Am)的質(zhì)體ACC酶的氨基酸編號系統(tǒng)。本文使用的ACC酶編號是基于用于大穗看麥娘參考序列ACC酶蛋白(SEQ ID NO:1)或在ACC酶橫向同源物(V＝CY3；H＝3'DMT dC CPG)中的類似氨基酸殘基處的編號。下表列出產(chǎn)生以下中的一種或多種的ACC酶突變：禾草滅(alloxydim)、丁氧環(huán)酮(butroxydim)、烯草酮、cloproxydim，噻草酮(cycloxydim)、稀禾定、吡喃草酮、肟草酮、chlorazifop、炔草酯(clodinafop)、clofop、禾草靈、噁唑禾草靈、精噁唑禾草靈、噻唑禾草靈、吡氟禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟氯禾靈、精吡氟氯禾靈、異噁草醚(isoxapyrifop)、喔草酯(propaquizafop)、喹禾靈、精喹禾靈、三氟禾草肟(trifop)、唑啉草酯、這些除草劑中的任一種的農(nóng)學(xué)上可接受的鹽和酯以及其組合抗性表型。

類似地，圖29和30分別描繪適于將突變引入亞麻基因組以便將以下氨基酸取代中的一個或多個引入EPSPS基因(其中全部相對于大腸桿菌AroA蛋白的氨基酸序列變化)(原核EPSPS等效物)(如在美國專利號8,268,622中所描述的那些)的(編碼)C-GRON和(非編碼)NC-GRON。(V＝CY3；H＝3'DMT dC CPG)。以下表列出產(chǎn)生這些除草劑中的任一種的草甘膦農(nóng)學(xué)上可接受的鹽或酯以及其組合抗性表型的EPSPS突變。

如本文所用的術(shù)語“CRISPR”是指元件；即cas(CRISPR相關(guān))基因、轉(zhuǎn)錄物(例如mRNA)或蛋白質(zhì)以及至少一個CRISPR間隔區(qū)序列(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，還稱為SPIDR—間隔區(qū)散布直接重復(fù)序列)；其當(dāng)在細(xì)胞中有效存在或表達(dá)時能夠經(jīng)由CRISPR/CAS細(xì)胞機(jī)器實(shí)現(xiàn)靶DNA序列的裂解，如描述于例如Cong,L.等人,Science,第339卷第6121期第819-823頁(2013)；Jinek等人,Science,第337卷:816-821(2013)；Wang等人,RNA,第14卷,第903-913頁(2008)；Zhang等人,Plant Physiology,第161卷,第20-27頁(2013),Zhang等人,PCT申請?zhí)朠CT/US2013/074743；以及Charpentier等人,PCT申請?zhí)朠CT/US2013/032589。在一些實(shí)施方案中，例如像用于真核細(xì)胞中的CRISPR，如本文考慮的CRISPR還可包括另外的元件，所述元件包括用于一種或多種功能性核定位信號的序列。如本文考慮的CRISPR可以許多方式或表現(xiàn)中的任一種表達(dá)于、施用至和/或存在于細(xì)胞(如植物細(xì)胞)中。例如，如本文考慮的CRISPR可包括或涉及以下中的一種或多種：質(zhì)粒上的CRISPR、質(zhì)粒上的CRISPR切口酶、質(zhì)粒上的CRISPRa或質(zhì)粒上的CRISPRi，如下：

質(zhì)粒上的CRISPR：一種重組表達(dá)載體，其包含：

(i)編碼DNA靶向RNA(例如，引導(dǎo)RNA)的核苷酸序列，其中所述DNA靶向RNA包含：

a.包含與靶DNA中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的第一區(qū)段(例如，原型間隔區(qū)、間隔區(qū)或crRNA)；以及

b.與位點(diǎn)定向修飾多肽相互作用的第二區(qū)段(例如，反式活化的crRNA或tracrRNA)；以及

(ii)編碼所述位點(diǎn)定向修飾多肽(例如，cas基因)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)定向多肽包含：

a.與DNA靶向RNA相互作用的RNA結(jié)合部分(例如，REC葉)；以及

b.引起靶DNA內(nèi)的雙鏈斷裂的活性部分(例如，NUC葉)，其中所述靶DNA內(nèi)的雙鏈斷裂的位點(diǎn)由DNA靶向RNA決定。

質(zhì)粒上的CRISPR切口酶：一種重組表達(dá)載體，其包含：(i)編碼DNA靶向RNA(例如，引導(dǎo)RNA)的核苷酸序列，其中所述DNA靶向RNA包含：

a.包含與靶DNA中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的第一區(qū)段(例如，原型間隔區(qū)、間隔區(qū)或crRNA)；以及

b.與位點(diǎn)定向修飾多肽相互作用的第二區(qū)段(例如，反式活化的crRNA或tracrRNA)；以及

(ii)編碼所述位點(diǎn)定向修飾多肽(例如，cas基因)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)定向多肽包含：

a.與DNA靶向RNA相互作用的RNA結(jié)合部分(例如，REC葉)；以及

b.引起靶DNA內(nèi)的單鏈斷裂的活性部分(例如，NUC葉)，其中所述靶DNA內(nèi)的單鏈斷裂的位點(diǎn)由DNA靶向RNA決定。

質(zhì)粒上的CRISPRa。一種重組表達(dá)載體，其包含：

(i)編碼DNA靶向RNA(例如，引導(dǎo)RNA)的核苷酸序列，其中所述DNA靶向RNA包含：

a.包含與靶DNA中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的第一區(qū)段(例如，原型間隔區(qū)、間隔區(qū)或crRNA)；以及

b.與位點(diǎn)定向修飾多肽相互作用的第二區(qū)段(例如，反式活化的crRNA或tracrRNA)；以及

(ii)編碼所述位點(diǎn)定向修飾多肽(例如，cas基因)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)定向多肽包含：

a.與DNA靶向RNA相互作用的RNA結(jié)合部分(例如，REC葉)；以及

b.調(diào)節(jié)靶DNA內(nèi)的轉(zhuǎn)錄的活性部分(例如，NUC葉；在某些實(shí)施方案中增加轉(zhuǎn)錄)，其中所述靶DNA內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的位點(diǎn)由DNA靶向RNA決定。

質(zhì)粒上的CRISPRi。一種重組表達(dá)載體，其包含：

(i)編碼DNA靶向RNA(例如，引導(dǎo)RNA)的核苷酸序列，其中所述DNA靶向RNA包含：

a.包含與靶DNA中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列的第一區(qū)段(例如，原型間隔區(qū)、間隔區(qū)或crRNA)；以及

b.與位點(diǎn)定向修飾多肽相互作用的第二區(qū)段(例如，反式活化的crRNA或tracrRNA)；以及

(ii)編碼所述位點(diǎn)定向修飾多肽(例如，cas基因)的核苷酸序列，其中所述位點(diǎn)定向多肽包含：

a.與DNA靶向RNA相互作用的RNA結(jié)合部分(例如，REC葉)；以及

b.調(diào)節(jié)靶DNA內(nèi)的轉(zhuǎn)錄/翻譯的活性部分(例如，NUC葉；在一些實(shí)施方案中減少轉(zhuǎn)錄/翻譯)，其中所述靶DNA內(nèi)的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)節(jié)的位點(diǎn)由DNA靶向RNA決定。

質(zhì)粒上的CRISPR、質(zhì)粒上的CRISPR切口酶、質(zhì)粒上的CRISPRa以及質(zhì)粒上的CRISPRi可在一些實(shí)施方案中可替代地使一種或多種適當(dāng)?shù)脑鳛镽NA(例如mRNA)或蛋白質(zhì)施用、表達(dá)或存在于細(xì)胞中而非在質(zhì)粒上。受保護(hù)的mRNA的遞送可以是如Kariko等人,美國專利號8,278,036中所描述。

在一些實(shí)施方案中，CRISPRi和CRISPRa各自可包括失活的cas9(dCas9)。失活的cas9仍然結(jié)合靶DNA，但不具有切割活性。核酸酶缺陷型Cas9可由D10A和H840A點(diǎn)突變產(chǎn)生，所述突變使其兩個催化結(jié)構(gòu)域失活。

在一些實(shí)施方案中，CRISPRi經(jīng)由RNA聚合酶II的位阻抑制轉(zhuǎn)錄起始或延伸。CRISPRi可任選地通過將強(qiáng)阻遏物結(jié)構(gòu)域融合至dCas9蛋白的C末端來增強(qiáng)(CRISPRei)。在一些實(shí)施方案中，阻遏物結(jié)構(gòu)域募集且采用染色質(zhì)修飾因子。在一些實(shí)施方案中，所述阻遏物結(jié)構(gòu)域可包括但不限于如在Kagale,S.等人,Epigenetics,第6卷第2期第141-146頁(2011)中描述的結(jié)構(gòu)域：

1.LDLNRPPPVEN-OsERF3阻遏物結(jié)構(gòu)域(LxLxPP基序)

2.LRLFGVNM–AtBRD阻遏物結(jié)構(gòu)域(R/KLFGV基序)

3.LKLFGVWL-AtHsfB1阻遏物結(jié)構(gòu)域(R/KLFGV基序)

4.LDLELRLGFA–AtSUP阻遏物結(jié)構(gòu)域(EAR基序)

5.ERSNSIELRNSFYGRARTSPWSYGDYDNCQQDHDYLLGFSWPPRSYTCSFCKREFRSAQALGGHMNVHRRDRARLRLQQSPSSSSTPSPPYPNPNYSYSTMANSPPPHHSPLTLFPTLSPPSSPRYRAGLIRSLSPKSKHTPENACKTKKSSLLVEAGEATRFTSKDACKILRNDEIISLELEIGLINESEQDLDLELRLGFA*-含全AtSUP基因阻遏物結(jié)構(gòu)域(EAR基序)

在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄的CRISPRa活化通過使用含有融合的C末端轉(zhuǎn)錄活化因子的dCas9蛋白來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，活化可包括但不限于VP64(4X VP16)、AtERF98活化結(jié)構(gòu)域或AtERF98x4多聯(lián)體，如在Cheng,AW等人,Cell Research,第1-9頁(2013)；Perez-Pinera,P.等人,Nature Methods,第10卷第913-976頁(2013)；Maeder,ML.等人,Nature Methods,第10卷第977-979頁(2013)以及Mali,P.,等人,Nature Biotech.,第31卷第833-838頁(2013)中所描述。

在一些實(shí)施方案中，所述CRISPR包括切口酶。在某些實(shí)施方案中，使用兩種或更多種CRISPR切口酶。在一些實(shí)施方案中，所述兩種或更多種切口酶在靶核酸的相對鏈上切割。在其他實(shí)施方案中，所述兩種或更多種切口酶在靶核酸的同一鏈上切割。

如本文所用，“阻遏蛋白”或“阻遏物”是指分別結(jié)合DNA的操作子或RNA以防止轉(zhuǎn)錄或翻譯的蛋白質(zhì)。

如本文所用，“阻遏”是指通過使阻遏蛋白結(jié)合DNA或mRNA上的特異性位點(diǎn)來抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯。在一些實(shí)施方案中，阻遏包括轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的至少1.5倍、在其他實(shí)施方案中至少兩倍且在其他實(shí)施方案中至少五倍的顯著變化。

如本文所用，關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的“活化蛋白”或“活化物”是指分別結(jié)合DNA的操作子或RNA以增強(qiáng)或增加轉(zhuǎn)錄或翻譯的蛋白質(zhì)。

如本文關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所用，關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的“活化”是指通過使活化蛋白結(jié)合DNA或mRNA上的特異性位點(diǎn)來增強(qiáng)或增加轉(zhuǎn)錄或翻譯。在一些實(shí)施方案中，活化包括轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的至少1.5倍、在一些實(shí)施方案中至少兩倍且在一些實(shí)施方案中至少五倍的顯著變化。

在某些實(shí)施方案中，增加一種或多種細(xì)胞DNA修復(fù)過程的條件可包括以下中的一種或多種：將一個或多個位點(diǎn)引入至GRON中或至植物細(xì)胞DNA中，所述位點(diǎn)是用于堿基切除修復(fù)的靶標(biāo)；將一個或多個位點(diǎn)引入至GRON中或至植物細(xì)胞DNA中，所述位點(diǎn)是用于非同源末端連接的靶標(biāo)；將一個或多個位點(diǎn)引入至GRON中或至植物細(xì)胞DNA中，所述位點(diǎn)是用于微同源介導(dǎo)的末端連接的靶標(biāo)；將一個或多個位點(diǎn)引入至GRON中或至植物細(xì)胞DNA中，所述位點(diǎn)是用于同源重組的靶標(biāo)；以及將一個或多個位點(diǎn)引入至GRON中或至植物細(xì)胞DNA中，所述位點(diǎn)是用于實(shí)現(xiàn)修復(fù)的靶標(biāo)(例如，堿基切除修復(fù)(BER)；同源重組修復(fù)(HR)；錯配修復(fù)(MMR)；非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)，其包括經(jīng)典和替代NHEJ；以及核苷酸切除修復(fù)(NER))。

如下文所述，用于本文的GRON可包括來自常規(guī)RNA和DNA核苷酸的以下改變中的一種或多種：

一個或多個無堿基核苷酸；

一個或多個8’氧代dA和/或8’氧代dG核苷酸；

在其3’端處的反向堿基；

一個或多個2’O-甲基核苷酸；

一個或多個RNA核苷酸；

在其5’端的一個或多個RNA核苷酸，且在一些實(shí)施方案中2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個；其中所述RNA核苷酸中的一個或多個可進(jìn)一步進(jìn)行修飾；在其3’端的一個或多個RNA核苷酸，且在一些實(shí)施方案中2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個；其中所述RNA核苷酸中的一個或多個可進(jìn)一步進(jìn)行修飾；

在其5’端處的一個或多個2’O-甲基RNA核苷酸，且在一些實(shí)施方案中2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個；

嵌入染料；

5’末端帽；

選自由以下組成的組的主鏈修飾：硫代磷酸酯修飾、膦酸甲酯修飾、鎖核酸(LNA)修飾、O-(2-甲氧基乙基)(MOE)修飾、二PS修飾以及肽核酸(PNA)修飾；

一個或多個鏈內(nèi)交聯(lián)；

綴合至其、且在一些實(shí)施方案中在所述GRON的5’或3’端處的一種或多種熒光染料；以及

增加雜交能量的一個或多個堿基。

此列表不意圖是限制性的。

如本文所用的術(shù)語“搖擺堿基”是指參考核苷酸序列的一個或多個核苷酸堿基的變化，其中所述變化不會相對于參考序列改變由所述核苷酸編碼的氨基酸的序列。

如本文所用，術(shù)語“非核苷酸”或“無堿基核苷酸”是指可替代一個或多個核苷酸單元并入核酸鏈中的任何基團(tuán)或化合物，包括糖和/或磷酸酯取代，并且允許剩余的堿基展現(xiàn)其酶活性。所述基團(tuán)或化合物是無堿基的，因?yàn)槠洳缓泄J(rèn)的核苷酸堿基如腺苷、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。它可具有針對2’或3’H或OH的取代，如在本領(lǐng)域和本文中所描述。

如本文所述，在某些實(shí)施方案中，GRON質(zhì)量和轉(zhuǎn)化效率可通過使用改進(jìn)其純度的核苷酸多聚體如二聚體、三聚體、四具體等合成GRON的全部或一部分來改進(jìn)。

在某些實(shí)施方案中，靶脫氧核糖核酸(DNA)序列是在植物細(xì)胞內(nèi)，例如靶DNA序列是在植物細(xì)胞基因組內(nèi)。植物細(xì)胞可以是非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因的，并且靶DNA序列可以是所述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源基因。

在某些實(shí)施方案中，增加一種或多種細(xì)胞DNA修復(fù)過程的條件包括引入一種或多種化合物，所述化合物在將GRON遞送至植物細(xì)胞中之前或同時誘導(dǎo)單或雙DNA鏈斷裂至植物細(xì)胞中。示例性化合物在本文描述。

本文所述的方法和組合物適用于一般植物。僅作為舉例，植物物種可選自由以下組成的組：芥花、向日葵、玉米、煙草、甜菜、棉花、苞米、小麥(包括但不限于小麥屬，普通小麥(Triticum aestivum)、硬粒小麥(Triticum durum)、提莫非維小麥(Triticum timopheevii)、一粒小麥(Triticum monococcum)、斯佩耳特小麥(Triticum spelta)、茹科夫斯基小麥(Triticum zhukovskyi)以及烏拉爾圖小麥(Triticum urartu)及其雜種)、大麥(包括但不限于大麥(Hordeum vulgare L.)、Hordeum comosum、平展大麥(Hordeum depressum)、Hordeum intercedens、狐尾大麥(Hordeum jubatum)、海大麥(Hordeum marinum)、海大麥、帕氏大麥(Hordeum parodii)、小大麥(Hordeum pusillum)、Hordeum secalinum、以及鈍稃野大麥(Hordeum spontaneum))、水稻(包括但不限于水稻(Oryza sativa)亞屬秈稻(indica)、水稻亞屬粳稻(japonica)、水稻亞屬爪哇稻(javanica)、水稻亞屬糯稻(lutinosa)(糯米(glutinous rice))、水稻Aromatica組(例如，印度香米(basmati))、以及水稻(浮稻(floating rice)組))、苜蓿(alfafa)、大麥、高粱、西紅柿、芒果、桃子、蘋果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、木薯、土豆、胡蘿卜、萵苣、洋蔥、大豆、大豆屬、甘蔗、豌豆、鷹嘴豆、紫花豌豆(field bean)、蠶豆、扁豆、蕪菁、蕪菁甘藍(lán)、球芽甘藍(lán)(brussel sprouts)、羽扇豆、花椰菜、羽衣甘藍(lán)、菜豆、楊樹、松樹、桉樹、葡萄、柑橘、黑小麥、苜蓿、黑麥(包括但不限于野黑麥(Secale sylvestre)、Secale strictum、普通黑麥(Secale cereal)、瓦維洛夫黑麥(Secale vavilovii)、非洲黑麥(Secale africanum)、Secale ciliatoglume、Secale ancestrale以及山地黑麥(Secale montanum))、燕麥、草皮(包括但不限于草皮草，包括結(jié)縷草(Zoysia japonica)、Agrostris palustris、草地早熟禾(Poa pratensis)、早熟禾(Poa annua)、馬唐(Digitaria sanguinalis)、香附子(Cyperus rotundus)、短葉水蜈蚣(Kyllinga brevifolia)、阿穆爾莎草(Cyperus amuricus)、加拿大蓬(Erigeron Canadensis)、天胡荽(Hydrocotyle sibthorpioides)、雞眼草(Kummerowia striata)、地錦草(Euphorbia humifusa)、以及野生堇菜(Viola arvensis))和牧草、亞麻、油菜、棉花、芥菜、黃瓜、牽?；?、香脂、辣椒、茄子、萬壽菊、蓮花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鳶尾、百合、產(chǎn)堅(jiān)果植物(在它們尚未具體地提及的情況下)。這些還可全部或部分地適用于所有其他生物系統(tǒng)，包括但不限于細(xì)菌、酵母、真菌、藻類和哺乳動物細(xì)胞以及甚至其細(xì)胞器(例如，線粒體和葉綠體)。在一些實(shí)施方案中，所述生物體或細(xì)胞是選自由以下組成的組的物種：大腸桿菌、恥垢分枝桿菌、枯草桿菌、小球藻、蘇云金芽孢桿菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母、Chlamydamonas rhienhardtii、畢赤酵母、棒狀桿菌、黑曲霉以及粗糙脈孢菌。在一些實(shí)施方案中，所述酵母是解脂耶氏酵母。在其他實(shí)施方案中，所述酵母不是釀酒酵母。在一些實(shí)施方案中，所述植物或植物細(xì)胞是選自由以下組成的組的物種：擬南芥、馬鈴薯、富利亞薯(Solanum phureja)、水稻、大豆(Glycine max)、糙果莧(Amaranthus tuberculatus)、亞麻、以及玉米。所述植物物種可選自由禾本科的單子葉植物組成的組。禾本科可被分成兩種主要進(jìn)化枝，含有亞科竹亞科(Bambusoideae)、稻亞科(Ehrhartoideae)和早熟禾亞科(Pooideae)的進(jìn)化枝(BEP進(jìn)化枝)和含有亞科黍亞科(Panicoideae)、蘆竹亞科(Arundinoideae)、虎尾草亞科(Chloridoideae)、假淡竹葉亞科(Centothecoideae)、Micrairoideae、三芒草亞科(Aristidoideae)以及扁芒草亞科(Danthonioideae)的進(jìn)化枝(PACCMAD進(jìn)化枝)。亞科竹亞科包括稻族。所述植物物種可涉及BEP進(jìn)化枝的植物，具體地說亞科竹亞科和稻亞科的植物。所述BET進(jìn)化枝包括亞科竹亞科、稻亞科和Triticodae群并且無其他亞科早熟禾亞科群。BET作物植物是為BET亞進(jìn)化枝的成員的生長以獲得糧食或飼料的植物，例如大麥、玉米等。

在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括從植物細(xì)胞再生具有通過GRON引入的突變的植物，并且可包括從所述植物采集種子。

在相關(guān)方面，本公開涉及包含根據(jù)本文所述的方法通過GRON引入的基因組修飾的植物細(xì)胞，包含根據(jù)本文所述的方法通過GRON引入的基因組修飾的植物，或包含根據(jù)本文所述的方法通過GRON引入的基因組修飾的種子；或包含根據(jù)本文所述的方法通過GRON引入的基因組修飾的種子的后代。

本公開的其他實(shí)施方案將是從以下詳述、示例性實(shí)施方案和權(quán)利要求書顯而易見的。

附圖簡述

圖1描繪通過硫代磷酸酯(PS)標(biāo)記的GRON(在GRON的每一端具有3PS部分)和5’Cy3/3’idC標(biāo)記的GRON介導(dǎo)的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。

圖2描繪包含RNA/DNA的GRON(本文被稱為“2’-O-甲基GRON”)。

圖3是bfp基因上的BFP5 CRISPR所靶向的位置的示意圖。

圖4示出用各種長度的Cy3或3PS GRON引入的CRISPR對BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥模型系統(tǒng)中BFP至GFP轉(zhuǎn)化的百分比的作用的結(jié)果。

圖5示出用各種長度的3PS GRON引入的CRISPR對BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥模型系統(tǒng)中BFP至GFP轉(zhuǎn)化的百分比的作用的結(jié)果。

圖6是在實(shí)施例9中使用的GRON設(shè)計(jì)的示意圖。

圖7示出來自71-聚體GRON的如通過流式細(xì)胞術(shù)測定的來自擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)的GFP陽性原生質(zhì)體平均百分比的測量。

圖8示出來自201-聚體GRON的如通過流式細(xì)胞術(shù)測定的來自擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)的GFP陽性原生質(zhì)體的測量。

圖9示出用編碼和非編碼GRON引入的CRISPR對BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥模型系統(tǒng)中GFP陽性細(xì)胞的平均百分比的作用。

圖10是將單鏈GRON或雙鏈DNA鍵結(jié)至CRISPR/Cas復(fù)合物的示意圖。

圖11示出CRISPR和GRON在介導(dǎo)具有不同長度的間隔區(qū)的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化中的作用的結(jié)果。

圖12示出CRISPR和GRON在介導(dǎo)具有在質(zhì)粒(gRNA質(zhì)粒)上編碼或用作擴(kuò)增子(gRNA擴(kuò)增子)的間隔區(qū)的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化中的作用的結(jié)果。

圖13示出CRISPR和GRON在介導(dǎo)具有未修飾的對比3PS修飾的41-聚體GRON的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化中的作用的結(jié)果。

圖14示出源自在T＝0時用CRISPR質(zhì)粒處理的莖尖原生質(zhì)體PEG的3周和6周齡亞麻(Linum usitatissimum)(亞麻(flax))微小愈傷組織的下一代測序的結(jié)果。

圖15示出源自在T＝0時用CRISPR質(zhì)粒處理的莖尖原生質(zhì)體PEG的3周和6周齡亞麻微小愈傷組織的下一代測序的結(jié)果。

圖16示出擬南芥原生質(zhì)體中的CRISPR-Cas核酸酶活性和基因編輯。16A：在遞送后72小時用CRISPR-Cas質(zhì)粒(BC-1)處理的原生質(zhì)體中如通過深度測序測定的基于大小的插入缺失的分布。插入缺失代表總讀數(shù)的0.79％。16B：通過在質(zhì)粒(BC-1)和GRON(CG-6)遞送后第72小時通過流式細(xì)胞術(shù)鑒別的GFP發(fā)熒光原生質(zhì)體的百分比測量的BFP至GFP編輯。所表示的數(shù)據(jù)未針對轉(zhuǎn)染效率標(biāo)準(zhǔn)化。誤差線是s.e.m.(n＝9)。

圖17示出使用CRISPR-Cas與具有不同長度和化學(xué)修飾的GRON的組合的擬南芥原生質(zhì)體中的基因編輯。17a：在質(zhì)粒(BC-1)和GRON(CG-1)或(CG-2)遞送后第72小時如通過流式細(xì)胞術(shù)測量的BFP至GFP基因編輯中的3PS和未修飾的GRON的比較。17b：在質(zhì)粒(BC-2)和GRON(CG-5)或(CG-8)遞送后72小時如通過流式細(xì)胞術(shù)測量的BFP至GFP基因編輯中的GRON長度的比較。17c：比較在質(zhì)粒(BC-1)和GRON(CG-6)、(CG-9)或(CG-10)遞送后第72小時如通過流式細(xì)胞術(shù)測量的用于BFP至GFP基因編輯的3PS與2’-O-MeGRON。17d：比較在質(zhì)粒(BC-3)和GRON(CG-3)或(CG-4)遞送后第72小時如通過流式細(xì)胞術(shù)測量的BFP至GFP基因編輯中的3PS-與Cy3GRON。誤差線是s.e.m.(n＝3)。(CG-1)：BFP反義41nb未修飾的；(CG-2)：BFP反義41nb 3PS修飾的；(CG-3)：BFP有義41nb 3PS修飾的；(CG-4)：BFP有義41nb Cy3修飾的；(CG-5)：BFP有義60nb 3PS修飾的；(CG-6)：BFP反義201nb 3PS修飾的；(CG-8)：BFP有義201nb 3PS修飾的；(CG-9)：在第一5’RNA堿基上的BFP反義201nb 2’-O-Me修飾；(CG-10)：在前九個5’RNA堿基上的BFP反義201nb 2’-O-Me修飾。

圖18示出擬南芥和亞麻原生質(zhì)體中的TALEN核酸酶活性和基因編輯。18a：在遞送后第72小時用TALEN質(zhì)粒(BT-1)處理的擬南芥原生質(zhì)體中如通過深度測序測定的基于大小的插入缺失的分布。插入缺失代表總讀數(shù)的0.51％。18b：在質(zhì)粒(BT-1)和GRON(CG-7)遞送后第48小時如通過流式細(xì)胞術(shù)測量的BFP至GFP基因編輯。18c：在遞送后第7天用靶向EPSPS基因的TALEN(LuET-1)處理的亞麻原生質(zhì)體中基于bp長度的插入缺失的分布。插入缺失的總頻率是0.50％。d，在質(zhì)粒(LuET-1)和GRON(CG-11)遞送至原生質(zhì)體中之后第7天如通過深度測序測量的亞麻EPSPS基因編輯?？傋x數(shù)的百分比表示作為總讀數(shù)的百分比的含有T97I和P101A編輯的讀數(shù)的數(shù)目。誤差線是s.e.m.(n＝3)。(CG-7)：BFP有義201nb 3PS修飾的；(CG-11)：EPSPS有義144nb Cy3修飾的。

圖19示出誘導(dǎo)雙鏈斷裂的抗生素博來霉素和腐草霉素對轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體中的BFP至GFP編輯的作用。在PEG引入GRON(CG2)之前，將原生質(zhì)體用博來霉素或腐草霉素處理90分鐘。成功的編輯產(chǎn)生GFP熒光。使用Attune Acoustic Focusing Cytometer定量發(fā)熒光的原生質(zhì)體。

圖20示出在GRON遞送至BFP轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體中、從而靶向從BFP至GFP的轉(zhuǎn)化之后五天所轉(zhuǎn)化的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì)胞。綠色熒光指示BFP-GFP編輯。A亮視野圖像；B，呈藍(lán)光的同一視場。誤差線是s.e.m.(n＝4)；(CG2)：BFP反義41nb 3PS修飾的；(CG12)BFP反義41nb 3PS修飾的非靶向。用ImageXpress Micro系統(tǒng)(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)獲得圖像，比例尺＝20μm

圖21示出CRISPR-Cas和TALEN設(shè)計(jì)。21A：CRISPR-Cas質(zhì)粒的示意圖。甘露堿合酶(Mas)啟動子驅(qū)動為針對高等植物優(yōu)化的密碼子的Cas9基因的轉(zhuǎn)錄。Cas9基因包含在所述基因的任一端處的兩個SV40核定位信號(NLS)以及2X FLAG表位標(biāo)簽。擬南芥U6啟動子驅(qū)動gRNA骨架的轉(zhuǎn)錄并且轉(zhuǎn)錄使用poly(T)信號終止。21B：TALEN質(zhì)粒的示意圖。Mas啟動子驅(qū)動用2A核糖體跳過序列連接在一起的右和左tale臂的轉(zhuǎn)錄。Fok1核酸內(nèi)切酶連接至每個Tale臂的3’端。左tale的5’端包含核定位信號(NLS)和V5表位標(biāo)簽。rbcT是豌豆RBCSE9基因終止子。

圖22示出BFP和EPSPS核酸酶靶區(qū)域。a，CRISPR-Cas原型間隔區(qū)BC-1、BC-2和BC-3的BFP基因靶區(qū)域以及TALEN BT-1，左和右tale臂。PAM序列以紅色示出。TALEN結(jié)合位點(diǎn)呈粗體且加下劃線。BFP至GFP編輯CAC→TAC(H66Y)的位點(diǎn)呈綠色粗體。b，TALEN、LuET-1、左和右tale臂的EPSPS基因靶區(qū)域。EPSPS轉(zhuǎn)化的位點(diǎn)ACA>ATA和CCG>GCG(T97I和P101A)是綠色。

圖23示出大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides)(大穗看麥娘(blackgrass))ACC酶基因產(chǎn)物的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。

圖24示出大腸桿菌EPSPS基因產(chǎn)物的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。

圖25示出示例性類似EPSPS位置。

圖26示出示例性ACC酶序列。

詳述

通過寡核苷酸介導(dǎo)的靶向遺傳修飾是用于DNA的短鏈段的特異性改變以產(chǎn)生缺失、短插入和點(diǎn)突變的有價(jià)值的技術(shù)。這些方法涉及DNA配對/退火，接著DNA修復(fù)/重組事件。首先，核酸在由細(xì)胞蛋白質(zhì)因子介導(dǎo)的過程中與雙鏈DNA中的其互補(bǔ)鏈退火。這種退火產(chǎn)生位于中心的錯配堿基對(在點(diǎn)突變的情況下)，從而導(dǎo)致最可能刺激內(nèi)源性蛋白質(zhì)機(jī)器以起始修復(fù)過程的第二階段的結(jié)構(gòu)微擾：染色體序列和/或細(xì)胞器中(例如，線粒體和葉綠體)的位點(diǎn)特異性修飾。這種新引入的錯配誘導(dǎo)DNA修復(fù)機(jī)器進(jìn)行第二修復(fù)事件，從而導(dǎo)致靶位點(diǎn)的最終修改。本文公開的各種方面和實(shí)施方案中的本發(fā)明方法和組合物可通過提供創(chuàng)新穎方法來改進(jìn)所述方法，所述方法增加DNA修復(fù)組分的可用性，從而提高對靶核酸的基因修復(fù)介導(dǎo)的修飾的效率和可再現(xiàn)性。

用于位點(diǎn)定向基因組修飾的有效方法對于研究且、臨床基因療法、工業(yè)微生物學(xué)和農(nóng)業(yè)來說是合乎需要的。一種方法利用三鏈體形成寡核苷酸(TFO)，所述寡核苷酸以序列特異性方式結(jié)合雙鏈DNA作為第三鏈以介導(dǎo)定向誘變。這種TFO可通過遞送鍵結(jié)誘變劑如補(bǔ)骨脂素或苯丁酸氮芥(Havre等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.90:7879-7883,1993；Havre等,J Virol 67:7323-7331,1993；Wang等,Mol Cell Biol 15:1759-1768,1995；Takasugi等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.88:5602-5606,1991；Belousov等,Nucleic Acids Res 25:3440-3444,1997)或通過以足夠親和力結(jié)合以引起易錯修復(fù)(Wang等,Science 271:802-805,1996)來作用。

用于基因組修飾的另一策略涉及誘導(dǎo)外源性DNA片段與靶基因之間的同源重組。這種方法已經(jīng)成功地用于靶向并破壞哺乳動物中的選定基因并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)攜帶特異性基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生(Capeechi等,Science 244:1288-1292,1989；Wagner，美國專利號4,873,191)。這種方法涉及轉(zhuǎn)移選擇性標(biāo)記物以允許所需重組體的分離。在無選擇的情況下，典型基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染的DNA的同源與非同源整合的比例較低，通常在1:1000或更小的范圍內(nèi)(Sedivy等,Gene Targeting,W.H.Freeman and Co.,New York,1992)。同源整合的這種低效率限制基因轉(zhuǎn)移用于實(shí)驗(yàn)用途或基因療法的效用。同源重組的頻率可通過對來自UV照射和選定致癌物的靶位點(diǎn)的損傷(Wang等,Mol Cell Biol 8:196-202,1988)以及通過位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶(Sedivy等,Gene Targeting,W.H.Freeman and Co.,New York,1992；Rouet等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.91:6064-6068,1994；Segal等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.92:806-810,1995)來增強(qiáng)。此外，由三鏈體定向補(bǔ)骨脂素光加成物誘導(dǎo)的DNA損傷能夠刺激染色體外載體之內(nèi)和之間的重組(Segal等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.92:806-810,1995；Faruqi等,Mol Cell Biol 16:6820-6828,1996；Glazer，美國專利號5,962,426)。

線性供體片段比其環(huán)狀對應(yīng)物重組發(fā)生更強(qiáng)(Folger等,Mol Cell Biol 2:1372-1387,1982)。重組在某些實(shí)施方案中還可受供體與靶部位兩者之間的不間斷同源性的長度影響，其中較短片段常常似乎是對于重組的無效底物(Rubnitz等,Mol Cell Biol 4:2253-2258,1984)。盡管如此，使用DNA或DNA/RNA雜合體的短片段用于基因校正仍然是各種策略的重點(diǎn)。(Kunzelmann等,Gene Ther 3:859-867,1996)。

如本文所用的“核酸序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸以及其片段或部分，并且是指基因組或合成來源的DNA或RNA，其可以是單鏈或雙鏈的并且表示有義鏈或反義鏈。

如本文所用，術(shù)語“寡核苷酸”和“寡聚物”是指至少約10個核堿基以及多達(dá)約1000個核堿基的聚合物。

如本文所用的術(shù)語“DNA修飾分子”和“DNA修飾試劑”是指能夠識別且特異性地結(jié)合細(xì)胞基因組中的核酸序列并且能夠修飾基因組內(nèi)的靶核苷酸序列的分子，其中DNA修飾分子識別和特異性結(jié)合核酸序列是蛋白質(zhì)獨(dú)立性的。如本文結(jié)合DNA修飾分子所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)獨(dú)立性的”意指DNA修飾分子不需要蛋白質(zhì)和/或酶的存在和/或活性來用于識別和/或特異性地結(jié)合核酸序列。DNA修飾分子舉例說明但不限于三鏈體形成寡核苷酸、肽核酸、聚酰胺和寡核苷酸，其意圖促進(jìn)基因轉(zhuǎn)換。本公開的DNA修飾分子在某些實(shí)施方案中與用于同源重組的現(xiàn)有技術(shù)核酸序列(Wong和Capecchi,Molec.Cell.Biol.7:2294-2295,1987)的區(qū)別在于用于同源重組的現(xiàn)有技術(shù)核酸序列是蛋白質(zhì)依賴性的。如本文結(jié)合分子所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)依賴性的”意指分子需要蛋白質(zhì)和/或酶的存在和/或活性來用于分子對核酸序列的識別和/或特異性地結(jié)合。用于確定DNA修飾分子是否需要蛋白質(zhì)和/或酶的存在和/或活性來識別和/或特異性地結(jié)合核酸序列的方法在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)(參見例如，Dennis等Nucl.Acids Res.27:4734-4742,1999)。例如，DNA修飾分子可在不存在任何蛋白質(zhì)和/或酶的情況下在體外與核酸序列一起孵育。DNA修飾分子與核酸序列之間的特異性結(jié)合的檢測證明DNA修飾分子是蛋白質(zhì)獨(dú)立性的。另一方面，DNA修飾分子與核酸序列之間的特異性結(jié)合的不存在證明DNA修飾分子是蛋白質(zhì)依賴性的和/或需要另外的因子。

“三鏈體形成寡核苷酸”(TFO)被定義為能夠結(jié)合在雙鏈DNA或RNA螺旋的大溝中以形成三螺旋的DNA或RNA的序列。雖然TFO不限于任何具體長度，但TFO的優(yōu)選長度是250個核苷酸或更少、200個核苷酸或更少、或100個核苷酸或更少、或5至50個核苷酸或10至25個核苷酸或15至25個核苷酸。雖然TFO與雙鏈DNA之間的序列特異性程度對于三螺旋的形成來說是必要的，但不需要特定特異性程度，只要三螺旋能夠形成即可。同樣，不需要TFO與雙螺旋之間的特定親合力或親和力程度，只要三螺旋能夠形成即可。雖然不意圖限制在一個實(shí)施方案中TFO所特異性地結(jié)合的核苷酸序列的長度，但TFO所特異性結(jié)合的核苷酸序列是1至100、在一些實(shí)施方案中5至50、在其他實(shí)施方案中10至25且在其他實(shí)施方案中15至25個核苷酸。此外，“三螺旋”被定義為具有結(jié)合至雙螺旋核酸內(nèi)的靶序列的寡核苷酸的雙螺旋核酸?！半p螺旋”核酸可以是任何雙鏈核酸，包括雙鏈DNA、雙鏈RNA和DNA與RNA的混合雙鏈。雙鏈核酸不限于任何具體長度。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，它具有大于500bp、在一些實(shí)施方案中大于1kb且在一些實(shí)施方案中大于約5kb的長度。在許多應(yīng)用中，雙螺旋核酸是細(xì)胞、基因組核酸。三鏈體形成寡核苷酸可以平行或反平行方式結(jié)合靶序列。

“肽核酸”、“聚酰胺”或“PNA”是其中磷酸主鏈被基于N-氨基乙基甘氨酸的聚酰胺結(jié)構(gòu)置換的核酸。PNA具有比遵循沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對規(guī)則的其天然對應(yīng)物對于互補(bǔ)核酸的更高親和力。PNA可形成具有以下化學(xué)計(jì)量學(xué)的DNA的高度穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)：(PNA)2.DNA。雖然肽核酸和聚酰胺不限于任何具體長度，但肽核酸和聚酰胺的優(yōu)選長度是200個核苷酸或更少，在一些實(shí)施方案中100個核苷酸或更少，且在一些實(shí)施方案中5至50個核苷酸長。雖然不意圖限制在一個實(shí)施方案中肽核酸和聚酰胺所特異性地結(jié)合的核苷酸序列的長度，但肽核酸和聚酰胺所特異性地結(jié)合的核苷酸序列是1至100、在一些實(shí)施方案中5至50、在其他實(shí)施方案中5至25且在其他實(shí)施方案中5至20個核苷酸。

術(shù)語“細(xì)胞(cell)”是指單個細(xì)胞。術(shù)語“細(xì)胞(cells)”是指細(xì)胞的群體。群體可以是包含一種細(xì)胞類型的純?nèi)后w。同樣，群體可包含多于一種細(xì)胞類型。在本公開中，關(guān)于細(xì)胞群體可包含的細(xì)胞類型的數(shù)目不存在限制。如本文所用的細(xì)胞包括但不限于植物愈傷組織細(xì)胞、有或無細(xì)胞壁的細(xì)胞、原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。

當(dāng)提及細(xì)胞的樣品時術(shù)語“同步”或“同步的”，或“同步細(xì)胞”或“同步細(xì)胞群體”是指已經(jīng)處理以引起細(xì)胞群體處于細(xì)胞周期的同一階段的多個細(xì)胞。樣品中的所有細(xì)胞不必要是同步的。一小部分細(xì)胞可能不與樣品中的大多數(shù)細(xì)胞同步。同步細(xì)胞的優(yōu)選范圍是10％-100％之間。更優(yōu)選的范圍是30％-100％之間。此外，細(xì)胞不必是單一細(xì)胞類型的純?nèi)后w。多于一種細(xì)胞類型可包含于樣品中。在此方面，如與樣品中的另一種細(xì)胞類型相比，僅一種細(xì)胞類型可同步或可處于細(xì)胞周期的不同階段。

當(dāng)提及單個細(xì)胞時術(shù)語“同步細(xì)胞”意指細(xì)胞已進(jìn)行操作以使得其處于與在操作之前細(xì)胞的細(xì)胞周期階段不同的細(xì)胞周期階段?；蛘?，“同步細(xì)胞”是指已進(jìn)行操作以在與對照細(xì)胞(例如，不存在操作的細(xì)胞)相比時改變(即，增加或減少)在操作之前細(xì)胞所處的細(xì)胞周期階段的持續(xù)時間。

術(shù)語“細(xì)胞周期”是指當(dāng)分裂(即增殖)時細(xì)胞所經(jīng)歷的變化的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)進(jìn)展。細(xì)胞周期通常被認(rèn)為包括被稱為“間期”、“前期”、“中期”、“后期”和“末期”的階段。此外，細(xì)胞周期的部分可被稱為“M(有絲分裂)”、“S(合成)”、“G0”、“G1(間隙1期)”和“G2(間隙2期)”。此外，細(xì)胞周期包括以上所述階段中間的進(jìn)展時期。

術(shù)語“細(xì)胞周期抑制”是指細(xì)胞或細(xì)胞群體中細(xì)胞周期進(jìn)展的終止。細(xì)胞周期抑制通常通過使細(xì)胞暴露于干擾細(xì)胞生理學(xué)的方面以防止細(xì)胞周期繼續(xù)的藥劑(化學(xué)的、蛋白質(zhì)的或其他)來誘導(dǎo)。

“增殖”或“細(xì)胞生長”是指親本細(xì)胞重復(fù)地分裂成兩個子代細(xì)胞、從而導(dǎo)致群體中細(xì)胞的總體增加的能力。細(xì)胞群體可處于生物體或培養(yǎng)設(shè)備中。

術(shù)語“能夠修飾DNA”或“DNA修飾方式”是指具有誘導(dǎo)或能夠幫助誘導(dǎo)DNA的靶向區(qū)段的核苷酸序列的變化的工序以及內(nèi)源性或外源性藥劑或試劑。這類變化可通過基于靶向DNA區(qū)段一個或多個的缺失、添加或取代來進(jìn)行。DNA序列變化不必賦予由靶向序列編碼的任何基因的功能性變化。此外，DNA的變化不必對任何特定部分或百分比的細(xì)胞進(jìn)行。

術(shù)語“目標(biāo)核苷酸序列”是指任何核苷酸序列，所述核苷酸序列的操作可出于任何原因由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)為是合乎需要的。這類核苷酸序列包括但不限于結(jié)構(gòu)基因(例如，報(bào)道基因、選擇性標(biāo)志物基因、致癌基因、耐藥基因、生長因子等)的編碼序列以及不編碼mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的非編碼調(diào)控序列(例如，啟動子序列、增強(qiáng)子序列、聚腺苷酸化序列、終止序列、調(diào)控RNA如miRNA等)。

“氨基酸序列”、“多肽序列”、“肽序列”和“肽”在本文中可互換使用來指代氨基酸的序列。

如本文所用的“靶序列”是指包含長度大于8個核苷酸但長度少于201個核苷酸的序列的雙螺旋核酸。在一些實(shí)施方案中，靶序列在8至30個堿基之間。一般來說，靶序列由雙螺旋核酸上的鏈之一上的核苷酸序列限定。

如本文所用，當(dāng)提及雙螺旋核酸序列的鏈之一上的核苷酸序列時，“富含嘌呤的序列”或“多嘌呤序列”被定義為核苷酸的連續(xù)序列，其中靶序列的多于50％的核苷酸包含嘌呤堿基。然而，優(yōu)選的是，富含嘌呤的靶序列含有多于60％的嘌呤核苷酸，在一些實(shí)施方案中多于75％的嘌呤核苷酸，在其他實(shí)施方案中多于90％的嘌呤核苷酸且在其他實(shí)施方案中100％嘌呤核苷酸。

如本文所用，當(dāng)提及雙螺旋核酸序列的鏈之一上的核苷酸序列時，“富含嘧啶的序列”或“多嘧啶序列”被定義為核苷酸的連續(xù)序列，其中靶序列的多于50％的核苷酸包含嘧啶堿基。然而，優(yōu)選的是，富含嘧啶的靶序列含有多于60％的嘧啶核苷酸，且在一些實(shí)施方案中多于75％的嘧啶核苷酸。在一些實(shí)施方案中，序列含有多于90％的嘧啶核苷酸并且在其他實(shí)施方案中100％的嘧啶核苷酸。

第一核苷酸序列的“變體”被定義為與所述第一核苷酸序列不同的核苷酸序列(例如，通過具有可使用雜交測定或使用DNA測序檢測的一個或多個缺失、插入或取代)。檢測第一核苷酸序列的基因組序列的改變或修飾包括在此定義內(nèi)。例如，雜交測定可用于檢測：(1)當(dāng)包含在基因組中時能夠與第一核苷酸序列雜交的限制酶片段的模式的改變(即，RFLP分析)，(2)第一核苷酸序列的選定部分不能與含有第一核苷酸序列的基因組DNA的樣品雜交(例如，使用等位基因特異性寡核苷酸探針)，(3)不適當(dāng)或出人意料的雜交，如與除第一核苷酸序列的正常染色體基因座之外的基因座雜交(例如，使用熒光原位雜交法(FISH)用于中期染色體播散等)。變體的一個實(shí)例是突變的野生型序列。

如本文所用的術(shù)語“核酸”和“未修飾的核酸”是指已知的四種脫氧核糖核酸堿基(即鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)中的任一種。術(shù)語“修飾的核酸”是指其結(jié)構(gòu)相對于未修飾的核酸的結(jié)構(gòu)改變的核酸。這類修飾的示例性將是堿基的置換共價(jià)修飾，如氨基和環(huán)氮的烷基化以及雙鍵的飽和。

如本文所用，當(dāng)用于提及核酸序列時術(shù)語“突變”和“修飾”以及其語法等效物可互換地用來指代缺失、插入、取代、鏈斷裂和/或加合物的引入?！叭笔А北欢x為其中一個或多個核苷酸不存在的核酸序列的變化。“插入”或“添加”是已經(jīng)導(dǎo)致添加一個或多個核苷酸的核酸序列的變化?！叭〈庇梢粋€或多個核苷酸被為與所置換的一個或多個核苷酸不同的分子的分子置換引起。例如，核酸可被不同的核酸置換，如通過胸腺嘧啶被胞嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤或尿苷置換來舉例說明。嘧啶至嘧啶(例如，C至T或T至C核苷酸取代)或嘌呤至嘌呤(例如，G至A或A至G核苷酸取代)被稱為轉(zhuǎn)換，而嘧啶至嘌呤或嘌呤至嘧啶(例如G至T或G至C或A至T或A至C)被稱為顛換。或者，核酸可被修飾的核酸置換，如通過胸腺嘧啶被胸腺嘧啶乙二醇置換來舉例說明。突變可導(dǎo)致錯配。術(shù)語“錯配”是指兩個核酸之間的非共價(jià)相互作用，每個核酸駐留在不同的多核酸序列上，所述核酸不遵循堿基配對規(guī)則。例如，對于部分互補(bǔ)的序列5′-AGT-3′和5′-AAT-3′來說，存在G-A錯配(轉(zhuǎn)換)。術(shù)語“加合物的引入”或“加合物形成”是指分子與DNA序列中的一個或多個核苷酸的共價(jià)或非共價(jià)鍵聯(lián)以使得所述鍵聯(lián)導(dǎo)致DNA復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄水平的降低(在一些實(shí)施方案中從10％至100％，在其他實(shí)施方案中從50％至100％，且在一些實(shí)施方案中從75％至100％)。

術(shù)語“DNA切割體”是指實(shí)現(xiàn)鏈斷裂的部分。非限制性實(shí)例包括大范圍核酸酶、TALE/TALEN、抗生素、鋅指以及CRISPR或CRISPR/cas系統(tǒng)。

當(dāng)提及雙鏈核酸序列時術(shù)語“鏈斷裂”包括單鏈斷裂和/或雙鏈斷裂。單鏈斷裂(缺口)是指雙鏈核酸序列的兩條鏈之一中的中斷。這與雙鏈斷裂形成對比，雙鏈斷裂是指雙鏈核酸序列的兩條鏈中的中斷，其可產(chǎn)生平末端或交錯末端。鏈斷裂可直接地(例如，通過電離輻射或用某些化學(xué)品處理)或間接地(例如，通過在核酸堿基處的酶切割)引入至雙鏈核酸序列中。

術(shù)語“突變細(xì)胞”和“修飾的細(xì)胞"是指在細(xì)胞的基因組序列中含有至少一種修飾的細(xì)胞。

當(dāng)用于提及核苷酸序列時術(shù)語“部分”是指所述核苷酸序列的片段。所述片段大小在5個核苷酸殘基至整個核苷酸序列減去一個核酸殘基的范圍內(nèi)。

DNA分子被說成具有“5′端”和“3′端”，因?yàn)閱魏塑账嵋允沟靡粋€單核苷酸戊糖環(huán)的5′磷酸通過磷酸二酯鍵聯(lián)連接至在一個方向上的其鄰居的3′氧的方式反應(yīng)以制備寡核苷酸。因此，如果寡核苷酸的5′磷酸未連接至單核苷酸戊糖環(huán)的3′氧，則寡核苷酸的那端被稱為“5′端”。如果寡核苷酸的3′氧未連接至另一個單核苷酸戊糖環(huán)的5′磷酸，則寡核苷酸的那端被稱為“3′端”。如本文所用，即使在較大寡核苷酸內(nèi)部，核酸序列也可被稱為具有5′端和3′端。在線性或環(huán)狀DNA分子中，離散元件被稱為在5′元件或3′元件的“上游”或“下游”。此術(shù)語反映轉(zhuǎn)錄沿DNA鏈在5′至3′方向上進(jìn)行。引導(dǎo)所連接的基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強(qiáng)子元件通過位于編碼區(qū)的5′或上游。然而，增強(qiáng)子元件即使在位于啟動子元件和編碼區(qū)的3′時也可施加其作用。轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化信號位于編碼區(qū)的3′或下游。

如本文所用的術(shù)語“重組DNA分子”是指通過分子生物學(xué)技術(shù)連接在一起的DNA區(qū)段構(gòu)成的DNA分子。

如本文所用的術(shù)語“重組蛋白”或“重組多肽”是指使用重組DNA分子表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。

如本文所用，術(shù)語“載體”和“媒介物”可互換用于指將DNA區(qū)段從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)胞的核酸分子。

如本文所用的術(shù)語“處于可操作的組合中”、“處于可操作的順序”以及“可操作地連接”是指核酸序列的鍵聯(lián)處于這種方式，所述方式使得產(chǎn)生能夠引導(dǎo)給定基因的轉(zhuǎn)錄和/或所需蛋白質(zhì)分子的合成的核酸分子。所述術(shù)語還指氨基酸序列的鍵聯(lián)處于這種方式，所述方式使得產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。

如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指將外來DNA引入至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染可通過本領(lǐng)域已知的各種方式來完成，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑、原生質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、基因槍(即，粒子轟擊)等等。

如本文所用，術(shù)語“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”用于指通過堿基配對規(guī)則相關(guān)的“多核苷酸”和“寡核苷酸”(其是指核苷酸序列的可互換的術(shù)語)。例如，序列“5′-CAGT-3′”與序列“5′-ACTG-3′”互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分的“或”全部”?！安糠帧被パa(bǔ)性是其中一個或多個核酸堿基根據(jù)堿基配對規(guī)則不匹配。核酸之間的“全部”或“完全”互補(bǔ)性是其中每一個核酸堿基在堿基配對規(guī)則下與另一堿基匹配。核酸鏈之間的互補(bǔ)性程度可對核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有重要作用。這在擴(kuò)增反應(yīng)以及依賴于核酸之間的結(jié)合的檢測方法中可能具有特殊重要性。為方便起見，術(shù)語“多核苷酸”和“寡核苷酸”包括包含核苷的分子。

如本文所用關(guān)于核苷酸序列的術(shù)語“同源性”和“同源的”是指與其他核苷酸序列的互補(bǔ)性程度?？纱嬖诓糠滞葱曰蛲耆葱?即，同一性)。當(dāng)關(guān)于雙鏈核酸序列如cDNA或基因組克隆使用時，術(shù)語“基本上同源”是指能夠在如上所述的低嚴(yán)格度條件下與雙鏈核酸序列的任一鏈或兩個鏈雜交的任何核酸序列(例如，探針)。與核酸序列部分互補(bǔ)，即“基本上同源”的核苷酸序列是至少部分地抑制完全互補(bǔ)的序列與靶核酸序列的雜交的核苷酸序列。完全互補(bǔ)核酸序列與靶序列的雜交的抑制可使用雜交測定(DNA印跡或RNA印跡、溶液雜交等)在低嚴(yán)格度條件下來檢查。基本上同源的序列或探針將在低嚴(yán)格度條件下競爭并且抑制完全同源序列與靶序列的結(jié)合(即，雜交)。這并不是說低嚴(yán)格度條件使得允許非特異性結(jié)合，因?yàn)榈蛧?yán)格度條件要求兩個序列彼此的結(jié)合是特異性(即，選擇性)相互作用。不存在非特異性結(jié)合可通過使用缺乏甚至部分互補(bǔ)性程度(例如，小于約30％同一性)的第二靶序列來測試；在不存在非特異性結(jié)合的情況下，探針將不與第二非互補(bǔ)靶標(biāo)雜交。

低嚴(yán)格度條件包括等效于以下的條件：在68℃下在由以下組成的溶液中結(jié)合或雜交：5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH₂PO₄·H₂O和1.85g/l EDTA，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.4)、0.1％SDS、5×登哈特氏試劑(50×登哈特氏含有每500ml：5g Ficoll(400型，Pharmacia)、5g BSA(級分V；Sigma))和100μg/ml變性的鮭魚精子DNA，接著當(dāng)采用長度為約100至約1000個核苷酸的探針時在室溫下在包含2.0×SSPE、0.1％SDS的溶液中洗滌。

此外，促進(jìn)在高嚴(yán)格度條件下雜交(例如，增加雜交和/或洗滌步驟的溫度，在雜交溶液中使用甲酰胺等)的條件是本領(lǐng)域中熟知的。當(dāng)關(guān)于核酸雜交使用時，高嚴(yán)格度條件包括等效于以下的條件：在68℃下在由以下組成的溶液中結(jié)合或雜交：5×SSPE、1％SDS、5×登哈特氏試劑和100μg/ml變性的鮭魚精子DNA，接著當(dāng)采用長度為約100至約1000個核苷酸的探針時在68℃下在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗滌。

本領(lǐng)域中熟知多種等效條件可用于包括低嚴(yán)格度條件；可改變因素如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶標(biāo)的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成，存在于溶液中或固定的等)以及鹽和其他組分的濃度(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)以及雜交溶液的組分以產(chǎn)生不同于但等效于上文列舉的條件的低嚴(yán)格度雜交條件。

當(dāng)在涉及目標(biāo)雜交條件時提及雜交條件時，術(shù)語“等效”意指雜交條件和目標(biāo)雜交條件導(dǎo)致具有相同范圍的同源性百分比(％)的核酸序列的雜交。例如，如果目標(biāo)雜交條件導(dǎo)致第一核酸序列與具有與所述第一核酸序列50％至70％同源性的其他核酸序列的雜交，那么另一種雜交條件在以下情況下被說成等效于所述目標(biāo)雜交條件：此另一雜交條件也導(dǎo)致所述第一核酸序列與具有與所述第一核酸序列50％至70％同源性的其他核酸序列的雜交。

如本文所用，術(shù)語“雜交”用于指使用任何方法進(jìn)行互補(bǔ)核酸的配對，通過所述方法核酸的一條鏈通過堿基配對與互補(bǔ)鏈連接以形成雜交復(fù)合物。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，核酸之間的締合強(qiáng)度)受這類因素如核酸之間的互補(bǔ)性程度、所涉及的條件的嚴(yán)格度、所形成的雜合體的Tm以及核酸內(nèi)的G:C比例影響。

如本文所用，術(shù)語“雜交復(fù)合物”是指通過在互補(bǔ)G和C堿基之間和互補(bǔ)A和T堿基之間形成氫鍵在兩個核酸序列之間形成的復(fù)合物；這些氫鍵可通過堿基堆疊相互作用進(jìn)一步穩(wěn)定。兩個互補(bǔ)核酸序列氫鍵呈反平行構(gòu)型。雜交復(fù)合物可在溶液中(例如，科特(Cot)或羅特(Rot)分析)或在存在于溶液中的一個核酸序列與固定至固相支持體(例如，如用于DNA印跡和RNA印跡、斑點(diǎn)印跡中的尼龍膜或硝基纖維素濾膜，或如用于原位雜交、包括FISH(熒光原位雜交)中的載玻片)的另一個核酸序列之間形成。

如本文所用，術(shù)語“Tm”用于指“解鏈溫度”。解鏈溫度是雙鏈核酸分子的群體變成半數(shù)解離成單個鏈的溫度。用于計(jì)算核酸的Tm的等式是本領(lǐng)域中熟知的。如由標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所指示，Tm值的簡單估算可通過以下等式計(jì)算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，當(dāng)核酸處于1M NaCl下的水溶液中時(參見，例如Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,in Nucleic Acid Hybridization,1985)。其他參考文獻(xiàn)包括更復(fù)雜的計(jì)算，所述計(jì)算將結(jié)構(gòu)以及序列特征考慮在內(nèi)用于計(jì)算Tm。

如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)格度”用于指進(jìn)行核酸雜交的溫度條件、離子強(qiáng)度和其他化合物如有機(jī)溶劑的存在。“嚴(yán)格度”通常在約Tm-5℃(低于探針的熔解溫度5℃)到低于Tm約20℃至25℃的范圍內(nèi)發(fā)生。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解，嚴(yán)格雜交可用于鑒別或檢測相同的多核苷酸序列或用于鑒別或檢測類似或相關(guān)的多核苷酸序列。

當(dāng)提及第一核苷酸序列與第二核苷酸序列的結(jié)合時，術(shù)語“特異性結(jié)合”、“結(jié)合特異性”以及其語法等效物是指相較于所述第二核苷酸序列與第三核苷酸序列之間的相互作用，所述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間的優(yōu)先相互作用。特異性結(jié)合時不要求絕對結(jié)合特異性的相關(guān)術(shù)語；換言之，術(shù)語“特異性結(jié)合”不要求所述第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列在不存在所述第二核苷酸序列和第三核苷酸序列的相互作用的情況下相互作用。而是，所述第一核苷酸序列與所述第二核苷酸序列之間的相互作用水平足夠大于所述第二核苷酸序列與所述第三核苷酸序列之間的相互作用水平。第一核苷酸序列與第二核苷酸序列的“特異性結(jié)合”還意指所述第一核苷酸序列與所述第二核苷酸序列之間的相互作用依賴于所述第一核苷酸序列之上或之內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)的存在；換言之，所述第二核苷酸序列識別且結(jié)合所述第一核苷酸序列之上或之內(nèi)的特異性結(jié)構(gòu)而不是總體上結(jié)合核酸或結(jié)合核苷酸序列。例如，如果第二核苷酸序列對于第一核苷酸序列之上或之內(nèi)的結(jié)構(gòu)“A”具有特異性，則含有結(jié)構(gòu)A的第三核酸序列的存在將減少結(jié)合至第一核苷酸序列的第二核苷酸序列的量。

如本文所用，術(shù)語“可擴(kuò)增的核酸”用于指可通過任何擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸?？紤]“可擴(kuò)增的核酸”通常將包括“樣品模板”。

術(shù)語“異源核酸序列”或“異源DNA”可互換地用于指連接至核酸序列的核苷酸序列，在自然中所述核苷酸不與所述核酸序列連接或在自然中所述核苷酸序列與所述核酸序列在不同位置連接。異源DNA對于其所引入的細(xì)胞不是內(nèi)源的，而是獲自另一細(xì)胞。通常但不是必須地，這種異源DNA編碼通常不由表達(dá)其的細(xì)胞產(chǎn)生的RNA和蛋白質(zhì)。異源DNA的實(shí)例包括報(bào)道基因、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、選擇性標(biāo)志物蛋白(例如，賦予耐藥性的蛋白質(zhì))等。

“擴(kuò)增”被定義為產(chǎn)生核酸序列的另外拷貝，并且通常使用本領(lǐng)域中熟知的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)來進(jìn)行(Dieffenbach C W和G S Dveksler(1995)PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.)。如本文所用，術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCR”)是指特此以引用的方式并入的K.B.Mullis美國專利號4,683,195和4,683,202的方法，所述專利描述用于在無克隆或純化的情況下增加基因組DNA的混合物中靶序列的區(qū)段濃度的方法。所需靶序列的擴(kuò)增區(qū)段的長度由兩個寡核苷酸引物相對于彼此的相對位置決定，并且因此此長度是可控制的參數(shù)。通過所述方法的重復(fù)方面，所述方法被稱為“聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCR”)。因?yàn)榘行蛄械乃钄U(kuò)增區(qū)段變成混合物中的主要序列(就濃度而言)，所以它們被稱為“PCR擴(kuò)增的”。

使用PCR，有可能將基因組DNA中的特定靶序列的單個拷貝擴(kuò)增至可通過幾種不同方法(例如，與標(biāo)記的探針雜交；并入生物素化的引物，接著抗生物素蛋白-酶綴合物檢測；將32P標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸如dCTP或dATP并入至擴(kuò)增區(qū)段中)檢測的水平。除了基因組DNA之外，任何寡核苷酸序列可用適當(dāng)組的引物分子擴(kuò)增。具體地說，通過PCR方法本身產(chǎn)生的擴(kuò)增區(qū)段本身是用于后續(xù)PCR擴(kuò)增的有效模板。

這樣一種優(yōu)選的方法(特別是對于商業(yè)應(yīng)用來說)是基于廣泛使用的實(shí)時PCR技術(shù)，并且組合等位基因特異性PCR與阻斷劑(ASB-PCR)來抑制野生型等位基因的擴(kuò)增。ASB-PCR可用于檢測從任何類型的組織(包括福爾馬林固定的石蠟包埋的腫瘤標(biāo)本)提取的DNA或RNA中的種系或體細(xì)胞突變。發(fā)展了一組試劑設(shè)計(jì)規(guī)則，從而實(shí)現(xiàn)針對野生型等位基因的背景呈千倍或更大過量的單個點(diǎn)取代、插入或缺失的敏感性和選擇性檢測。(Morlan J,Baker J,Sinicropi D Mutation Detection by Real-Time PCR:A Simple,Robust and Highly Selective Method.PLoS ONE 4(2):e4584,2009)

術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)”和“RT-PCR”是指一種用于逆轉(zhuǎn)錄RNA序列以產(chǎn)生cDNA序列的混合物，接著在無克隆或純化的情況下增加所述混合物中所轉(zhuǎn)錄cDNA序列的所需區(qū)段的濃度的方法。通常，在使用兩種引物PCR擴(kuò)增所轉(zhuǎn)錄DNA的所需區(qū)段之前使用單個引物(例如，寡-dT引物)逆轉(zhuǎn)錄RNA。

如本文所用，術(shù)語“引物”是指無論是作為純化的限制性酶切消化物天然存在的還是合成產(chǎn)生的寡核苷酸，當(dāng)置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下(即，在核苷酸和誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶的存在下和在適合的溫度和pH下)時所述寡核苷酸能夠充當(dāng)合成起始點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，引物是單鏈的以獲得最大擴(kuò)增效率，但可替代地是雙鏈的。如果是雙鏈的，首先對引物進(jìn)行處理以在用于制備延伸產(chǎn)物之前分離其鏈。在一些實(shí)施方案中，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長以在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)生的合成。引物的確切長度將取決于許多因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。

如本文所用，術(shù)語“探針”是指無論是作為純化的限制性酶切消化物天然存在還是合成、重組或通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的寡核苷酸(即，核苷酸的序列)，所述寡核苷酸能夠與另一目標(biāo)寡核苷酸雜交。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針適用于特定基因序列的檢測、鑒別和分離?？紤]用于本公開的任何探針將用任何“報(bào)道分子”標(biāo)記，以使得它可在任何檢測系統(tǒng)中檢測，所述系統(tǒng)包括但不限于酶(例如，ELISA以及基于酶的組織化學(xué)測定)、熒光系統(tǒng)、放射性系統(tǒng)和發(fā)光系統(tǒng)。不意圖本發(fā)明限于任何特定檢測系統(tǒng)或標(biāo)記。

如本文所用，術(shù)語“限制性核酸內(nèi)切酶”和“限制酶”是指細(xì)菌酶，其各自在特異性核苷酸序列處或附近切割雙鏈或單鏈DNA或使其缺口，例如可使用IIS型限制性核酸內(nèi)切酶的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域(例如，F(xiàn)okI)，如由Kim等,1996,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,6:1 156-60)所教導(dǎo)。

如本文所用，術(shù)語“具有編碼基因的核苷酸序列的寡核苷酸”意指包含基因的編碼區(qū)的核酸序列，即編碼基因產(chǎn)物的核酸序列。編碼區(qū)可以cDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當(dāng)以DNA形式存在時，寡核苷酸可以是單鏈的(即，有義鏈)或雙鏈的。另外，如果需要允許正確起始初級RNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄和/或正確加工，“具有編碼基因的核苷酸序列的寡核苷酸”可包括適合的控制元件，如增強(qiáng)子、啟動子、剪接點(diǎn)、多腺苷酸化信號等。此外，本公開的編碼區(qū)可包含內(nèi)源性增強(qiáng)子、剪接點(diǎn)、插入序列、多腺苷酸化信號等。

真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄控制信號包含“增強(qiáng)子”元件。增強(qiáng)子包括與參與轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞蛋白質(zhì)特異性地相互作用的DNA序列的較短陣列(Maniatis,T.等,Science 236:1237,1987)。增強(qiáng)子元件已經(jīng)從多種真核細(xì)胞來源分離，包括植物、酵母、昆蟲和哺乳動物和細(xì)胞和病毒中的基因。特定增強(qiáng)子的選擇取決于將使用什么細(xì)胞類型來表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。

表達(dá)載體上“剪接信號”的存在經(jīng)常導(dǎo)致較高水平的重組轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。剪接信號介導(dǎo)從初級RNA轉(zhuǎn)錄物除去內(nèi)含子并且包括剪接供體和受體位點(diǎn)(Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,第16.7-16.8頁,1989)。通常使用的剪接供體和受體位點(diǎn)是來自SV40的16S RNA的剪接點(diǎn)。

真核細(xì)胞中重組DNA序列的有效表達(dá)需要表達(dá)引導(dǎo)所得到的轉(zhuǎn)錄物的有效終止和多腺苷酸化的信號。轉(zhuǎn)錄終止信號通常見于多腺苷酸化信號的下游并且長度是數(shù)百個核苷酸。如本文所用的術(shù)語“聚A位點(diǎn)”或“聚A序列”表示引導(dǎo)新生RNA轉(zhuǎn)錄物的終止和多腺苷酸化兩者的DNA序列。重組轉(zhuǎn)錄物的有效多腺苷酸化是合乎需要的，因?yàn)槿狈跘尾的轉(zhuǎn)錄物是不穩(wěn)定的且快速降解。表達(dá)載體中使用的聚A信號可以是“異源性的”或“內(nèi)源性的”。內(nèi)源性聚A信號是在基因組中給定基因的編碼區(qū)的3′端天然發(fā)現(xiàn)的聚A信號。異源性聚A信號是與一種基因分離且位于另一基因的3′的聚A信號。

如本文所用的術(shù)語“啟動子”、“啟動子元件”或“啟動子序列”是指當(dāng)置于寡核苷酸序列的5′端(即，在其前面)時能夠控制寡核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動子通常位于寡核苷酸序列的5′(即，上游)，其控制寡核苷酸轉(zhuǎn)錄成mRNA，并且提供用于由RNA聚合酶特異性結(jié)合和用于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)。

當(dāng)提及核酸序列時，術(shù)語“啟動子活性”是指核酸序列起始寡核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA的能力。

術(shù)語“組織特異性”在其應(yīng)用于啟動子時是指能夠在于不同類型的組織中寡核苷酸的表達(dá)的相對不存在下引導(dǎo)針對特定類型的組織選擇性表達(dá)相同寡核苷酸序列的啟動子。啟動子的組織特異性可通過以下方式來評估：例如，將報(bào)道基因可操作地連接至啟動子序列以產(chǎn)生報(bào)道基因構(gòu)建體，將所述報(bào)道基因構(gòu)建體引入至植物或動物的基因組中，以使得所述報(bào)道基因構(gòu)建體被整合至所得到的轉(zhuǎn)基因動物的每一組織中，并且檢測所述轉(zhuǎn)基因植物或動物的不同組織中報(bào)道基因的表達(dá)(例如，檢測mRNA、蛋白質(zhì)或由報(bào)道基因編碼的蛋白質(zhì)的活性)。選擇性不必是絕對的。在一種或多種組織中檢測到報(bào)道基因相對于在其他組織中報(bào)道基因的表達(dá)水平更高的表達(dá)水平表明啟動子對于其中檢測到更高表達(dá)水平的組織來說是特異性的。

術(shù)語“細(xì)胞類型特異性”在應(yīng)用于啟動子時是指能夠在于同一組織內(nèi)的不同細(xì)胞類型中寡核苷酸序列的表達(dá)的相對不存在下引導(dǎo)相同寡核苷酸序列在特定細(xì)胞類型中的選擇性表達(dá)的啟動子。術(shù)語“細(xì)胞類型特異性”當(dāng)應(yīng)用于啟動子時也意指能夠促進(jìn)寡核苷酸在單一組織內(nèi)的區(qū)域中的選擇性表達(dá)的啟動子。再次，選擇性不必是絕對的。啟動子的細(xì)胞類型特異性可使用本領(lǐng)域中熟知的方法來評定，例如，如本文所述的免疫組織化學(xué)染色。簡言之，將組織切片包埋于石蠟中，并且使石蠟切片與第一抗體反應(yīng)，所述第一抗體對由寡核苷酸序列編碼的多肽產(chǎn)物具有特異性，所述寡核苷酸序列的表達(dá)受啟動子控制。作為石蠟切片的替代方案，可將樣品冷凍切片。例如，可在切片之前或期間冷凍切片，從而避免殘余石蠟的潛在干擾。允許對第一抗體具有特異性的標(biāo)記的(例如，過氧化物酶綴合的)第二抗體結(jié)合切片的組織且通過顯微術(shù)檢測特異性結(jié)合(例如，用抗生物素蛋白/生物素)。

術(shù)語“選擇性表達(dá)”、“選擇性地表達(dá)"及其語法等效物是指在兩個或更多個目標(biāo)區(qū)域中相對表達(dá)水平的比較。例如，“選擇性表達(dá)”當(dāng)與組織結(jié)合使用時是指目標(biāo)基因在特定組織中或表達(dá)所述基因的細(xì)胞在所述組織內(nèi)分別與同一基因在另一組織中的表達(dá)水平和表達(dá)所述基因的細(xì)胞在另一組織中的數(shù)目相比基本上更高的表達(dá)水平或基本上更大的細(xì)胞數(shù)目(即，選擇性不必是絕對的)。選擇性表達(dá)不要求(但它可包括)目標(biāo)基因在特定組織中的表達(dá)和同一基因在另一組織中表達(dá)的總體不存在。類似地，如本文關(guān)于細(xì)胞類型所用的“選擇性表達(dá)”是指目標(biāo)基因在特定細(xì)胞類型中或表達(dá)所述基因的細(xì)胞在特定細(xì)胞類型中當(dāng)分別與所述基因在另一細(xì)胞類型中的表達(dá)水平或表達(dá)所述基因的細(xì)胞在另一細(xì)胞類型中的數(shù)目相比時基本上更高的表達(dá)水平或基本上更大的細(xì)胞數(shù)目。

當(dāng)關(guān)于兩個或更多個核苷酸序列使用時術(shù)語“連續(xù)的”意指核苷酸序列在不存在插入序列的情況下或在存在不包含一個或多個控制元件的插入序列的情況下串聯(lián)連接。

如本文所用，術(shù)語“編碼……的核酸分子”、“編碼……的核苷酸”、“編碼……的DNA序列”和“編碼……的DNA”是指沿著脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序確定沿著多肽(蛋白質(zhì))鏈的氨基酸順序。因此，DNA序列編碼氨基酸序列。

當(dāng)關(guān)于核酸使用時，術(shù)語“分離的”(如在“分離的寡核苷酸”中)是指在其天然來源中通常與之締合的至少一種污染物核酸分離的核酸序列。分離的核酸是以不同于在自然中發(fā)現(xiàn)它的形式或布置存在的核酸。相比之下，未分離的核酸是以它們存在于自然中的狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的核酸如DNA和RNA。例如，給定DNA序列(例如，基因)接近鄰近基因在宿主細(xì)胞染色體上發(fā)現(xiàn)；RNA序列如編碼特定蛋白質(zhì)的特異性mRNA序列在細(xì)胞中作為與編碼眾多蛋白質(zhì)的多種其他mRNA的混合物發(fā)現(xiàn)。然而，編碼目標(biāo)多肽的分離的核酸作為舉例包括通常表達(dá)目標(biāo)多肽的細(xì)胞中的核酸，其中所述核酸處于不同于天然細(xì)胞的核酸的染色體或染色體外位置中，或以另外的方式由與在自然中發(fā)現(xiàn)的不同的核酸序列側(cè)接。分離的核酸或寡核苷酸可以單鏈或雙鏈形式存在。分離的核酸可通過多種技術(shù)(例如雜交、斑點(diǎn)印跡等)容易地鑒別(如果需要)。當(dāng)分離的核酸或寡核苷酸待用于表達(dá)蛋白質(zhì)時，所述寡核苷酸將最低限度含有有義鏈或編碼鏈(即，寡核苷酸可以是單鏈的)?；蛘?，它可含有有義鏈和反義鏈(即，寡核苷酸可以是雙鏈的)。

如本文所用，術(shù)語“純化的”或“以純化”是指從樣品中除去一種或多種(不需要的)組分。例如，在重組多肽在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達(dá)的情況下，通過除去宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)純化多肽，從而增加重組多肽在所述樣品中的百分比。

如本文所用，術(shù)語“基本上純化的”是指從其天然環(huán)境中除去、分離或分開的并且至少60％不含、在一些實(shí)施方案中75％不含且其他實(shí)施方案90％不含與它們所天然締合的其他組分的分子(核酸或氨基酸序列)。因此“分離的多核苷酸”是基本上純化的多核苷酸。

如本文所用，當(dāng)關(guān)于結(jié)構(gòu)基因使用時術(shù)語“編碼區(qū)”是指編碼由于mRNA分子的翻譯而在初生多肽中發(fā)現(xiàn)的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中編碼區(qū)在5'側(cè)的邊界通常為編碼起始子甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”，而在3'側(cè)的邊界為規(guī)定終止密碼子的三個三聯(lián)體(即，TAA、TAG、TGA)之一。

“編碼序列”意指可轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生mRNA和/或多肽或其片段的核酸或其補(bǔ)體或其部分的序列。編碼序列包括基因組DNA或不成熟的初級RNA轉(zhuǎn)錄物中的外顯子，所述外顯子通過細(xì)胞的生物化學(xué)機(jī)器連接在一起以提供成熟的mRNA。反義鏈?zhǔn)沁@種核酸的補(bǔ)體，并且編碼序列可從其中推斷出。

“非編碼序列”意指不體內(nèi)轉(zhuǎn)錄成氨基酸或其中tRNA不相互作用以放置或試圖放置氨基酸的核酸或其補(bǔ)體或其部分的序列。非編碼序列包括基因組DNA或不成熟的初級RNA轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子序列和基因相關(guān)序列如啟動子、增強(qiáng)子、沉默子等兩者。

如本文所用，術(shù)語“結(jié)構(gòu)基因”或“結(jié)構(gòu)核苷酸序列”是指編碼RNA的DNA序列或不控制其他基因的表達(dá)的蛋白質(zhì)。相比之下，“調(diào)控基因”或“調(diào)控序列”是編碼控制其他基因的表達(dá)的產(chǎn)物(例如，轉(zhuǎn)錄因子)的結(jié)構(gòu)基因。

如本文所用，術(shù)語“調(diào)控元件”是指控制核酸序列的表達(dá)的一些方面的遺傳元件。例如，啟動子是有助于起始可操作地連接的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件。其他調(diào)控元件包括剪接信號、多腺苷酸化信號、終止信號等。

如本文所用，術(shù)語“肽轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)”或“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)”是指結(jié)合蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子并且從而控制核酸序列表達(dá)的一些方面的核苷酸序列。例如，Sp-1和AP1(激活蛋白1)結(jié)合位點(diǎn)是肽轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)例。

如本文所用，術(shù)語“基因”意指包含結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)的脫氧核糖核苷酸序列?！盎颉边€可包括在5'端和3'端兩者上與編碼區(qū)相鄰定位的非翻譯序列，以使得所述基因?qū)?yīng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)的5'且存在于mRNA上的序列被稱為5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3'或下游且存在于mRNA上的序列被稱為3'非翻譯序列。術(shù)語“基因”涵蓋基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有以被稱為“內(nèi)含子”或“插入?yún)^(qū)域”或“插入序列”的非編碼序列來間斷的編碼區(qū)域。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄至異源核RNA(hnRNA)中的基因區(qū)段；內(nèi)含子可含有調(diào)控元件如增強(qiáng)子。內(nèi)含子從核或初級轉(zhuǎn)錄物中除去或“剪除”；因此，內(nèi)含子不存在于信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中。mRNA在翻譯期間起作用以指定新生多肽中的氨基酸的序列或順序?；蛲ǔＪ菃蝹€基因座。在正常二倍體生物種，基因具有兩個等位基因。然而在，在四倍體土豆中，每個基因具有4個等位基因。在為十二倍體的甘蔗中，可存在12個等位基因/基因。具體實(shí)例包括亞麻，其具有兩個具有兩個等位基因的EPSPS基因座；以及水稻，其具有單個具有兩個等位基因的同聚質(zhì)體ACC酶。

除了含有內(nèi)含子以外，基因的基因組形式還可包括位于RNA轉(zhuǎn)錄物上存在的序列的5'和3'端上的序列。這些序列被稱為“側(cè)接”序列或區(qū)域(這些側(cè)接序列位于存在于mRNA轉(zhuǎn)錄物上的非翻譯序列的5'或3')。5'側(cè)接區(qū)域可含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列如啟動子和增強(qiáng)子。3'側(cè)接區(qū)域可含有引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后裂解和多腺苷酸化的序列。

“非人動物”是指不為人的任何動物并且包括脊椎動物如嚙齒類動物、非人靈長類動物、綿羊、牛、反芻動物、兔類動物、豬、山羊、馬、犬科動物、貓科動物、鳥類等。優(yōu)選的非人動物選自嚙齒目。“非人動物”另外是指兩棲動物(例如非洲蟾蜍屬)、爬行動物、昆蟲(例如果蠅屬)和其他非哺乳動物物種。

如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”是指具有來源于另一種生物體的DNA插入的生物體或細(xì)胞，所述DNA變得整合至植物或動物的體細(xì)胞和/或種系細(xì)胞任一者的基因組中?！稗D(zhuǎn)基因”意指對于其中發(fā)現(xiàn)其的植物或動物來說部分或完全異源(即，在自然中不存在)或?qū)τ趦?nèi)源序列(即，在自然中在動物中發(fā)現(xiàn)的序列)來說同源且在與天然存在的序列的位置不同的位置處插入至植物或動物的基因組中的DNA序列。包含一種或多種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物或動物在本公開的范圍之內(nèi)。另外，如本文所用的“轉(zhuǎn)基因的”是指通過本公開的方法、通過同源重組、TFO突變或通過類似的過程修飾和/或“敲除”一種或多種基因(使無功能或使在降低的水平下起作用，即“敲除”突變)的生物體。例如，在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體或細(xì)胞包括包含外來啟動子和/或編碼區(qū)的插入的DNA。

“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是已經(jīng)獲得在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長以獲得多個代的能力、在軟瓊脂中生長的能力和/或不具有通過細(xì)胞與細(xì)胞接觸抑制的細(xì)胞生長的能力的細(xì)胞或細(xì)胞系。在此方面，轉(zhuǎn)化是指外來遺傳物質(zhì)引入至細(xì)胞或生物體中。轉(zhuǎn)化可通過已知的任何方法完成，所述方法允許核酸成功引入至細(xì)胞中且導(dǎo)致所引入的核酸的表達(dá)?！稗D(zhuǎn)化”包括但不限于這類方法，如轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、核轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移)。轉(zhuǎn)化可通過使用任何表達(dá)載體完成。例如，考慮使用桿狀病毒以將外來核酸引入至昆蟲細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”還包括方法如P-元件介導(dǎo)的整個昆蟲的種系轉(zhuǎn)化。另外，轉(zhuǎn)化是指已經(jīng)自然地轉(zhuǎn)化(通常通過遺傳突變)的細(xì)胞。

如本文所用，“外源性”意指編碼蛋白質(zhì)的基因通常不在細(xì)胞中表達(dá)。此外，“外源性”是指轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中以增加所述基因的正常(即自然)表達(dá)水平。

肽序列和核苷酸序列可以是“內(nèi)源性的”或“異源的”(即“外來的”)。術(shù)語“內(nèi)源性的”是指在其所引入的細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的序列，只要其不含相對于天然存在的序列的一些修飾。術(shù)語“異源性的”是指對于它所引入的細(xì)胞來說不是內(nèi)源性的序列。例如，異源DNA包括連接至或進(jìn)行操作以變得連接至核酸序列的核苷酸序列，在自然中所述核苷酸序列不與所述核酸序列連接或在自然中所述核苷酸序列與所述核酸序列在不同位置連接。異源性DNA還包括在其所引入的細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的且含有相對于天然存在的序列的一些修飾的核苷酸序列。通常但不是必須地，異源DNA編碼通常不由其所引入的細(xì)胞產(chǎn)生的異源RNA和異源蛋白質(zhì)。異源DNA的實(shí)例包括編碼選擇性標(biāo)志物蛋白(例如，賦予耐藥性的蛋白質(zhì))的報(bào)道基因、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、DNA序列等。

構(gòu)建體

本文所公開的核酸分子(例如，位點(diǎn)特異性核酸酶或CRISPR的引導(dǎo)RNA)可用于產(chǎn)生重組核酸構(gòu)建體。在一個實(shí)施方案中，本公開的核酸分子可用于制備核酸構(gòu)建體，例如，用于在目標(biāo)植物、微生物或動物中表達(dá)的表達(dá)盒。這種表達(dá)可以是瞬時的，例如當(dāng)構(gòu)建體未整合至宿主基因組中或在由啟動子和構(gòu)建體在宿主基因組內(nèi)的位置(如果構(gòu)建體變得整合)提供的控制下維持。

表達(dá)盒可包括可操作地連接至本文所公開的位點(diǎn)特異性核酸酶或引導(dǎo)RNA序列的調(diào)控序列。所述盒可另外地包含至少一種待共轉(zhuǎn)化至生物體中的另外基因?；蛘撸稍诙鄠€表達(dá)盒上提供另外基因。

所述核酸構(gòu)建體可配備有多個限制位點(diǎn)，所述限制位點(diǎn)用于插入位點(diǎn)特異性核酸酶編碼序列以便處于調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。核酸構(gòu)建體可另外地包含編碼選擇性標(biāo)志物基因的核酸分子。

任何啟動子可用于產(chǎn)生核酸構(gòu)建體。啟動子對于本文所公開的植物、微生物或動物宿主核酸序列而言可以是天然的或類似的、或外來的或異源的。另外地，啟動子可以是天然序列或可替代地是合成序列。在啟動子對于植物、微生物或動物宿主而言是“外來的”或“異源的”的情況下，意圖啟動子是在所述啟動子所引入的天然植物、微生物或動物中未發(fā)現(xiàn)的。如本文所用，嵌合基因包含可操作地連接至對于編碼序列而言異源的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的編碼序列。

本文公開的位點(diǎn)定向核酸酶序列可使用異源啟動子表達(dá)。

任何啟動子可用于制備構(gòu)建體以控制位點(diǎn)定向核酸酶序列的表達(dá)，如提供用于在植物、微生物或動物中表達(dá)的組成型、組織優(yōu)選的、誘導(dǎo)型或其他啟動子的啟動子。組成型啟動子包括例如，Rsyn7啟動子的核心啟動子和在WO 99/43 838和美國專利號6,072,050中公開的其他組成型啟動子；核心CaMV 35S啟動子(Odell等Nature 313:810-812；1985)；稻肌動蛋白(McElroy等,Plant Cell 2:163-171,1990)；泛素(Christensen等,Plant Mol.Biol.12:619-632,1989和Christensen等,Plant Mol.Biol.18:675-689,1992)；pEMU(Last等,Theor.Appl.Genet.81:581-588,1991)；MAS(Velten等,EMBO J.3:2723-2730,1984)；ALS啟動子(美國專利號5,659,026)等。其他組成型啟動子包括例如美國專利號5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142以及6,177,611。

組織優(yōu)選的啟動子可用于引導(dǎo)特定植物組織內(nèi)的位點(diǎn)定向核酸酶表達(dá)。這類組織優(yōu)選的啟動子包括但不限于葉優(yōu)選的啟動子、根優(yōu)選的啟動子、種子優(yōu)選的啟動子以及干優(yōu)選的啟動子。組織優(yōu)選的啟動子包括Yamamoto等,Plant J.12(2):255-265,1997；Kawamata等,Plant Cell Physiol.38(7):792-803,1997；Hansen等,Mol.Gen Genet.254(3):337-343,1997；Russell等,Transgenic Res.6(2):157-168,1997；Rinehart等,Plant Physiol.1 12(3):1331-1341,1996；Van Camp等,Plant Physiol.1 12(2):525-535,1996；Canevascini等,Plant Physiol.112(2):513-524,1996；Yamamoto等,Plant Cell Physiol.35(5):773-778,1994；Lam,Results Probl.Cell Differ.20:181-196,1994；Orozco等Plant Mol Biol.23(6):1129-1138,1993；Matsuoka等,Proc Nat’l.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590,1993；以及Guevara-Garcia等,Plant J.4(3):495-505,1993。

核酸構(gòu)建體還可包括轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。在使用轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的情況下，任何終止區(qū)可用于制備核酸構(gòu)建體。例如，終止區(qū)可源自另一來源(即，對于啟動子而言外來或異源的)?？晒┯糜诒竟_的構(gòu)建體中的終止區(qū)的實(shí)例包括來自根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒的那些，如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。還參見Guerineau等,Mol.Gen.Genet.262:141-144,1991；Proudfoot,Cell 64:671-674,1991；Sanfacon 等,Genes Dev.5:141-149,1991；Mogen等,Plant Cell 2:1261-1272,1990；Munroe等,Gene 91:151-158,1990；Ballas等,Nucleic Acids Res.17:7891-7903,1989；以及Joshi等,Nucleic Acid Res.15:9627-9639,1987。

與本文公開的任何方面、實(shí)施方案、方法和/或組合物結(jié)合，核酸可進(jìn)行優(yōu)化以獲得在轉(zhuǎn)化的植物中增加的表達(dá)。即，編碼位點(diǎn)定向核酸酶蛋白質(zhì)的核酸可使用植物優(yōu)選的密碼子進(jìn)行合成以獲得改進(jìn)的表達(dá)。關(guān)于宿主優(yōu)選的密碼子使用的討論，參見例如，Campbell和Gowri,(Plant Physiol.92:1-11,1990)。用于合成植物優(yōu)選的基因的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是可供使用的。參見，例如美國專利號5,380,831和5,436,391，以及Murray等,Nucleic Acids Res.17:477-498,1989。還參見例如，Lanza等人,BMC Systems Biology 8:33-43,2014；Burgess-Brown等人.,Protein Expr.Purif.59:94-102,2008；Gustafsson等人,Trends Biotechnol 22:346-353,2004。

此外，可對本文公開的核酸序列進(jìn)行其他序列修飾。例如，另外的序列修飾已知增強(qiáng)在細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包括消除編碼假多腺苷酸化信號、外顯子/內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列的序列以及對于基因表達(dá)可能有害的其他這類良好表征的序列。還可將序列的G-C含量調(diào)整至靶細(xì)胞宿主的平均水平，如參照在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因來計(jì)算。此外，可對序列進(jìn)行修飾以避免預(yù)測的發(fā)夾二級mRNA結(jié)構(gòu)。

其他核酸序列也可用于制備本公開的構(gòu)建體，例如以增強(qiáng)位點(diǎn)定向核酸酶編碼序列的表達(dá)。這類核酸序列包括來自煙草花葉病毒(TMV)、苞米枯黃斑點(diǎn)病毒和苜?；ㄈ~病毒的苞米AdhI、內(nèi)含子基因(Callis等,Genes and Development 1:1183-1200,1987)以及前導(dǎo)序列(W-序列)的內(nèi)含子(Gallie等,Nucleic Acid Res.15:8693-8711,1987；和Skuzeski等,Plant Mol.Biol.15:65-79,1990)。來自苞米的萎縮-1基因座的第一內(nèi)含子已經(jīng)顯示增加嵌合基因構(gòu)建體中基因的表達(dá)。美國專利號5,424,412和5,593,874公開了在基因表達(dá)構(gòu)建體中使用特異性內(nèi)含子，并且Gallie等(Plant Physiol.106:929-939,1994)也已經(jīng)顯示內(nèi)含子適用于在組織特異性基礎(chǔ)上調(diào)控基因表達(dá)。為了進(jìn)一步增強(qiáng)或優(yōu)化位點(diǎn)定向核酸酶基因表達(dá)，本文公開的植物表達(dá)載體還可包含含有基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR)的DNA序列。用這類修飾的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞然后可展示本公開的核苷酸序列的過量表達(dá)或組成型表達(dá)。

本文公開的表達(dá)構(gòu)建體還可包括能夠引導(dǎo)針對葉綠體或原核生物和真核生物種的其他細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)定向核酸酶序列的表達(dá)的核酸序列。這類核酸序列包括葉綠體靶向序列，所述序列編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽以將目標(biāo)基因產(chǎn)物引導(dǎo)至植物細(xì)胞葉綠體。這類轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域中已知的。關(guān)于葉綠體靶向序列，“可操作地連接”意指編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列(即，葉綠體靶向序列)連接至本文公開的位點(diǎn)定向核酸酶核酸分子，以使得兩個序列是連續(xù)的且在同一閱讀框中。參見例如，Von Heijne等,Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126,1991；Clark等,J.Biol.Chem.264:17544-17550,1989；Della-Cioppa等,Plant Physiol.84:965-968,1987；Romer等,Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421,1993；以及Shah等,Science 233:478-481,1986。

葉綠體靶向序列是本領(lǐng)域中已知的并且包括核酮糖-1,5-雙磷酸羧化酶的葉綠體小亞基(Rubisco)(de Castro Silva Filho等,Plant Mol.Biol.30:769-780,1996；Schnell等,J.Biol.Chem.266(5):3335-3342,1991)；5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等,J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810,1990)；色氨酸合酶(Zhao等人,J.Biol.Chem.270(1 1):6081-6087,1995)；質(zhì)體藍(lán)素(Lawrence等,J.Biol.Chem.272(33):20357-20363,1997)；分支酸合酶(Schmidt等,J.Biol.Chem.268(36):27447-27457,1993)；以及光收獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHBP)(Lamppa等,J.Biol.Chem.263:14996-14999,1988)。還參見，Von Heijne等,Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126,1991；Clark等,J.Biol.Chem.264:17544-17550,1989；Della-Cioppa等,Plant Physiol.84:965-968,1987；Romer等,Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421,1993；以及Shah等,Science 233:478-481,1986。

與本文公開的任何方面、實(shí)施方案、方法和/或組合物結(jié)合，可制備核酸構(gòu)建體以引導(dǎo)從植物細(xì)胞葉綠體表達(dá)突變體位點(diǎn)定向核酸酶編碼序列。用于葉綠體轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域中已知的。參見例如，Svab等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 87:8526-8530,1990；Svab和Maliga,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:913-917,1993；Svab和Maliga,EMBO J.12:601-606,1993。所述方法依賴于通過同源重組將含有選擇性標(biāo)志物的DNA粒子槍遞送至質(zhì)體基因組中。另外地，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可通過核編碼的和質(zhì)體引導(dǎo)的RNA聚合酶的組織優(yōu)選的表達(dá)、通過沉默的攜帶質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因的反式活化來完成。這種系統(tǒng)已經(jīng)在McBride等Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 91:7301-7305,1994中報(bào)道。

可針對在葉綠體中的表達(dá)來優(yōu)化待靶向葉綠體的目標(biāo)核酸，以便考慮在所述植物細(xì)胞核與這種細(xì)胞器之間在密碼子使用方面的差異。按照這種方式，可使用葉綠體優(yōu)選的密碼子來合成目標(biāo)核酸。參見例如美國專利號5,380,831，其以引用的方式并入本文。

核酸構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞且再生包含位點(diǎn)定向核酸酶編碼序列的轉(zhuǎn)基因植物。用于轉(zhuǎn)化植物的多種植物轉(zhuǎn)化載體和方法是可供使用的。參見例如美國專利號6,753,458，An,G.等,Plant Physiol.,81:301-305,1986；Fry,J.等,Plant Cell Rep.6:321-325,1987；Block,M.,Theor.Appl Genet.76:767-774,1988；Hinchee等,Stadler.Genet.Symp.203212.203-212,1990；Cousins等,Aust.J.Plant Physiol.18:481-494,1991；Chee,P.P.和Slightom,J.L.,Gene.118:255-260,1992；Christou等,Trends.Biotechnol.10:239-246,1992；D'Halluin等,Bio/Technol.10:309-3 14,1992；Dhir等,Plant Physiol.99:81-88,1992；Casas等,Proc.Nat’l.Acad Sci.USA 90:11212-11216,1993；Christou,P.,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 29P:1 19-124,1993；Davies,等,PlantCell Rep.12:180-183,1993；Dong,J.A.和Mc Hughen,A.,Plant Sci.91:139-148,1993；Franklin,C.I.和Trieu,T.N.,Plant.Physiol.102:167,1993；Golovkin等,Plant Sci.90:41-52,1993；Guo Chin Sci.Bull.38:2072-2078；Asano,等,Plant Cell Rep.13,1994；Ayeres N.M.和Park,W.D.,Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239,1994；Barcelo等,Plant.J.5:583-592,1994；Becker,等,Plant.J.5:299-307,1994；Borkowska等,Acta.Physiol Plant.16:225-230,1994；Christou,P.,Agro.Food.Ind.HiTech.5:17-27,1994；Eapen等,Plant Cell Rep.13:582-586,1994；Hartman等,Bio-Technology 12:919923,1994；Ritala等,Plant.Mol.Biol.24:317-325,1994；以及Wan,Y.C.和Lemaux,P.G.,Plant Physiol.104:3748,1994。所述構(gòu)建體還可使用同源重組轉(zhuǎn)化至植物細(xì)胞中。

當(dāng)提及肽序列和核苷酸序列時術(shù)語“野生型”分別是指當(dāng)從天然存在的來源分離時具有所述肽序列和核苷酸序列的特征的肽序列和核苷酸序列(基因座/基因/等位基因)。野生型肽序列和核苷酸序列是在群體中最經(jīng)常觀察到的序列，并且因此分別任意指定所述肽序列和核苷酸序列的“正常”或“野生型”形式?！耙吧汀边€可指在一個或多個特定核苷酸位置處的序列，或在一個或多個特定密碼子位置處的序列，或在一個或多個特定氨基酸位置處的序列。

“共有序列”被定義為對于至少25％的序列含有相同的氨基酸或核苷酸或功能上等效的氨基酸或核苷酸的氨基酸或核苷酸的序列。相同的或功能上等效的氨基酸或核苷酸不必是連續(xù)的。

如本文所用的術(shù)語“蕓苔屬”是指蕓苔屬的植物。示例性蕓苔屬物種包括但不限于埃塞俄比亞芥(B.carinata)、長芥(B.elongate)、地中海包心菜(B.fruticulosa)、芥菜型油菜(B.juncea)、甘藍(lán)型油菜(B.napus)、塌棵菜(B.narinosa)、黑芥(B.nigra)、甘藍(lán)(B.oleracea)、小松菜(B.perviridis)、蕪菁(B.rapa)(同義詞B.campestris)、褐芥(B.rupestris)、B.septiceps以及亞洲芥(B.tournefortii)。

核堿基是堿基，在某些優(yōu)先的實(shí)施方案中其是嘌呤、嘧啶或其衍生物或類似物。核苷是含有戊呋喃糖基部分的核堿基，例如，任選取代的核糖核苷或2'-脫氧核糖核苷。核苷可通過一些鍵聯(lián)部分中的一種連接，所述連接部分可能含磷或不含磷。通過未取代的磷酸二酯鍵聯(lián)連接的核苷被稱為核苷酸。如本文所用的術(shù)語“核堿基”包括肽核堿基、肽核酸的亞基和嗎啉核堿基以及核苷和核苷酸。

寡核堿基是包含核堿基的聚合物；在一些實(shí)施方案中所述聚合物的至少一部分可通過沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對與具有互補(bǔ)序列的DNA雜交。寡核堿基鏈可具有單個5'和3'末端，其是聚合物的最終核堿基。特殊的寡核堿基鏈可含有所有類型的核堿基。寡核堿基化合物是含有一個或多個可為互補(bǔ)的且通過沃森-克里克堿基配對雜交的寡核堿基鏈的化合物。核糖型核堿基包括含有戊呋喃糖基的核堿基，其中2'碳是被羥基、烷氧基或鹵素取代的亞甲基。脫氧核糖型核堿基是不同于核糖型核堿基的核堿基且包括所有不含有戊呋喃糖基部分的核堿基。

在某些實(shí)施方案中，寡核堿基鏈可包括寡核堿基鏈和寡核堿基鏈的區(qū)段或區(qū)域兩者。寡核堿基鏈可具有3'端和5'端，并且當(dāng)寡核堿基鏈與一條鏈同延時，所述鏈的3'和5'端也是所述鏈的3'和5'末端。

如本文所用，術(shù)語“密碼子”是指構(gòu)成遺傳密碼的三個相鄰核苷酸(RNA或DNA)的序列，所述序列決定在蛋白質(zhì)合成期間特異性核酸插入多肽鏈中或用于終止蛋白質(zhì)合成的信號。術(shù)語“密碼子”還用于指原始DNA所轉(zhuǎn)錄至其中的信使RNA中的三個核苷酸的對應(yīng)(和互補(bǔ))序列。

如本文所用，術(shù)語“同源性”是指在蛋白質(zhì)和DNA之中的序列相似性。術(shù)語“同源性”或“同源的”是指同一性程度?？纱嬖诓糠滞葱曰蛲耆葱浴２糠滞葱蛄惺钱?dāng)與另一序列相比時具有小于100％序列同一性的序列。

“雜合的”是指在同源染色體區(qū)段中在一個或多個遺傳基因座處具有不同的等位基因。如本文所用，“雜合的”還可指樣品、細(xì)胞、細(xì)胞群體或生物體，其中可檢測到在一個或多個遺傳基因座處的不同等位基因。雜合樣品還可通過本領(lǐng)域中已知的方法例如像核酸測序來測定。例如，如果測序電泳圖譜顯示在單個基因座處的兩個峰且兩個峰大約是相同大小，則樣品可被表征為雜合的?；蛘撸绻粋€峰小于另一個，但是較大峰的大小的至少約25％，則樣品可被表征為雜合的。在一些實(shí)施方案中，較小峰是較大峰的至少約15％。在其他實(shí)施方案中，較小峰是較大峰的至少約10％。在其他實(shí)施方案中，較小峰是較大峰的至少約5％。在其他實(shí)施方案中，檢測到最小量的較小峰。

如本文所用，“純合的”是指在同源染色體區(qū)段中在一個或多個遺傳基因座處具有相同的等位基因?！凹兒系摹边€可指樣品、細(xì)胞、細(xì)胞群體或生物體，其中可檢測到在一個或多個遺傳基因座處的相同等位基因。純合樣品可通過本領(lǐng)域中已知的方法例如像核酸測序來測定。例如，如果測序電泳圖譜顯示在特定基因座處的單個峰，則樣品可關(guān)于所述基因座被稱為“純合的”。

術(shù)語“半合子的”是指因?yàn)榈诙任换蛉笔Щ虿淮嬖谟谕慈旧w區(qū)段上而在細(xì)胞或生物體的基因型中僅出現(xiàn)一次的基因或基因區(qū)段。如本文所用，“半合子的”還可指樣品、細(xì)胞、細(xì)胞群體或生物體，其中在基因型中僅可檢測到一次在一個或多個遺傳基因座處的基因。

如本文所用的術(shù)語“接合性狀態(tài)”是指如通過本領(lǐng)域中已知和本文所述的測試方法所測定出現(xiàn)雜合、純合或半合子的樣品、細(xì)胞群體或生物體。術(shù)語“核酸的接合性狀態(tài)”意指測定核酸的來源是否出現(xiàn)雜合、純合或半合子的?！敖雍闲誀顟B(tài)”可指序列中的單個核苷酸位置中的差異。在一些方法中，關(guān)于單個突變樣品的接合性狀態(tài)可被分類為純合野生型、雜合(即，一個野生型等位基因和一個突變體等位基因)、純合突變體或半合子的(即，野生型或突變體等位基因的單個拷貝)。

如本文所用，術(shù)語“RTDS”是指由Cibus開發(fā)的The Rapid Trait Development System^TM(RTDS)。RTDS是在不并入外來基因或控制序列的情況下有效于進(jìn)行基因序列中的精確變化的位點(diǎn)特異性基因修飾系統(tǒng)。

如本文所用的術(shù)語“約”意指數(shù)量上加或減10％。例如，“約3％”將涵蓋2.7％-3.3％，并且“約10％”將涵蓋9％-11％。此外，在本文中結(jié)合定量術(shù)語使用“約”的情況下，應(yīng)理解，除將值加上或減去10％以外，也涵蓋和描述了定量術(shù)語的精確值。例如，術(shù)語“約3％”明確地考慮、描述并精確地包括3％。

RTDS和修復(fù)寡核苷酸(GRON)

本公開總體上涉及用于改進(jìn)對基因組或其他核苷酸序列中的特定位置的修飾的靶向效率的新穎方法。另外，本公開涉及已經(jīng)通過本文所公開的方法修飾、突變或標(biāo)記的靶DNA。本公開還涉及已經(jīng)通過本公開的方法修飾的細(xì)胞、組織和生物體。本公開依賴于與成功的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)Rapid Trait Development System(RTDS^TM，Cibus US LLC)部分相關(guān)的組合物和方法的發(fā)展。

RTDS是基于酮利用細(xì)胞自己的基因修復(fù)系統(tǒng)來特異性地修飾原位基因序列并且不插入外來DNA和基因表達(dá)控制序列而改變靶向基因。這種工序?qū)崿F(xiàn)基因序列中的精確變化，而基因組的剩余部分保持未改變。與常規(guī)轉(zhuǎn)基因GMO相比，既不不存在外來遺傳物質(zhì)的整合，也不存在任何外來遺傳物質(zhì)留在植物中。通過RTDS引入的基因序列的變化不是隨機(jī)插入的。因?yàn)槭苡绊懙幕虮３衷谄涮烊晃恢弥?，所以未發(fā)生隨機(jī)、不受控制的或不利的表達(dá)模式。

實(shí)現(xiàn)這種變化的RTDS是如本文所述的化學(xué)合成的寡核苷酸(GRON)，其可由DNA和修飾的RNA堿基兩者以及其他化學(xué)部分組成，并且被設(shè)計(jì)成在靶向基因位置處雜交以產(chǎn)生錯配的堿基對。這種錯配的堿基對充當(dāng)信號以將細(xì)胞自身的天然基因修復(fù)系統(tǒng)吸引至所述位點(diǎn)并且校正(置換、插入或缺失)所述基因內(nèi)的指定核苷酸。一旦校正過程完成，RTDS分子降解并且現(xiàn)在修飾的或修復(fù)的基因在所述基因的正常內(nèi)源性控制機(jī)制下表達(dá)。

本文公開的方法和組合物可用具有如本文和下文中詳述描述的構(gòu)象和化學(xué)的“基因修復(fù)寡核堿基”(GRON)實(shí)踐或進(jìn)行。如本文考慮的“基因修復(fù)寡核堿基”還已經(jīng)使用其他名稱描述在公布的科學(xué)和專利文獻(xiàn)中，所述名稱包括“重組誘發(fā)性(recombinagenic)寡核堿基”；“RNA/DNA嵌合寡核苷酸”；“嵌合寡核苷酸”；“混合雙鏈寡核苷酸(MDON)”；“RNA DNA寡核苷酸(RDO)”；“基因靶向寡核苷酸”；“基因質(zhì)體”；“單鏈修飾的寡核苷酸”；“單鏈寡脫氧核苷酸突變載體”(SSOMV)；“雙鏈突變載體”和“異源雙鏈突變載體”?；蛐迯?fù)寡核堿基可使用本領(lǐng)域中通常使用的任何方法引入至植物細(xì)胞中，所述方法包括但不限于微載體(生物射彈遞送)、微纖維、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的攝取、電穿孔和顯微注射。

在一個實(shí)施方案中，基因修復(fù)寡核堿基是混合雙鏈寡核苷酸(MDON)，其中混合雙鏈寡核苷酸的RNA型核苷酸通過用氟、氯或溴官能團(tuán)置換2'-羥基或通過在2'-O上安置取代基而成為RNA酶抗性的。適合的取代基包括Kmiec II中教導(dǎo)的取代基。替代取代基包括美國專利號5,334,711(Sproat)教導(dǎo)的取代基和專利公布EP 629 387和EP 679 657(總稱Martin申請案)教導(dǎo)的取代基，其特此以引用的方式并入。如本文所用，核糖核苷酸的2'-氟、2'-氯或2'-溴衍生物或者其T-OH被Martin申請案或Sproat中所述的取代基取代的核糖核苷酸被稱為“T-取代的核糖核苷酸”。如本文所用，術(shù)語“RNA型核苷酸”意指通過未取代的磷酸二酯鍵聯(lián)或由Kmiec I或Kmiec II教導(dǎo)的任何非天然鍵聯(lián)與混合雙鏈寡核苷酸的其他核苷酸連接的T-羥基或2'-取代核苷酸。如本文所用，術(shù)語“脫氧核糖型核苷酸”意指具有T-H的核苷酸，其可通過未取代的磷酸二酯鍵聯(lián)或由Kmiec I或Kmiec II教導(dǎo)的任何非天然鍵聯(lián)與基因修復(fù)寡核堿基的其他核苷酸連接。

在本公開的一個具體實(shí)施方案中，基因修復(fù)寡核堿基是單獨(dú)通過未取代的磷酸二酯鍵連接的混合雙鏈寡核苷酸(MDON)。在替代實(shí)施方案中，通過由Kmiec II教導(dǎo)的取代的磷酸二酯、磷酸二酯衍生物和無磷基鍵聯(lián)進(jìn)行連接。在又一個實(shí)施方案中，混合雙鏈寡核苷酸中的每個RNA型核苷酸是2'-取代的核苷酸。2'-取代的核糖核苷酸的具體優(yōu)選實(shí)施方案是2'-氟、T-甲氧基、2'-丙氧基、2'-烯丙氧基、2'-羥乙氧基、2'-甲氧基乙氧基、T-氟丙氧基和2'-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。2'-取代的核糖核苷酸的更優(yōu)選的實(shí)施方案是2'-氟、2'-甲氧基、2'-甲氧基乙氧基和2'-烯丙氧基取代的核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，混合雙鏈寡核苷酸通過未取代的磷酸二酯鍵連接。

雖然僅具有單一類型的2'-取代的RNA型核苷酸的混合雙鏈寡核苷酸(MDON)更方便合成，但本公開的方法仍可用具有兩種或更多種類型的RNA型核苷酸的混合雙鏈寡核苷酸實(shí)踐。由在兩個RNA型三核苷酸之間引入脫氧核苷酸引起的中斷可能不會影響RNA區(qū)段的功能，因此，術(shù)語RNA區(qū)段涵蓋術(shù)語如“中斷的RNA區(qū)段”。未中斷的RNA區(qū)段被稱為連續(xù)RNA區(qū)段。在一個替代實(shí)施方案中，RNA區(qū)段可含有交替的抗RNA酶核苷酸和未取代的2'-OH核苷酸?；旌想p鏈寡核苷酸在一些實(shí)施方案中具有少于100個核苷酸且其他實(shí)施方案中少于85個核苷酸、但多于50個核苷酸。第一條鏈和第二條鏈進(jìn)行沃森-克里克堿基配對。在一個實(shí)施方案中，混合雙鏈寡核苷酸的鏈通過接頭如單鏈六、五或四核苷酸共價(jià)鍵合，以使得第一條鏈和第二條鏈?zhǔn)蔷哂袉蝹€3'端和單個5'端的寡核苷酸單鏈的區(qū)段。通過添加“發(fā)夾帽”可保護(hù)3'端和5'端，借此3'端和5'端核苷酸與鄰近核苷酸進(jìn)行沃森-克里克配對。另外，可在遠(yuǎn)離3'端和5'端的第一條鏈與第二條鏈之間的接點(diǎn)處安置第二發(fā)夾帽，以使得第一條鏈和第二條鏈之間的沃森-克里克配對穩(wěn)定。

第一條鏈和第二條鏈含有與靶基因/等位基因的兩個片段同源的兩個區(qū)域，即，具有與靶基因/等位基因相同的序列。同源區(qū)含有RNA區(qū)段的核苷酸，并且可含有連接DNA區(qū)段的一種或多種DNA型核苷酸，并且還可含有不在插入DNA區(qū)段內(nèi)的DNA型核苷酸。具有同源性的兩個區(qū)域被一個區(qū)域分開且各自與所述區(qū)域相鄰，所述區(qū)域具有與靶基因的序列不同的序列，被稱為“異源區(qū)”。異源區(qū)可含有一個、兩個或三個錯配的核苷酸。錯配的核苷酸可以是連續(xù)的或者可替代地被與靶基因/等位基因同源的一個或兩個核苷酸分開?；蛘?，異源區(qū)還可含有插入或一個、兩個、三個或五個或更少的核苷酸?；蛘撸旌想p鏈寡核苷酸的序列可能與靶基因/等位基因序列不同，差別在于從混合雙鏈寡核苷酸中缺失一個、兩個、三個或五個或更少的核苷酸。在這種情況下，異源區(qū)的長度和位置被視為缺失的長度，即使沒有混合雙鏈寡核苷酸的核苷酸在異源區(qū)內(nèi)。當(dāng)意圖一個或多個取代時，與兩個同源區(qū)互補(bǔ)的靶基因片段之間的距離與異源區(qū)的長度相同。當(dāng)異源區(qū)含有插入時，同源區(qū)在混合雙鏈寡核苷酸中分開的距離因而比其互補(bǔ)同源片段在基因/等位基因中分開的距離要遠(yuǎn)，而當(dāng)異源區(qū)編碼缺失時情況相反。

混合雙鏈寡核苷酸的RNA區(qū)段各自是同源區(qū)的一部分，即，序列中與靶基因的片段相同的區(qū)域，其區(qū)段一起在一些實(shí)施方案中含有至少13個RNA型核苷酸且在一些實(shí)施方案中16至25個RNA型核苷酸或其他實(shí)施方案中18-22個RNA型核苷酸或在一些實(shí)施方案中20個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，同源區(qū)的RNA區(qū)段被插入DNA區(qū)段分開且與其相鄰，即，由插入DNA區(qū)段“連接”。在一個實(shí)施方案中，異源區(qū)的每個核苷酸是插入DNA區(qū)段的核苷酸。含有混合雙鏈寡核苷酸的異源區(qū)的插入DNA區(qū)段被稱為“突變區(qū)段(mutator segment)”。

在本公開的另一個實(shí)施方案中，基因修復(fù)寡核堿基(GRON)是單鏈寡脫氧核苷酸突變載體(SSOMV)，如公開于國際專利申請PCT/USOO/23457、美國專利號6,271,360、6,479,292和7,060,500中，其以引用的方式整體并入。SSOMV的序列與美國專利號5,756,325；5,871,984；5,760,012；5,888,983；5,795,972；5,780,296；5,945,339；6,004,804和6,010,907以及國際公布號WO 98/49350；WO 99/07865；WO 99/58723；WO 99/58702；和WO 99/40789中描述的突變載體基于相同的原理。SSOMV的序列含有與靶序列同源、被一個區(qū)域分開的兩個區(qū)域，所述區(qū)域含有所需的遺傳改變，其被稱為突變區(qū)。突變區(qū)可具有與靶序列中分開同源區(qū)的序列相同長度的序列，但是具有不同的序列。這樣的突變區(qū)可引起取代?；蛘撸琒SOMV中的同源區(qū)可彼此鄰接，而具有相同序列的靶基因中的區(qū)域被一個、兩個或更多個核苷酸分開。這樣的SSOMV引起不在SSOMV上的核苷酸從靶基因缺失。最后，與同源區(qū)相同的靶基因的序列可能在靶基因中相鄰，但被SSOMV序列中的一個、兩個或更多個核苷酸分開。這樣的SSOMV引起靶基因序列中的插入。在某些實(shí)施方案中，SSOMV不會與本身退火。

SSOMV的核苷酸是通過未修飾的磷酸二酯鍵連接的脫氧核糖核苷酸，除了3'末端和/或5'末端核苷酸間鍵聯(lián)或者可替代地兩個3'末端和/或5'末端核苷酸間鍵聯(lián)可以是硫代磷酸酯或氨基磷酸酯。如本文所用，核苷酸間鍵聯(lián)是SSOMV的核苷酸之間的鍵聯(lián)，并且不包括3'端核苷酸或5'端核苷酸與封閉取代基之間的鍵聯(lián)。在一個具體的實(shí)施方案中，SSOMV的長度在21與55個脫氧核苷酸之間，并且相應(yīng)地，同源區(qū)的長度具有至少20個脫氧核苷酸的總長度且至少兩個同源區(qū)應(yīng)各自具有至少8個脫氧核苷酸的長度。

SSOMV可被設(shè)計(jì)為與靶基因的編碼鏈或非編碼鏈互補(bǔ)。當(dāng)所需的突變是單堿基取代時，優(yōu)選突變核苷酸和靶向核苷酸是嘧啶。在與實(shí)現(xiàn)所需的功能結(jié)果一致的程度上，優(yōu)選突變核苷酸和互補(bǔ)鏈中的靶核苷酸都是嘧啶。特別優(yōu)選是編碼顛換突變的SSOMV，即，C或T突變核苷酸分別與互補(bǔ)鏈中的C或T核苷酸錯配。

岡崎片段/2’-OME GRON設(shè)計(jì)。在各種實(shí)施方案中，GRON可具有RNA和DNA核苷酸和/或其他類型的核堿基。在一些實(shí)施方案中，所述DNA或RNA核苷酸中的一個或多個包含修飾。在一些實(shí)施方案中，第一5’核苷酸是RNA核苷酸并且所述核苷酸的剩余部分是DNA。在其他實(shí)施方案中，第一5’RNA核苷酸用2-O-Me進(jìn)行修飾。在其他實(shí)施方案中，前兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個5’核苷酸是RNA核苷酸并且所述核苷酸的剩余部分是DNA。在其他實(shí)施方案中，所述前兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個5’RNA核苷酸中的一個或多個用2-O-Me進(jìn)行修飾。在植物細(xì)胞中，DNA中的雙鏈斷裂通常通過NHEJ DNA修飾途徑進(jìn)行修復(fù)。所述途徑不需要模板來修復(fù)DNA并且因此是易錯的。使用這種途徑來修復(fù)植物細(xì)胞的DNA的優(yōu)點(diǎn)是它是快速、普遍的且最重要地可在細(xì)胞未在進(jìn)行DNA復(fù)制的任何時間發(fā)生。在修復(fù)植物細(xì)胞中的復(fù)制叉外部的雙鏈斷裂中起作用的另一種DNA修復(fù)途徑稱為同源重組(HR)；然而，與NHEJ途徑不同，這種類型的修復(fù)是精確的且需要施用DNA模板(GRON)。因?yàn)檫@些GRON模擬靶向基因的DNA復(fù)制叉處的岡崎片段，所以對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說與雙鏈DNA切割體一起使用它們不是顯而易見的。

提高效率

本公開提供多種方法以使用修復(fù)寡核苷酸增加靶基因的轉(zhuǎn)化效率，并且所述方法可單獨(dú)地或彼此組合使用。這些包括：

1.將修飾引入至修復(fù)寡核苷酸，其將DNA修復(fù)機(jī)器吸引至靶向(錯配)位點(diǎn)。

A.在寡核苷酸中引入一個或多個無堿基位點(diǎn)(例如，10個堿基內(nèi)，并且在一些實(shí)施方案中具有所需錯配位點(diǎn)的5個堿基)產(chǎn)生為堿基切除修復(fù)(BER)中的中間體并且將BER機(jī)器吸引至靶向通過修復(fù)寡核苷酸轉(zhuǎn)化的位點(diǎn)附近的損害。dSpacer(無堿基呋喃)修飾的寡核苷酸可如在例如Takeshita等,J.Biol.Chem.,262:10171-79,1987中所描述來制備。

B.包括誘導(dǎo)單鏈或雙鏈斷裂成寡核苷酸或與寡核苷酸一起斷裂的化合物產(chǎn)生通過NHEJ、微同源介導(dǎo)的末端連接(MMEJ)和同源重組修復(fù)的損害。作為舉例，抗生物素的博來霉素家族、鋅指、FokI(或限制酶的任何IIS型類別)可共價(jià)連接至修復(fù)寡核苷酸的3’或5’端，以便在靶向通過修復(fù)寡核苷酸轉(zhuǎn)化的位點(diǎn)附近引入雙鏈斷裂?？股锼氐牟﹣砻顾丶易迨荄NA裂解糖肽，其包括博來霉素、博萊霉素(zeocin)、腐草霉素(phleomycin)、他利霉素(tallysomycin)、培洛霉素以及其他。

C.引入并入寡核苷酸中的一個或多個8’氧代dA或dG(例如，在10個堿基內(nèi)，并且在一些實(shí)施方案中具有所需錯配位點(diǎn)的5個堿基)產(chǎn)生與由活性氧物種產(chǎn)生的損害類似的損害。這些損害誘導(dǎo)所謂的“推動修復(fù)”系統(tǒng)。參見例如，Kim等,J.Biochem.Mol.Biol.37:657-62,2004。

2.增加修復(fù)寡核苷酸的穩(wěn)定性：

在寡核苷酸的3’端引入反向堿基(idC)在修復(fù)寡核苷酸上產(chǎn)生3’封閉端。

在修復(fù)寡核苷酸的5’和/或3’引入一個或多個2’O-甲基核苷酸或堿基，所述核苷酸或堿基增加雜交能量(參見例如WO2007/073149)。

在修復(fù)寡核苷酸的5’端引入一個或多個2’O-甲基RNA核苷酸，從而導(dǎo)致DNA堿基，所述堿基提供所需的錯配位點(diǎn)，從而產(chǎn)生岡崎片段樣核酸結(jié)構(gòu)。

綴合的(5’或3’)嵌入燃料如吖啶、補(bǔ)骨脂素、溴化乙錠和賽博(Syber)染料。

引入5’末端帽如T/A鉗夾、膽固醇部分、SIMA(HEX)、riboC和亞磷酰胺(amidite)。

主鏈修飾如硫代磷酸酯、2’-O甲基、膦酸甲酯、鎖核酸(LNA)、MOE(甲氧基乙基)、di PS和肽核酸(PNA)。

使修復(fù)寡核苷酸例如與鏈內(nèi)交聯(lián)試劑如順鉑和絲裂霉素C交聯(lián)。

與熒光染料如Cy3、DY547、Cy3.5、Cy3B、Cy5和DY647綴合。

3.通過并入增加雜交能量的堿基增加修復(fù)寡核苷酸的雜交能量(參加例如WO2007/073149)。

4.通過使用核苷酸多聚體(二聚體、三聚體、四聚體等)作為合成的結(jié)構(gòu)單元提高修復(fù)寡核苷酸合成的質(zhì)量。這導(dǎo)致更少的偶聯(lián)步驟和更容易地分離全長產(chǎn)物與結(jié)構(gòu)單元。

5.使用較長修復(fù)寡核苷酸(即，長度大于55核苷酸，例如像本文所述的長度，例如具有在修復(fù)寡核苷酸中靶向的一個或多個突變或兩個或更多個突變。

前述方法的實(shí)例提供在表1中。

表1.示例性GRON化學(xué)

前述修飾還可包括已知的核苷酸修飾如甲基化、5’嵌入染料、對5’和3’端的修飾、主鏈修飾、交聯(lián)劑、環(huán)化和“帽”以及用類似物如肌苷取代一個或多個天然存在的核苷酸。核苷酸的修飾包括添加吖啶、胺、生物素、瀑布藍(lán)、膽固醇、Cy3@、Cy5@、Cy5.5@Daboyl、地高辛、二硝基苯基、Edans、6-FAM、熒光素、3'-甘油基、HEX、IRD-700、IRD-800、JOE、磷酸補(bǔ)骨脂素、若丹明、ROX、硫醇(SH)、間隔基、TAMRA、TET、AMCA-S"、SE、BODIPY°、Marina Blue@、PacificBlue@、Oregon Green@、Rhodamine Green@、Rhodamine Red@、Rhodol Green@和Texas Red@。多核苷酸主鏈修飾包括膦酸甲酯、2'-OMe-膦酸甲酯RNA、硫代磷酸酯、RNA、2'-OMeRNA。堿基修飾包括2-氨基-dA、2-氨基嘌呤、3'-(ddA)、3'dA(蛹蟲草菌素)、7-脫氮-dA、8-Br-dA、8-氧代-dA、N6-Me-dA、無堿基位點(diǎn)(dSpacer)、生物素dT、2'-OMe-5Me-C、2'-OMe-丙基-C、3'-(5-Me-dC)、3'-(ddC)、5-Br-dC、5-1-duc、5-Me-dC、5-F-dC、羧基-dT、可轉(zhuǎn)化的dA、可轉(zhuǎn)化的dC、可轉(zhuǎn)化的dG、可轉(zhuǎn)化的dT、可轉(zhuǎn)化的dU、7-脫氮-dG、8-Br-dG、8-氧代-dG、O6-Me-dG、S6-DNP-dG、4-甲基-吲哚、5-硝基吲哚、2'-OMe-肌苷、2'-dl、o6-苯基-dl、4-甲基-吲哚、2'-脫氧水粉菌素、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、dP(嘌呤類似物)、dK(嘧啶類似物)、3-硝基吡咯、2-硫代-dT、4-硫代-dT、生物素-dT、羧基-dT、04-Me-dT、04-三唑dT、2'-OMe-丙炔基-U、5-Br-dU、2'-dU、5-F-dU、5-l-dU、04-三唑dU。所述術(shù)語還涵蓋肽核酸(PNA)、DNA類似物，其中主鏈?zhǔn)怯蒒-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元而不是糖組成的假肽。PNA模擬DNA的行為并且結(jié)合互補(bǔ)核酸鏈。PNA的中性主鏈導(dǎo)致比正常所實(shí)現(xiàn)的更強(qiáng)結(jié)合和更大特異性。此外，已經(jīng)利用PNA的獨(dú)特化學(xué)、物理和生物特性以產(chǎn)生強(qiáng)大的生物分子工具、反義和反義劑、分子探針和生物傳感器。

寡核苷酸可具有缺口、間隙、修飾的寡核苷酸如修飾的寡核苷酸主鏈、無堿基核苷酸或其他化學(xué)部分。在另一實(shí)施方案中，寡核堿基的至少一個鏈包括至少一個另外修飾的核苷酸，例如，2′-O-甲基修飾的核苷酸如MOE(甲氧基乙基)、具有5′-硫代磷酸酯基的核苷酸、連接至膽固醇基衍生物、2′-脫氧-2′-氟修飾的核苷酸、2′-脫氧-修飾的核苷酸、鎖核苷酸、無堿基核苷酸(核堿基缺失或具有替代其的羥基(參見例如，Glen Research,http://www.glenresearch.com/GlenReports/GR21-14.html))、2′-氨基修飾的核苷酸、2′-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、亞磷酰胺以及包含核苷酸的非天然堿基。還包括各種鹽、混合鹽以及游離酸形式。

優(yōu)選的修飾的寡核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3'-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯、具有正常3'-5'鍵聯(lián)、這些鍵聯(lián)的2'-5'連接類似物的硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯，以及具有其中一個或多個核苷酸間鍵聯(lián)為3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵聯(lián)的那些。具有反向極性的優(yōu)選的寡核苷酸在3'最末端的核苷酸間鍵聯(lián)處包含單個3'至3'鍵聯(lián)，即可為無堿基(核堿基缺失或其被羥基替代)的單個反向核苷殘基。鍵聯(lián)翻轉(zhuǎn)的最常見用途是添加3'-3'鍵聯(lián)至具有硫代磷酸酯主鏈的反義寡核苷酸的末端。3'-3'鍵聯(lián)通過產(chǎn)生具有兩個5'-OH端和無3'-OH端的寡核苷酸使反義寡核苷酸至外切核酸酶降解穩(wěn)定。可通過使用“逆轉(zhuǎn)亞磷酰胺”在寡核苷酸合成期間將鍵聯(lián)翻轉(zhuǎn)引入至特定位置中。這些試劑在5'-OH位置上具有亞磷酰胺基團(tuán)且在3'-OH位置上具有二甲氧基三苯甲基(DMT)保護(hù)基。通常，DMT保護(hù)基是在5'-OH上且亞磷酰胺是在3'-OH上。

修飾堿基的實(shí)例包括但不限于2-氨基嘌呤、2′-氨基-丁酰芘-尿苷、2'-氨基尿苷、2′-脫氧尿苷、2′-氟-胞苷、2′-氟-尿苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代-尿苷、5-溴-尿苷、5-氟-胞苷、5-氟尿苷、5-吲哚-尿苷、5-甲基-胞苷、肌苷、N3-甲基-尿苷、7-脫氮-鳥嘌呤、8-氨基己基-氨基-腺嘌呤、6-硫代-鳥嘌呤、4-硫代-胸腺嘧啶、2硫代-胸腺嘧啶、5-碘-尿苷、5-碘-胞苷、8-溴-鳥嘌呤、8-溴-腺嘌呤、7-脫氮-腺嘌呤、7-二氮雜-鳥嘌呤、8-氧代-鳥嘌呤、5,6-二氫-尿苷以及5-羥基甲基-尿苷。這些合成單元是可商購的(例如，購自Glen Research公司)并且可通過化學(xué)合成并入至DNA中。

糖部分的修飾的實(shí)例是3′-脫氧化2′-氟化和阿拉伯糖苷化，然而，它不應(yīng)被解釋為限于此。通過化學(xué)合成也可能將這些并入DNA中。

5′端修飾的實(shí)例是5′-胺化、5′-生物素化、5′-熒光素化、5′-四氟-熒光素化、5′-硫化以及5′-丹磺?；欢?，它不應(yīng)被解釋為限于此。

3′端修飾的實(shí)例是3′-胺化、3′-生物素化、2,3-二脫氧化、3′-硫化、3′-丹磺?；?、3′-羧化以及3′-膽固醇化，然而，它不應(yīng)被解釋為限于此。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸可含有5'封閉取代基，其通過接頭連接至5'末端碳。接頭的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不重要，除了它的長度，長度在一些實(shí)施方案中應(yīng)為至少6個原子長，且接頭應(yīng)當(dāng)靈活?？墒褂枚喾N無毒取代基，如生物素、膽固醇或其他類固醇或非嵌入的陽離子熒光染料。特別優(yōu)選的制造寡核堿基的試劑是由Glen Research,Sterling Va.(現(xiàn)在GE Healthcare)作為Cy3^TM和Cy5^TM銷售的試劑，所述試劑是封閉的亞磷酰胺，其并入寡核苷酸后分別產(chǎn)生3,3,3',3'-四甲基N,N'-異丙基取代的吲哚單碳菁染料和吲哚二碳菁染料。Cy3是特別優(yōu)選的。當(dāng)吲哚碳菁是N-氧基烷基取代的時，其可通過具有5'端磷酸酯的磷酸二酯，方便地與寡脫氧核苷酸的5'末端連接。當(dāng)直接使用可商購的Cy3亞磷酰胺時，所得的5'修飾包括封閉取代基和接頭，所述封閉取代基和接頭一起是N-羥丙基、N'-磷脂酰丙基3,3,3',3'-四甲基吲哚單碳菁。所考慮的其他染料包括若丹明6G、四甲基若丹明、磺酰若丹明101、部花青540、Atto565、Atto550 26、Cy3.5、Dy547、Dy548、Dy549、Dy554、Dy555、Dy556、Dy560、mStrawberry和mCherry。

在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，吲哚碳菁染料在吲哚環(huán)的3和3'位置被四次取代。不受理論的限制，這些取代防止染料變成嵌入染料。在這些位置處的取代基的身份不重要。

本文所述的寡核苷酸設(shè)計(jì)還可與其他DNA編輯或重組技術(shù)組合用作更有效的供體模板，所述技術(shù)包括但不限于使用位點(diǎn)特異性同源重組通過鋅指核酸酶基因靶向、轉(zhuǎn)錄活化因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)或成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)。

本公開在某些方面和實(shí)施方案中總體上涉及用于有效修飾基因組細(xì)胞DNA和/或?qū)NA重組至細(xì)胞的基因組DNA中的方法。雖然不限于任何具體用途，但文提供的一些方法可在某些實(shí)施方案中適用于例如將修飾引入細(xì)胞的基因組中以便測定所述修飾對細(xì)胞的作用。例如，可將修飾引入編碼酶的核苷酸序列中以測定所述修飾是否改變酶的酶活性，和/或測定酶的催化區(qū)的位置?；蛘?，可將修飾引入DNA結(jié)合蛋白的編碼序列中以測定所述蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合活性是否被改變，并且因此以描述蛋白質(zhì)內(nèi)的特定DNA結(jié)合區(qū)。另一個替代方案是將修飾引入非編碼調(diào)控序列(例如，啟動子、增強(qiáng)子、調(diào)控RNA序列(miRNA)等)中以便測定修飾修飾對可操作地連接至非編碼調(diào)控序列的第二序列的表達(dá)水平的作用。這對于例如限定具有調(diào)控活性的特定序列來說可能是合乎需要的。

DNA切割體

用于產(chǎn)生靶向基因破壞的一種策略是通過使用DNA切割體如位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生單鏈或雙鏈DNA斷裂。核酸內(nèi)切酶最常用于生物體中的靶向基因破壞，所述生物體在傳統(tǒng)上對于更常規(guī)的基因靶向方法難治，如海藻、植物和較大動物模型，包括人。例如，存在涉及用于治療和預(yù)防HIV感染的鋅指核酸酶的進(jìn)行中的當(dāng)前人臨床試驗(yàn)。另外，核酸內(nèi)切酶工程化當(dāng)前用于嘗試破壞作物中產(chǎn)生不希望的表型的基因。

鋅指

一類人工核酸內(nèi)切酶是鋅指核酸內(nèi)切酶。鋅指核酸內(nèi)切酶將非特異性裂解結(jié)構(gòu)域(通常FokI核酸內(nèi)切酶的非特異性裂解結(jié)構(gòu)域)與工程化以結(jié)合特異性DNA序列的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域組合。鋅指核酸內(nèi)切酶的分子結(jié)構(gòu)使得它們是用于將位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂遞送至基因組的通用平臺。因?yàn)镕okI核酸內(nèi)切酶裂解為二聚體，所以防止脫靶裂解事件的一種策略一直是設(shè)計(jì)在相鄰的9堿基對位點(diǎn)處結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域。還參見美國專利號7,285,416；7,521,241；7,361,635；7,273,923；7,262,054；7,220,719；7,070,934；7,013,219；6,979,539；6,933,113；6,824,978；其各自特此以引用的方式整體并入本文。

TALEN

TALEN是用于誘導(dǎo)單鏈或雙鏈斷裂成特異性DNA位點(diǎn)的可靶向的核酸酶，其然后通過可用于產(chǎn)生裂解位點(diǎn)處的序列改變的機(jī)制修復(fù)。

用于工程化TALEN的DNA結(jié)合區(qū)的基本構(gòu)件是來源于由黃單胞菌屬(Xanthomonas spp.)變形菌門編碼的天然存在的TALE的高度保守的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。通過TALEN的DNA結(jié)合由在重復(fù)序列的氨基末端和羧基末端側(cè)接另外的TALE衍生結(jié)構(gòu)域的高度保守的33-35個氨基酸重復(fù)序列的陣列介導(dǎo)。

這些TALE重復(fù)序列特異性地結(jié)合DNA的單個堿基，所述堿基的身份由通常在重復(fù)序列的位置12和13處發(fā)現(xiàn)的兩個高變殘基確定，其中陣列中重復(fù)序列的數(shù)目對應(yīng)于所需靶核酸的長度，選擇重復(fù)序列的身份以匹配靶核酸序列。在一些實(shí)施方案中，靶核酸在15與20個堿基對之間以便最大化靶位點(diǎn)的選擇性。靶核酸的裂解通常在TALEN結(jié)合的50個堿基對內(nèi)發(fā)生。用于TALEN識別位點(diǎn)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述。參見例如，Cermak等,Nucleic Acids Res.2011年7月；39(12):e82。

一旦被設(shè)計(jì)來匹配所需的靶序列，TALEN可重組表達(dá)且引入至原生質(zhì)體中作為外源蛋白質(zhì)，或從原生質(zhì)體內(nèi)的質(zhì)粒表達(dá)或作為mRNA施用。

大范圍核酸酶

歸巢核酸內(nèi)切酶(還被稱為大范圍核酸酶)是序列特異性核酸內(nèi)切酶，所述核酸內(nèi)切酶由于其較大(例如，>14bp)裂解位點(diǎn)而以較高特異性程度產(chǎn)生基因組DNA中的雙鏈斷裂。雖然歸巢核酸內(nèi)切酶對于其靶位點(diǎn)的特異性允許所誘導(dǎo)的DNA斷裂的確切靶向，但歸巢核酸內(nèi)切酶裂解位點(diǎn)是罕見的并且發(fā)現(xiàn)靶向基因中的天然存在的裂解位點(diǎn)的概率較低。

另一類人工核酸內(nèi)切酶是工程化的大范圍核酸酶。工程化的歸巢核酸內(nèi)切酶通過修飾現(xiàn)有歸巢核酸內(nèi)切酶的特異性產(chǎn)生。在一種方法中，將變異引入天然存在的歸巢核酸內(nèi)切酶的氨基酸序列中并且然后篩選所得到的工程化的歸巢核酸內(nèi)切酶以選擇裂解靶向結(jié)合位點(diǎn)的功能性蛋白質(zhì)。在另一種方法中，嵌合歸巢核酸內(nèi)切酶通過組合兩種不同歸巢核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)來進(jìn)行工程化以產(chǎn)生由每個歸巢核酸內(nèi)切酶的半位點(diǎn)組成的新識別位點(diǎn)。參見，例如美國專利號8,338,157。

CRISPR或CRISPR/cas系統(tǒng)

CRISPR-Cas系統(tǒng)包含三種基本設(shè)計(jì)組分：1)Cas基因、轉(zhuǎn)錄物(例如，mRNA)或蛋白質(zhì)；2)引導(dǎo)RNA(gRNA)；以及3)crRNA(CRISPR RNA)是從編碼CRISPR重復(fù)陣列的RNA轉(zhuǎn)錄物加工的RNA區(qū)段，其具有與外源DNA位點(diǎn)互補(bǔ)的“原型間隔區(qū)”(例如，內(nèi)源性DNA靶區(qū)域)以及CRISPR重復(fù)的一部分。參見例如，PCT申請?zhí)朩O/2014/093661和WO/2013/176772。

Cas(CRISPR相關(guān)的)基因、轉(zhuǎn)錄物(例如，mRNA)或蛋白質(zhì)

來自質(zhì)粒載體的瞬時Cas表達(dá)指導(dǎo)Cas蛋白遞送和或指導(dǎo)CasmRNA遞送至植物細(xì)胞中。Cas基因針對在高等植物、藻類或酵母中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并且在適用時由組成型、誘導(dǎo)型、阻止特異性或物種特異性啟動子驅(qū)動。Cas轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號是NosT、RBCT、HSP18.2T或其他基因特異性或物種特異性終止子。Cas基因盒或mRNA可包含內(nèi)含子，天然的或與基因特異性啟動子和或合成啟動子組合。Cas蛋白可包含一個或多個核定位信號序列(NLS)、突變、缺失、改變或截短。在瞬時表達(dá)系統(tǒng)中，Cas基因盒可與CRISPR-Cas系統(tǒng)的其他組分如同一瞬時表達(dá)載體上的gRNA盒組合。或者，Cas基因盒可獨(dú)立于gRNA盒或CRISPR-Cas系統(tǒng)的其他組分定位且從構(gòu)建體表達(dá)。CRISPR相關(guān)(Cas)基因編碼具有各種預(yù)測的核酸操作活性的蛋白質(zhì)，如核酸酶、解旋酶和聚合酶。Cas基因包括cas9。Cas9是編碼含有預(yù)測的RuvC樣和HNH核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的大蛋白質(zhì)，并且與存在于大多數(shù)古細(xì)菌和許多細(xì)節(jié)中的CRISPR適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相關(guān)。Cas9蛋白由兩個葉組成：

1)識別(REC)葉-由三個結(jié)構(gòu)域組成：

a)BH(橋螺旋)

b)REC1-有助于RNA引導(dǎo)的DNA靶向

c)REC2-有助于RNA引導(dǎo)的DNA靶向

2)核酸酶(NUC)葉-由三個結(jié)構(gòu)域組成：

a)RuvC-有助于RNA引導(dǎo)的DNA靶向；核酸內(nèi)切酶活性

b)HNH–核酸內(nèi)切酶活性

c)PI-PAM相互作用

在其他實(shí)施方案中，所述Cas基因可以是cas9的同源物，其中RuvC、HNH、REC和BH結(jié)構(gòu)域是高度保守的。在一些實(shí)施方案中，cas基因是來自以下種類的那些。

引導(dǎo)RNA(gRNA)

gRNA或sgRNA(單引導(dǎo)RNA)被工程化為crRNA與反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)序列的一部分之間的融合，其將Cas9引導(dǎo)至與所述原型間隔區(qū)互補(bǔ)的特異性DNA序列。引導(dǎo)RNA可包括含有嵌合RNA設(shè)計(jì)與長tracerRNA雜合體、短tracrRNA雜合體或天然CRISPR陣列+tracrRNA構(gòu)象的表達(dá)盒。嵌合gRNA將crRNA的靶向特異性與tracrRNA的骨架特性組合至單一轉(zhuǎn)錄物中。gRNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)通過物種特異性高等植物RNA聚合酶III啟動子如來自U6或U3snRNA基因家族的那些進(jìn)行控制(Wang等人2008)。gRNA轉(zhuǎn)錄終止根據(jù)Wang等人2008通過聚dT的6-20個核苷酸序列段進(jìn)行控制。gRNA表達(dá)盒位于來自CRISPR-Cas系統(tǒng)的相同或不同瞬時表達(dá)載體上。gRNA轉(zhuǎn)錄物可體外合成且直接遞送至植物細(xì)胞中，獨(dú)立于gRNA瞬時表達(dá)載體或與其組合。

靶區(qū)域

引導(dǎo)RNA包含限定對DNA靶區(qū)域、原型間隔區(qū)和原型間隔區(qū)相鄰基序(PAM)的特異性的兩種組分。通常20個核苷酸、但可基于DNA靶標(biāo)變化的原型間隔區(qū)序列提供對CRISPR-Cas復(fù)合物的DNA序列特異性。DNA靶標(biāo)還包含NNG或NAG三核苷酸序列(PAM)，其中N表示緊鄰原型間隔區(qū)3’或下游的任何核苷酸。

單組分方法

與Le Cong等人(2013)和其他類似，用于CRISPR-Cas基因編輯的簡化的“單組分方法”，其中單一瞬時表達(dá)構(gòu)建體包含CRISPR-Cas復(fù)合物的所有組分，即gRNA和Cas表達(dá)盒兩者。這允許任何給定植物或作物中用于靶向單個或多個基因座的簡單分子設(shè)計(jì)。靶向多個基因座可通過靶標(biāo)特異性gRNA盒中的簡單跳過來實(shí)現(xiàn)。另外，物種特異性啟動子、終止子或其他表達(dá)增強(qiáng)元件可容易地穿梭進(jìn)出“單組分方法”瞬時載體，從而允許以物種特異性方式最優(yōu)表達(dá)gRNA和Cas蛋白。

雙組分方法

在雙組分方法中，Cas和gRNA表達(dá)盒位于不同的瞬時表達(dá)載體上。這允許單獨(dú)地遞送CRISPR-Cas編輯組分，從而允許同一細(xì)胞內(nèi)gRNA與Cas的不同比率。類似于單組份方法，所述雙組分方法還允許影響CRISPR–Cas組分的表達(dá)的啟動子、終止子或其他元件容易地改變且允許以物種特異性方法靶向DNA。

抗生素

另一種類別的核酸內(nèi)切酶是抗生素，其是DNA裂解糖肽，如抗生素的博來霉素家族是DNA裂解糖肽，其包括博來霉素、博萊霉素(zeocin)、腐草霉素(phleomycin)、他利霉素(tallysomycin)、培洛霉素以及在本文進(jìn)一步描述的其他。

其他DNA修飾分子可用于靶向基因重組中。例如，肽核酸可用于將修飾誘導(dǎo)至一個或多個靶細(xì)胞的基因組中(參見例如，Ecker，美國專利號5,986,053，其以引用的方式并入本文)。簡言之，包含至少部分肽主鏈的合成寡核苷酸用于靶向同源基因組核苷酸序列。在結(jié)合雙螺旋DNA之后或通過連接至肽核酸的誘變劑，誘導(dǎo)靶DNA序列的修飾和/或重組發(fā)生。靶向特異性通過靶向序列與基因組序列之間的序列同源性程度測定。

此外，本公開不限于本文用于執(zhí)行基因組序列的修飾的具體方法。確實(shí)，考慮多種方法。例如，可使用三鏈體螺旋形成寡核苷酸(TFO)靶向基因。TFO可例如通過PCR或通過使用基因合成儀設(shè)備合成產(chǎn)生。另外，在發(fā)現(xiàn)適合的天然序列的情況下TFO可分離自基因組DNA。TFO可以多種方式使用，包括例如通過鍵結(jié)至誘變劑如包括但不限于補(bǔ)骨脂素或苯丁酸氮芥(參見例如，Havre等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.90:7879-7883,1993；Havre等,J Virol 67:7323-7331,1993；Wang等,Mol Cell Biol 15:1759-1768,1995；Takasugi等,Proc Nat’l Acad Sci,U.S.A.88:5602-5606,1991；Belousov等,Nucleic Acids Res 25:3440-3444,1997)。此外，例如，TFO可鍵結(jié)至供體雙鏈DNA(參見例如，Chan等,J Biol Chem 272:11541-11548,1999)。TFO還可通過以足夠親和力結(jié)合以引起易錯修復(fù)來起作用(Wang等,Science 271:802-805,1996)。

本文所公開的方法不必限于所使用的DNA修飾試劑的性質(zhì)或類型。例如，這類DNA修飾試劑釋放自由基，所述自由基導(dǎo)致DNA鏈斷裂。或者，所述試劑烷基化DNA以形成將阻斷復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的加合物。在另一個替代方案中，所述試劑產(chǎn)生抑制細(xì)胞酶、從而導(dǎo)致鏈斷裂的交聯(lián)或分子。已經(jīng)連接至寡核苷酸以形成TFO的DNA修飾試劑的實(shí)例包括但不限于，吲哚并咔唑、萘二咸亞安(NDI)、反鉑、博來霉素、環(huán)丙烷并吡咯并吲哚的類似物以及菲并二氫二噁英。具體地說，吲哚并咔唑是拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑。這些酶的抑制導(dǎo)致鏈斷裂和DNA蛋白質(zhì)加合物形成(Arimondo等,Bioorganic and Medicinal Chem.8,777,2000)。NDI是可氧化鳥嘌呤的光氧化劑，所述鳥嘌呤可能引起鳥嘌呤殘基的位點(diǎn)處的突變(Nunez,等,Biochemistry,39,6190,2000)。反鉑已經(jīng)顯示在TFO連接至所述試劑時與三鏈體靶標(biāo)中的DNA反應(yīng)。這種反應(yīng)引起將是致突變的DNA加合物的形成(Columbier,等,Nucleic Acids Research,24:4519,1996)。博來霉素是廣泛作用輻射模擬物的DNA斷裂劑。它已經(jīng)連接至寡核苷酸并且顯示作為呈所述型式的斷裂劑是活性的(Sergeyev,Nucleic Acids Research 23,4400,1995；Kane,等,Biochemistry,34,16715,1995)。環(huán)丙烷并吡咯并吲哚的類似物已經(jīng)連接至TFO并且顯示烷基化三鏈體靶序列中的DNA。烷基化DNA然后將含有將是致突變的化學(xué)加合物(Lukhtanov,等,Nucleic Acids Research,25,5077,1997)。菲并二氫二噁英是在光活化時釋放自由基種類的掩蔽醌。它們已經(jīng)連接至TFO且已經(jīng)顯示在光活化時將斷裂引入雙鏈DNA中(Bendinskas等,Bioconjugate Chem.9,555,1998)。

本公開考慮誘導(dǎo)修飾和/或重組的其他方法。例如，另一個實(shí)施方案涉及誘導(dǎo)外源DNA片段與靶基因之間的同源重組(參見例如，Capecchi等,Science 244:1288-1292,1989)或通過使用具有針對靶向位點(diǎn)的親和力的肽核酸(PNA)。仍然其他方法包括通過聚酰胺進(jìn)行的序列特異性DNA識別和靶向(參見例如，Dervan等,Curr Opin Chem Biol 3:688-693,1999；Biochemistry 38:2143-2151,1999)和使用具有位點(diǎn)特異性活性的核酸酶(例如，鋅指蛋白、TALEN、大范圍核酸酶和/或CRISPR)。

本公開不限于修飾和/或重組的任何特定頻率。在一些實(shí)施方案中，本文公開的方法導(dǎo)致把核苷酸序列中0.2％至3％的修飾頻率。然而，考慮任何修飾和/或重組頻率(即，0％與100％之間)在本公開的范圍內(nèi)。修飾和/或重組頻率取決于用于誘導(dǎo)修飾和/或重組的方法、所使用的細(xì)胞類型、所靶向的特定基因以及所使用的DNA突變試劑(如果存在)。另外，由于檢測方法的限制，用于檢測修飾和/或重組的方法可能不能檢測修飾和/或重組的所有發(fā)生。此外，一些修飾和/或重組事件可能是沉默的，從而未給出已發(fā)生修飾和/或重組的可檢測的指示。不能檢測沉默的修飾和/或重組事件提供修飾和/或重組的人工低估。由于這些原因及其他原因，本公開不必限于任何具體修飾和/或重組頻率。在一個實(shí)施方案中，修飾和/或重組的頻率在0.01％與100％之間。在另一個實(shí)施方案中，修飾和/或重組的頻率在0.01％與50％之間。在另一個實(shí)施方案中，修飾和/或重組的頻率在0.1％與10％之間。在另一個實(shí)施方案中，修飾和/或重組的頻率在0.1％與5％之間。

如本文關(guān)于用能夠?qū)⑼蛔円爰?xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的DNA修飾分子處理的細(xì)胞群體所用的術(shù)語“突變的頻率”是指在處理的群體中與用DNA修飾分子處理的細(xì)胞的總數(shù)目相比含有在靶位點(diǎn)處的突變的細(xì)胞的數(shù)目。例如，相對于用被設(shè)計(jì)來在細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)處引入突變的鍵結(jié)至補(bǔ)骨脂素DNA修飾分子TFO處理的細(xì)胞群體，5％的突變頻率意指在用TFO-補(bǔ)骨脂素處理的總計(jì)100個細(xì)胞之中，5個細(xì)胞含有靶位點(diǎn)處的突變。

雖然本公開不必限于細(xì)胞中DNA修飾和/或重組的任何精確度，但應(yīng)考慮取決于所需結(jié)果，本公開的一些實(shí)施方案要求較高精確度。例如，基因修復(fù)所需的特異性序列變化(例如，特定堿基變化)要求與產(chǎn)生僅需要破壞基因的基因敲除相比更高的精確度。使用本公開的方法，實(shí)現(xiàn)大于現(xiàn)有技術(shù)方法的修飾和/或同源重組的更高精確度水平。

基因修復(fù)寡核堿基至植物細(xì)胞中的遞送

用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的任何通常已知的方法可用于遞送基因修復(fù)寡核苷酸。說明性方法在以下列出。本文的方法和組合物可涉及許多方法中的任一種來用一種或多種DNA修飾試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用于將DNA修飾試劑引入一種或多種細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中熟知的并且包括但不限于，顯微注射、電穿孔、被動吸附、磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染劑、核轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、基因槍(即，粒子轟擊)等。

用于通過射彈穿透將DNA的較大片段引入具有纖維素細(xì)胞壁的植物細(xì)胞中的金屬微載體(微球體)的使用是相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(自此生物射彈遞送)。美國專利號4,945,050；5,100,792和5,204,253描述用于選擇用于發(fā)射它們的微載體和裝置的一般技術(shù)。

在本文公開的方法中使用微載體的具體條件可包括描述于國際公布WO 99/07865中的條件。在說明性技術(shù)中，按順序添加冰冷的微載體(60mg/mL)、混合雙鏈寡核苷酸(60mg/mL)、2.5M CaCl₂和0.1M亞精胺；例如通過渦旋輕輕攪拌混合物10分鐘，并且然后在室溫下靜置10分鐘，隨后將微載體在5體積的乙醇中稀釋，離心并重懸于100％乙醇中。在粘附溶液使用8-10μg/μL微載體、14-17μg/mL混合雙鏈寡核苷酸、1.1-1.4M CaCl₂和18-22mM亞精胺的濃度可獲得良好結(jié)果。在8μg/μL微載體、16.5μg/mL混合雙鏈寡核苷酸、1.3M CaCl₂和21mM亞精胺的條件下觀察到最佳結(jié)果。

還可使用微纖維將基因修復(fù)寡核堿基引入植物細(xì)胞中以穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。Coffee等的美國專利號5,302,523描述使用碳化硅纖維來促進(jìn)黑色墨西哥甜的苞米懸浮培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化?？捎糜谑褂梦⒗w維引入用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的DNA的任何機(jī)械技術(shù)可用于遞送用于衍變的基因修復(fù)寡核堿基。

用于基因修復(fù)寡核堿基的微纖維遞送的示例性技術(shù)是如下：將無菌微纖維(2μg)懸浮在150μL的含有約10μg的混合雙鏈寡核苷酸的植物培養(yǎng)基中。使懸浮培養(yǎng)物沉降并且將等體積的壓積細(xì)胞和無菌纖維/核苷酸懸浮液渦旋10分鐘并接種。立即或在達(dá)約120小時的延遲情況下(如對于特定性狀適當(dāng)?shù)?施加選擇性培養(yǎng)基。

在替代實(shí)施方案中，基因修復(fù)寡核堿基可通過來源于植物部分的原生質(zhì)體的電穿孔遞送至植物細(xì)胞。根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)通過植物部分、特別是葉的酶處理來形成原生質(zhì)體。參見，例如Gallois等,1996,Methods in Molecular Biology 55:89-107,Humana Press,Totowa,N.J.；Kipp等,1999,Methods in Molecular Biology 133:213-221,Humana Press,Totowa,NJ。原生質(zhì)體不需要在電穿孔之前在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于電穿孔的示例性條件是0.3mL總體積中的300,000個原生質(zhì)體，其中基因修復(fù)寡核堿基的濃度是0.6-4μg/mL之間。

在一個替代實(shí)施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的技術(shù)在膜修飾劑聚乙二醇的存在由植物原生質(zhì)體攝取核酸。在另一個替代實(shí)施方案中，基因修復(fù)寡核堿基可通過用微毛細(xì)管將其注射至植物細(xì)胞中或至原生質(zhì)體中來遞送。

在一個替代實(shí)施方案中，將核酸包埋在由藻酸鈣組成的微珠中并且在存在膜修飾劑聚乙二醇的情況下由植物原生質(zhì)體攝取(參見例如，Sone等,2002,Liu等,2004)。

在一個替代實(shí)施方案中，將核酸冷凍在水中并且通過轟擊以微顆粒的形式引入植物細(xì)胞中(參見例如，Gilmore,1991,美國專利5,219,746；Brinegar等)。

在一個替代實(shí)施方案中，將連接至納米顆粒的核酸通過在含有所述納米顆粒的懸浮液中孵育細(xì)胞來引入完整植物細(xì)胞中(參見例如，Pasupathy等,2008)或通過經(jīng)由顆粒轟擊將它們遞送至完整細(xì)胞或通過共孵育將它們遞送至原生質(zhì)體中(參見，例如Torney等,2007)。

在一個替代實(shí)施方案中，使核酸與穿透肽復(fù)合且通過共孵育遞送至細(xì)胞中(參見例如，Chugh等,2008,WO 2008148223A1；Eudes和Chugh)。

在一個替代實(shí)施方案中，通過電穿孔將核酸引入完整細(xì)胞中(參見例如，He等,1998,US 2003/0115641A1,Dobres等)。

在一個替代實(shí)施方案中，通過將干燥胚胎細(xì)胞浸漬在具有核酸的溶液中來將核酸遞送至細(xì)胞中(參見例如，等,1989,Senaratna等,1991)或在一些實(shí)施方案中通過Cellsqueeze(SQZ Biotech)引入。

植物的選擇

在不同實(shí)施方案中，如本文所公開的植物可以是雙子葉植物、單子葉植物或裸子植物的任何物種，包括作為樹或灌木生長的任何木本植物物種、任何草本物種或產(chǎn)生食用水果、種子或蔬菜的任何物種或產(chǎn)生彩色或芳香花的任何物種。例如，植物可選自由以下組成的組的植物物種：芥花、向日葵、玉米、煙草、甜菜、棉花、苞米、小麥、大麥、水稻、苜蓿、大麥、高粱、西紅柿、芒果、桃子、蘋果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、木薯、土豆、胡蘿卜、萵苣、洋蔥、大豆、大豆屬、甘蔗、豌豆、鷹嘴豆、紫花豌豆、蠶豆、扁豆、蕪菁、蕪菁甘藍(lán)、球芽甘藍(lán)、羽扇豆、花椰菜、羽衣甘藍(lán)、菜豆、楊樹、松樹、桉樹、葡萄、柑橘、黑小麥、苜蓿、黑麥、燕麥、草皮和牧草、亞麻、油菜、芥菜、黃瓜、牽?；?、香脂、辣椒、茄子、萬壽菊、蓮花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鳶尾、百合以及產(chǎn)堅(jiān)果植物(在它們尚未具體地提及的情況下)。

可使用本領(lǐng)域中通常已知的方法針對對除草劑的抗性或耐受性對植物和植物細(xì)胞進(jìn)行測試，例如通過在存在除草劑的情況下生長植物或植物細(xì)胞且測量相較于在不存在除草劑情況下的生長的生長速率。

如本文所用，植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的基本上正常生長被定義為植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的生長率或細(xì)胞分裂率為表達(dá)野生型目標(biāo)蛋白的對應(yīng)植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的生長率或細(xì)胞分裂率的至少35％、至少50％、至少60％或至少75％。

如本文所用，植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞的基本上正常發(fā)育被定義為植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞中的一個或多個發(fā)育事件的出現(xiàn)與在表達(dá)野生型蛋白質(zhì)的對應(yīng)植物、植物器官、植物組織或植物細(xì)胞中發(fā)生的那些發(fā)育事件基本上相同。

在某些實(shí)施方案中，本文提供的植物器官包括但不限于葉、莖、根、葉芽、花芽、分生組織、胚芽、子葉、胚乳、萼片、花瓣、雌蕊、心皮、雄蕊、花藥、小孢子、花粉、花粉管、胚珠、子房和果實(shí)或從其取得的切片、薄片或盤。植物組織包括但不限于愈傷組織、基本組織、維管組織、貯藏組織、分生組織、葉片組織、莖組織、根組織、冠癭組織、植物腫瘤組織以及再生組織。植物細(xì)胞包括但不限于具有細(xì)胞壁的分離的細(xì)胞、其各種大小的聚集體以及原生質(zhì)體。

當(dāng)與由類似經(jīng)受的非耐受樣植物提供的相比，植物當(dāng)其經(jīng)受相關(guān)除草劑時是對所述除草劑基本上“耐受性的”并且提供轉(zhuǎn)移至右側(cè)的劑量/響應(yīng)曲線。這類劑量/響應(yīng)曲線具有繪制在X軸上的“劑量”和繪制在y軸上的“致死百分比”、“除草作用”等。耐受性植物將需要比非耐受性樣植物更多的除草劑，以便產(chǎn)生給定除草作用。當(dāng)經(jīng)受在通常由農(nóng)用化學(xué)品團(tuán)體用于殺死地中的雜草的濃度和比例下的除草劑時，對除草劑基本上“抗性”的植物展示很少(如果有)壞死、溶解、褪綠或其他損害。對除草劑具有抗性的植物還是能夠容忍除草劑的。

植物的產(chǎn)生

植物物種的不同組織的組織培養(yǎng)和自其再生植物是已知的。例如，通過組織培養(yǎng)繁育芥花栽培品系在以下的任一者中描述但不限于以下中的任一者：Chuong等,"A Simple Culture Method for Brassica hypocotyls Protoplasts,"Plant Cell Reports 4:4-6,1985；Barsby,T.L.,等,"A Rapid and Efficient Alternative Procedure for the Regeneration of Plants from Hypocotyl Protoplasts of Brassica napus,"Plant Cell Reports (Spring,1996)；Kartha,K.,等,"In vitro Plant Formation from Stem Explants of Rape,"Physiol.Plant,31:217-220,1974；Narasimhulu,S.,等,"Species Specific Shoot Regeneration Response of Cotyledonary Explants of Brassicas,"Plant Cell Reports(Spring 1988)；Swanson,E.,"Microspore Culture in Brassica,"Methods in Molecular Biology,第6卷,第17章,第159頁,1990。

變種的進(jìn)一步繁殖可通過組織培養(yǎng)和再生發(fā)生。大豆的不同組織的組織培養(yǎng)和自其再生植物是熟知的和廣泛公布的。例如，可參考Komatsuda,T.等,"Genotype X Sucrose Interactions for Somatic Embryogenesis in Soybeans,"Crop Sci.31:333-337,1991；Stephens,P.A.,等,"Agronomic Evaluation of Tissue-Culture-Derived Soybean Plants,"Theor.Appl.Genet.82:633-635,1991；Komatsuda,T.等,"Maturation and Germination of Somatic Embryos as Affected by Sucrose and Plant Growth Regulators in Soybeans Glycine gracilis Skvortz and Glycine max(L.)Merr."Plant Cell,Tissue and Organ Culture,28:103-113,1992；Dhir,S.等,"Regeneration of Fertile Plants from Protoplasts of Soybean(Glycine max L.Merr.)；Genotypic Differences in Culture Response,"Plant Cell Reports 11:285-289,1992；Pandey,P.等,"Plant Regeneration from Leaf and Hypocotyl Explants of Glycine wightii(W.and A.)VERDC.var.longicauda,"Japan J.Breed.42:1-5,1992；以及Shetty,K.,等,"Stimulation of In Vitro Shoot Organogenesis in Glycine max(Merrill.)通過尿囊素和酰胺,"Plant Science 81:245-251,1992。Collins等的1991年6月18日頒布的美國專利號5,024,944和Ranch等的1991年4月16日頒布的美國專利號5,008,200特此以引用的方式整體并入本文。

示例性實(shí)施方案

除了所描述的和在本公開其他地方提供的方面和實(shí)施方案，具體地考慮特定實(shí)施方案的以下非限制性列表。

1.一種引起細(xì)胞中的遺傳變化的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于DNA切割體和修飾的GRON。

2.一種細(xì)胞，其包含DNA切割體和GRON。

3.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自由以下組成的組的細(xì)胞的一種或多種物種：植物、細(xì)菌、酵母、真菌、藻類以及哺乳動物。

4.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自由以下組成的組的細(xì)胞的一種或多種物種：大腸桿菌、恥垢分枝桿菌、枯草桿菌、小球藻、蘇云金芽孢桿菌、釀酒酵母、解脂耶氏酵母、Chlamydamonas rhienhardtii、畢赤酵母、棒狀桿菌、黑曲霉以及粗糙脈孢菌。擬南芥、馬鈴薯、富利亞薯、水稻、大豆、糙果莧、亞麻以及玉米

5.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是解脂耶氏酵母。

6.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是不為釀酒酵母的酵母細(xì)胞。

7.一種引起植物細(xì)胞中的遺傳變化的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于DNA切割體和修飾的GRON。

8.一種植物細(xì)胞，其包含DNA切割體和修飾的GRON。

9.一種引起植物細(xì)胞中的遺傳變化的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于DNA切割體和包含DNA和RNA的GRON。

10.一種植物細(xì)胞，其包含DNA切割體，所述DNA切割體包含DNA和RNA。

11.一種引起細(xì)胞中的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因的遺傳變化的方法，其中所述遺傳變化在一個或多個氨基酸位置處引起所述乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)中的變化，所述位置選自由以下組成的組：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2078、2079、2080和2088，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于修飾的GRON。

12.一種引起細(xì)胞中的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因的遺傳變化的方法，其中所述遺傳變化在一個或多個氨基酸位置處引起所述乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)中的變化，所述位置選自由以下組成的組：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2078、2079、2080和2088，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于DNA切割體和修飾的GRON。

13.一種用于產(chǎn)生植物或植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將具有乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因中的靶向突變的基因修復(fù)寡核堿基(GRON)引入植物細(xì)胞中以便產(chǎn)生具有ACC酶基因的植物細(xì)胞，所述ACC酶基因表達(dá)ACC酶蛋白，所述ACC酶蛋白包含在對應(yīng)于選自由以下組成的組的位置的一個或多個氨基酸位置處的突變：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2078、2079、2080和2088。

14.一種用于產(chǎn)生植物或植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將DNA切割體和具有乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因中的靶向突變的基因修復(fù)寡核堿基(GRON)引入植物細(xì)胞中以便產(chǎn)生具有ACC酶基因的植物細(xì)胞，所述ACC酶基因表達(dá)ACC酶蛋白，所述ACC酶蛋白包含在對應(yīng)于選自由以下組成的組的位置的一個或多個氨基酸位置處的突變：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2078、2079、2080和2088。

15.一種能育植物，其包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號的位置2078處的突變。

16.一種能育水稻植物，其包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在基于大穗看麥娘參考序列SEQ IDNO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號的位置2078處的突變。

17.一種植物細(xì)胞，其包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號的位置2078處的突變；并且還包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在一個或多個氨基酸位置處的突變，所述位置選自由以下組成的組：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2079、2080和2088。

18.一種能育植物細(xì)胞，其包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號的位置2078處的突變；并且還包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在一個或多個氨基酸位置處的突變，所述位置選自由以下組成的組：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2079、2080和2088。

19.一種引起細(xì)胞中的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因的遺傳變化的方法，其中所述遺傳變化在基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號的位置2078處引起所述乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)蛋白中的變化，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于修飾的GRON。

20.一種引起細(xì)胞中的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因的遺傳變化的方法，其中所述遺傳變化在基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號的位置2078處引起所述乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)蛋白中的變化，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于DNA切割體和修飾的GRON。

21.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法、植物或細(xì)胞，其中乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因中的所述突變或變化(如果存在)產(chǎn)生包含選自由以下組成的組的一個或多個的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)蛋白：在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至亮氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至蛋氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至天冬酰胺；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至絲氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至蘇氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至纈氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1783的位置處的甘氨酸至半胱氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1786的位置處的丙氨酸至脯氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2078的位置處的天冬氨酸至甘氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2078的位置處的天冬氨酸至賴氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2078的位置處的天冬氨酸至蘇氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2079的位置處的絲氨酸至苯丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2080的位置處的賴氨酸至谷氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至苯丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至甘氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至組氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置的位置2088處的半胱氨酸至賴氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至亮氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至天冬酰胺；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至脯氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至谷氨酰胺；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至精氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至絲氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至蘇氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至纈氨酸；以及在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至色氨酸。

22.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的植物或細(xì)胞，或通過如前述實(shí)施方案所述的方法中的任一種制備的植物或植物細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞包含乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)蛋白，所述蛋白包含選自由以下組成的組的一個或多個：在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至亮氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至蛋氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至天冬酰胺；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至絲氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至蘇氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1781的位置處的異亮氨酸至纈氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1783的位置處的甘氨酸至半胱氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1786的位置處的丙氨酸至脯氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2078的位置處的天冬氨酸至甘氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2078的位置處的天冬氨酸至賴氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2078的位置處的天冬氨酸至蘇氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2079的位置處的絲氨酸至苯丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2080的位置處的賴氨酸至谷氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至苯丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至甘氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至組氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置的位置2088處的半胱氨酸至賴氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至亮氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至天冬酰胺；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至脯氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至谷氨酰胺；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至精氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至絲氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至蘇氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至纈氨酸；以及在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置2088的位置處的半胱氨酸至色氨酸。

23.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的植物或細(xì)胞，或通過如前述實(shí)施方案所述的方法中的任一種制備的植物或細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在一個或多個氨基酸位置處的突變，所述位置選自由以下組成的組：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2078、2079、2080和2088。

24.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的植物或細(xì)胞，或通過如前述實(shí)施方案所述的方法中的任一種制備的植物或細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號的位置2078處的突變；并且還包含編碼蛋白質(zhì)的乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)基因，所述蛋白質(zhì)包含在一個或多個氨基酸位置處的突變，所述位置選自由以下組成的組：基于大穗看麥娘參考序列SEQ ID NO:1或在ACC酶橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號1781、1783、1786、2079、2080和2088。

在前述ACC酶實(shí)施方案11-24中的任一項(xiàng)中，無論是方法、植物、細(xì)胞或是其他，以下是在其中使用的適合突變：

替代突變包括但不限于以下：

關(guān)于實(shí)施方案11-24，與基于大穗看麥娘參考序列的編號的1781m、1783、1786、2078、2079和2080對應(yīng)的位置是本領(lǐng)域中熟知的且可容易地從適當(dāng)?shù)男蛄袛?shù)據(jù)庫獲得。作為舉例，以下表示出水稻ACC酶序列中的對應(yīng)位置：

Am：大穗看麥娘；OsI：水稻秈稻品種；OsJ：水稻粳稻品種

25.一種用于產(chǎn)生具有突變的EPSPS基因的植物或植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因中的靶向突變的基因修復(fù)寡核堿基(GRON)引入植物細(xì)胞中以便產(chǎn)生具有EPSPS基因的植物細(xì)胞，所述EPSPS基因表達(dá)EPSPS蛋白，所述EPSPS蛋白包含在對應(yīng)于選自由以下組成的組的位置的一個或多個氨基酸位置處的突變：基于大腸桿菌參考序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列或在EPSPS橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號96、97和101。

26.一種用于產(chǎn)生具有突變的EPSPS基因的植物或植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將DNA切割體和具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因中的靶向突變的基因修復(fù)寡核堿基(GRON)引入植物細(xì)胞中以便產(chǎn)生具有EPSPS基因的植物細(xì)胞，所述EPSPS基因表達(dá)EPSPS蛋白，所述EPSPS蛋白包含在對應(yīng)于選自由以下組成的組的位置的一個或多個氨基酸位置處的突變：基于大腸桿菌參考序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列或在EPSPS橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號96、97和101。

27.一種具有突變的EPSPS基因的植物或細(xì)胞，其中所述植物或細(xì)胞是通過將DNA切割體和具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因中的靶向突變的基因修復(fù)寡核堿基(GRON)引入植物細(xì)胞中以便產(chǎn)生具有EPSPS基因的植物細(xì)胞的方法制備的，所述EPSPS基因表達(dá)EPSPS蛋白，所述EPSPS蛋白包含在對應(yīng)于選自由以下組成的組的位置的一個或多個氨基酸位置處的突變：基于大腸桿菌參考序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列或在EPSPS橫向同源物中的類似氨基酸殘基處的編號96、97和101。

28.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的植物或細(xì)胞，或通過如前述實(shí)施方案所述的方法中的任一種制備的植物或細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞表達(dá)EPSPS蛋白，所述蛋白包含選自由以下組成的組的一個或多個氨基酸位置處的突變：在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置96的位置處的甘氨酸至丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置97的位置處的蘇氨酸至異亮氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置101的位置處的脯氨酸至丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置101的位置處的脯氨酸至絲氨酸；以及在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置101的位置處的脯氨酸至蘇氨酸。

29.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的植物或細(xì)胞，或通過如前述實(shí)施方案所述的方法中的任一種制備的植物或細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞表達(dá)EPSPS蛋白，所述蛋白包含選自由以下組成的組的突變組合：在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置97的位置處的蘇氨酸至異亮氨酸和在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置101的位置處的脯氨酸至丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置97的位置處的蘇氨酸至異亮氨酸和在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置101的位置處的脯氨酸至丙氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置97的位置處的蘇氨酸至異亮氨酸和在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置101的位置處的脯氨酸至絲氨酸；在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置97的位置處的蘇氨酸至異亮氨酸和在對應(yīng)于SEQ ID NO:2的位置101的位置處的脯氨酸至蘇氨酸。

關(guān)于實(shí)施方案25-30，與基于大腸桿菌參考序列SEQ ID NO：2的編號的96、97和101對應(yīng)的位置是本領(lǐng)域中熟知的且可容易地從適當(dāng)?shù)男蛄袛?shù)據(jù)庫獲得。參見，例如美國專利號8,268,622。作為舉例，以下表示出亞麻EPSPS序列中的對應(yīng)位置：

亞麻EPSPS

大腸桿菌EPSPS序列是AroA，其具有序列

MESLTLQPIARVDGTINLPGSKTVSNRALLLAALAHGKTVLTNLLDSDDVRHMLNALTALGVSYTLSADRTRCEIIGNGGPLHAEGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGSNDIVLTGEPRMKERPIGHLVDALRLGGAKITYLEQENYPPLRLQGGFTGGNVDVDGSVSSQFLTALLMTAPLAPEDTVIRIKGDLVSKPYIDITLNLMKTFGVEIENQHYQQFVVKGGQSYQSPGTYLVEGDASSASYFLAAAAIKGGTVKVTGIGRNSMQGDIRFADVLEKMGATICWGDDYISCTRGELNAIDMDMNHIPDAAMTIATAALFAKGTTRLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVEEGHDYIRITPPEKLNFAEIATYNDHRMAMCFSLVALSDTPVTILDPKCTAKTFPDYFEQLARISQAA

亞麻基因1序列是lcl-g41452_1333，其具有序列

MALVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRRSGNVAAAAAAPLRVSASLTTAAEKASTVPEEVVLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSEGTTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGCGGVFPVGKLAKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVTCSSTSCPPVHVNGQGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPGNAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVIWTENSVTVTGPPRDASGRKHLRAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAICTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLNIAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH

亞麻基因2序列是lcl-g40547_1271，其具有序列

MAQVTKICGGANAVALPATFGTRRTKSISSSVSFRSSTSPPSLKQRRLLGNVAAAAAAAPLRISASLATAAEKASTVPEEIVLQPIKDISGIVTLPGSKSLSNRILLLAALSFGKTVVDNLLNSDDVHYMLGALKTLGLNVEHSSEQKRAIVEGRGGVFPVGKLGKNDIELFLGNAGTAMRPLTAAVTAAGGNSSYILDGVPRMRERPIGDLVVGLKQLGADVSCSSTSCPPVHVNAKGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVDMTLKLMERFGVAVEHSGSWDRFFVKGGQKYKSPGNAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTITVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVTWTETSVTVTGPPRDASGKKHLRAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALYADGPTAIRDVASWRVKETERMIAVCTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLSIAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPVTIRDPGCTKKTFPDYFEVLERYTKH

30.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述DNA切割體是選自CRISPR、TALEN、鋅指、大范圍核酸酶以及DNA切割抗生素的一種或多種。

31.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述DNA切割體是CRISPR或TALEN。

32.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述DNA切割體是CRISPR。

33.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述DNA切割體是TALEN。

34.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述DNA切割體是選自由以下各項(xiàng)組成的組的一種或多種DNA切割抗生素：博來霉素(bleomycin)、博菜霉素(zeocin)、腐草霉素、他利霉素以及培洛霉素。

35.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述DNA切割體是博菜霉素(zeocin)。

36.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON是單鏈的。

37.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON是化學(xué)保護(hù)的寡核苷酸。

38.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在5’端受保護(hù)的化學(xué)保護(hù)的寡核苷酸。

39.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在3’端受保護(hù)的化學(xué)保護(hù)的寡核苷酸。

40.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端和所述3’端受保護(hù)的化學(xué)保護(hù)的寡核苷酸。

41.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含選自Cy3基團(tuán)、3PS基團(tuán)和2’-O-甲基的一個或多個。

42.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含Cy3基團(tuán)。

43.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端上的所述第一堿基處的Cy3基團(tuán)。

44.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述3’端上的所述第一堿基處的Cy3基團(tuán)。

45.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含3PS基團(tuán)。

46.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含兩個或更多個3PS基團(tuán)。

47.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含三個或更多個3PS基團(tuán)。

48.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端上的所述第一堿基處的3PS基團(tuán)。

49.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述3’端上的所述第一堿基處的3PS基團(tuán)。

50.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含2’-O-甲基。

51.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含兩個或更多個2’-O-甲基。

52.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端上的所述第一堿基處的2’-O-甲基。

53.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON在所述5’端上的所述第一堿基處具有2’-O-甲基并且不具有任何其他2’-O-甲基。

54.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前兩個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

55.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前三個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

56.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前四個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

57.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前五個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

58.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前六個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

59.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前七個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

60.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前八個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

61.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前九個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

62.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的前十個或更多個堿基中的每個上的2’-O-甲基。

63.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON包含在所述5’端處的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個RNA堿基。

64.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON相對于所述靶序列具有搖擺堿基對以獲得所述遺傳變化。

65.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是15與60個核苷酸之間。

66.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是41個核苷酸。

67.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是50與110個核苷酸之間。

68.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是101個核苷酸。

69.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是150與210個核苷酸之間。

70.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是201個核苷酸。

71.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是70與210個核苷酸之間。

72.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于70個核苷酸。

73.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于100個核苷酸。

74.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于165個核苷酸。

75.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于175個核苷酸。

76.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于185個核苷酸。

77.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于195個核苷酸。

78.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于200個核苷酸。

79.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于210個核苷酸。

80.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于220個核苷酸。

81.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于230個核苷酸。

82.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于240個核苷酸。

83.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于250個核苷酸。

84.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于260個核苷酸。

85.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于270個核苷酸。

86.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于280個核苷酸。

87.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于290個核苷酸。

88.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于300個核苷酸。

89.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于400個核苷酸。

90.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于500個核苷酸。

91.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于600個核苷酸。

92.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于700個核苷酸。

93.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于800個核苷酸。

94.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于900個核苷酸。

95.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述GRON的長度是長于1000個核苷酸。

96.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物細(xì)胞選自由以下組成的組：芥花、向日葵、玉米、煙草、甜菜、棉花、苞米、小麥、大麥、水稻、苜蓿、大麥、高粱、西紅柿、芒果、桃子、蘋果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、木薯、土豆、胡蘿卜、萵苣、洋蔥、大豆、大豆屬、甘蔗、豌豆、鷹嘴豆、紫花豌豆、蠶豆、扁豆、蕪菁、蕪菁甘藍(lán)、球芽甘藍(lán)、羽扇豆、花椰菜、羽衣甘藍(lán)、菜豆、楊樹、松樹、桉樹、葡萄、柑橘、黑小麥、苜蓿、黑麥、燕麥、草皮和牧草、亞麻、油菜、芥菜、黃瓜、牽牛花、香脂、辣椒、茄子、萬壽菊、蓮花、卷心菜、菊花、康乃馨、郁金香、鳶尾以及百合。

97.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是芥花。

98.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是玉米。

99.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是苞米。

100.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是水稻。

101.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是高粱。

102.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是土豆。

103.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是大豆。

104.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是亞麻。

105.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是油菜。

106.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是木薯。

107.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物是向日葵。

108.一種引起植物細(xì)胞中的遺傳變化的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞暴露于CRISPR和修飾的GRON。

109.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中進(jìn)行多種遺傳變化。

110.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中使用兩個或更多個引導(dǎo)RNA。

111.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述多于一個引導(dǎo)RNA中的每個與用于遺傳變化的不同靶標(biāo)互補(bǔ)

112.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述CRISPR包含切口酶。

113.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述DNA切割體包含兩種或更多種切口酶。

114.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中兩種或更多種切口酶在所述靶核酸序列的相對鏈上切割。

115.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中兩種或更多種切口酶在所述靶核酸序列的同一鏈上切割。

116.一種非轉(zhuǎn)基因除草劑抗性或耐性植物，其通過如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或由如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞制備。

117.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞具有乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)的遺傳變化或突變，并且選自由以下組成的組：大麥、苞米、小米、燕麥、黑麥、水稻、高粱、甘蔗、草皮草和小麥。

118.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞具有乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)的遺傳變化或突變并且是對一種或多種除草劑抗性或耐性的。

119.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞具有乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)的遺傳變化或突變，是對一種或多種ACC酶抑制性除草劑抗性的。

120.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞具有乙酰輔酶A羧化酶(ACC酶)的遺傳變化或突變，是對選自由以下組成的組的一種或多種除草劑抗性的：禾草滅、丁氧環(huán)酮、烯草酮、cloproxydim，噻草酮、稀禾定、吡喃草酮、肟草酮、chlorazifop、炔草酯、clofop、禾草靈、噁唑禾草靈、精噁唑禾草靈、噻唑禾草靈、吡氟禾草靈、精吡氟禾草靈、吡氟氯禾靈、精吡氟氯禾靈、異噁草醚、喔草酯、喹禾靈、精喹禾靈、三氟禾草肟、唑啉草酯、這些除草劑中的任一種的農(nóng)學(xué)上可接受的鹽和酯以及其組合。

121.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)中的遺傳變化或突變，并且其中所述植物細(xì)胞選自由以下組成的組：玉米、小麥、水稻、大麥、高粱、燕麥、黑麥、甘蔗、大豆、棉花、甜菜、油菜、芥花、亞麻、木薯、向日葵、土豆、煙草、西紅柿、苜蓿、楊樹、松樹、桉樹、蘋果、萵苣、豌豆、扁豆、葡萄以及草皮草。

122.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)中的遺傳變化或突變，并且其中植物或植物細(xì)胞是對至少一種除草劑抗性的。

123.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)中的遺傳變化或突變，并且其中植物或植物細(xì)胞是對磷酰甲基甘氨酸家族的除草劑抗性的。

124.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)中的遺傳變化或突變，并且其中植物或植物細(xì)胞是對草甘膦抗性的。

125.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述植物或植物細(xì)胞具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)中的遺傳變化或突變，并且其中植物或植物細(xì)胞選自由以下組成的組：玉米、小麥、水稻、大麥、高粱、燕麥、黑麥、甘蔗、大豆、棉花、甜菜、油菜、芥花、亞麻、木薯、向日葵、土豆、煙草、西紅柿、苜蓿、楊樹、松樹、桉樹、蘋果、萵苣、豌豆、扁豆、葡萄以及草皮草。

126.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的一個等位基因處發(fā)生。

127.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的兩個等位基因處發(fā)生。

128.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的三個等位基因處發(fā)生。

129.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的四個等位基因處發(fā)生。

130.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個或十二個等位基因處發(fā)生。

131.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變包含產(chǎn)生所述基因的一個等位基因的敲除的缺失或插入。

132.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變包含產(chǎn)生所述基因的兩個等位基因的敲除的缺失或插入。

133.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變包含產(chǎn)生所述基因的三個等位基因的敲除的缺失或插入。

134.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變包含產(chǎn)生所述基因的四個等位基因的敲除的缺失或插入。

135.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變包含產(chǎn)生所述基因的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個或十二個等位基因的敲除的缺失或插入。

136.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的一個等位基因處發(fā)生，并且所述基因的第二等位基因包含產(chǎn)生所述第二等位基因的敲除的缺失或插入。

137.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的一個等位基因處發(fā)生，并且所述基因的第二等位基因和第三等位基因包含產(chǎn)生所述第二等位基因和所述第三等位基因的敲除的缺失或插入。

138.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化或突變在所述基因的一個等位基因處發(fā)生，并且所述基因的第二等位基因、第三等位基因和第四等位基因包含產(chǎn)生所述第二等位基因、所述第三等位基因和所述第四等位基因的敲除的缺失或插入。

139.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化包含在一個等位基因處的至少一個突變以及在另一個等位基因處的至少一個敲除。

140.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化包含在一個等位基因處的至少一個突變以及在至少一個其他等位基因處的至少一個敲除。

141.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化包含在一個等位基因處的至少一個突變以及在至少兩個其他等位基因處的至少一個敲除。

142.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化包含在一個等位基因處的至少一個突變以及在至少三個其他等位基因處的至少一個敲除。

143.如前述實(shí)施方案中任一項(xiàng)所述的方法或細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中的遺傳變化包含在一個等位基因處的至少一個突變以及所有其他等位基因中的敲除。

實(shí)施例

以下是實(shí)施例，所述實(shí)施例說明用于實(shí)踐本文所述的方法和組合物的程序。這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制性的。

實(shí)施例1：GRON長度

Sommer等(Mol Biotechnol.33:115-22,2006)描述了用于檢測體內(nèi)基因轉(zhuǎn)化的報(bào)道系統(tǒng)，所述系統(tǒng)依賴于單核苷酸變化在綠色熒光蛋白(GFP)變體中在藍(lán)色與綠色熒光之間轉(zhuǎn)換。這種報(bào)道系統(tǒng)適用于使用擬南芥作為模型物種以便評定在GRON長度的修飾之后GRON轉(zhuǎn)化的效率的以下實(shí)驗(yàn)中。

簡言之，對于此實(shí)施例和后續(xù)實(shí)施例，通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生具有藍(lán)色熒光蛋白基因的多個拷貝的擬南芥品系(參見例如，Clough和Brent,1998)。用此品系建立源自根的分生組織培養(yǎng)物，其用于原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)(參見例如，Mathur等,1995)。GRON遞送至原生質(zhì)體中通過聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的GRON攝取至原生質(zhì)體中來實(shí)現(xiàn)。使用與由Fujiwara和Kato(2007)描述的方法類似的使用96孔型式的方法。在以下簡要描述方案。所給出的體積是施加至96孔培養(yǎng)皿的單獨(dú)孔的體積。

1.將6.25μl的GRON(80μM)與25μl的擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因根分生組織源性的原生質(zhì)體在于96孔板的每個孔中5x10⁶個細(xì)胞/ml下進(jìn)行混合。

2.添加31.25μl的40％PEG溶液并且混合原生質(zhì)體。

3.將處理的細(xì)胞在冰上孵育30分鐘。

4.向每個孔添加200μl的W5溶液且混合細(xì)胞。

5.使板在冰上孵育30分鐘，從而允許原生質(zhì)體沉降至每個孔的底部。

6.除去在沉降的原生質(zhì)體以上的200μl培養(yǎng)基。

7.添加85μl的培養(yǎng)基(MSAP，參見Mathur等,1995)。

8.將板在室溫下在黑暗中孵育48小時。在添加培養(yǎng)基之后GRON的最終濃度是8μM。

在GRON遞送之后四十八小時，通過流式細(xì)胞術(shù)對樣品進(jìn)行分析以便檢測綠色和黃色熒光不同于對照原生質(zhì)體的綠色和黃色熒光的原生質(zhì)體(BFP0指示與BFP靶標(biāo)相比非靶向GRON無變化；C是編碼鏈設(shè)計(jì)且NC是非編碼鏈設(shè)計(jì))。單一C至T核苷酸差異(編碼鏈)或G至A核苷酸靶向BFP4分子中心中的突變(非編碼鏈)。綠色熒光由在BFP基因中引入靶向突變引起，從而導(dǎo)致GFP的合成。圖1中示出了結(jié)果。

表2示出被設(shè)計(jì)用于將藍(lán)色熒光蛋白(BFP)基因轉(zhuǎn)化成綠色熒光的示例性101聚體和201聚體BFP4/NC 5’-3PS/3’-3PS GRON的序列。“3PS”指示在5’和3’寡核苷酸端中的每個處的3個硫代磷酸酯鍵聯(lián))。

表2.用于BFP至GFP轉(zhuǎn)化的示例性GRON核苷酸序列

*＝PS鍵聯(lián)(硫代磷酸酯)

實(shí)施例2：使用5’Cy3/3’idC標(biāo)記的GRON的轉(zhuǎn)化率

這一系列實(shí)施例的目的是比較硫代磷酸酯(PS)標(biāo)記的GRON(GRON的每一端具有3PS部分)至5’Cy3/3’idC標(biāo)記的GRON的效率。5’Cy3/3’idC標(biāo)記的GRON具有5’Cy3熒光團(tuán)(亞磷酰胺)和3’idC反向堿基。使用藍(lán)色熒光蛋白(BFP)至綠色熒光的轉(zhuǎn)化評定效率。

在所有三個實(shí)施例中，通過將GRON PEG遞送至單獨(dú)Falcon管(標(biāo)記的“管”)或96孔板(標(biāo)記的“96孔培養(yǎng)皿”)進(jìn)行，如通過細(xì)胞計(jì)量術(shù)所測定，在BFP至GFP轉(zhuǎn)化效率方面在不同GRON化學(xué)之間不存在顯著差異(圖1)。

實(shí)施例3：41聚體BFP4/NC 5’-3PS/3’-3PS GRON與2’-O-Me GRON之間的比較

這一系列實(shí)施例的目的是在存在和不存在多種博來霉素家族Zeocin^TM(1mg/ml)以誘導(dǎo)DNA斷裂的情況下，比較在GRON的各端具有3PS部分的硫代磷酸酯(PS)標(biāo)記的GRON與2’-O-Me或“岡崎片段GRON”的轉(zhuǎn)化效率。這些GRON的設(shè)計(jì)在圖2中描繪。通過PEG處理將GRON遞送至擬南芥BFP原生質(zhì)體中，并且通過細(xì)胞計(jì)量術(shù)在處理后24小時測定BFP至GFP轉(zhuǎn)化。將用博萊霉素(1mg/ml)處理的樣品在PEG處理之前與博萊霉素一起在冰上孵育90分鐘。

一般來說，博萊霉素(1mg/ml)的存在增加BFP至GFP轉(zhuǎn)化，如通過細(xì)胞計(jì)量術(shù)所測定(表3)。在博萊霉素存在和不存在的情況下，當(dāng)與在前九個5’RNA堿基中的每個上含有一個2’-O Me基團(tuán)的NC岡崎GRON相比時，在GRON的5’端處的第一RNA堿基上含有一個2’-O Me基團(tuán)的NC岡崎GRON在將BFP轉(zhuǎn)化至GFP方面更有效(圖2和表3)。

在所有實(shí)施例中，在存在或不存在1mg/ml的博萊霉素的情況下，在41聚體BFP4/NC 5’3PS/3’3PS與在第一5’RNA堿基上含有一個5’2’-O me基團(tuán)的71聚體岡崎片段BFP4/NC GRON(指代為BFP4 71聚體(1)NC)之間在BFP至GFP轉(zhuǎn)化方面不存在顯著差異，如通過細(xì)胞計(jì)量術(shù)所測定(圖2和表3)。重要的是注意在博萊霉素存在下(并且預(yù)期對于博來霉素、腐草霉素、他利霉素、培洛霉素以及此抗生素家族的其他成員來說)，所述轉(zhuǎn)化變成鏈獨(dú)立性(即，具有在這些實(shí)施例中測試的設(shè)計(jì)的編碼(C)和非編碼(NC)GRON兩者展示大約相等的活性)。

表3：在存在和不存在糖肽抗生素博來霉素的情況下標(biāo)準(zhǔn)GRON設(shè)計(jì)與岡崎片段GRON設(shè)計(jì)的比較。

實(shí)施例4：41聚體、101聚體和201聚體BFP4/NC 5’-3PS/3’-3PSGRON之間的比較

這一系列實(shí)施例的目的是比較在不同長度的GRON的各端處具有3PS部分的硫代磷酸酯(PS)標(biāo)記的GRON的轉(zhuǎn)化效率(在存在或不存在博萊霉素的情況下)：表2中所示的41聚體、101聚體和201聚體。再次，博萊霉素(1mg/ml)的存在增加BFP至GFP轉(zhuǎn)化率，如通過細(xì)胞計(jì)量術(shù)所測定(表4)。在存在或不存在博萊霉素的兩者情況下在NC GRON長度增加的情況下所有三個實(shí)施例的總體趨勢是線性的。除了在博萊霉素存在下BFP-4/NC/101和BFP-4/C/101，這具有接近于等于但小于41聚體NC GRON的轉(zhuǎn)化率。這與使用BFP-4/41編碼和非編碼GRON的所有先前實(shí)施例形成對比，其中非編碼總是遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)異于編碼GRON。轉(zhuǎn)化頻率的這種不對稱還適用于在此實(shí)施例系列中使用的BFP-4/201GRON。

表4：

實(shí)施例5：Cas9蛋白遞送至植物中

所述實(shí)施例利用重組Cas9蛋白直接遞送至植物細(xì)胞中作為遞送CRISPR-Cas表達(dá)質(zhì)粒的替代方案。所述方法單獨(dú)地或組合地采用載體如細(xì)胞穿透肽(CPP)、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體試劑、聚(乙二醇)(PEG)以便允許活性重組Cas9蛋白遞送至細(xì)胞。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x10⁷個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。然后將預(yù)先以20:1、10:或5:1以及其他CPP與貨物比(例如TAT、穿膜肽、Chariot^TM、PEP-1或其他)涂覆有CPP或用脂質(zhì)體試劑封裝的熒光標(biāo)記的重組Cas9蛋白(1μg)與所接種的原生脂質(zhì)體混合且在23℃下孵育2-6小時以允許Cas9/載體復(fù)合物穿透細(xì)胞。在另一系列的處理中，使用PEG方法將如上所述預(yù)先涂覆有CPP或未涂覆的熒光標(biāo)記的重組Cas9蛋白(1μg)引入原生質(zhì)體中。然后在處理之后第24小時通過流式細(xì)胞術(shù)對原生質(zhì)體進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的Cas9陽性原生質(zhì)體的百分比。

實(shí)施例6：具有201聚體±搖擺堿基GRON的CRISPR

所述系列實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR來在bfp基因和201聚體GRON中產(chǎn)生靶向雙鏈斷裂以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的擬南芥轉(zhuǎn)基因BFP模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。所述BFP CRISPR靶向bfp基因的編碼鏈并且轉(zhuǎn)化位點(diǎn)是PAM序列的上游27bp(圖3)。所述GRON用作模板來修復(fù)bfp基因中通過CRISPR產(chǎn)生的雙鏈斷裂且連同將來自BFP的靶向基因轉(zhuǎn)化成GFP，它也在bfp基因中引入對應(yīng)于BFP CRISPR的PAM序列的搖擺堿基。一旦已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)化，就假設(shè)BFP CRISPR的PAM序列中的搖擺堿基通過CRISPR最小化bfp基因的再切割。所述系列的實(shí)施例將幫助解決將搖擺堿基引入轉(zhuǎn)化的bfp基因中的BFP CRISPR的PAM序列中是否將提高轉(zhuǎn)化效率。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的甘露堿合酶(MAS)啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送分別以0.05μg/μl和0.16μM的最終濃度引入原生質(zhì)體中。將原生質(zhì)體在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的GFP陽性原生質(zhì)體的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至BFP靶基因的間隔區(qū)序列。在此實(shí)施例中，BFP靶向bfp基因(圖3)。有或無搖擺堿基的靶向BFP的201聚體GRON用于測定其對BFP至GFP轉(zhuǎn)化速率的影響。表5給出GRON及其對應(yīng)序列的列表。

表5.在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

使用BFP CRISPR，當(dāng)相較于無搖擺堿基的BFP4/C GRON時，具有搖擺堿基的BFP4/C GRON在BFP至GFP轉(zhuǎn)化中達(dá)3.5倍更有效(表6)。當(dāng)具有搖擺堿基的BFP4/C GRON用于代替具有搖擺堿基的BFP4/NC GRON時，存在BFP至GFP轉(zhuǎn)化的達(dá)5.9倍增加(表6)。因此，當(dāng)與BFP CRISPR一起使用時，具有搖擺堿基的BFP4/C GRON在BFP至GFP轉(zhuǎn)化中最有效。

結(jié)論

在GRON中包括改變轉(zhuǎn)化的靶基因中的BFP CRISPR的PAM序列的搖擺堿基增加BFP至GFP轉(zhuǎn)化。通過下一代測序證實(shí)通過BFPCRISPR連同基于搖擺的GRON進(jìn)行的BFP至GFP轉(zhuǎn)化(數(shù)據(jù)未示出)。另外，通過下一代測序證實(shí)BFP CRISPR裂解DNA且產(chǎn)生bfp基因中的插入缺失的能力(數(shù)據(jù)未示出)。

表6.在將BFP CRISPR和GRON PEG遞送至源自擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因品系21-15-09的原生質(zhì)體中之后第72小時通過流式細(xì)胞術(shù)測定的BFP至GFP轉(zhuǎn)化的百分比。

實(shí)施例7：具有Cy3修飾的GRON的CRISPR

所述系列實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR來在bfp基因和GRON中產(chǎn)生靶向雙鏈斷裂以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。在這些實(shí)施例中使用的BFP6 CRISPR(CR:BFP6)靶向bfp基因并且引起轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的DNA中的雙鏈斷裂。與BFP6 CRISPR一起使用的GRON在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)周圍包含bfp基因的編碼序列并且在5’端用Cy3標(biāo)記且在3’端用idC反向堿基標(biāo)記，并且在本文被稱為Cy3 GRON。這些GRON在三種不同長度的41聚體、101聚體和201聚體處進(jìn)行測試，并且將它們與3PS GRON進(jìn)行直接比較，所述3PS GRON與Cy3 GRON的唯一不同在于它們在GRON的5’和3’端兩者上具有3個硫代磷酸酯鍵聯(lián)。這些GRON在本文被稱為3PS GRON。關(guān)于在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表參見表7。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)和8.0μM(對于41聚體GRON)、0.32μM(對于101聚體GRON)和0.16μM 201聚體GRON的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受8.0μM(對于41聚體)、5.0μM(對于101聚體)和2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。將原生質(zhì)體在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的GFP陽性原生質(zhì)體的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌C as9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRI SPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crR NA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至BFP靶基因的間隔區(qū)序列。在此實(shí)驗(yàn)中，使用BFP6 CRISPR(5’GGTGCCGCACGTCACGAAGTCGG 3’)，其靶向bfp基因。所述GRON包含在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的編碼序列。表7給出所使用的GRON的列表。

表7.在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

使用BFP6 CRISPR，在所測試的所有長度下的Cy3 GRON能夠與3PS GRON一樣有效地介導(dǎo)BFP至GFP轉(zhuǎn)化(圖4)?？傊?，當(dāng)相較于僅GRON樣品時，含有BFP6 CRISPR和GRON的樣品具有更高水平的BFP與GFP轉(zhuǎn)化(圖4)，從而證明CRISPR對提高轉(zhuǎn)化率具有積極影響。

實(shí)施例8：具有不同大小的GRON的CRISPR

所述系列實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR來在bfp基因和各種長度的GRON中產(chǎn)生靶向雙鏈斷裂以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。在這些實(shí)施例中使用的BFP CRISPR靶向bfp基因并且引起轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的DNA中的雙鏈斷裂。與BFP CRISPR一起使用的GRON在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)周圍包含bfp基因的編碼序列并且在5’端和3’端兩者處用3個硫代磷酸酯鍵聯(lián)標(biāo)記，并且在本文被稱為3PS GRON。將這些GRON在60聚體、101聚體和201聚體的三種不同長度下進(jìn)行測試并且將它們與僅GRON處理進(jìn)行直接比較。關(guān)于在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表參見表8。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)和0.547μM(對于60聚體GRON)、0.32μM(對于101聚體GRON)和0.16μM 201聚體GRON的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受7.5μM(對于60聚體)、5.0μM(對于101聚體)和2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。將原生質(zhì)體在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的GFP陽性原生質(zhì)體的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至BFP靶基因的間隔區(qū)序列。所述BFP CRISPR間隔區(qū)序列是5’GTCGTGCTGCTTCATGTGGT3’。在此實(shí)施例中，使用BFP CRISPR，其靶向bfp基因。所述GRON包含在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的編碼序列。表8給出所使用的GRON的列表。

表8.在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表。

結(jié)果

使用BFP CRISPR，當(dāng)與60nt長的GRON直接比較時，在長度≥101nt下的GRON在介導(dǎo)BFP至GFP轉(zhuǎn)化方面更好(圖5)?？傊?，當(dāng)相較于僅GRON樣品時，含有BFP CRISPR和GRON的樣品具有更高水平的BFP至GFP轉(zhuǎn)化(圖5)，從而證明CRISPR對提高轉(zhuǎn)化率具有積極影響。所述數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明當(dāng)與CRISPR一起使用時，在介導(dǎo)BFP至GFP轉(zhuǎn)化中最有效的GRON的長度需要是長度≥101nt。

實(shí)施例9：具有2’-O-Me GRON的CRISPR

此實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR來在bfp基因和GRON中產(chǎn)生靶向雙鏈斷裂以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。在此實(shí)施例中使用的BFP CRISPR靶向bfp基因并且引起轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的DNA中的雙鏈斷裂。與BFP CRISPR一起使用的GRON在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)周圍包含bfp基因的編碼或非編碼序列，其中GRON的前十個5’堿基是RNA堿基，而不是DNA堿基。將這些RNA堿基在第一5’RNA堿基或前九個5’RNA堿基處用2’-O-Me基團(tuán)標(biāo)記，如在圖6中所描繪。這些GRON在本文被稱為2’-O-Me GRON并且與具有類似長度的在GRON的5’和3’端包含具有3個硫代磷酸酯鍵聯(lián)的DNA堿基的3PS GRON進(jìn)行直接比較。這些GRON在本文被稱為3PS GRON。關(guān)于在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表參見表9。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)、0.5μM(對于71聚體GRON)和0.16μM(對于201聚體GRON)的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受5.0μM(對于71聚體)和2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。將原生質(zhì)體在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的GFP陽性原生質(zhì)體的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至BFP靶基因的間隔區(qū)序列。所述BFP CRISPR間隔區(qū)序列是5’CTCGTGACCACCTTCACCCA3’。在此實(shí)施例中，使用BFP CRISPR，其靶向bfp基因。所述GRON包含在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的編碼或非編碼序列。表9示出所使用的GRON的列表。

表9.在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

使用BFP CRISPR，當(dāng)相較于各種不同類型的GRON保護(hù)((0)、(1)或(9))時，所述71聚體和201聚體2’-O-Me GRON具有類似的BFP至GFP轉(zhuǎn)化(圖7和8)。使用BFP CRISPR，所述2’-O-Me GRON在介導(dǎo)BFP至GFP轉(zhuǎn)化方面比其3PS GRON對應(yīng)物更有效(圖7和8)。

實(shí)施例10：具有GRON引入的CRISPR切口酶

此實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR來在bfp基因和GRON中產(chǎn)生靶向單鏈缺口以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。在此實(shí)施例中使用的BFP1 CRISPR(CR:BFP1)靶向bfp基因，并且包含催化殘基(RuvC中的D10A和HNH中的H840A)中的引起分別與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)或非互補(bǔ)的DNA鏈上的轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的DNA中的單鏈缺口的突變。這些CRISPR在本文被稱為BFP1 CRISPR切口酶D10A和BFP1 CRISPR切口酶H840A并且在單獨(dú)質(zhì)粒上單獨(dú)地抑或與BFP5 sgRNA一起使用。當(dāng)多種CRISPR切口酶在此實(shí)施例中一起使用時，它們可以使同一DNA鏈或相對的DNA鏈缺口。當(dāng)包含相同突變(D10A或H840A)的兩種Cas9蛋白一起使用時，它們使同一DNA鏈缺口。相反，當(dāng)兩種Cas9蛋白一起使用并且它們中的一者包含D10A突變且另一者包含H840A突變時，它們使相對的DNA鏈缺口。與切口酶CRISPR一起使用的GRON在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)周圍包含位于的BFP5 CRISPR的PAM序列中的具有一個搖擺堿基的bfp基因的編碼或非編碼序列。這些GRON在5’和3’端兩者上具有3個硫代磷酸酯鍵聯(lián)并且在本文被稱為3PS GRON。關(guān)于在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表參見表10。將所述切口酶CRISPR直接與它們的能夠引起bfp基因的DNA中的靶向雙鏈斷裂的CRISPR對應(yīng)物進(jìn)行比較。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述Cas9基因包含催化殘基中的突變，RuvC中的D10A或HNH中的H840A。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)和0.16μM(對于201聚體)的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。將原生質(zhì)體在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的GFP陽性原生質(zhì)體的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌C as9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRI SPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至BFP靶基因的間隔區(qū)序列。在此實(shí)施例中，使用，BFP1和BFP5 sgRNA，其靶向轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的不同區(qū)域。BFP1間隔區(qū)(5’CTCGTGACCACCTTCACCCA3’)靶向編碼鏈，而BFP5間隔區(qū)(5’GTCGTGCTGCTTCATGTGGT3’)靶向bfp基因的非編碼鏈。所述GRON包含在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的編碼或非編碼序列。表10示出所使用的GRON的列表。

表10.在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

當(dāng)BFP1 CRISPR和BFP5 CRISPR一起使用而不是單獨(dú)使用時，兩種CRISPR切口酶(D10A和H840A)在介導(dǎo)BFP至GFP轉(zhuǎn)化方面更有效(圖9)。此外，當(dāng)相較于這些CRISPR切口酶與NC/201 1W GRON一起使用的處理時，在BFP1和BFP5 D10A CRISPR切口酶與C/2011W GRON一起使用時，BFP至GFP轉(zhuǎn)化顯著更高(圖9)。當(dāng)BFP1和BFP5 H840A CRISPR切口酶一起使用時，在C/201或NC/201 1W GRON情況下觀察到大致相同的BFP至GFP轉(zhuǎn)化(圖9)。這些水平的BFP至GFP轉(zhuǎn)化比單獨(dú)使用BFP5 CRISPR時稍微更高，并且比單獨(dú)使用BFP1 CRISPR時稍微更低(圖9)。

實(shí)施例11：使用CRISPR靶向多種基因

此實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR在源自擬南芥模型系統(tǒng)的原生質(zhì)體的給定群體中同時轉(zhuǎn)化多種基因以便在靶基因和GRON中產(chǎn)生雙鏈斷裂來介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。在此實(shí)施例中使用的CRISPR通過將編碼Cas9基因的質(zhì)粒和靶向擬南芥基因組中的BFP和乙酰羥酸合酶(AHAS)基因的多重sgRNA引入原生質(zhì)體來靶向這兩種不同基因。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。這將允許Cas9在將介導(dǎo)其轉(zhuǎn)化的GRON存在下引起B(yǎng)FP和AHAS基因兩者中的雙鏈斷裂。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動多種不同的sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)和0.16μM(對于201聚體)的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。原生質(zhì)體將在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后將它們通過流式細(xì)胞儀和等位基因特異性PCR測定進(jìn)行分析以便分別測定給定處理內(nèi)的BFP至GFP和AHAS轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的百分比。

在等位基因特異性PCR測定中，基因組DNA的5,000基因組等效物的10-16個重復(fù)樣品用于主要PCR反應(yīng)中。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者從同一質(zhì)?；蚨鄠€質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至靶向基因的間隔區(qū)序列。在此實(shí)施例中，不同的sgRNA和GRON用于靶向其轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的多個基因；BFP間隔區(qū)(5’CTCGTGACCACCTTCACCCA 3’)和AHAS間隔區(qū)(5’TGGTTATGCAATTGGAAGATCGC 3’)。表11描述所使用的GRON。

表11.在此實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

在將BFP和AHAS CRISPR質(zhì)粒和BFP/C 201聚體和AHAS(W)574/NC 201聚體GRON PEG遞送至擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因品系中之后144小時時測定BFP至GFP和AHAS轉(zhuǎn)化。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)揭示處理1產(chǎn)生0.20％BFP至GFP轉(zhuǎn)化(表12)。等位基因特異性PCR測定揭示處理1產(chǎn)生0.01％AHAS轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體(表12)。使用兩種測定，僅GRON處理具有最小轉(zhuǎn)化(表12)。此實(shí)施例展示在源自擬南芥BFP模型系統(tǒng)的原生質(zhì)體的給定群體中兩種獨(dú)立靶基因(BFP和AHAS)的成功同時轉(zhuǎn)化。

表12.通過以下來測量在將CRISPR質(zhì)粒和GRON PEG遞送至源自擬南芥BFP模型系統(tǒng)的原生質(zhì)體的給定群體中之后144小時BFP和AHAS基因兩者的轉(zhuǎn)化：(1)流式細(xì)胞術(shù)，其測定GFP陽性原生質(zhì)體的百分比，或(2)等位基因特異性PCR，其測定AHAS轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的百分比。

實(shí)施例12：Cas9 mRNA遞送至植物細(xì)胞中

此實(shí)施例利用重組Cas9 mRNA直接遞送至植物細(xì)胞中作為遞送CRISPR-Cas表達(dá)質(zhì)粒的替代方案。所述方法包括(1)修飾的mRNA的體外合成，和(2)將所述修飾的mRNA遞送至植物細(xì)胞中。

方法

Cas9 mRNA將使用RNA聚合酶如來自線性化質(zhì)粒模板的T7、T3或SP6，包括5’UTR、蛋白質(zhì)的編碼序列(CDS)和3’UTR的組分在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。一種RNA聚合酶可并入比彼此更好的特定修飾的核苷。所述5’UTR可包含提高其穩(wěn)定性的元件，如丙型肝炎病毒的MiR-122(Shimakami等人,2012)。體外合成將并入保護(hù)性的核苷并且確保靶植物細(xì)胞中的良好翻譯。重組Cas9 mRNA將被加帽且包含聚A尾。

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。重組Cas9 mRNA將在以下方式中的一種中遞送至植物細(xì)胞中(列表非包括性的)：細(xì)胞穿透肽(CPP)、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體試劑、聚(乙二醇)(PEG)單獨(dú)地或組合地以便允許活性重組Cas9蛋白遞送至細(xì)胞中。

實(shí)施例13：用于鍵結(jié)DNA、RNA或蛋白質(zhì)的CRISPR-Cas

此實(shí)施例利用修飾的單引導(dǎo)RNA(sgRNA)盒，其中接頭序列(還可被稱為鍵結(jié)序列)被包括在tracrRNA的3’端處，但在RNA聚合酶III終止信號的5’端處，如在以下實(shí)施例中所示(圖10)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。雖然是優(yōu)選的，接頭的布置不限于tracerRNA的3’端，但將在sgRNA盒內(nèi)的若干位置處研究。所述接頭序列可在核苷酸長度上變化或包含將提高鍵結(jié)或增加通過三鏈體相互作用鍵結(jié)的分子的數(shù)目的二級結(jié)構(gòu)。

所述接頭將允許與包含互補(bǔ)序列的DNA、RNA或蛋白質(zhì)沃森-克里克堿基配對(圖10)。另外，sgRNA盒中的接頭序列將被設(shè)計(jì)為包含高級二級和三級結(jié)構(gòu)，從而允許將鍵結(jié)多個DNA、RNA或蛋白質(zhì)分子的更復(fù)雜的多方面相互作用區(qū)域。

總體概念是CRISPR-Cas復(fù)合物將生物分子鍵結(jié)至核酸酶活性位點(diǎn)，從而提高基因編輯的可能性。這些生物分子包含GRON，其將介導(dǎo)靶向基因的轉(zhuǎn)化?？赏ㄟ^簡單使用例如基因串或退火的寡聚物來將鍵結(jié)接頭添加至sgRNA。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR-Cas鍵結(jié)質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子。

驅(qū)動15-30bp的多核苷酸序列段互補(bǔ)的接頭序列的sgRNA的擬南芥U6啟動子位于靶向bfp的201聚體編輯GRON上(如在圖10中所示)。所述sgRNA鍵結(jié)盒通過聚-T10終止子終止。將所述CRISPR-Cas質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)和0.16μM(對于201聚體)GRON的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。將原生質(zhì)體在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的GFP陽性原生質(zhì)體的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者從同一質(zhì)粒或不同質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)和接頭的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至BFP靶基因的間隔區(qū)序列。在此實(shí)施例中，使用CRISPR，其靶向bfp基因。所述GRON包含在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的編碼或非編碼序列。

實(shí)施例14：具有截短的gRNA的CRISPR。

此實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR在源自擬南芥BFP模型系統(tǒng)的原生質(zhì)體中的BFP至GFP的轉(zhuǎn)化以便在靶向基因和GRON中產(chǎn)生雙鏈斷裂來介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。在此實(shí)施例中使用的CRISPR通過將編碼Cas9基因的質(zhì)粒和兩種不同長度的一種sgRNA引入原生質(zhì)體來靶向擬南芥基因組中的bfp基因。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。將Cas9引導(dǎo)至靶基因中的crRNA被稱為間隔區(qū)并且長度典型地為20-nt(CR:BFP1 20-nt)，然而，在這些實(shí)施例中，測試了使用17-nt(CR:BFP1 17-nt)的更小長度間隔區(qū)在介導(dǎo)BFP至GFP轉(zhuǎn)化中的有效性。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動多種不同的sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)和0.16μM(對于201聚體)的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。原生質(zhì)體將在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的BFP至GFP的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者從同一質(zhì)?；蚨鄠€質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至靶向基因的間隔區(qū)序列。在這些實(shí)施例中，對20-nt(5’CTCGTGACCACCTTCACCCA 3’)對比17-nt(5’GTGACCACCTTCACCCA 3’)的兩種不同長度BFP1間隔區(qū)進(jìn)行了測試。表13描述所使用的GRON。

表13.在此實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

將BFP1原型間隔區(qū)的長度從20bp減少至17bp在將質(zhì)粒和GRON PEG遞送至擬南芥BFP模型系統(tǒng)中之后第72小時分別具有0.163％對比0.177％的類似水平的BFP至GFP轉(zhuǎn)化(圖11)。

實(shí)施例15：具有擴(kuò)增子gRNA的CRISPR。

此實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR在源自擬南芥BFP模型系統(tǒng)的原生質(zhì)體中的BFP至GFP的轉(zhuǎn)化以便在靶向基因和GRON中產(chǎn)生雙鏈斷裂來介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。在此實(shí)施例中使用的CRISPR通過將編碼Cas9基因的質(zhì)粒和一種sgRNA引入原生質(zhì)體來靶向擬南芥基因組中的bfp基因，所述sgRNA在質(zhì)粒上編碼或或作為擴(kuò)增子引入原生質(zhì)體。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA將Cas9引導(dǎo)至靶基因，其中Cas9產(chǎn)生雙鏈斷裂并且GRON用作模板以便以位點(diǎn)定向方式將BFP轉(zhuǎn)化成GFP。

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x10⁷個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動多種不同的sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T₁₀終止子。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)和0.16μM(對于201聚體)的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受2.5μM(對于201聚體)的最終GRON濃度。原生質(zhì)體將在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的BFP至GFP的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者從同一質(zhì)粒或多個質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至靶向基因的間隔區(qū)序列。在這些實(shí)施例中，將同一BFP6gRNA(5’GGTGCCGCACGTCACGAAGTCGG 3’)作為擴(kuò)增子遞送至原生質(zhì)體中或在質(zhì)粒上編碼。表14描述所使用的GRON。

表14.在此實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

在將質(zhì)粒和GRON PEG遞送至擬南芥BFP模型系統(tǒng)中之后第72小時，當(dāng)相較于用在單獨(dú)質(zhì)粒上編碼的gRNA(gRNA質(zhì)粒)和Cas9兩者處理時，遞送作為擴(kuò)增子的BFP6 gRNA(CR：BFP6(gRNA擴(kuò)增子))連同僅含有Cas9的質(zhì)粒具有類似的BFP至GFP轉(zhuǎn)化率(圖12)。

實(shí)施例16：具有未修飾的GRON的CRISPR。

此實(shí)施例的目的是展示使用CRISPR來在bfp基因和GRON中產(chǎn)生靶向雙鏈斷裂以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的擬南芥BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)中的BFP至GFP轉(zhuǎn)化。在此實(shí)施例中使用的BFP CRISPR靶向bfp基因并且引起轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的DNA中的雙鏈斷裂。所述3PS GRON在GRON的5’和3’端兩者上包含具有3個硫代磷酸酯鍵聯(lián)的DNA堿基并且在本文被稱為3PS GRON。在BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥模型系統(tǒng)中使用BFPCRISPR將3PS GRON直接與其未修飾的GRON對應(yīng)物在BFP至GFP轉(zhuǎn)化方面進(jìn)行比較。關(guān)于在這些實(shí)施例中使用的GRON的列表參見表15。

表15.在此實(shí)施例中使用的GRON的列表

方法

將源自誘導(dǎo)的根組織的BFP轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體以250,000個細(xì)胞/孔以1x107個細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在平底96孔板上。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T10終止子。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。將所述CRISPR質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl(對于CRISPR)、0.16μM(對于41聚體GRON)的最終濃度引入原生質(zhì)體中。在PEG遞送之后單獨(dú)GRON處理接受0.8μM(對于41聚體)的最終GRON濃度。將原生質(zhì)體在黑暗中在23℃下孵育72小時，且然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析以便測定給定處理內(nèi)的GFP陽性原生質(zhì)體的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至BFP靶基因的間隔區(qū)序列。所述BFP CRISPR間隔區(qū)序列是5’CTCGTGACCACCTTCACCCA 3’。在此實(shí)施例中，使用BFP CRISPR，其靶向bfp基因。所述GRON包含在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)附近的bfp基因的非編碼序列。表16示出所使用的GRON的列表。

表16.在此實(shí)施例中使用的GRON的列表

結(jié)果

使用BFP CRISPR，所述41聚體3PS GRON在介導(dǎo)BFP至GFP轉(zhuǎn)化方面比其未修飾的GRON對應(yīng)物更有效(圖13)。

實(shí)施例17：亞麻中的TALEN和GRON

此實(shí)施例的目的是展示在遞送TALEN質(zhì)粒和GRON之后在原生質(zhì)體中24小時和微小愈傷組織中3周時大麻中的EPSPS轉(zhuǎn)化。在此實(shí)施例中使用的TALEN通過將編碼TALEN的質(zhì)粒引入源自莖尖的原生質(zhì)體中靶向亞麻基因組中的epsps基因，產(chǎn)生雙鏈斷裂并且GRON用作模板以便以位點(diǎn)定向方式轉(zhuǎn)化epsps基因。

方法

亞麻原生質(zhì)體分離自從體外發(fā)芽的幼苗獲得的莖尖。將所述TALEN質(zhì)粒連同GRON通過PEG介導(dǎo)的遞送分別以0.05μg/μl和0.5μM的最終濃度引入原生質(zhì)體中。將原生質(zhì)體在液體培養(yǎng)基中黑暗中在25℃下孵育達(dá)48小時，或包埋在藻酸鹽珠粒(5x 10⁵個細(xì)胞/ml)中，并且在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和微小愈傷組織的形成。將在DNA遞送之后第24小時或3周獲得的原生質(zhì)體或微小愈傷組織樣品通過NGS進(jìn)行分析以測定在給定處理內(nèi)進(jìn)行靶突變的細(xì)胞(DNA讀數(shù))的百分比。還估計(jì)了由不完美的NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)產(chǎn)生的插入缺失的百分比。

TALEN構(gòu)建體包含兩個臂(左和右)，各自由連接至FokI的催化性DNA裂解結(jié)構(gòu)域的TAL效應(yīng)子樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。所述TAL效應(yīng)子樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ALEN臂引導(dǎo)至DNA的特異性位點(diǎn)，所述DNA允許每個臂的FokI核酸內(nèi)切酶二聚化在一起且裂解雙鏈DNA。所述TALEN編碼的質(zhì)粒包含MasP：LuEPSPS_(左臂)-T2A-LuEPSPS_(右臂)與rbcSE9終止子。LuEPSPS_(左臂)序列是5’TGGAACAGCTATGCGTCCG 3’并且LuEPSPS_(右臂)序列是5’TGAGTTGCCTCCAGCGGCT 3’。有或無搖擺堿基的靶向LuEPSPS的GRON(144聚體)用于測定其對轉(zhuǎn)化速率的影響。

結(jié)果

24小時原生質(zhì)體和3周齡微小愈傷組織分別具有0.067％和0.051％EPSPS轉(zhuǎn)化，如通過下一代測序所測定(圖14)。另外，這些數(shù)據(jù)表明TALEN是活性的并且能夠裂解亞麻中的epsps靶基因，并且分別在原生質(zhì)體中24小時和微小愈傷組織中達(dá)3周時形成2.60％和1.84％的插入缺失。此外，在引入TALEN質(zhì)粒和GRON之后將EPSPS轉(zhuǎn)化和插入缺失維持達(dá)3周。

實(shí)施例18：亞麻中的CRISPR和GRON

此實(shí)施例的目的是展示在遞送Cas9質(zhì)粒之后三周和六周亞麻微小愈傷組織中的Cas9的活性。在此實(shí)施例中使用的CRISPR通過將編碼Cas9基因的質(zhì)粒和sgRNA引入源自莖尖的原生質(zhì)體中來靶向亞麻基因組中的epsps基因。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA將Cas9引導(dǎo)至靶基因，其中Cas9以位點(diǎn)定向方式在epsps基因中產(chǎn)生雙鏈斷裂。當(dāng)通過遍在NHEJ途徑修復(fù)時，所述epsps基因中的雙鏈斷裂將引起在裂解位點(diǎn)周圍形成插入缺失。

方法

亞麻原生質(zhì)體分離自從體外發(fā)芽的幼苗獲得的莖尖。所述CRISPR編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T₁₀終止子。將所述CRISPR質(zhì)粒通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl的最終濃度引入原生質(zhì)體中。將原生質(zhì)體包埋在藻酸鹽珠粒(5x 10⁵個細(xì)胞/ml)中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在黑暗中在25℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器(30rpm)中孵育。在CRISPR質(zhì)粒遞送之后3和6周將從單獨(dú)細(xì)胞形成的微小愈傷組織通過NGS進(jìn)行分析以測定進(jìn)行通過易錯NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑產(chǎn)生的插入缺失的細(xì)胞(DNA讀數(shù))的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至靶基因的間隔區(qū)序列。在此實(shí)施例中，CRISPR靶向epsps基因。

結(jié)果

3和6周齡微小愈傷組織分別具有46.5％和54.7％插入缺失形成，如通過下一代測序所測定(圖15)。這些數(shù)據(jù)表明Cas9是活性的并且能夠裂解亞麻中的EPSPS靶基因且形成插入缺失。此外，在引入CRISPR質(zhì)粒之后，這些插入缺失被維持達(dá)6周。

實(shí)施例19：工程化核酸酶的構(gòu)建

CRISPR-Cas

對于構(gòu)建瞬時CRISPR-Cas9表達(dá)質(zhì)粒，將在N和C末端兩者上含有SV40NLS且在N末端上含有2x FLAG標(biāo)簽的高等植物密碼子優(yōu)化的SpCas9基因作為一系列Strings^TM(Life Technology,Carlsbad,CA)合成，然后通過Gibson方法克隆甘露堿合酶(MAS)啟動子的下游和豌豆核酮糖雙磷酸羧化酶(rbcsE9)終止子的上游。接著，將由通過擬南芥U6啟動子驅(qū)動表達(dá)的嵌合gRNA盒組成的sgRNA盒作為Strings^TM合成，然后使用Gibson方法穿梭至含有Cas9的構(gòu)建體中，從而形成pBCRISPR。為了指定相應(yīng)靶序列的嵌合gRNA，將編碼可變20-nt sgRNA靶向序列的DNA寡核苷酸對(擴(kuò)展數(shù)據(jù)表2)退火以產(chǎn)生具有4-bp突出端的短雙鏈片段。將所述片段連接至BbsI消化的pBCrispr以產(chǎn)生CRISPR-Cas構(gòu)建體BC-1、BC-2和BC-3。

TALEN

TALEN表達(dá)構(gòu)建體BT-1和LuET-1的設(shè)計(jì)和構(gòu)建是基于如在Cermak等人,Nucleic Acids Res.39,e82(2011)中描述的規(guī)則。靶序列是基于基因編輯位點(diǎn)和重復(fù)可變的i殘基(RVD)按照NG、HD、NI和NN分別識別T、C、A和G的規(guī)則進(jìn)行選擇的。連接至異二聚體FokI結(jié)構(gòu)域的TAL效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域的組裝是通過商業(yè)服務(wù)(GeneArt；Life Technologies)完成的。使用Gibson方法將TALEN單體在MAS啟動子的下游和rbcE9終止子的上游進(jìn)行克隆且表達(dá)為2A偶聯(lián)單元。

細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體分離

使表面滅菌的擬南芥種子在28℃下在12小時光照/黑暗循環(huán)下在固體1/2MS培養(yǎng)基(根據(jù)XX的礦物質(zhì)和維生素；1/2濃縮的；87.7mM蔗糖)上發(fā)芽。收集來自2至3周齡幼苗的根材料并且在28℃下在低光照條件下維持在1/2MS液體培養(yǎng)基中。在原生質(zhì)體分離之前三周，將根培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移且維持在MSAR[0.22％1/2MS、87.7mM蔗糖、11.4μM IAA、2.3μM 2,4-D、1.5μM 2iP，pH 5.8]中。將根切割成大約6mm區(qū)段并且在含有細(xì)胞壁消化酶[1.25％纖維素醚RS、0.25％混合酶R-10、0.6M甘露醇、5mM MES、0.1％BSA]的MSAP溶液[0.22％1/2MS、87.7mM蔗糖、11.4μM IAA、2.3μM 2,4-D、1.5μM 2iP以及400mM甘露醇，pH 5.8]中在黑暗中在輕搖下孵育3-4小時。收集所釋放的原生質(zhì)體并且使其通過無菌100μm過濾器和35μm過濾器。將原生質(zhì)體濾液與0.8倍體積的Optiprep^TM密度梯度培養(yǎng)基(Sigma)混合且輕輕混合。將60％W5[154mM NaCl、5mM KCl、125mM CaCl₂·2H₂O、5mM葡萄糖、10mM MES，(pH 5.8)]/40％Optiprep溶液、接著90％W5/10％Optiprep溶液緩慢分層添加到濾液/Optiprep溶液上以制備梯度，將其在198RCF下離心10分鐘。收集白色原生質(zhì)體層且與2倍體積的W5混合。將原生質(zhì)體在44RCF下離心10分鐘且以1x10⁷個細(xì)胞/ml的密度重新懸浮于TM溶液[14.8mMMgCl₂·6H₂O、5mM MES、572mM甘露醇，(pH 5.8)]中。對于使用Zeocin^TM(Life Technologies,Carlsbad,CA)和腐草霉素(InvivoGen,San Diego,CA)的實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)染之前將原生質(zhì)體在冰上保持在調(diào)整至pH 7.0的TM中持續(xù)90分鐘。關(guān)于抗生素濃度，參見擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1。

亞麻原生質(zhì)體分離自從體外發(fā)芽的3周齡幼苗獲得的莖尖。將根莖用解剖刀精細(xì)切碎，在室溫下在B-培養(yǎng)基[B5鹽和維生素(Gamborg等人,1968)、4mM CaCl₂、0.1M葡萄糖、0.3M甘露醇、0.1M甘氨酸、250mg/l酪蛋白水解物、10mg/l L-半胱氨酸-HCL、0.5％聚乙烯吡咯烷酮(MW 10,000)、0.1％BSA、1mg/l BAP、0.2mg/l NAA以及0.5mg/l 2,4-D]中質(zhì)壁分離1小時，且在含有懸浮有0.66％纖維素酶YC和0.16％混合酶R-10的B-培養(yǎng)基的細(xì)胞壁消化酶溶液中在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(50rpm)在25℃下孵育5小時。篩分所釋放的原生質(zhì)體并且使用Optiprep(Sigma)層通過密度梯度離心進(jìn)行純化，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并且在黑暗中以0.5x 10⁶個原生質(zhì)體/ml的密度在B培養(yǎng)基中保持靜止過夜。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染

在96孔平底板中，將2.5x10⁵個細(xì)胞/孔用10pmol GRON、10pmol GRON加3.25μg CRISPR-Cas或TALEN表達(dá)構(gòu)建體或模擬物使用PEG[270mM甘露醇、67.5mM Ca(NO₃)₂、38.4％PEG 1500，(pH 5.8)]進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞和DNA與PEG一起在冰上孵育30分鐘，接著用200μl的W5溶液洗滌。最后，添加85μl的MSAP++[MSAP含有50nM植物磺肽素-α和20μM沒食子酸正丙酯]并且在低光照條件下在28℃下培養(yǎng)細(xì)胞。

在培養(yǎng)約18小時之后，使用PEG介導(dǎo)的遞送將原生質(zhì)體用TALEN質(zhì)粒連同GRON(20μg質(zhì)粒和0.2nmol GRON/10⁶原生質(zhì)體)轉(zhuǎn)染。將處理的原生質(zhì)體在B培養(yǎng)基中在黑暗中在25℃下孵育達(dá)48小時，或在轉(zhuǎn)染后第24小時包埋在藻酸鹽珠粒中，并且在V-KM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和微小愈傷組織的形成。對于抗生素實(shí)驗(yàn)，將1.25x10⁵個細(xì)胞/孔用8μM GRON CG13使用以上描述的PEG溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞計(jì)數(shù)

在轉(zhuǎn)染后第七十二小時，使用Acoustic Focusing細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Applied)在激發(fā)和如針對GFP而言適當(dāng)?shù)陌l(fā)射檢測下通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行分析。背景水平是基于無DNA遞送的PEG處理的原生質(zhì)體。對于抗生素實(shí)驗(yàn)，將在轉(zhuǎn)染之前用博萊霉素或腐草霉素處理的原生質(zhì)體在轉(zhuǎn)染后第48小時通過細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行分析。

測序分析

使用植物II試劑盒根據(jù)制造商的建議(Machery-Nagel,Bethlehem,PA)從CRISPR-Cas或TALEN處理的原生質(zhì)體提取基因組DNA。對于擬南芥CRISPR和TALEN使用聚合酶與100ng的基因組DNA和引物BFPF-1(5’-GGACGACGGCAACTACAAGACC-3’)/BFPR-1(5’-TAAACGGCCACAAGTTCAGC-3’)或?qū)τ趤喡門ALEN，使用LuEPF-1(5’-GCATAGCAGTGAGCAGAAGC-3’)/LuEPR-15’-AGAAGCTGAAAGGCTGGAAG-3’來產(chǎn)生在TALEN或CRISPR靶區(qū)域側(cè)翼的擴(kuò)增子。使用Qiaquick MinElute柱(Qiagen,Valencia,CA)純化且濃縮所述擴(kuò)增子。使用2x 250bp MiSeq運(yùn)行(Illumina,SanDiego,CA)通過GeneWiz(South Plainfield,NJ)進(jìn)行所述擴(kuò)增子的深度測序。對于數(shù)據(jù)分析，將讀數(shù)1和讀數(shù)2的fastq文件輸入至CLC基因組學(xué)工作臺7.0.4(CLCBio,Boston,MA)中。將配對的讀數(shù)合并至單一序列中，如果它們的序列重疊。如果擴(kuò)增子或其反向和互補(bǔ)序列包含正向和反向引物序列，則鑒別所述擴(kuò)增子的序列。樣品中獨(dú)特序列的出現(xiàn)被記錄為其豐度。通過將具有編輯或插入缺失的讀數(shù)的數(shù)目除以所測序的讀數(shù)的總數(shù)且然后乘以100來計(jì)算插入缺失或基因編輯百分比。

CRISPR-Cas原型間隔區(qū)的序列

TALEN結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列

所使用的GRON序列

統(tǒng)計(jì)分析

使用學(xué)生t檢驗(yàn)與雙尾分配測定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。P值<0.05被認(rèn)為是顯著的。數(shù)據(jù)作為平均值和SEM示出。

結(jié)果

擬南芥原生質(zhì)體中的CRISPR-Cas核酸酶活性和基因編輯。

可將工程化的核酸酶如TAL效應(yīng)子核酸酶(TALEN)和成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶Cas9(CRISPR-Cas9)進(jìn)行編程以便以高特異性靶向且裂解雙鏈DNA。TALEN由兩個臂組成，各自具有連接至FokI的催化性DNA核酸酶結(jié)構(gòu)域的TAL效應(yīng)子樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TALE)。所述TALE結(jié)構(gòu)域?qū)ALEN臂引導(dǎo)至DNA的特異性位點(diǎn)，從而允許FokI核酸內(nèi)切酶的二聚化以及雙鏈斷裂(DSB)的隨后產(chǎn)生。所述CRISPR-Cas9系統(tǒng)由兩種組分組成；釀膿鏈球菌Cas9核酸酶(SpCas9)和兩種RNA(crRNA和tracrRNA)的嵌合融合，其被稱為工程化的單引導(dǎo)(sgRNA)。所述sgRNA通過其前二十個5’堿基與DNA靶標(biāo)的堿基配對支持Cas9的靶向核酸特異性，隨后產(chǎn)生位點(diǎn)特異性DSB。

在植物中，DSB通常通過易錯非同源末端連接(NHEJ)DNA修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)，從而產(chǎn)生在修復(fù)位點(diǎn)處的隨機(jī)缺失和/或插入(插入缺失)。相比之下，精確基因組編輯依賴于待通過同源導(dǎo)向修復(fù)(HDR)進(jìn)行修復(fù)的靶向變化附近的核酸酶誘導(dǎo)的DSB，所述同源導(dǎo)向修復(fù)時比NHEJ更精確的修復(fù)途徑，這是由于同源模板DNA的要求—在大多數(shù)情況下姊妹染色半體。通過利用HDR途徑，有可能使用工程化的寡核苷酸作為修復(fù)模板來特異性地編輯DNA，當(dāng)通過核酸酶裂解或當(dāng)與雙鏈斷裂誘導(dǎo)抗生素組合使用時非特異性地裂解。

圖16描繪源自BFP轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)的擬南芥原生質(zhì)體中的CRISPR-Cas9核酸酶活性，其中穩(wěn)定整合的BFP基因可通過編輯編碼H66的密碼子(CAC→TAC H66Y)而轉(zhuǎn)化成GFP。當(dāng)用CRISPR-Cas9(BC-1)處理細(xì)胞時，通過深度測序在BFP基因的H66基因座附近以0.79％的頻率產(chǎn)生NHEJ誘導(dǎo)的插入缺失(圖16a)。大多數(shù)插入缺失是單個bp且都不長于9bp。相反，用僅GRON處理或模擬物處理的細(xì)胞未展示插入缺失(數(shù)據(jù)未示出)。這些結(jié)果表明CRISPR-Cas9核酸酶能夠主動靶向此轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)中的BFP基因。

關(guān)于CRISPR-Cas9與GRON的組合介導(dǎo)源自轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)的原生質(zhì)體中的BFP至GFP基因編輯的有效性，當(dāng)相較于單獨(dú)GRON或單獨(dú)CRISPR-Cas9處理時，當(dāng)CRISPR-Cas9和硫代磷酸酯(PS)修飾的GRON(CG6)兩者被同時引入時觀察到BFP至GFP編輯的7.4倍提高(圖16b)。這些結(jié)果證明將具有PS修飾的GRON的CRISPR-Cas9引入擬南芥原生質(zhì)體中顯著提高BFP至GFP基因編輯的頻率。

當(dāng)相較于未修飾的GRON時，在5’和3’端兩者處含有三個鄰近的PS修飾(本文稱為3PS)的GRON積極實(shí)現(xiàn)BFP至GFP編輯。當(dāng)相較于未修飾的GRON模板(CG1；圖17a)時，當(dāng)與CRISPR-Cas9(BC-1)組合時，3PS修飾的GRON(CG2)在BFP至GFP編輯方面更有效。此外，觀察到編輯與GRON長度之間的正相關(guān)(圖17b)?？傊?，這些結(jié)果表明在CRISPR-Cas9存在下，GRON修飾和長度兩者能夠極大地提高植物如擬南芥中的基因編輯的頻率。

當(dāng)201核酸酶(nb)3PS修飾的GRON(CG6)或201nb 2’-O-甲基修飾的GRONs(CG9)或(CG10)(由作為RNA的前十個5’堿基與用2’-O-甲基修飾的第一RNA堿基或前9個RNA堿基組成)連同CRISPR-Cas9(BC-1)被引入擬南芥原生質(zhì)體中時，未觀察到它們之間的BFP至GFP編輯的顯著差異(圖17c)。類似地，當(dāng)201nb 3PS修飾的GRON(CG3)或201nb Cy3修飾的GRON(CG4)(包含5’Cy3和3’idC反向堿基)連同CRISPR-Cas9(BC-3)引入擬南芥原生質(zhì)體中時，未觀察到編輯頻率的顯著差異(圖17d)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明在CRISPR-Cas9存在下，不同GRON修飾能夠極大地提高擬南芥中的基因編輯的頻率。

基于CRISPR-Cas9和修飾的GRON的這些結(jié)果，確定與靶向BFP基因的TALEN對偶聯(lián)的修飾的GRON也產(chǎn)生提高的BFP至GFP基因編輯。為了首先顯示在BFP基因座處的有效核酸酶活性，將擬南芥原生質(zhì)體用TALEN(BT-1)進(jìn)行處理并且通過深度測序在預(yù)期裂解位點(diǎn)處或附近發(fā)現(xiàn)0.51％插入缺失—從而指示在此模型系統(tǒng)中TALEN與CRISPR-Cas9一樣有活性(圖18a)。大多數(shù)缺失是＞10bp但小于50bp，而插入(比缺失的豐度顯著更低)是三個bp或更少。接下來，檢查與修飾的GRON偶聯(lián)的TALEN編輯BFP至GFP的有效性。當(dāng)相較于單獨(dú)3PS GRON時(圖18b)時，當(dāng)引入BFP TALEN(BT-1)和3PS GRON(CG7)兩者時，觀察到BFP至GFP編輯的頻率的9.2倍提高。與上述CRISPR-Cas實(shí)驗(yàn)類似，這些結(jié)果證明將具有3PS修飾的GRON的TALEN引入擬南芥原生質(zhì)體中也顯著提高BFP至GFP基因編輯的頻率。

亞麻(普通亞麻)中的EPSPS(5’-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因座也用作此系統(tǒng)中的靶標(biāo)。所述EPSPS基因編碼莽草酸酯途徑中的參與芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成的酶。在植物中，EPSPS是除草劑草甘膦的靶標(biāo)，其中它充當(dāng)磷酸烯醇丙酮酸的結(jié)合位點(diǎn)的競爭性抑制劑。

選擇了靶向亞麻中的在編輯時將使EPSPS對草甘膦耐受的兩個基因座(T97I和P101A)附近的位點(diǎn)的TALEN(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖18b)。將TALEN(LuET-1)與含有在T97I和P101A處的靶向變化的144nb 5’Cy3修飾的GRON(CG11)一起遞送至原生質(zhì)體中，觀察到在引入之后七天在兩個基因座處0.19％的基因編輯頻率以及0.5％的插入缺失頻率(圖18c、18d)。大多數(shù)插入缺失是10bp或更少(圖18c)。這些結(jié)果證明將具有Cy3修飾的GRON的TALEN引入亞麻原生質(zhì)體中顯著提高EPSPS基因編輯的頻率并且進(jìn)一步證明多個核苷酸編輯可用單個GRON實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施例20：博來霉素抗生素家族的兩個成員對轉(zhuǎn)化的作用

此系列實(shí)施例的目的是評價(jià)抗生素對轉(zhuǎn)化效率的作用。

方法

將來自具有藍(lán)色熒光蛋白基因的多個拷貝的擬南芥品系的原生質(zhì)體如實(shí)施例1中所描述用GRON進(jìn)行處理，使用以下修飾：在添加GRON之前，將所述原生質(zhì)體在冰上在補(bǔ)充有0、250或1000μg/ml Zeocin^TM或腐草霉素的TM(14.8mM MgCl₂x 6H₂O、5mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸、572mM甘露醇)中保持90分鐘。將所述溶液的pH調(diào)整至7.0。通過如實(shí)施例1中描述的流式細(xì)胞術(shù)評價(jià)從BFP至GFP轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞的百分比。

結(jié)果

在所使用的兩種濃度(250和1000μg/ml)下的博萊霉素和腐草霉素均產(chǎn)生BFP至GFP基因編輯的增加(參見圖19)。在GRON遞送之后五天觀察到由BFP至GFP基因編輯產(chǎn)生的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞(圖20)。

參考文獻(xiàn)

1.LeCong等人2013Science:第339卷第6121期第819-823頁.

2.Jinek等人2012Science.337:816-21

3.Wang等人2008RNA 14:903-913

4.Zhang等人2013.Plant Physiol.161:20-27

實(shí)施例21：水稻中的CRISPR和GRON

此實(shí)驗(yàn)的目的是展示在將CRISPR-Cas質(zhì)粒和GRON PEG遞送至原生質(zhì)體中之后120小時時水稻中的ACC酶轉(zhuǎn)化。在此實(shí)驗(yàn)中使用的CRISPR-Cas通過將編碼Cas9基因的質(zhì)粒和sgRNA引入原生質(zhì)體中來靶向水稻基因組中的acc酶基因。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA將Cas9引導(dǎo)至靶基因，其中Cas9產(chǎn)生acc酶基因中的雙鏈斷裂并且GRON用作模板以便以位點(diǎn)定向方式轉(zhuǎn)化acc酶基因。

方法

水稻原生質(zhì)體分離自愈傷組織。所述CRISPR-Cas編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的玉米泛素蛋白啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的水稻U6啟動子與聚-T₁₀終止子。將所述CRISPR-Cas質(zhì)粒通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl的最終濃度引入原生質(zhì)體中。具有以下序列5’V C TGA CCT GAA CTT GAT CTC AAT TAA CCC TTG CGG TTC CAG AAC ATT GCC TTT TGC AGT CCT CTC AGC ATA GCA CTC AAT GCG GTC TGG GTT TAT CTT GCT TCC AAC GAC AAC CCA AGC CCC TCC TCG TAG CTC TGC AGC CAT GGG AAT GTA GAC AAA GGC AGG CTG ATT GTA TGT CCT AAG GTT CTC AAC AAT AGT CGA GCC H 3’的GRON以0.8μM的最終濃度使用。將原生質(zhì)體包埋在瓊脂糖(2.5x 106個細(xì)胞/ml)中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在黑暗中在28℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器(60rpm)中孵育。在CRISPR-Cas質(zhì)粒和/或GRON遞送之后120小時將單獨(dú)樣品通過NGS進(jìn)行分析以便測定攜帶ACC酶轉(zhuǎn)化且具有acc酶基因中的插入缺失的細(xì)胞(DNA讀數(shù))的百分比。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從同一質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至靶基因的間隔區(qū)序列(5’-ACGAGGAGGGGCTTGGGTTGTGG-3)。在此實(shí)驗(yàn)中，CRISPR靶向acc酶基因。

結(jié)果

在第120小時時，水稻原生質(zhì)體具有0.026％ACC酶轉(zhuǎn)化，如通過下一代測序所測定。無CRISPR-Cas的僅GRON對照顯示在120小時時0.002％的最小Acc酶轉(zhuǎn)化并且未處理的對照未顯示轉(zhuǎn)化。另外，這些數(shù)據(jù)表明CRISPR-Cas是活性的且能夠裂解ACC酶靶基因且形成8.0％的插入缺失。

參考文獻(xiàn)

5.LeCong等人2013Science:第339卷第6121期第819-823頁.

6.Jinek等人2012Science.337:816-21

7.Wang等人2008RNA 14:903-913

8.Zhang等人2013.Plant Physiol.161:20-27

實(shí)施例22：水稻中的CRISPR和GRON

總結(jié)：已通過PCR和DNA測序分析在十九周齡愈傷組織中鑒別了靶向ACC酶突變。

引言

此實(shí)驗(yàn)的目的是展示在將CRISPR-Cas質(zhì)粒和GRON PEG遞送至原生質(zhì)體中之后水稻中的ACC酶轉(zhuǎn)化。在此實(shí)驗(yàn)中使用的CRISPR-Cas通過將編碼Cas9基因的質(zhì)粒和sgRNA引入原生質(zhì)體中來靶向水稻基因組中的ACC酶基因。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA將Cas9引導(dǎo)至靶基因，其中Cas9在ACC酶基因中的靶向位置處產(chǎn)生雙鏈斷裂或缺口并且GRON用作模板以便以位點(diǎn)定向方式轉(zhuǎn)化ACC酶基因。

結(jié)果

已通過PCR和DNA測序分析在十九周齡愈傷組織中鑒別了在以下表中描述的靶向OsACC酶突變。

方法

水稻原生質(zhì)體分離自從成熟種子來源的胚性愈傷組織引發(fā)的懸浮培養(yǎng)物。通過PEG介導(dǎo)的遞送方法將分別0.05μg/μl和0.8μM最終濃度的CRISPR-Cas質(zhì)粒與GRON引入原生質(zhì)體中。最終濃度下的CRISPR-Cas質(zhì)粒的示例性范圍包括但不限于0.01至0.2μg/μl。最終濃度下的GRON的示例性范圍包括但不限于0.01至4μM。所述CRISPR-Cas編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的玉米泛素蛋白啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的水稻U6啟動子與聚-T₁₀終止子。GRON的序列信息在表3中進(jìn)行了描述。在PEG處理之后，將原生質(zhì)體包埋在瓊脂糖(1.25x 10⁶個細(xì)胞/ml)中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在黑暗中在28℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器(60rpm)中孵育。用于將原生質(zhì)體包埋在瓊脂糖中的示例性范圍包括但不限于0.625x 10⁶至2.5x 10⁶個細(xì)胞/ml。在CRISPR-Cas質(zhì)粒和/或GRON處理之后4周通過下一代測序?qū)碜悦糠N處理的樣品進(jìn)行分析以測定攜帶ACC酶轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(DNA讀數(shù))的比例。將來自轉(zhuǎn)化處理的微小愈傷組織釋放到含有烯草酮(0.25-0.5μM)或稀禾定(2.5μM)的固體選擇培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)19周之后將在此選擇培養(yǎng)基上生長的單獨(dú)愈傷組織品系通過內(nèi)部篩選方法以及DNA測序進(jìn)行分析以便鑒別含有靶向ACC酶轉(zhuǎn)化的單獨(dú)愈傷組織。

所述CRISPR由兩種組分組成：Cas9如植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從質(zhì)粒表達(dá)。Cas9和sgRNA還可分別通過mRNA/RNA或蛋白質(zhì)/RNA遞送。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含具有在表2中描述的序列的間隔區(qū)，其用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至靶基因。在此實(shí)驗(yàn)中，CRISPR靶向水稻ACC酶基因。

在所述基因內(nèi)的兩個不同位置處(位點(diǎn)1和位點(diǎn)2)OsACC酶的轉(zhuǎn)化的列表。對于每個位點(diǎn)，所有轉(zhuǎn)化事件的組合是可能的。

在此實(shí)驗(yàn)中使用的CRISPR-Cas gRNA間隔區(qū)序列的列表。間隔區(qū)長度可變化達(dá)±20bp。在所述間隔區(qū)序列內(nèi)錯配的可容許達(dá)10bp。

適合在此實(shí)驗(yàn)中使用的GRON序列的列表提供于以下表中(V＝CY3；H＝3'DMT dC CPG)。

實(shí)施例23：亞麻中的CRISPR和GRON

總結(jié)：已通過PCR和DNA測序分析在四周齡愈傷組織中鑒別了靶向LuEPSPS突變。

引言

此實(shí)驗(yàn)的目的是展示通過CRISPR-Cas質(zhì)粒和GRON的PEG介導(dǎo)的遞送，莖尖來源的原生質(zhì)體中的亞麻基因組中的EPSPS基因的轉(zhuǎn)化。在此實(shí)驗(yàn)中使用的CRISPR-Cas和GRON靶向亞麻基因組中的EPSPS基因。所述CRISPR由兩種組分組成：Cas9，如植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從質(zhì)粒表達(dá)。Cas9和sgRNA還可分別通過mRNA/RNA或蛋白質(zhì)/RNA遞送。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA將Cas9引導(dǎo)至靶向基因，其中Cas9產(chǎn)生EPSPS基因中的雙鏈斷裂或缺口并且GRON用作模板以便以位點(diǎn)定向方式轉(zhuǎn)化EPSPS基因。

結(jié)果

已通過PCR和DNA測序分析在四周齡愈傷組織中鑒別了靶向LuEPSPS(T97I和/或P101A、P101T或P101S和/或G96A)突變。已經(jīng)從這些轉(zhuǎn)化的愈傷組織再生了根。

方法

亞麻原生質(zhì)體分離自從體外發(fā)芽的幼苗獲得的莖尖。所述CRISPR-Cas編碼的質(zhì)粒包含驅(qū)動Cas9編碼序列的MAS啟動子與rbcSE9終止子以及驅(qū)動sgRNA的擬南芥U6啟動子與聚-T₁₀終止子。將所述CRISPR-Cas質(zhì)粒通過PEG介導(dǎo)的遞送以0.05μg/μl的最終濃度引入原生質(zhì)體中。靶向兩種亞麻LuEPSPS基因中的每種的GRON(表2)以4.0μM的最終濃度使用。最終濃度下的CRISPR-Cas質(zhì)粒的示例性范圍包括但不限于0.01至0.2μg/μl。最終濃度下的GRON的示例性范圍包括但不限于0.01至4μM。將原生質(zhì)體包埋在藻酸鹽珠粒(5x 10⁵個細(xì)胞/ml)中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在黑暗中在25℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器(30rpm)中孵育。用于將原生質(zhì)體包埋在藻酸鹽珠粒中的示例性范圍包括但不限于3.0x 10⁵至7.5x 10⁵個細(xì)胞/ml。在CRISPR-Cas質(zhì)粒和/或GRON遞送之后3周和7周通過下一代測序?qū)膯为?dú)細(xì)胞發(fā)育的微小愈傷組織進(jìn)行分析以測定攜帶LuEPSPS基因中的靶向突變的細(xì)胞(DNA讀數(shù))的比例。從在固體再生培養(yǎng)基上接種的8周齡轉(zhuǎn)化的微小愈傷組織生長較大愈傷組織，并且在約4-8周之后根開始從再生的愈傷組織分化。通過PCR和DNA測序分析來鑒別具有靶向EPSPS基因突變的轉(zhuǎn)化的愈傷組織和根。

所述CRISPR由兩種組分組成：植物密碼子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)和sgRNA，所述兩者均從質(zhì)粒表達(dá)。sgRNA是CRISPR RNA(crRNA)與反式活化crRNA(tracrRNA)的融合。所述crRNA區(qū)包含具有在下表中描述的序列的間隔區(qū)，其用于將Cas9核酸酶引導(dǎo)至EPSPS靶向基因。

在此實(shí)驗(yàn)中使用的CRISPR-Cas gRNA間隔區(qū)序列的列表間隔區(qū)長度可變化達(dá)±20bp。在所述間隔區(qū)序列內(nèi)錯配的可容許達(dá)10bp。

適合在此實(shí)驗(yàn)中使用的GRON序列的列表提供于以下表中(V＝CY3；H＝3'DMT dC CPG)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解，本公開充分適于執(zhí)行目標(biāo)并且獲得所提到的以及其中固有的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文中提供的實(shí)施例代表優(yōu)選實(shí)施方案，為示例性的，并且并非意圖作為本公開的范圍的限制。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于顯而易見的是，在不脫離本公開的范圍和精神的情況下可對本文中所公開的公開內(nèi)容進(jìn)行可變的替換和修改。

本文中適當(dāng)?shù)卣f明性地描述的公開內(nèi)容可在缺少在本文中并未具體公開的任何一個或多個元件、一個或多個限制的情況下實(shí)踐。因此，例如，在本文中的每一個例子中，術(shù)語“包括”、“主要由……組成”和“由……組成”中的任何術(shù)語可由其他兩個術(shù)語中的任何一個代替。已使用的術(shù)語和措辭是用作描述而非限制的術(shù)語，并且在使用這類術(shù)語和措辭時并非旨在排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是應(yīng)認(rèn)識到，各種修改在公開要求的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)理解，盡管本公開已由優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征具體公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用本文中公開的概念的修改和變化，并且應(yīng)理解，所述修改和變化被視為在如由所附權(quán)利要求書定義的本公開的范圍內(nèi)。

因此，應(yīng)理解，盡管本公開已由優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征具體公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用所公開的公開內(nèi)容的修改、改進(jìn)和變化，并且應(yīng)理解，所述修改、改進(jìn)和變化被視為在本公開的范圍內(nèi)。本文中提供的材料、方法和實(shí)施例代表優(yōu)選實(shí)施方案，為示例性的，并且并非意圖作為本公開的范圍的限制。

本公開已在本文中進(jìn)行了廣泛性和一般性的描述。落在一般性公開范圍內(nèi)的每個較狹義的物種和亞屬群也構(gòu)成本公開的一部分。這包括具有附帶條件或否定限制的本公開的一般性描述，以從類屬中除去任何主題而不管所刪除的材料在本文中是否進(jìn)行了具體敘述。

此外，根據(jù)Markush組描述了本公開的特征或方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到本公開還因此根據(jù)Markush組的任何個別成員或成員亞組進(jìn)行了描述。

所有出版物、專利申請、專利和其他本文提到的參考文獻(xiàn)均以引用的方式明確地整體并入本文，引用程度就如同每個參考文獻(xiàn)分別以引用的方式單獨(dú)并入一樣。如有沖突，將以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。

在以下權(quán)利要求書內(nèi)闡述其他實(shí)施方案。