相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2014年6月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62/017,582和2014年6月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)no.62/017,627的權(quán)益，這兩份臨時(shí)申請(qǐng)均據(jù)此全文以引用方式并入本文。對(duì)經(jīng)由efs網(wǎng)絡(luò)作為文本文件提交的序列表的引用所述序列表的正式文本是經(jīng)由efs網(wǎng)絡(luò)作為ascii格式序列表以電子方式提交的，文件名為463545seqlist.txt，創(chuàng)建于2015年6月25日，大小為14000字節(jié)，并且與本說(shuō)明書(shū)同時(shí)提交。該ascii格式文件中含有的序列表是本說(shuō)明書(shū)的組成部分，其全文以引用方式并入本文。本發(fā)明涉及用于維持或培養(yǎng)多能和/或全能細(xì)胞的方法與組合物，以及用于產(chǎn)生細(xì)胞群體和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法與組合物。
背景技術(shù)：
：也許是由于y染色體具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，所以在小鼠胚胎干細(xì)胞中產(chǎn)生y連鎖基因突變的常規(guī)基因靶向策略已獲得的成果有限。因此通常情況下，對(duì)鼠y連鎖基因功能的理解受限于從對(duì)攜帶自發(fā)缺失、隨機(jī)基因捕獲插入或常染色體轉(zhuǎn)基因的小鼠的研究獲得的見(jiàn)解。需要開(kāi)發(fā)用于提高靶向y染色體上的基因組座位的能力的方法。sry蛋白(性別決定區(qū)y)是胎盤(pán)哺乳動(dòng)物中決定雄性性別的關(guān)鍵調(diào)控因子。sry基因(也稱(chēng)為睪丸決定因子(tdf))駐留在y染色體上。sry被認(rèn)為是通過(guò)其高遷移率族(hmg)結(jié)構(gòu)域結(jié)合dna的轉(zhuǎn)錄因子。小鼠sry基因的表達(dá)在胚胎發(fā)育第11天左右的狹窄時(shí)間窗內(nèi)局限于生殖嵴；既檢測(cè)了srymrna，又檢測(cè)了sry蛋白。必須在該時(shí)間窗內(nèi)制備足夠多的sry，以使雙潛能生殖嵴朝著雄性睪丸形成程序轉(zhuǎn)變，同時(shí)抑制雌性卵巢發(fā)育程序。在成體睪丸中，檢測(cè)到了環(huán)狀sry轉(zhuǎn)錄物，但未檢測(cè)到sry蛋白。sry基因中導(dǎo)致產(chǎn)生失活sry蛋白或改變基因表達(dá)的定時(shí)和強(qiáng)度的突變可引起雄性到雌性的性逆轉(zhuǎn)，從而產(chǎn)生具有x和y染色體但在解剖學(xué)上為雌性的動(dòng)物。所謂的xy雌性通常是不育的，或只具有很低的可育性。能夠通過(guò)調(diào)控sry來(lái)控制性別決定，在產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾動(dòng)物的過(guò)程中將具有極大的價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種用于制備能夠在f0代中產(chǎn)生可育xy雌性非人哺乳動(dòng)物的xy胚胎干(es)細(xì)胞系的方法。該方法包括：(a)修飾非人哺乳動(dòng)物xy胚胎干(es)細(xì)胞，以具有降低sry蛋白的水平和/或活性的修飾；以及(b)在一定條件下培養(yǎng)所述經(jīng)修飾的es細(xì)胞系，所述條件允許制備能夠在f0代中產(chǎn)生可育xy雌性非人哺乳動(dòng)物的es細(xì)胞系。還提供了一種用于在f0代中產(chǎn)生可育xy雌性非人哺乳動(dòng)物的方法。該方法包括：(a)將通過(guò)上述方法制備的具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中；(b)孕育該宿主胚胎；以及(c)獲得f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物，其中在達(dá)到性成熟后，該f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雌性xyf0非人哺乳動(dòng)物在與野生型小鼠雜交時(shí)是可育的。在具體實(shí)施例中，所述野生型小鼠為c57bl/6。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述嚙齒動(dòng)物為小鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞來(lái)源于129品系。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞為vgf1小鼠es細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞包含來(lái)源于129品系的y染色體。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞來(lái)自c57bl/6品系。在另一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為大鼠或倉(cāng)鼠。在一些實(shí)施例中，sry蛋白的水平和/或活性降低由sry基因中的遺傳修飾引起。在一些此類(lèi)方法中，sry基因中的遺傳修飾包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、敲除、敲入，用同源、異源或直系同源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列，或它們的組合。在本文提供的方法中，靶向遺傳修飾可包括插入、缺失、敲除、敲入、點(diǎn)突變或它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾位于常染色體上。在一些實(shí)施例中，sry基因的修飾包括可選標(biāo)記和/或報(bào)告基因的插入，所述可選標(biāo)記和/或報(bào)告基因有效連接至所述非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，sry基因的修飾包括報(bào)告基因的插入，所述報(bào)告基因有效連接至內(nèi)源sry啟動(dòng)子。在一個(gè)具體實(shí)施例中，報(bào)告基因編碼報(bào)告蛋白lacz。在一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)步驟包括在適用于在培養(yǎng)中維持非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞、包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基為低滲透壓培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施例中，所述低滲透壓培養(yǎng)基表現(xiàn)出約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓。在其他實(shí)施例中，所述低滲透壓培養(yǎng)基表現(xiàn)出以下一種或多種特征：約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或這些特征之中任何兩種或更多種的組合。在一些實(shí)施例中，在將所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中并接著孕育該宿主胚胎之后，至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的f0非人哺乳動(dòng)物為xy雌性，在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞在y染色體上包含靶基因組座位，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，并且其中所述核酸酶試劑在所述識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂。這種方法還可包括在存在包含插入多核苷酸的靶向載體的情況下使所述es細(xì)胞暴露于所述核酸酶試劑，其中在暴露于所述核酸酶試劑和所述靶向載體后，所述es細(xì)胞被修飾成包含所述插入多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為編碼核酸酶的mrna。在具體實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為(a)鋅指核酸酶(zfn)；(b)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)；或(c)大范圍核酸酶。在其他實(shí)施例中，所述核酸酶試劑包括成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(cas)蛋白和向?qū)na(grna)。在此類(lèi)方法中，所述向?qū)na(grna)包括(a)靶向第一識(shí)別位點(diǎn)的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)rna(crrna)；和(b)反式激活crisprrna(tracrrna)。在一些情況下，所述識(shí)別位點(diǎn)緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。在一個(gè)實(shí)施例中，cas蛋白為cas9。還提供了一種體外培養(yǎng)物，其包含根據(jù)本文所提供的任何方法的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞系。提供了一種體外培養(yǎng)物，并且該體外培養(yǎng)物包含(a)具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的非人哺乳動(dòng)物xy胚胎干(es)細(xì)胞；以及(b)適用于在培養(yǎng)中維持非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞、包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓。在其他實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出以下一種或多種特征：約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或這些特征之中任何兩種或更多種的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為小鼠或大鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞為vgf1小鼠es細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為大鼠或倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，sry蛋白的水平和/或活性降低源自sry基因中的遺傳修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，sry基因中的遺傳修飾包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、敲除、敲入、用異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列，或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞包含一種、兩種、三種或更多種靶向遺傳修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾包括插入、缺失、敲除、敲入、點(diǎn)突變或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾包括異源多核苷酸在所述xyes細(xì)胞的基因組中的至少一個(gè)插入。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾位于常染色體上。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出50±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及218±22mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約3mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及218mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及261±26mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及261mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出110±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及294±29mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約6.4mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及294mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及270±27mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及270mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽、86±5mm葡萄糖以及322±32mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉、15.5mg/ml葡萄糖以及322mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，在將所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中并接著孕育該宿主胚胎之后，至少80％的所述f0非人哺乳動(dòng)物為xy雌性，在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。還提供了一種用于在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy非人哺乳動(dòng)物的方法，包括：(a)在適用于在培養(yǎng)中維持非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞、包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的供體非人哺乳動(dòng)物xy胚胎干(es)細(xì)胞，(b)將所述供體xy非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞引入宿主胚胎中；(c)孕育該宿主胚胎；以及(d)獲得f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物，其中在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基表現(xiàn)出約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓。在其他實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基表現(xiàn)出包括以下一者或多者的特征：約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或這些特征之中任何兩種或更多種的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為小鼠或大鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞為vgf1小鼠es細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為大鼠或倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，sry蛋白的水平和/或活性降低源自sry基因中的遺傳修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，sry基因中的遺傳修飾包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、敲除、敲入、用異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列，或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞包含一種、兩種、三種或更多種靶向遺傳修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾包括插入、缺失、敲除、敲入、點(diǎn)突變或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾包括異源多核苷酸在所述xyes細(xì)胞的基因組中的至少一個(gè)插入。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾位于常染色體上。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出50±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及218±22mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約3mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及218mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及261±26mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及261mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出110±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及294±29mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約6.4mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及294mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及270±27mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及270mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽、86±5mm葡萄糖以及322±32mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉、15.5mg/ml葡萄糖以及322mosm/kg。還提供了在f1代中產(chǎn)生對(duì)于靶向遺傳突變?yōu)榧兒系霓D(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法，包括：(a)使所述sry蛋白的水平和/或活性降低的f0xy可育雌性與衍生自相同es細(xì)胞克隆的同齡群無(wú)性系同胞f0xy雄性非人哺乳動(dòng)物雜交，其中所述f0xy可育雌性非人哺乳動(dòng)物和所述f0xy雄性非人哺乳動(dòng)物各自對(duì)于所述遺傳突變均為雜合的；以及(b)獲得對(duì)于所述遺傳修飾為純合的f1子代小鼠。還提供了一種用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，(b)向該細(xì)胞中引入(i)核酸酶試劑，其中所述核酸酶試劑在第一識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂與位置足夠接近第一識(shí)別位點(diǎn)的第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)；以及(c)鑒定在其基因組中包含在所述靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，第一同源臂和第二同源臂的總和為至少4kb但少于150kb。在一個(gè)實(shí)施例中，第一同源臂和/或第二同源臂的長(zhǎng)度為至少400bp但少于1000bp。在另一個(gè)實(shí)施例中，第一同源臂和/或第二同源臂的長(zhǎng)度為約700bp至約800bp。還提供了一種用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)；(b)向該細(xì)胞中引入包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接與第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的第一同源臂和第二同源臂；以及(c)鑒定在其基因組中包含在所述靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，第一同源臂和/或第二同源臂的長(zhǎng)度為至少400bp但少于1000bp。在另一個(gè)實(shí)施例中，第一同源臂和/或第二同源臂的長(zhǎng)度為約700bp至約800bp。在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非人細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞為多能細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為非人胚胎干(es)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為嚙齒動(dòng)物胚胎干(es)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞或大鼠胚胎干(es)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為編碼核酸酶的mrna。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為鋅指核酸酶(zfn)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為大范圍核酸酶。在一些實(shí)施例中，所述核酸酶試劑包括成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(cas)蛋白和向?qū)na(grna)。在這種方法中，所述向?qū)na(grna)可包括(a)靶向第一識(shí)別位點(diǎn)的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)rna(crrna)；和(b)反式激活crisprrna(tracrrna)。在一個(gè)實(shí)施例中，第一識(shí)別位點(diǎn)或第二識(shí)別位點(diǎn)緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。在一些實(shí)施例中，cas蛋白為cas9。在一些實(shí)施例中，所述修飾包括內(nèi)源核酸序列的缺失。在一些實(shí)施例中，所述缺失在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、或約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb的范圍內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述缺失為至少500kb。在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非人細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞為多能細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為非人胚胎干(es)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為嚙齒動(dòng)物胚胎干(es)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞或大鼠胚胎干(es)細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述核酸酶試劑包括成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(cas)蛋白和向?qū)na(grna)。在這種方法中，所述向?qū)na(grna)可包括(a)靶向第一識(shí)別位點(diǎn)的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)rna(crrna)；和(b)反式激活crisprrna(tracrrna)。在一個(gè)實(shí)施例中，第一識(shí)別位點(diǎn)或第二識(shí)別位點(diǎn)緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。在一些實(shí)施例中，cas蛋白為cas9。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為鋅指核酸酶(zfn)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為大范圍核酸酶。用于修飾y染色體的方法包括在存在包含至少10kb核酸序列的大靶向載體(ltvec)的情況下使y染色體暴露于cas蛋白和crisprrna，并且包括在暴露于cas蛋白、crisprrna和ltvec后，將y染色體修飾成包含至少10kb的核酸序列。ltvec可包含至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb或至少90kb的核酸序列。在其他實(shí)施例中，ltvec包含至少100kb、至少150kb或至少200kb的核酸序列。還提供了一種用于修飾y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述靶基因組座位包含向?qū)na(grna)靶序列；(b)向該哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入：(i)包含第一核酸的大靶向載體(ltvec)，所述第一核酸側(cè)接有與靶基因組座位同源的靶向臂，其中所述ltvec為至少10kb；(ii)包含第一啟動(dòng)子的第一表達(dá)構(gòu)建體，所述第一啟動(dòng)子有效連接至編碼cas蛋白的第二核酸，以及(iii)包含第二啟動(dòng)子的第二表達(dá)構(gòu)建體，所述第二啟動(dòng)子有效連接至編碼向?qū)na(grna)的第三核酸，所述向?qū)na包含雜交至grna靶序列和反式激活crisprrna(tracrrna)的核苷酸序列，其中所述第一啟動(dòng)子和所述第二啟動(dòng)子在該哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性；以及(c)鑒定在y染色體上的靶基因組座位處包含靶向遺傳修飾的經(jīng)修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，ltvec為至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb或至少90kb。在其他實(shí)施例中，ltvec為至少100kb、至少150kb或至少200kb。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，嚙齒動(dòng)物為大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為多能細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為小鼠胚胎干(es)細(xì)胞或大鼠胚胎干(es)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為發(fā)育受限的人祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，cas蛋白為cas9蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，grna靶序列緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。在一個(gè)實(shí)施例中，ltvec的5’同源臂和3’同源臂的總和為約10kb至約150kb。在一個(gè)實(shí)施例中，ltvec的5’同源臂和3’同源臂的總和為約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約120kb、或約120kb至150kb。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向遺傳修飾包括：(a)用同源或直系同源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列；(b)內(nèi)源核酸序列的缺失；(c)內(nèi)源核酸序列的缺失，其中所述缺失在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、或約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb的范圍內(nèi)；(d)外源核酸序列的插入；(e)外源核酸序列的插入，所述插入在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、約150kb至約200kb、約200kb至約250kb、約250kb至約300kb、約300kb至約350kb、或約350kb至約400kb的范圍內(nèi)；(f)包含同源或直系同源核酸序列的外源核酸序列的插入；(g)包含人和非人核酸序列的嵌合核酸序列的插入；(h)側(cè)接有位點(diǎn)特異性重組酶靶序列的條件性等位基因的插入；(i)有效連接至所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的第三啟動(dòng)子的可選標(biāo)記或報(bào)告基因的插入；或(j)它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，所述靶基因組座位包含(i)與5’同源臂同源的5’靶序列，以及(ii)與3’同源臂同源的3’靶序列。在一個(gè)實(shí)施例中，所述5’靶序列和所述3’靶序列相隔至少5kb但少于3mb。在一個(gè)實(shí)施例中，所述5’靶序列和所述3’靶序列相隔至少5kb但少于10kb、至少10kb但少于20kb、至少20kb但少于40kb、至少40kb但少于60kb、至少60kb但少于80kb、至少約80kb但少于100kb、至少100kb但少于150kb、或至少150kb但少于200kb、至少約200kb但少于約300kb、至少約300kb但少于約400kb、至少約400kb但少于約500kb、至少約500kb但少于約1mb、至少約1mb但少于約1.5mb、至少約1.5mb但少于約2mb、至少約2mb但少于約2.5mb、或至少約2.5mb但少于約3mb。在一個(gè)實(shí)施例中，第一表達(dá)構(gòu)建體和第二表達(dá)構(gòu)建體位于單個(gè)核酸分子上。在一個(gè)實(shí)施例中，所述靶基因組座位包括sry基因座。還提供了一種用于非人動(dòng)物y染色體上的靶向遺傳修飾的方法，包括：(a)根據(jù)本文所述的方法修飾非人多能細(xì)胞的y染色體上的目標(biāo)基因組座位，從而產(chǎn)生在y染色體上包含靶向遺傳修飾的經(jīng)遺傳修飾的非人多能細(xì)胞；(b)將(a)的所述經(jīng)修飾的非人多能細(xì)胞引入非人宿主胚胎中；以及在代孕母體中孕育包含所述經(jīng)修飾的多能細(xì)胞的非人宿主胚胎，其中所述代孕母體產(chǎn)生包含靶向遺傳修飾的f0子代，其中所述靶向遺傳修飾能夠通過(guò)種系傳遞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述目標(biāo)基因組座位包括sry基因座。本發(fā)明提供了用于在y染色體上生成靶向遺傳修飾的方法與組合物。組合物包括體外培養(yǎng)物，所述體外培養(yǎng)物包含具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的xy多能和/或全能動(dòng)物細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)；以及在促進(jìn)xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞。此類(lèi)組合物可應(yīng)用于在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy非人哺乳動(dòng)物的各種方法。附圖說(shuō)明圖1提供了靶向小鼠sry基因的crisprcas9/grna的示意圖。vg-1(seqidno:10)；vg-2(seqidno:11)；vg-3(seqidno:12)。圖1所示的引物和探針以seqidno:13至29提供。圖2提供了使用lacz報(bào)告基因，用talen和crispr靶向sry基因的示意圖。用ltvec和短臂載體(smalltvec)兩者靶向sry基因，以避免攻擊y染色體上的基因座，所述短臂載體的同源臂比ltvec小。圖3示出了胚胎中的lacz表達(dá)。圖4提供了由zfn或由crispr向?qū)na結(jié)合cas9dna內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的在y染色體上產(chǎn)生大于500kb的大段缺失的示意圖。圖5a、圖5b和圖5c提供了對(duì)各種克隆中y染色體的大段缺失的測(cè)序確認(rèn)。圖5a為克隆1-d5的測(cè)序結(jié)果。kdm5上游和uspy9下游序列以seqidno:30、1-d51500f(seqidno:31)、1-d51000r(seqidno:32)提供；圖5b為克隆5-c4的測(cè)序結(jié)果。kdm5上游和uspy9下游序列以seqidno:33、1500f(seqidno:34)、1000r(seqidno:35)、1000f(seqidno:36)提供；圖5c為克隆6-a12的測(cè)序結(jié)果。kdm5上游和uspy9下游序列以seqidno:37、1500f(seqidno:38)、1000r(seqidno:39)、1000f(seqidno:40)、1500r(seqidno:41)提供。圖5b和圖5c中的加框區(qū)域代表微同源區(qū)。具體實(shí)施方式定義在本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”包括任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合形式，包括編碼和非編碼的氨基酸、以及經(jīng)化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生的氨基酸。這些術(shù)語(yǔ)還包括已經(jīng)過(guò)修飾的聚合物，諸如具有經(jīng)修飾的肽骨架的多肽。在本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”包括任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸，或它們的類(lèi)似物或修飾形式。這些術(shù)語(yǔ)包括單鏈、雙鏈和多鏈的dna或rna，基因組dna、cdna、dna-rna雜合體，以及包含嘌呤堿基、嘧啶堿基或其他天然的、經(jīng)化學(xué)修飾的、經(jīng)生物化學(xué)修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的聚合物。為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，無(wú)論核酸是雙鏈形式還是單鏈形式，核酸大小都可用bp來(lái)表示，如果核酸為單鏈形式，則bp是只在單鏈核酸與其完全互補(bǔ)鏈形成雙鏈體時(shí)形成的那些?！懊艽a子優(yōu)化”通常包括在維持天然氨基酸序列的同時(shí)，通過(guò)用在宿主細(xì)胞的基因中更頻繁或最頻繁使用的密碼子替換天然序列的至少一個(gè)密碼子來(lái)修飾核酸序列以增強(qiáng)特定宿主細(xì)胞中的表達(dá)的過(guò)程。例如，可修飾編碼cas蛋白的核酸，以替換成與天然存在的核酸序列相比在給定的原核或真核細(xì)胞(包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、人細(xì)胞、非人細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、倉(cāng)鼠細(xì)胞或任何其他宿主細(xì)胞)中具有更高使用頻率的密碼子。密碼子使用表可輕易獲得，例如在“密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)”處獲得。這些表可按多種方式進(jìn)行調(diào)整。參見(jiàn)nakamuraetal.(2000)nucleicacidsresearch28:292(nakamura等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第292頁(yè))。用于對(duì)在特定宿主中表達(dá)的特定序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化的計(jì)算機(jī)算法也是可得的(參見(jiàn)例如geneforge)。“有效連接”或?yàn)椤坝行У剡B接的”包括兩種或更多種組分(例如，啟動(dòng)子和另一個(gè)序列元件)的并置關(guān)系，使得兩種組分都發(fā)揮正常功能并允許至少一種所述組分能夠介導(dǎo)施加于至少一種其他組分的功能。例如，如果啟動(dòng)子響應(yīng)于存在或不存在一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子而控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平，則該啟動(dòng)子可有效連接至該編碼序列。核酸的“互補(bǔ)性”是指核酸的一條鏈中的核苷酸序列由于其核堿基基團(tuán)的取向，而與相對(duì)核酸鏈上的另一個(gè)序列形成氫鍵。dna中的互補(bǔ)堿基通常為a與t、c與g。rna中的互補(bǔ)堿基通常為c與g、u與a?；パa(bǔ)性可以是完美的或顯著的/充分的。兩個(gè)核酸之間完美互補(bǔ)意味著這兩個(gè)核酸可形成雙鏈體，該雙鏈體中的每個(gè)堿基通過(guò)沃森-克里克(watson-crick)配對(duì)而與互補(bǔ)堿基結(jié)合?！帮@著”或“充分”互補(bǔ)是指一條鏈中的序列與相對(duì)鏈中的序列并非完全和/或完美互補(bǔ)，而是在兩條鏈上的堿基之間發(fā)生充分結(jié)合，從而在一組雜交條件(例如，鹽濃度和溫度)下形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合體。此類(lèi)條件可通過(guò)以下方式預(yù)測(cè)：使用序列和標(biāo)準(zhǔn)數(shù)學(xué)計(jì)算來(lái)預(yù)測(cè)雜交鏈的tm，或通過(guò)使用常規(guī)方法來(lái)憑經(jīng)驗(yàn)確定tm。tm是指使兩條核酸鏈之間形成的雜交復(fù)合體群體的50％變性的溫度。在低于tm的溫度下，有利于雜交復(fù)合體形成，而在高于tm的溫度下，有利于雜交復(fù)合體中的鏈融化或分離?？赏ㄟ^(guò)使用例如tm＝81.5+0.41(％g+c)來(lái)估計(jì)在1mnacl水溶液中具有已知g+c含量的核酸的tm，但也可使用其他已知的tm計(jì)算法來(lái)考慮核酸的結(jié)構(gòu)特征?！半s交條件”包括其中一條核酸鏈通過(guò)互補(bǔ)鏈相互作用和氫鍵與第二條核酸鏈結(jié)合而產(chǎn)生雜交復(fù)合體的累積環(huán)境。此類(lèi)條件包括含有核酸的水溶液或有機(jī)溶液的化學(xué)組分及其濃度(例如鹽、螯合劑、甲酰胺)，以及混合物的溫度。其他因素(諸如溫育時(shí)長(zhǎng)或反應(yīng)室尺寸)可能對(duì)環(huán)境有影響。參見(jiàn)例如sambrooketal.,molecularcloning,alaboratorymanual,2.sup.nded.,pp.1.90-1.91,9.47-9.51,11.47-11.57(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989)(sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第2版增補(bǔ)版，第1.90-1.91頁(yè)，第9.47-9.51頁(yè)，第11.47-11.57頁(yè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約冷泉港，1989年)。雜交需要兩個(gè)核酸含有互補(bǔ)序列，但堿基之間可能存在錯(cuò)配。適于兩個(gè)核酸之間進(jìn)行雜交的條件取決于核酸長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度，這些都是本領(lǐng)域熟知的變量。兩個(gè)核苷酸序列之間的互補(bǔ)程度越大，具有那些序列的核酸的雜合體的解鏈溫度(tm)值越大。對(duì)于具有短片段互補(bǔ)(例如，在35個(gè)或更少、30個(gè)或更少、25個(gè)或更少、22個(gè)或更少、20個(gè)或更少、或者18個(gè)或更少的核苷酸上互補(bǔ))的核酸之間的雜交，錯(cuò)配位置變得重要(參見(jiàn)sambrook等人，出處同上，第11.7-11.8頁(yè))。通常，可雜交核酸的長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸。可雜交核酸的示例性最小長(zhǎng)度包括至少約15個(gè)核苷酸、至少約20個(gè)核苷酸、至少約22個(gè)核苷酸、至少約25個(gè)核苷酸，以及至少約30個(gè)核苷酸。此外，溫度和洗滌溶液的鹽濃度在必要時(shí)可根據(jù)多個(gè)因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些因素諸如互補(bǔ)區(qū)長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度。多核苷酸序列不必與其可特異性雜交的靶核酸的序列100％互補(bǔ)。此外，多核苷酸可以在一個(gè)或多個(gè)區(qū)段上雜交，使得介入?yún)^(qū)段或相鄰區(qū)段不參與雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。多核苷酸(例如，grna)可與其所靶向的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)域具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列互補(bǔ)性。例如，如果在grna的20個(gè)核苷酸中有18個(gè)與靶區(qū)域互補(bǔ)、因而將特異性雜交，則該grna代表90％的互補(bǔ)性。在該例子中，剩余的非互補(bǔ)核苷酸可以是成簇的或其間間隔互補(bǔ)核苷酸，不必彼此鄰接、也不必與互補(bǔ)核苷酸鄰接。可使用blast程序(局部比對(duì)基本檢索工具)和本領(lǐng)域已知的powerblast程序(altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-410(altschul等人，1990年，《分子生物學(xué)雜志》，第215卷，第403-410頁(yè))；zhangandmadden(1997)genomeres.7:649-656(zhang和madden，1997年，《基因組研究》，第7卷，第649-656頁(yè)))或通過(guò)使用gap程序(wisconsin序列分析程序包(wisconsinsequenceanalysispackage)，第8版，用于unix操作系統(tǒng)，美國(guó)威斯康星州麥迪遜大學(xué)研究園遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwis.))，使用默認(rèn)設(shè)置來(lái)常規(guī)地測(cè)定核酸內(nèi)的特定核酸序列片段之間的互補(bǔ)性百分比，該測(cè)定使用史密斯-沃特曼算法(adv.appl.math.,1981,2,482-489(《應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展》，1981年，第2卷，第482-489頁(yè)))。本文所提供的方法與組合物采用多種不同的組分。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，在說(shuō)明書(shū)通篇中，一些組分可具有活性變體和片段。此類(lèi)組分包括例如cas蛋白、crisprrna、tracrrna和向?qū)na。這些組分各自的生物活性在本文別處描述。在兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比較窗中比對(duì)最大對(duì)應(yīng)時(shí)，兩個(gè)序列中的殘基是相同的。在關(guān)于蛋白質(zhì)使用序列同一性百分比時(shí)，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置通常因保守氨基酸置換而不同，發(fā)生保守氨基酸置換時(shí)，氨基酸殘基被置換成其他具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基，因而不改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列在保守置換方面不同時(shí)，可上調(diào)序列同一性百分比以校正所述置換的保守性。由于這類(lèi)保守置換而不同的序列被稱(chēng)為具有“序列相似性”或“相似性”。用于進(jìn)行這種調(diào)節(jié)的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換當(dāng)作部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配來(lái)記分，從而增大序列同一性百分比。因此，例如，在將相同的氨基酸記1分并將非保守置換記0分的情況下，保守置換的得分介于0和1之間。計(jì)算保守置換的得分，例如，如在程序pc/gene(美國(guó)加利福尼亞州山景城intelligenetics公司(intelligenetics,mountainview,california))中實(shí)現(xiàn)。“序列同一性百分比”包括通過(guò)在比較窗上比較兩個(gè)最佳比對(duì)序列而測(cè)定的值，其中與參考序列(其不包含添加和缺失)相比，多核苷酸序列在比較窗中的部分可包含添加或缺失(即缺口)以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。通過(guò)以下方式計(jì)算這種百分比：確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100，得到序列同一性百分比。除非另有說(shuō)明，否則序列同一性/相似性值包括使用gap版本10并使用以下參數(shù)獲得的值：對(duì)于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用gap權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3，以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；對(duì)于氨基酸序列的同一性％和相似性％，使用gap權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2，以及blosum62評(píng)分矩陣；或它們的任何等同程序?！暗韧绦颉卑▽?duì)于任何兩個(gè)所考慮的序列，當(dāng)與由gap版本10產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)比較時(shí)，產(chǎn)生具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配以及相同的序列同一性百分比的比對(duì)的任一種序列比較程序。“包含”或“包括”一種或多種所述要素的組合物或方法可包括未明確述及的其他要素。例如，“包含”或“包括”一種蛋白質(zhì)的組合物可含有單獨(dú)的蛋白質(zhì)，也可含有蛋白質(zhì)與其他成分的組合。指定的值范圍包括在該范圍內(nèi)的或限定該范圍的所有整數(shù)，以及由該范圍內(nèi)的整數(shù)限定的所有子范圍。術(shù)語(yǔ)“約”涵蓋指定值的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量誤差界限(例如，sem)內(nèi)的值，除非從上下文中明確地看出并非如此。單數(shù)形式的冠詞“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多個(gè)指代物，除非上下文中明確地另行規(guī)定。例如，術(shù)語(yǔ)“一種cas蛋白”或“至少一種cas蛋白”可包括多種cas蛋白，包括它們的混合物。i.用于在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy動(dòng)物的方法與組合物由供體es細(xì)胞和宿主胚胎產(chǎn)生非人動(dòng)物的方法是已知的。選擇具有某些特征的供體es細(xì)胞，這些特征增強(qiáng)細(xì)胞遷入宿主胚胎的能力，因此部分地或基本上部分地有助于用供體es細(xì)胞和宿主胚胎形成動(dòng)物。所形成的動(dòng)物可以是雄性或雌性，這很大程度上基于es細(xì)胞的基因型(例如，xy或xx)。大部分用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的es細(xì)胞系具有雄性xy基因型。由于y染色體在哺乳動(dòng)物性別決定中占支配地位，所以，在將xyes細(xì)胞引入宿主胚胎囊胚中并孕育時(shí)，這些細(xì)胞在第一代(f0)中幾乎總是產(chǎn)生表型為雄性的動(dòng)物，所述表型為雄性的動(dòng)物為嵌合體，也就是說(shuō)，含有來(lái)源于雄性供體es細(xì)胞的細(xì)胞(xy)和來(lái)源于宿主胚胎的細(xì)胞，所述來(lái)源于宿主胚胎的細(xì)胞可以是雄性(xy)、也可以是雌性(xx)。xyes細(xì)胞在通過(guò)velocimouse方法引入8-細(xì)胞宿主胚胎中并孕育時(shí)，可以在第一代(f0)中產(chǎn)生完全來(lái)源于xyes細(xì)胞、且表型為雄性的動(dòng)物。wo2011/156723提供了這樣的方法和組合物：其采用在培養(yǎng)中維持xy供體細(xì)胞的培養(yǎng)基，使得在將xy供體細(xì)胞引入宿主胚胎并在合適的宿主中孕育之后，在f0群體中產(chǎn)生可育的xy雌性動(dòng)物。此類(lèi)組合物可用于產(chǎn)生對(duì)于給定的靶向遺傳修飾為純合的f1子代。本申請(qǐng)?zhí)峁┝耸褂镁哂薪档蛃ry蛋白水平和/或活性的修飾的xy供體細(xì)胞與促進(jìn)產(chǎn)生解剖學(xué)上正常、可育且多產(chǎn)的xyf0雌性的培養(yǎng)基的組合的方法與組合物。此類(lèi)方法和組合物允許在f0代中產(chǎn)生可育的雌性xy非人動(dòng)物。具有降低sry蛋白的水平和/或活性的修飾的xyes細(xì)胞與本文所述培養(yǎng)基的組合顯著增大了f0代中可育雌性xy子代的百分比。用于有效地將雄性性逆轉(zhuǎn)為雌性的方法在家畜行業(yè)中很有價(jià)值。例如，對(duì)于奶牛行業(yè)來(lái)說(shuō)，雌性小牛遠(yuǎn)比雄性小牛有價(jià)值。對(duì)于家禽也是如此。出于繁育目的，無(wú)論是牛、豬還是綿羊，優(yōu)選地讓多頭雌性?xún)H與少數(shù)幾頭公牛、公豬或公羊交配繁育。因此，本文所提供的各種方法可用于各種具有重要商業(yè)價(jià)值的繁育行業(yè)。還提供了用于制備無(wú)需在雌性化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，就能夠在f0代中產(chǎn)生可育xy雌性非人哺乳動(dòng)物的xy胚胎干(es)細(xì)胞系的方法和組合物。在此類(lèi)方法中，具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的xyes細(xì)胞系可產(chǎn)生能夠在缺乏本文別處所提供的雌性化培養(yǎng)基的情況下(例如，通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基諸如本文別處所描述的dmem)，在f0代中產(chǎn)生可育xy雌性非人哺乳動(dòng)物的es細(xì)胞系。a.具有降低sry蛋白的水平和/或活性的修飾的動(dòng)物xy細(xì)胞本文提供了包含來(lái)自動(dòng)物的各種xy多能和/或全能細(xì)胞的各種組合物和方法。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“多能細(xì)胞”，包括具有發(fā)育成不止一種分化細(xì)胞類(lèi)型的能力的未分化細(xì)胞。此類(lèi)多能和/或全能xy細(xì)胞可以是例如胚胎干(es)細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“胚胎干細(xì)胞”或“es細(xì)胞”包括胚胎衍生的全能或多能細(xì)胞，所述全能或多能細(xì)胞在引入胚胎后能夠有助于胚胎發(fā)育成任何組織。與細(xì)胞、多能和/或全能細(xì)胞、xy細(xì)胞、es細(xì)胞、ips細(xì)胞、供體細(xì)胞和/或宿主胚胎有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”，包括哺乳動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)和禽類(lèi)。哺乳動(dòng)物包括例如人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、猴、猿、貓、狗、馬、公牛、鹿、野牛、綿羊、嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠)、牲畜(例如，牛物種，如奶牛、犍牛等；羊物種，如綿羊、山羊等；以及豬物種，例如小豬和公豬)。禽類(lèi)包括例如雞、火雞、鴕鳥(niǎo)、鵝、鴨等。還包括家養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng)業(yè)動(dòng)物。與細(xì)胞、xy細(xì)胞、es細(xì)胞、供體細(xì)胞和/或宿主胚胎有關(guān)的短語(yǔ)“非人動(dòng)物”排除人類(lèi)。在具體實(shí)施例中，多能細(xì)胞為人xyes細(xì)胞、人xyips細(xì)胞、成人xyes細(xì)胞、發(fā)育受限的人祖es細(xì)胞、非人xyes細(xì)胞、非人xyips細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物xyes細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物xyips細(xì)胞、小鼠xyes細(xì)胞、小鼠xyips細(xì)胞、大鼠xyes細(xì)胞、大鼠xyips細(xì)胞、倉(cāng)鼠xyes細(xì)胞、倉(cāng)鼠xyips細(xì)胞、猴xyes細(xì)胞、猴xyips細(xì)胞、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物xyips細(xì)胞、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物xyips細(xì)胞。此外，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞可來(lái)自近交品系、雜交品系或遠(yuǎn)交品系。還已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，多能和/或全能xy細(xì)胞可具有xyy核型或xxy核型。小鼠多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)可來(lái)自129品系、c57bl/6品系、129與c57bl/6的混合品系、balb/c品系或swisswebster品系。在一個(gè)具體實(shí)施例中，小鼠多能和/或全能細(xì)胞一半來(lái)自129品系，另一半來(lái)自c57bl/6品系。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠多能和/或全能細(xì)胞為129品系，其中129品系選自下列品系：129p1、129p2、129p3、129x1、129s1(例如，129s1/sv、129s1/svlm)、129s2、129s4、129s5、129s9/svevh、129s6(129/svevtac)、129s7、129s8、129t1、129t2。參見(jiàn)例如festingetal.(1999)mammaliangenome10:836(festing等人，1999年，《哺乳動(dòng)物基因組》，第10卷，第836頁(yè))。在一個(gè)實(shí)施例中，小鼠多能和/或全能細(xì)胞為c57bl品系，并且在一個(gè)具體實(shí)施例中來(lái)自c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kal_wn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/6ntac、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr或c57bl/ola。在一個(gè)具體實(shí)施例中，小鼠多能和/或全能細(xì)胞為上述129品系與上述c57bl/6品系的混合物。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，小鼠多能和/或全能細(xì)胞為上述129品系的混合物，或上述bl/6品系的混合物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述混合物中的129品系為129s6(129/svevtac)品系。在一些實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞包含來(lái)源于129品系的y染色體。在另一個(gè)實(shí)施例中，小鼠xyes細(xì)胞為vgf1小鼠es細(xì)胞。vgf1(也稱(chēng)為f1h4)小鼠es細(xì)胞來(lái)源于通過(guò)使雌性c57bl/6ntac小鼠與雄性129s6/svevtac小鼠雜交而產(chǎn)生的雜交胚胎。因此，vgf1es細(xì)胞包含來(lái)自129s6/svevtac小鼠的y染色體。參見(jiàn)例如auerbach,w.etal.(2000)establishmentandchimeraanalysisof129/svev-andc57bl/6-derivedmouseembryonicstemcelllines.biotechniques29,1024–1028,1030,1032(auerbach,w.等人，2000年，“129/svev和c57bl/6來(lái)源小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立與嵌合體分析”，《生物技術(shù)》，第29卷，第1024–1028頁(yè)、第1030頁(yè)、第1032頁(yè))，該文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文。大鼠多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)可來(lái)自任何大鼠品系，包括但不限于aci大鼠品系、darkagouti(da)大鼠品系、wistar大鼠品系、lea大鼠品系、spraguedawley(sd)大鼠品系或fischer大鼠品系(諸如fisherf344或fisherf6)。大鼠多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)也可獲自來(lái)源于兩種或更多種上述品系的混合物的品系。在一個(gè)實(shí)施例中，大鼠多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)來(lái)源于選自da品系和aci品系的品系。在一個(gè)具體實(shí)施例中，大鼠多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)來(lái)源于aci品系。aci大鼠品系的特征在于具有黑野鼠色、腹部和足部為白色，并具有rt1av1單體型。這些品系可從多種來(lái)源獲得，包括哈倫實(shí)驗(yàn)室(harlanlaboratories)公司。在其他實(shí)施例中，各種大鼠多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)來(lái)自darkagouti(da)大鼠品系，該da大鼠品系的特征在于具有野鼠色毛色和rt1av1單體型。此類(lèi)大鼠可從多種來(lái)源獲得，包括查爾斯河實(shí)驗(yàn)室公司(charlesriverlaboratories)和哈倫實(shí)驗(yàn)室(harlanlaboratories)公司。在另一個(gè)實(shí)施例中，大鼠多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)來(lái)自近交大鼠品系。在具體實(shí)施例中，大鼠es細(xì)胞系來(lái)自aci大鼠，并包括aci.g1大鼠es細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，大鼠es細(xì)胞系來(lái)自da大鼠，并包括da.2b大鼠es細(xì)胞系或da.2c大鼠es細(xì)胞系。參見(jiàn)例如2014年2月20日提交的美國(guó)實(shí)用新型申請(qǐng)no.14/185,703，該申請(qǐng)全文以引用方式并入本文。在各種實(shí)施例中，所述多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)、供體細(xì)胞和/或宿主胚胎不來(lái)自下列一個(gè)或多個(gè)物種：南美原鼠屬物種(akodonspp.)、林旅鼠屬物種(myopusspp.)、田鼠屬物種(microtusspp.)、鼴鼠屬物種(talpaspp.)。在各種實(shí)施例中，所述供體細(xì)胞和/或宿主胚胎不來(lái)自其正常的野生型特征為xy雌性可育性的任何物種。在各種實(shí)施例中，在多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)、供體細(xì)胞或宿主胚胎中存在遺傳修飾的情況下，所述遺傳修飾不是xyy和xxy、tdy-陰性性逆轉(zhuǎn)、tdy-陽(yáng)性性逆轉(zhuǎn)、x0修飾、非整倍性、fgf9-/-基因型或sox9修飾。所述方法和組合物中采用的多能和/或全能xy細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)具有導(dǎo)致sry蛋白的水平和/或活性降低的遺傳修飾?！靶詣e決定區(qū)y”蛋白或“sry”蛋白是作為dna結(jié)合蛋白的高遷移率族(hmg)盒家族的成員的轉(zhuǎn)錄因子。sry是引發(fā)雄性性別決定的睪丸決定因子。來(lái)自多種生物體的sry蛋白的序列是已知的，包括來(lái)自小鼠的sry蛋白的序列(登記號(hào)q05738)、來(lái)自大鼠的sry蛋白的序列(genbank登記號(hào)caa61882.1)、來(lái)自人的sry蛋白的序列(登記號(hào)q05066)、來(lái)自貓的sry蛋白的序列(登記號(hào)q67c50)以及來(lái)自馬的sry蛋白的序列(登記號(hào)p36389)，這些sry蛋白的序列各自以引用方式并入本文。一般來(lái)講，如果sry蛋白的蛋白水平和/或活性水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于尚未經(jīng)過(guò)遺傳修飾或誘變處理以抑制sry蛋白的表達(dá)和/或活性的適當(dāng)對(duì)照細(xì)胞中sry蛋白的水平，則稱(chēng)所述sry蛋白的水平和/或活性降低。在具體實(shí)施例中，相對(duì)于尚未經(jīng)過(guò)修飾以具有降低的sry蛋白水平和/或活性的對(duì)照細(xì)胞，sry蛋白的濃度和/或活性至少降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％?！笆茉嚰?xì)胞”是其中已實(shí)現(xiàn)了遺傳改變(諸如本文所公開(kāi)的遺傳修飾)的細(xì)胞，或?yàn)閷?shí)現(xiàn)了這種遺傳改變的細(xì)胞的后代并包含這種改變的細(xì)胞?！皩?duì)照”或“對(duì)照細(xì)胞”提供了用于測(cè)量受試細(xì)胞的表型變化的參考點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)照細(xì)胞與sry活性降低的細(xì)胞盡可能密切地匹配，區(qū)別之處為對(duì)照細(xì)胞缺少導(dǎo)致活性降低的遺傳修飾或突變(例如，相應(yīng)的細(xì)胞可源自相同的細(xì)胞系)。在其他情況下，對(duì)照細(xì)胞可包括例如：(a)野生型細(xì)胞，即與用于引起受試細(xì)胞中出現(xiàn)遺傳改變的起始物質(zhì)具有相同基因型的細(xì)胞；(b)與起始物質(zhì)具有相同基因型，但已用無(wú)效構(gòu)建體(即用對(duì)目標(biāo)性狀無(wú)已知作用的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)進(jìn)行遺傳修飾的細(xì)胞；(c)作為受試細(xì)胞的未經(jīng)遺傳修飾子代的細(xì)胞(即，對(duì)照細(xì)胞和受試細(xì)胞源于相同的細(xì)胞系)；(d)在遺傳上與受試細(xì)胞相同但未暴露于將誘導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)的條件或刺激的細(xì)胞；或者(e)在其中的遺傳修飾不會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)多核苷酸的表達(dá)改變的條件下，受試細(xì)胞本身?？梢灾苯拥?例如通過(guò)測(cè)定細(xì)胞或生物體中的sry多肽的水平)或間接地(例如通過(guò)測(cè)量sry多肽的活性)測(cè)量sry多肽的表達(dá)水平。用于測(cè)定sry蛋白活性的各種方法是已知的。參見(jiàn)wangetal.(2013)cell153:910-918(wang等人，2013年，《細(xì)胞》，第153卷，第910-918頁(yè))；mandalosetal.(2012)plosone7:e45768:1-9(mandalos等人，2012年，《美國(guó)公共科學(xué)圖書(shū)館期刊》，第7卷，第e45768期，第1-9頁(yè))；以及wangetal.(2013)natbiotechnol.31:530-532(wang等人，2013年，《自然生物技術(shù)》，第31卷，第530-532頁(yè))，這些文獻(xiàn)各自以引用方式并入本文。在其他情況下，使用包括但不限于southern印跡分析、dna測(cè)序、pcr分析或表型分析的方法來(lái)選擇具有降低sry多肽的活性和/或水平的靶向遺傳修飾的細(xì)胞。然后將此類(lèi)細(xì)胞用于本文所述的各種方法、組合物和試劑盒。靶向遺傳修飾可包括對(duì)目標(biāo)多核苷酸的靶向改變，包括例如對(duì)y染色體上的靶基因組座位的靶向改變、對(duì)sry基因的靶向改變，或者對(duì)其他所需多核苷酸的靶向改變。此類(lèi)靶向修飾包括但不限于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、目標(biāo)多核苷酸或其部分的敲除、目標(biāo)多核苷酸或其部分的敲入、用異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列，或它們的組合。在具體實(shí)施例中，改變至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)核苷酸以形成靶向基因組修飾。sry蛋白的水平和/或活性降低可由sry基因中的遺傳修飾(即，調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)和/或內(nèi)含子等中的遺傳修飾)引起。此類(lèi)遺傳修飾包括但不限于基因組中核苷酸的添加、缺失和置換。此類(lèi)遺傳修飾可包括對(duì)sry基因的改變，包括例如將一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入sry基因、從sry基因缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸、置換sry基因中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸、敲除sry基因或其部分、敲入sry基因或其部分、用異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列，或它們的組合。因此，在具體實(shí)施例中，可通過(guò)破壞編碼sry多肽的基因來(lái)降低或消除sry多肽的活性。在具體實(shí)施例中，改變sry基因中的至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)核苷酸?？墒褂酶鞣N方法產(chǎn)生另外的靶向遺傳修飾。參見(jiàn)例如wangetal.(2013)cell153:910-918(wang等人，2013年，《細(xì)胞》，第153卷，第910-918頁(yè))；mandalosetal.(2012)plosone7:e45768:1-9(mandalos等人，2012年，《美國(guó)公共科學(xué)圖書(shū)館期刊》，第7卷，第e45768期，第1-9頁(yè))；以及wangetal.(2013)natbiotechnol.31:530-532(wang等人，2013年，《自然生物技術(shù)》，第31卷，第530-532頁(yè))，這些文獻(xiàn)各自以引用方式并入本文。另外，本文所描述的用于修飾y染色體上的基因組座位的各種方法可用于引入對(duì)sry基因的靶向遺傳修飾。在其他實(shí)施例中，通過(guò)將抑制sry多肽的水平或活性的多核苷酸引入細(xì)胞中來(lái)降低或消除sry多肽的活性和/或水平。所述多核苷酸可通過(guò)阻止sry信使rna翻譯來(lái)直接抑制sry多肽表達(dá)，或通過(guò)編碼抑制所述編碼sry蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的多肽來(lái)間接抑制sry多肽表達(dá)。在其他實(shí)施例中，通過(guò)將編碼抑制sry多肽活性的多肽的序列引入細(xì)胞中來(lái)降低或消除sry多肽的活性。在一個(gè)實(shí)施例中，xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)包含降低sry蛋白的活性和/或水平的條件性sry等位基因?！皸l件性sry等位基因”包括被設(shè)計(jì)成在期望的發(fā)育時(shí)間和/或期望的目標(biāo)組織內(nèi)具有降低的sry蛋白水平和/或活性的經(jīng)修飾sry基因?？蓪⒔档偷乃胶?或活性與缺少產(chǎn)生條件性等位基因的修飾的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較，或者在期望的發(fā)育時(shí)間活性降低的情況下與先前時(shí)間和/或后續(xù)時(shí)間進(jìn)行比較，或在期望的組織中活性降低的情況下與所有組織的平均活性進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)施例中，條件性sry等位基因包括sry的條件性無(wú)效等位基因，其可以在期望的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)和/或在特定的組織中關(guān)閉。這種條件性等位基因可用于產(chǎn)生源自任何基因靶向克隆的可育xy雌性。如本文別處所述，采用這種方法能夠在f1代中產(chǎn)生所需的純合遺傳修飾。采用此類(lèi)方法，不必繁育至f2代，就可快速查看表型。在非限制性實(shí)施例中，條件性sry等位基因?yàn)槿鐄s2011/0104799中所述的多功能等位基因，該專(zhuān)利全文以引用方式并入。在具體實(shí)施例中，所述條件性等位基因包含：(a)相對(duì)于靶基因的轉(zhuǎn)錄呈有義取向的起動(dòng)序列，以及呈有義或反義取向的藥物選擇盒(dsc)；(b)呈反義取向的目標(biāo)核苷酸序列(nsi)和逆轉(zhuǎn)條件模塊(conditionalbyinversionmodule)(coin，其利用外顯子斷裂內(nèi)含子和可逆轉(zhuǎn)的基因誘捕樣模塊；參見(jiàn)例如us2011/0104799，該專(zhuān)利全文以引用方式并入)；以及(c)在暴露于第一重組酶后重組以形成條件性等位基因的可重組單元，所述條件性等位基因(i)缺乏起動(dòng)序列和dsc，并且(ii)含有呈有義取向的nsi和呈反義取向的coin。sry基因的條件性等位基因可以在任何細(xì)胞類(lèi)型中產(chǎn)生，而不限于xy多能和/或全能細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型以及靶向y染色體上的基因組座位的非限制性方法在本文別處進(jìn)一步詳細(xì)討論。如本文別處所討論，具有降低sry蛋白的水平和/或活性的遺傳修飾的多能和/或全能xy細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)還可包含對(duì)目標(biāo)多核苷酸的至少一種另外的靶向遺傳修飾。所述至少一種另外的靶向遺傳修飾可包括一個(gè)或多個(gè)核酸的置換、用異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列、敲除和敲入。所述另外的靶向遺傳修飾可位于y染色體、x染色體或常染色體上?？墒褂酶鞣N方法產(chǎn)生另外的靶向遺傳修飾，包括采用如本文別處所討論的靶向質(zhì)粒和大靶向載體。還參見(jiàn)us20080092249、wo/1999/005266a2、us20040177390、wo/2008/017234a1和美國(guó)專(zhuān)利no.7,612,250，這些專(zhuān)利各自以引用方式并入本文，供讀者參考與核移植相關(guān)的方法。此外，本文所述的修飾y染色體上的基因組座位(即，sry基因)的各種方法也可用于將靶向遺傳修飾引入不位于y染色體上的目標(biāo)多核苷酸。b.用于培養(yǎng)具有降低sry蛋白的水平和/或活性的修飾的多能和/或全能xy細(xì)胞的培養(yǎng)基促進(jìn)f0代中產(chǎn)生xy可育雌性的各種方法和組合物中所采用的培養(yǎng)基是維持多能和/或全能細(xì)胞(即，es細(xì)胞、ips細(xì)胞、xyes細(xì)胞、xyips細(xì)胞等)的培養(yǎng)基。術(shù)語(yǔ)“維持”是指穩(wěn)定地保存本文所述多能和/或全能細(xì)胞(包括es細(xì)胞或ips細(xì)胞)的至少一種或多種特征或表型。此類(lèi)表型可包括維持多能性和/或全能性、細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)譜以及細(xì)胞的其他功能特性。術(shù)語(yǔ)“維持”還可涵蓋細(xì)胞增殖，或正在培養(yǎng)的細(xì)胞的數(shù)目增加。該術(shù)語(yǔ)還設(shè)想了允許細(xì)胞保持多能性，同時(shí)細(xì)胞可繼續(xù)分裂也可不繼續(xù)分裂、其數(shù)目可繼續(xù)增加也可不繼續(xù)增加的培養(yǎng)條件。在一些實(shí)施例中，通過(guò)以下方式來(lái)維持具有降低sry蛋白的水平和/或活性的遺傳修飾的xy細(xì)胞：在本領(lǐng)域已知的(通過(guò)添加補(bǔ)充物)適用于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)或維持多能和/或全能細(xì)胞(即es細(xì)胞、ips細(xì)胞、xyes細(xì)胞、xyips細(xì)胞等)的任何基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如，dmem)中培養(yǎng)所述xy細(xì)胞。在此類(lèi)情況下，所培養(yǎng)的xyes細(xì)胞具有發(fā)育成可育雌性動(dòng)物的潛能，但依然保留多能性和/或全能性，使得所述細(xì)胞可被應(yīng)用于受體胚胎中并產(chǎn)生可育的雌性子代。在其他實(shí)施例中，通過(guò)以下方式來(lái)維持具有降低sry蛋白的水平和/或活性的遺傳修飾的xy細(xì)胞：在如下文進(jìn)一步定義的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述xy細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間，讓一些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有發(fā)育成可育雌性動(dòng)物的潛能、但依然保留多能性和/或全能性的xy細(xì)胞，使得所述細(xì)胞可被應(yīng)用于受體胚胎中并產(chǎn)生可育的雌性子代。用于維持具有降低sry蛋白的水平和/或活性的遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即xyes細(xì)胞、xyips細(xì)胞等)的培養(yǎng)基促進(jìn)xyf0可育雌性的發(fā)育。因此，與在合適的對(duì)照培養(yǎng)基(諸如，基于dmem的一種培養(yǎng)基)中培養(yǎng)相比，在這種培養(yǎng)基中培養(yǎng)增加了所獲得的xyf0可育雌性的數(shù)量。因此，xyf0可育雌性的數(shù)量增加可包括：f0非人動(dòng)物中的至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(在將非人動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中并孕育該宿主胚胎之后)為xy雌性，并且在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人動(dòng)物是可育的。短語(yǔ)“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”包括例如本領(lǐng)域已知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如，dmem)，其(通過(guò)添加補(bǔ)充物)適用于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)或維持多能和/或全能細(xì)胞(即es細(xì)胞、ips細(xì)胞、xyes細(xì)胞、xyips細(xì)胞等)。適用于產(chǎn)生可育xy雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(即“低鹽dmem”或“低滲透壓培養(yǎng)基”)不同于通常用于在培養(yǎng)中維持es細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。一般來(lái)講，出于討論基礎(chǔ)培養(yǎng)基的目的，不適用于產(chǎn)生可育xy雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在本節(jié)中被描述為“dmem”，并且在表1中說(shuō)明(例如，典型的dmem培養(yǎng)基)。出于討論適用于產(chǎn)生可育xy雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的目的，使用短語(yǔ)“低鹽dmem”或“低滲透壓dmem”。本文明確地闡述了通常用于在培養(yǎng)中維持多能和/或全能細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如，dmem)與適用于產(chǎn)生可育xy雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如，“低鹽dmem”)之間的差異。為方便起見(jiàn)，使用短語(yǔ)“低鹽dmem”；用于產(chǎn)生可育xy雌性的合適dmem表現(xiàn)出的特征不限于“低鹽”，但包括本文所述的那些。例如，可通過(guò)以下方式使表1所示的dmem適用于產(chǎn)生可育的xy雌性：將氯化鈉和/或碳酸氫鈉的濃度改變?yōu)楸疚乃峁┑臐舛?，這也會(huì)引起滲透壓和電導(dǎo)率與表1所示的dmem相比有所不同。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子是各種形式的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbeco'smodifiedeagle'smedium)(dmem)(例如，英杰公司(invitrogen)的dmem，產(chǎn)品目錄號(hào)11971-025)(表1)。合適的低鹽dmem可作為ko-dmemtm(英杰公司(invitrogen)產(chǎn)品目錄號(hào)10829-018)商購(gòu)獲得?；A(chǔ)培養(yǎng)基當(dāng)用于在培養(yǎng)中維持細(xì)胞以用作供體細(xì)胞時(shí)，通常補(bǔ)充有本領(lǐng)域已知的多種補(bǔ)充物。此類(lèi)補(bǔ)充物在本公開(kāi)中用“補(bǔ)充物”或“+補(bǔ)充物”表示。表1：用于維持或培養(yǎng)多能和/或全能細(xì)胞的dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)充物”或短語(yǔ)“+補(bǔ)充物”包括添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以用于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)或維持多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)，例如用于在培養(yǎng)中維持供體細(xì)胞的多能性或全能性的元素。例如，適用于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)或維持多能和/或全能細(xì)胞的培養(yǎng)基補(bǔ)充物包括但不限于胎牛血清(fbs)、谷氨酰胺、抗生素(一種或多種)、青霉素和鏈霉素(例如，青鏈霉素)、丙酮酸鹽(例如，丙酮酸鈉)、非必需氨基酸(例如，memneaa)、2-巰基乙醇以及白血病抑制因子(lif)。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含適用于在培養(yǎng)中維持多能細(xì)胞的一種或多種補(bǔ)充物，所述多能細(xì)胞包括例如在注入胚胎以及宮腔內(nèi)移植到代孕母體小鼠內(nèi)之后促成雄性性別決定發(fā)育程序的能力降低的xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)施例中，適用于在培養(yǎng)中維持多能細(xì)胞的一種或多種補(bǔ)充物為fbs(90mlfbs/0.5l基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、谷氨酰胺(2.4mmol/0.5l基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、丙酮酸鈉(0.6mmol/0.5l基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、非必需氨基酸(<0.1mmol/0.5l基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、2-巰基乙醇、lif，以及一種或多種抗生素。在其他實(shí)施例中，用于在培養(yǎng)中維持多能細(xì)胞(包括例如在注入胚胎以及宮腔內(nèi)移植到代孕母體小鼠內(nèi)之后促成雄性性別決定發(fā)育程序的能力降低的xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的培養(yǎng)基包含約500ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了以下補(bǔ)充物：約90mlfbs(例如，hylconefbs產(chǎn)品目錄號(hào)sh30070.03)、約2.4毫摩爾谷氨酰胺(例如，約12ml200mm谷氨酰胺溶液，例如英杰公司(invitrogen)產(chǎn)品目錄號(hào)25030-081)、青霉素：鏈霉素(例如，60,000單位青霉素g鈉和60mg硫酸鏈霉素，含有約51mgnacl；例如約6ml英杰公司(invitrogen)青鏈霉素，產(chǎn)品目錄號(hào)15140-122)、約0.6毫摩爾丙酮酸鈉(例如，6ml100mm丙酮酸鈉，英杰公司(invitrogen)產(chǎn)品目錄號(hào)11360-070)、約0.06毫摩爾非必需氨基酸(例如，約6mlmemneaa，例如購(gòu)自英杰公司(invitrogen)、產(chǎn)品目錄號(hào)為11140-050的memneaa)、約1.2ml2-巰基乙醇，以及約1.2微克lif(例如，約120微升106單位/ml的lif制備物；例如約120微升milliporeesgrotm-lif，產(chǎn)品目錄號(hào)esg1107)。在組成用于維持xyes或xyips細(xì)胞，以便產(chǎn)生可育xy雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，通常采用用量大致相同的相同補(bǔ)充物，但基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成可能不同(不同于dmem，例如，不同于上表中所述的培養(yǎng)基)，不同之處(一處或多處)對(duì)應(yīng)于本文教導(dǎo)的差異(一處或多處)。在一些實(shí)施例中，補(bǔ)充物包括wnt條件培養(yǎng)基，例如wnt-3a條件培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施例中，將多能細(xì)胞(包括例如在注入胚胎以及宮腔內(nèi)移植到代孕母體小鼠內(nèi)之后促成雄性性別決定發(fā)育程序的能力降低的xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)維持在包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出以下一種或多種特征：(a)約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓；(b)約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；(c)約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；(d)約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；(e)約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或(f)這些特征之中任何兩種或更多種的組合。在其他實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)維持在如wo2011/156723(該專(zhuān)利全文以引用方式并入本文)中所述的培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低鹽dmem。在一個(gè)具體實(shí)施例中，低鹽dmem的nacl濃度為85至130mm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低滲透壓dmem。在一個(gè)具體實(shí)施例中，低滲透壓dmem的滲透壓為250至310mosm/kg。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為低電導(dǎo)率dmem。在一個(gè)具體實(shí)施例中，低電導(dǎo)率dmem的電導(dǎo)率為11至13ms/cm。在其他實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出不超過(guò)約320、310、300、290、280、275、270、260、250或240mosm/kg的滲透壓。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基或包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基表現(xiàn)出不超過(guò)約240至320mosm/kg、250至310mosm/kg、275至295mosm/kg、或260至300mosm/kg的滲透壓。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基或包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基表現(xiàn)出約270mosm/kg的滲透壓。在其他實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出不超過(guò)約10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5或14.0ms/cm的電導(dǎo)率。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出不超過(guò)約10至14ms/cm或11至13ms/cm的電導(dǎo)率。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約12至13ms/cm的電導(dǎo)率。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約12至13ms/cm的電導(dǎo)率和約260至300mosm/kg的滲透壓。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含濃度為約90mm的氯化鈉。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，氯化鈉的濃度為約70至95mm。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含濃度小于約35mm的碳酸氫鈉。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，碳酸氫鈉的濃度為約20至30mm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出不超過(guò)約100mm的堿金屬鹵化物鹽濃度。在一個(gè)實(shí)施例中，堿金屬鹵化物鹽為nacl。在一個(gè)實(shí)施例中，堿金屬鹵化物鹽的濃度不高于90、80、70、60或50mm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中堿金屬鹵化物鹽的濃度為約60至105mm、70至95mm、或80至90mm。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述濃度為約85mm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出一定的碳酸鹽濃度。在一個(gè)實(shí)施例中，所述碳酸鹽為鈉鹽。在一個(gè)實(shí)施例中，所述鈉鹽為碳酸氫鈉。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳酸鹽的濃度不高于40、35、30、25或20mm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳酸鹽的濃度為約10至40mm，在另一個(gè)實(shí)施例中為約20至30mm。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述濃度為約25或26mm。在其他實(shí)施例中，碳酸氫鈉濃度為約26mm、約18mm、約18mm至約26mm、或約18mm至約44mm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽的總濃度不超過(guò)140、130、120、110、100、90或80mm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽的總濃度為約80至140mm、85至130mm、90至120mm、95至120mm、或100至120mm。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽的總濃度為約115mm。在一個(gè)實(shí)施例中，堿金屬鹵化物鹽與碳酸鹽的摩爾比大于2.5。在一個(gè)實(shí)施例中，所述摩爾比為約2.6至4.0、2.8至3.8、3至3.6、或3.2至3.4。在一個(gè)實(shí)施例中，所述摩爾比為3.3至3.5。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述摩爾比為3.4。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約250至310mosm/kg的滲透壓，以及約60至105mm的堿金屬鹵化物鹽濃度。在另一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳酸鹽濃度為約20至30mm。在另一個(gè)實(shí)施例中，堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽的總濃度為約80至140mm。在另一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的電導(dǎo)率為約12至13ms/cm。在一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約50±5mmnacl和約26±5mm碳酸鹽，且滲透壓為約218±22mosm/kg。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約3mg/mlnacl和2.2mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為約218mosm/kg。在另一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約87±5mmnacl和約18±5mm碳酸鹽，且滲透壓為約261±26mosm/kg。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約5.1mg/mlnacl和約1.5mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為約261mosm/kg。在另一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約110±5mmnacl和約18±5mm碳酸鹽，且滲透壓為約294±29mosm/kg。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約6.4mg/mlnacl和約1.5mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為約294mosm/kg。在另一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約87±5mmnacl和約26±5mm碳酸鹽，且滲透壓為約270±27mosm/kg。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl和約2.2mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為約270mosm/kg。在另一個(gè)實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約87±5mmnacl、約26±5mm碳酸鹽以及約86±5mm葡萄糖，且滲透壓為約322±32mosm/kg。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約5.1mg/mlnacl、約2.2mg/ml碳酸氫鈉以及約15.5mg/ml葡萄糖，且滲透壓為約322mosm/kg。在本文所公開(kāi)的各種方法和組合物中可采用的另外的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括含有50±5mmnacl和26±5mm碳酸鹽、且滲透壓為218±22mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約3mg/mlnacl和2.2mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為約218mosm/kg。在其他實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含50±5mmnacl和26±5mm碳酸鹽，且滲透壓為218±22mosm/kg。在一個(gè)具體實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含約3mg/mlnacl和2.2mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為約218mosm/kg。在其他實(shí)施例中，具有如本文所公開(kāi)的nahco3濃度(包括約44mm、26mm或18mm)的高葡萄糖dmem培養(yǎng)基(生命科技公司(lifetech))補(bǔ)充有0.1mm非必需氨基酸、1mm丙酮酸鈉、0.1mm2-巰基乙醇、2mml-谷氨酰胺、各50μg/ml的青霉素和鏈霉素(生命科技公司(lifetech))、15％fbs(?？寺」?hyclone))以及2000u/mllif(密理博公司(millipore))。c.用于產(chǎn)生靶向遺傳修飾的方法可使用各種方法來(lái)產(chǎn)生降低sry蛋白的水平和/或活性的靶向遺傳修飾。例如，在一種情況下，靶向遺傳修飾采用了將經(jīng)由同源重組事件產(chǎn)生靶向遺傳修飾的系統(tǒng)。在其他情況下，可使用在靶向基因組位置處產(chǎn)生單鏈或雙鏈斷裂的核酸酶試劑來(lái)修飾動(dòng)物細(xì)胞。然后通過(guò)非同源性末端接合途徑(nhej)來(lái)修復(fù)單鏈或雙鏈斷裂。此類(lèi)系統(tǒng)可用于例如產(chǎn)生靶向功能喪失的遺傳修飾。用于產(chǎn)生此類(lèi)靶向遺傳修飾的非限制性方法在本文別處詳細(xì)討論，包括例如使用靶向質(zhì)粒、小靶向載體(smalltvec)或大靶向載體。還參見(jiàn)wangetal.(2013)cell153:910-918(wang等人，2013年，《細(xì)胞》，第153卷，第910-918頁(yè))；mandalosetal.(2012)plosone7:e45768:1-9(mandalos等人，2012年，《美國(guó)公共科學(xué)圖書(shū)館期刊》，第7卷，第e45768期，第1-9頁(yè))；以及wangetal.(2013)natbiotechnol.31:530-532(wang等人，2013年，《自然生物技術(shù)》，第31卷，第530-532頁(yè))，這些文獻(xiàn)各自以引用方式并入本文。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到在具體實(shí)施例中，對(duì)sry基因的靶向遺傳修飾和/或?qū)θ魏纹渌繕?biāo)多核苷酸的靶向遺傳修飾可在多能細(xì)胞(即，es細(xì)胞)正被維持在本文所述的培養(yǎng)基(例如，促進(jìn)xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基)中時(shí)發(fā)生。另選地，對(duì)sry基因和/或任何其他目標(biāo)多核苷酸的靶向遺傳修飾可在多能細(xì)胞(即，es細(xì)胞)被維持在不同的培養(yǎng)基中、隨后被轉(zhuǎn)移到本文所述的培養(yǎng)基(例如，促進(jìn)xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基)中時(shí)發(fā)生。d.用于培養(yǎng)和在培養(yǎng)中維持多能和/或全能細(xì)胞的方法本發(fā)明提供了在體外培養(yǎng)中維持或培養(yǎng)xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的方法，其中所述細(xì)胞包含降低sry蛋白水平和/或活性的修飾，并且所述細(xì)胞在本文所述的條件下維持體外培養(yǎng)。此類(lèi)在體外培養(yǎng)中維持或培養(yǎng)xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的方法用于在將非人動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中并接著孕育該宿主胚胎之后，促進(jìn)xyf0可育雌性動(dòng)物的數(shù)目增加。雖然本文所公開(kāi)的任何培養(yǎng)基都可用于此類(lèi)維持或培養(yǎng)方法，但一個(gè)非限制性例子包括在適用于在培養(yǎng)中維持或培養(yǎng)xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)、包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基或包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基表現(xiàn)出約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓。在一些實(shí)施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基或包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基表現(xiàn)出以下一種或多種特征：約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或這些特征之中任何兩種或更多種的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，所述方法包括在包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的合適培養(yǎng)基中維持或培養(yǎng)xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基或所述包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基具有約240至320mosm/kg的滲透壓、約10至14ms/cm的電導(dǎo)率、約50至105mm的堿金屬鹵化物鹽濃度、10至40mm的碳酸鹽濃度，以及/或者約80至140mm的堿金屬鹽和碳酸鹽組合濃度。在一個(gè)實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于培養(yǎng)基(含有用于維持es細(xì)胞的補(bǔ)充物)中維持1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周或4周，然后引入宿主胚胎中。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于培養(yǎng)基(含有用于維持es細(xì)胞的補(bǔ)充物的低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中維持約2至4周，然后引入宿主胚胎中。在另一個(gè)實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于含有低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中維持至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、2周、3周或4周，然后將供體細(xì)胞引入宿主胚胎中。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于含有低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中維持至少2至4周，然后將所述細(xì)胞引入宿主胚胎中。在另一個(gè)實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中維持(例如，冷凍)，之后將供體細(xì)胞解凍，置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中維持至少1天、2天、3天、4天或更多天，然后把所述xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)引入宿主胚胎中。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中至少傳代一次，將所述細(xì)胞冷凍在促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中，之后在促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中將所述細(xì)胞解凍，使所述細(xì)胞生長(zhǎng)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周或更長(zhǎng)時(shí)間，然后引入宿主胚胎中。在另一個(gè)實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中維持一天、二天、三天或四天，然后引入宿主胚胎中。在一個(gè)實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中維持三天。在一個(gè)實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中維持約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、2周、3周、4周或更長(zhǎng)時(shí)間，然后引入宿主胚胎中。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將供體細(xì)胞置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中維持至少一周，然后引入宿主胚胎中。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)置于促進(jìn)產(chǎn)生xy可育f0雌性的培養(yǎng)基中維持2至4周，然后引入宿主胚胎中。因此，提供了一種用于在培養(yǎng)中維持或培養(yǎng)xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的方法，其中將細(xì)胞維持在下述條件下：在將所述xy細(xì)胞引入宿主胚胎中并接著在合適的雌性宿主體內(nèi)孕育該宿主胚胎之后，這些條件促進(jìn)或有利于雌性xy動(dòng)物發(fā)育。在一個(gè)方面，提供了一種用于在本文所述的條件下在培養(yǎng)中維持或培養(yǎng)供體xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的方法，其中在將供體xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中以形成f0胚胎并接著在合適的動(dòng)物體內(nèi)孕育該f0胚胎之后，該f0胚胎發(fā)育成至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比為xy，并且在達(dá)到性成熟后為可育雌性的f0動(dòng)物。e.生成具有靶向遺傳修飾的f0胚胎和f1子代采用本文提供的sry蛋白水平和/或活性降低的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的各種方法和組合物可用于產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。用于引入遺傳修飾的各種方法在本文別處詳細(xì)討論。i.用于在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy非人動(dòng)物的方法提供了一種用于在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy非人動(dòng)物的方法。此類(lèi)方法包括：(a)在促進(jìn)xy可育雌性es細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基中維持或培養(yǎng)具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的供體非人動(dòng)物xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)；(b)將所述供體xy非人動(dòng)物xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)引入宿主胚胎中；(c)孕育該宿主胚胎；以及(d)獲得f0xy雌性非人動(dòng)物，其中在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人動(dòng)物是可育的。在具體實(shí)施例中，所述供體非人動(dòng)物的xy供體細(xì)胞可在目標(biāo)多核苷酸中包含至少一個(gè)另外的靶向遺傳修飾。此類(lèi)修飾在本文別處詳細(xì)討論。具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的xyes細(xì)胞可以在沒(méi)有低鹽培養(yǎng)基的情況下維持并且可發(fā)育成xy可育雌性。在一些實(shí)施例中，促進(jìn)xy可育f0雌性動(dòng)物發(fā)育的培養(yǎng)基可包括低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基適用于在培養(yǎng)中維持或培養(yǎng)非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞并包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物，其中所述低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出包括以下一者或多者的特征：約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓；約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或這些特征之中任何兩種或更多種的組合。在其他實(shí)施例中，可使用本文所公開(kāi)的培養(yǎng)基來(lái)執(zhí)行此類(lèi)用于在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy非人動(dòng)物的方法，所述培養(yǎng)基包括但不限于：(a)包含50±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽，且滲透壓為218±22mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(b)包含約3mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為218mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(c)包含87±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽，且滲透壓為261±26mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(d)包含約5.1mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為261mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(e)包含110±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽，且滲透壓為294±29mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(f)包含約6.4mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為294mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(g)包含87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽，且滲透壓為270±27mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(h)包含約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉，且滲透壓為270mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(i)包含nacl、26±5mm碳酸鹽、86±5mm葡萄糖，且滲透壓為322±32mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；以及/或者(j)包含約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉、15.5mg/ml葡萄糖，且滲透壓為322mosm/kg的基礎(chǔ)培養(yǎng)基?？蓪⒕哂薪档蛃ry蛋白的水平和/或活性的修飾并且已在促進(jìn)xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)的經(jīng)遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)植入宿主胚胎中。已植入宿主胚胎中的細(xì)胞在本文中稱(chēng)為“供體細(xì)胞”。在具體實(shí)施例中，經(jīng)遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)來(lái)自與宿主胚胎相同的品系或來(lái)自與宿主胚胎不同的品系。同樣，代孕母體可來(lái)自與經(jīng)遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)和/或宿主胚胎相同的品系，或者代孕母體可來(lái)自與經(jīng)遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)和/或宿主胚胎不同的品系。在一個(gè)實(shí)施例中，將xy供體細(xì)胞植入xx宿主胚胎中。在本文所公開(kāi)的方法和組合物中可采用多種宿主胚胎。在一些實(shí)施例中，將具有導(dǎo)致sry蛋白水平和/或活性降低的靶向遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)引入來(lái)自相應(yīng)生物體的桑椹胚前期胚胎(例如，8-細(xì)胞期胚胎)中。參見(jiàn)例如us7,576,259、us7,659,442、us7,294,754和us2008-0078000a1，所有這些專(zhuān)利均全文以引用方式并入本文。在其他實(shí)施例中，可在宿主胚胎處于2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、16-細(xì)胞期、32-細(xì)胞期或64-細(xì)胞期時(shí)將供體es細(xì)胞植入宿主胚胎中。在另一個(gè)實(shí)施例中，宿主胚胎為囊胚。在一個(gè)實(shí)施例中，宿主胚胎處于選自下列的時(shí)期：囊胚前期、桑椹胚前期、桑椹胚期、未致密化桑椹胚期和致密化桑椹胚期。在一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)采用小鼠胚胎時(shí)，宿主胚胎期選自泰勒期(theilerstage)1(ts1)、ts2、ts3、ts4、ts5和ts6，參考theiler(1989)“thehousemouse:atlasofmousedevelopment，”springer-verlag,newyork(theiler，1989年，《家鼠：小鼠發(fā)育數(shù)據(jù)集》，紐約施普林格出版公司)中所述的泰勒期。在一個(gè)具體實(shí)施例中，泰勒期選自ts1、ts2、ts3和ts4。在一個(gè)實(shí)施例中，宿主胚胎包含透明帶，并且供體細(xì)胞為通過(guò)透明帶中的孔引入宿主胚胎內(nèi)的xyes細(xì)胞；而在其他實(shí)施例中，宿主胚胎為無(wú)透明帶的胚胎。在其他具體實(shí)施例中，桑椹胚期宿主胚胎為聚合胚胎。也可使用核移植技術(shù)生成經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。簡(jiǎn)而言之，用于核移植的方法包括以下步驟：(1)將卵母細(xì)胞去核；(2)分離供體細(xì)胞或核，準(zhǔn)備與去核卵母細(xì)胞合并；(3)將所述細(xì)胞或核插入所述去核卵母細(xì)胞中，以形成重建細(xì)胞；(4)將所述重建細(xì)胞植入動(dòng)物的子宮，以形成胚胎；以及(5)允許所述胚胎發(fā)育。在此類(lèi)方法中，一般從處死的動(dòng)物體內(nèi)取出卵母細(xì)胞，不過(guò)也可從活體動(dòng)物的輸卵管和/或卵巢中分離卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞可在去核之前在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種培養(yǎng)基中成熟。將卵母細(xì)胞去核可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的多種方式執(zhí)行。將供體細(xì)胞或核插入去核卵母細(xì)胞中以形成重建細(xì)胞，通常借助在融合之前在透明帶下顯微注射供體細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。融合可通過(guò)跨接觸/融合平面施加直流電脈沖(電融合)、通過(guò)將細(xì)胞暴露于促進(jìn)融合的化學(xué)品(諸如聚乙二醇)、或借助滅活病毒(諸如仙臺(tái)病毒)來(lái)誘導(dǎo)。重建細(xì)胞通常在核供體和受體卵母細(xì)胞融合之前、期間和/或之后，通過(guò)電力方式和/或非電力方式激活。激活方法包括電脈沖、化學(xué)誘導(dǎo)沖擊、精液滲透、增加二價(jià)陽(yáng)離子在卵母細(xì)胞中的水平以及降低細(xì)胞蛋白在卵母細(xì)胞中的磷酸化(如借助激酶抑制劑)。激活的重建細(xì)胞或胚胎通常在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后移植到動(dòng)物的子宮中。參見(jiàn)例如us20080092249、wo/1999/005266a2、us20040177390、wo/2008/017234a1以及美國(guó)專(zhuān)利no.7,612,250，這些專(zhuān)利各自以引用方式并入本文。將包含sry蛋白水平和/或活性降低的經(jīng)遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的宿主胚胎孵育直至囊胚期，隨后植入代孕母體中以產(chǎn)生f0動(dòng)物?？山?jīng)由如本文所述的等位基因修飾(moa)測(cè)定法鑒定具有經(jīng)遺傳修飾的基因組座位的動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，將包含sry蛋白水平和/或活性降低的經(jīng)遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的宿主胚胎置于促進(jìn)xy可育雌性es細(xì)胞發(fā)育的培養(yǎng)基(即，低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中維持一天、兩天、三天、四天或更多天，然后植入合適的宿主。此類(lèi)方法對(duì)生成f0可育雌性動(dòng)物提供支持。在一個(gè)實(shí)施例中，將所培養(yǎng)的宿主胚胎植入代孕母體，然后在代孕母體中孕育所培養(yǎng)的宿主胚胎。在具體實(shí)施例中，在將非人動(dòng)物xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)引入宿主胚胎中并接著孕育該宿主胚胎之后，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的f0非人動(dòng)物為xy雌性，在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。還提供了f0胚胎，該f0胚胎包含具有至少一個(gè)異源干細(xì)胞的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，所述異源干細(xì)胞包括具有降低sry蛋白水平和/或活性的靶向遺傳修飾的xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞。本文所述的在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy非人動(dòng)物的各種方法可采用具有以下遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)：(1)用于降低sry多肽的水平和/或活性的遺傳修飾；以及在具體實(shí)施例中，(2)目標(biāo)多核苷酸中的一種或多種另外的靶向遺傳修飾。如本文別處所概述，可在xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)中產(chǎn)生至少1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種另外的靶向遺傳修飾。在此類(lèi)情況下，f0可育雌性xy非人動(dòng)物可包含這些另外的靶向遺傳修飾中的一種或多種。在其他實(shí)施例中，f0可育雌性xy非人動(dòng)物在其一生中產(chǎn)下1窩、2窩、3窩、4窩、5窩、6窩、7窩、8窩或9窩幼仔。在一個(gè)實(shí)施例中，f0可育雌性xy非人動(dòng)物每窩至少產(chǎn)下1只、2只、3只、4只、5只、6只、7只、8只、9只或10只后代。在一個(gè)實(shí)施例中，f0可育雌性xy非人動(dòng)物每窩產(chǎn)下約4至6只后代。在一個(gè)實(shí)施例中，f0可育雌性xy非人動(dòng)物產(chǎn)下2至6窩幼仔，其中每窩至少有2只、3只、4只、5只或6只后代。在一個(gè)實(shí)施例中，所述后代中的至少約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％為xy可育雌性后代。還提供了用于產(chǎn)生嚙齒動(dòng)物成窩幼仔(即，小鼠或大鼠的成窩幼仔)的方法，包括將根據(jù)本文所述方法制備的sry蛋白水平和/或活性降低的xy多能和/或全能供體細(xì)胞(即，xy供體es細(xì)胞或xy供體ips細(xì)胞)引入宿主胚胎中，在合適的代孕母體中孕育所述胚胎，以及獲得包括至少一只xy雌性嚙齒動(dòng)物的f0子代，所述xy雌性嚙齒動(dòng)物在達(dá)到性成熟后為可育的xy雌性嚙齒動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施例中，出生的在達(dá)到性成熟后可育的f0xy雌性嚙齒動(dòng)物的百分比為約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、95％或100％。在其他實(shí)施例中，用此類(lèi)方法產(chǎn)生的f0子代中約3％、約10％或更多、或者約63％或更多來(lái)源于經(jīng)遺傳修飾的供體xy細(xì)胞。本文所提供的方法和組合物允許f0動(dòng)物中的至少1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更多具有靶向遺傳修飾(即，降低sry蛋白水平和/或活性的靶向遺傳修飾和/或?qū)δ繕?biāo)多核苷酸的靶向遺傳修飾)，以將該遺傳修飾傳遞給f1子代。在一個(gè)實(shí)施例中，f0代雌性xy非人動(dòng)物和/或雄性xy非人動(dòng)物中的至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或99.8％來(lái)源于供體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，f0雌性xy非人動(dòng)物和/或f0雄性xy非人動(dòng)物具有的毛色100％來(lái)源于供體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，f0代中的非人雌性xy動(dòng)物為嚙齒動(dòng)物(即，小鼠或大鼠)，其毛色100％來(lái)源于供體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，f0代中所產(chǎn)生的非人雌性xy動(dòng)物中的至少90％、92％、94％、96％、98％或99.8％來(lái)源于xy供體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，f0代中的非人雌性xy動(dòng)物約100％來(lái)源于供體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)能夠在2,000個(gè)細(xì)胞中檢出1個(gè)細(xì)胞(0.05％)的定量測(cè)定法來(lái)確定宿主胚胎細(xì)胞對(duì)f0代中的非人雌性xy動(dòng)物的貢獻(xiàn)，雌性xy動(dòng)物的任何組織都不會(huì)增大宿主胚胎細(xì)胞的貢獻(xiàn)。ii.繁育雌性可育xyf0代的各種方法在具體實(shí)施例中，將來(lái)源于具有降低sry蛋白水平和/或活性的遺傳修飾的xy多能和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的所得雌性可育xyf0代與動(dòng)物雜交，獲得f1代后代。在具體實(shí)施例中，將雌性可育xyf0與野生型動(dòng)物雜交。在一個(gè)實(shí)施例中，所述雌性xyf0非人哺乳動(dòng)物在與野生型小鼠雜交時(shí)是可育的。在具體實(shí)施例中，所述野生型小鼠為c57bl/6。可使用特異性引物和/或探針對(duì)f1子代進(jìn)行基因分型，以確定是否存在導(dǎo)致sry蛋白水平和/或活性降低的靶向遺傳修飾。此外，如果f0代中存在另外的靶向遺傳修飾，則可使用用于確定是否存在此類(lèi)修飾的特異性引物和/或探針對(duì)f1子代進(jìn)行基因分型。然后可鑒定用于所需用途的適當(dāng)f1子代。在具體實(shí)施例中，選擇缺少用于降低sry蛋白水平和/或活性的遺傳修飾的f1子代。在其他實(shí)施例中，選擇缺少用于降低sry蛋白水平和/或活性的遺傳修飾并且包含至少一種另外的靶向遺傳修飾的f1子代。在一個(gè)非限制性例子中，在用特異性引物和/或探針進(jìn)行基因分型之后，將對(duì)于目標(biāo)多核苷酸的靶向遺傳修飾為雜合的并且缺少用于降低sry蛋白水平和/或活性的靶向修飾的f1動(dòng)物彼此雜交。這種雜交產(chǎn)生了對(duì)于經(jīng)遺傳修飾的目標(biāo)基因組座位為純合的并且不包含用于降低sry蛋白水平和/或活性的遺傳修飾的f2子代。還提供了在f1代中產(chǎn)生對(duì)于靶向遺傳修飾為純合的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的方法。該方法包括：(a)使具有降低sry蛋白水平和/或活性的靶向遺傳修飾的f0xy可育雌性非人動(dòng)物與f0xy雄性非人動(dòng)物雜交，其中所述f0xy可育雌性非人動(dòng)物和所述f0xy雄性非人動(dòng)物各自對(duì)于目標(biāo)多核苷酸的相同遺傳修飾均為雜合的，以及(b)獲得對(duì)于目標(biāo)多核苷酸中的靶向遺傳修飾為純合的f1子代。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所選擇的f1子代對(duì)于目標(biāo)多核苷酸中的靶向遺傳修飾為純合的，并且缺少用于降低sry蛋白活性和/或水平的靶向遺傳修飾。此類(lèi)方法可用于開(kāi)發(fā)繁育用成對(duì)非人動(dòng)物，其中每個(gè)非人動(dòng)物完全來(lái)源于相同f0代中的供體es細(xì)胞或ips細(xì)胞。可采用各種方法來(lái)獲得上述f0動(dòng)物。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，將在任何染色體上具有對(duì)目標(biāo)多核苷酸的靶向修飾的xy細(xì)胞克隆分離。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，可使用各種方法在目標(biāo)多核苷酸中產(chǎn)生靶向修飾。在第二步驟中，將靶向修飾引入sry基因中，使得該修飾降低sry蛋白的水平和/或活性。此類(lèi)方法將進(jìn)一步采用在促進(jìn)xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基中培養(yǎng)xyes細(xì)胞，如本文別處詳細(xì)描述。靶向修飾sry基因的方法在本文別處詳細(xì)公開(kāi)，可包括例如單獨(dú)使用靶向載體(包括ltvec)，或組合使用靶向載體與本文別處所述的核酸酶(即，talen、crispr或zfn體系)。分離既包含對(duì)目標(biāo)多核苷酸的第一靶向修飾，又包含用于降低sry蛋白的水平和/或活性的第二靶向sry基因修飾的亞克隆。將在目標(biāo)多核苷酸中具有靶向修飾的原始xy克隆以及既包含對(duì)sry基因的靶向修飾又包含對(duì)目標(biāo)多核苷酸的靶向修飾的xy亞克隆都引入單獨(dú)的非人宿主胚胎中，如本文別處所討論。在具體實(shí)施例中，非人宿主胚胎包括桑椹胚前期胚胎(即，8-細(xì)胞期胚胎)。將包含經(jīng)修飾多能細(xì)胞的每個(gè)非人宿主胚胎引入代孕母體內(nèi)進(jìn)行孕育。每個(gè)代孕母體均產(chǎn)生包含靶向基因組修飾的f0子代(即，在目標(biāo)多核苷酸中具有靶向修飾的f0xy雄性，以及具有對(duì)目標(biāo)多核苷酸的靶向修飾并且具有降低sry蛋白的水平和/或活性的遺傳修飾的f0xy可育雌性)。在具體實(shí)施例中，靶向基因組修飾中的每一種都能夠通過(guò)種系傳遞。將這些f0動(dòng)物中的每一個(gè)彼此交配，產(chǎn)生包含對(duì)目標(biāo)多核苷酸的純合靶向修飾的f1動(dòng)物。預(yù)期f1代中的四分之一對(duì)于目標(biāo)多核苷酸中的靶向修飾為純合的?？蛇x擇保留了對(duì)sry基因的靶向修飾的f1子代，也可選擇不保留對(duì)sry基因的靶向修飾的f1子代。在另一個(gè)實(shí)施例中，采用靶向載體(在具體實(shí)施例中，還采用核酸酶諸如talen、crispr或zfn)引入對(duì)sry基因的靶向修飾可與載體靶向?qū)δ繕?biāo)多核苷酸的遺傳修飾同時(shí)發(fā)生。此類(lèi)方法允許產(chǎn)生具有降低sry蛋白的水平和/或活性的遺傳修飾并且還包含對(duì)目標(biāo)多核苷酸的靶向修飾的xyes細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，f1代子代包含完全來(lái)源于供體es細(xì)胞的基因組。在其他實(shí)施例中，產(chǎn)生完全來(lái)源于es細(xì)胞的小鼠的f0代雄性小鼠與f0代雌性小鼠的雜交頻率為100％。ii.用于修飾y染色體上的挑戰(zhàn)性靶基因組座位或靶基因組座位的方法和組合物提供了允許修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法和組合物。還提供了允許修飾“挑戰(zhàn)性(challenging)”基因組座位的方法。術(shù)語(yǔ)“挑戰(zhàn)性基因座”包括難以通過(guò)常規(guī)的基因靶向策略靶向的染色體區(qū)域。此類(lèi)基因座可位于y染色體、x染色體或常染色體上。在某些實(shí)施例中，挑戰(zhàn)性基因座位于基因少、富含重復(fù)序列和/或大部分為異染色質(zhì)的染色體區(qū)域內(nèi)或附近。參見(jiàn)例如bernardinietal.,proc.natl.acad.sci.usa111:7600-7605(2014)(bernardini等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第111卷，第7600-7605頁(yè)，2014年)，該文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文用于所有目的。在某些實(shí)施例中，挑戰(zhàn)性基因座位于其中染色體dna的可及性受染色質(zhì)結(jié)構(gòu)限制的染色體區(qū)域內(nèi)或附近。在某些實(shí)施例中，挑戰(zhàn)性基因座在特征為異染色質(zhì)百分比高(諸如異染色質(zhì)為至少約20％、至少約30％、至少約40％、少約50％、至少約60％或至少約70％)的染色體區(qū)域內(nèi)或附近。在某些實(shí)施例中，挑戰(zhàn)性基因座位于已經(jīng)歷復(fù)制和重排或者特征為存在重復(fù)序列或反向重復(fù)序列的染色體區(qū)域內(nèi)或附近。參見(jiàn)例如gubbayetal.,proc.natl.acad.sci.usa89:7953-7957(1992)(gubbay等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第89卷，第7953-7957頁(yè)，1992年)，該文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文用于所有目的。術(shù)語(yǔ)“染色質(zhì)”包括核蛋白復(fù)合物，其致密化并組織細(xì)胞遺傳物質(zhì)，從而在細(xì)胞內(nèi)包含細(xì)胞遺傳物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“異染色質(zhì)”包括基因組中處于高度濃縮狀態(tài)并且通常轉(zhuǎn)錄沉默的區(qū)域。與常染色質(zhì)相比，異染色質(zhì)通常更緊密地盤(pán)繞并且通常具有重復(fù)性更高的dna序列。術(shù)語(yǔ)“常染色質(zhì)”包括基因組中由延伸得更長(zhǎng)且濃縮度較低的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域表征的區(qū)域，所述染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域通常具有轉(zhuǎn)錄活性并且是可及的。術(shù)語(yǔ)“暴露”包括采用任何方法使所需組分變得緊鄰或直接接觸。提供了允許修飾細(xì)胞中y染色體上的挑戰(zhàn)性靶基因組座位或靶基因組座位的方法和組合物。也許是由于y染色體具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，所以在小鼠胚胎干細(xì)胞中產(chǎn)生y連鎖基因突變的常規(guī)基因靶向策略已獲得的成果有限。因此通常情況下，對(duì)鼠y連鎖基因功能的理解受限于從對(duì)攜帶自發(fā)缺失、隨機(jī)基因捕獲插入或常染色體轉(zhuǎn)基因的小鼠的研究獲得的見(jiàn)解。本文提供的方法允許通過(guò)在不存在核酸酶試劑的情況下使用靶向載體或通過(guò)與核酸酶試劑組合使用靶向載體，來(lái)靶向y染色體上的基因組座位。一些此類(lèi)方法利用小靶向載體(或稱(chēng)smalltvec)?！皊malltvec”包括含有短同源臂的靶向載體。smalltvec上同源臂的長(zhǎng)度可為約400bp至1000bp。smalltvec的同源臂可具有足以促進(jìn)與對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)發(fā)生同源重組事件的任何長(zhǎng)度，包括例如約400bp至約500bp、約500bp至約600bp、約600bp至約700bp、約700bp至約800bp、約800bp至約900bp、或約900bp至約1000bp。smalltvec上同源臂的優(yōu)選長(zhǎng)度為約700bp至約800bp。在另一個(gè)實(shí)施例中，smalltvec的5’和3’同源臂的總和為約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、約2kb至約3kb、約3kb至約4kb、約4kb至約5kb、約5kb至約6kb、約6kb至約7kb、約8kb至約9kb，或?yàn)橹辽?0kb。在此類(lèi)方法中，與具有較長(zhǎng)同源臂的靶向載體相比，長(zhǎng)度短的同源臂增大了靶向效率。由于y染色體的性質(zhì)為具有高度重復(fù)的序列，所以smalltvec的短臂允許高度特異性地靶向y染色體。提供了用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)；(b)向該細(xì)胞中引入包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接與第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的第一同源臂和第二同源臂；以及(c)鑒定在其基因組中包含在y染色體上的所述靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞。在具體實(shí)施例中，靶向載體的第一同源臂和第二同源臂的總和為約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、約2kb至約3kb、約3kb至約4kb、約4kb至約5kb、約5kb至約6kb、約6kb至約7kb、約8kb至約9kb，或?yàn)橹辽?0kb或至少10kb且少于150kb。在一些實(shí)施例中，采用smalltvec。在具體實(shí)施例中，采用ltvec。在靶向挑戰(zhàn)性靶基因組座位時(shí)，可執(zhí)行類(lèi)似的方法。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，執(zhí)行此類(lèi)方法，其采用促進(jìn)本文所公開(kāi)的xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基，從而生成xyf0可育雌性動(dòng)物。在其他情況下，本文所述的方法用于在sry基因中產(chǎn)生靶向遺傳修飾，如本文別處所討論。還提供了用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，(b)向該細(xì)胞中引入(i)核酸酶試劑，其中所述核酸酶試劑在第一識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂與位置足夠接近第一識(shí)別位點(diǎn)的第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)；以及(c)鑒定在其基因組中包含在y染色體上的靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞。在具體實(shí)施例中，靶向載體的第一同源臂和第二同源臂的總和為約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、約2kb至約3kb、約3kb至約4kb、約4kb至約5kb、約5kb至約6kb、約6kb至約7kb、約8kb至約9kb，或?yàn)橹辽?0kb或至少10kb且少于150kb。在一些實(shí)施例中，采用smalltvec。在具體實(shí)施例中，采用ltvec。在靶向挑戰(zhàn)性靶基因組座位時(shí)，可執(zhí)行類(lèi)似的方法。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，執(zhí)行此類(lèi)方法，其采用促進(jìn)本文所公開(kāi)的xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基，從而生成xyf0可育雌性動(dòng)物。在其他情況下，本文所述的方法用于在sry基因中產(chǎn)生靶向遺傳修飾，如本文別處所討論。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，本文所公開(kāi)的采用靶向載體、smalltvec或ltvec在y染色體的基因組座位(或任何挑戰(zhàn)性基因組座位)中產(chǎn)生靶向修飾的各種方法可以在任何細(xì)胞類(lèi)型中執(zhí)行，并不限于xy多能和/或全能細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型包括但不限于人細(xì)胞、非人細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、倉(cāng)鼠細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或任何其他宿主細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞包括多能細(xì)胞，包括例如誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞、大鼠胚胎干(es)細(xì)胞、人胚胎干(es)細(xì)胞或發(fā)育受限的人祖細(xì)胞。還公開(kāi)了采用本文所提供的各種核酸酶試劑中的任一種(例如，crisprgrna與cas9、zfn或talen的組合)在y染色體上產(chǎn)生大段缺失的方法。y染色體上的這種缺失可以是內(nèi)源核酸序列的缺失。所述缺失可在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約600kb、約600kb至約700kb、約700kb至約800kb、約800kb至約900kb、約900kb至約1mb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述缺失大于500kb。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述缺失為約500kb至約600kb。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述缺失為約500kb。y染色體上的這種缺失可以是任意核酸序列的缺失。在一個(gè)實(shí)施例中，所述缺失包括與可育性/不育性相關(guān)聯(lián)的基因。y染色體上的所述缺失可包括多個(gè)基因的缺失。在此類(lèi)方法中，可缺失1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多個(gè)基因。在具體實(shí)施例中，kdm5d基因(賴(lài)氨酸(k)特異性去甲基化酶5d；例如entrezgeneid20592(小家鼠))和/或usp9y基因(泛素特異性肽酶9，y連鎖；例如entrezgeneid107868(小家鼠))是缺失所靶向的基因。在其他實(shí)施例中，sry基因是缺失所靶向的基因。a.核酸酶試劑與核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)術(shù)語(yǔ)“核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)”包括用核酸酶試劑在其處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂的dna序列。核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞可為內(nèi)源的(或天然的)，或所述識(shí)別位點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞可為外源的。在具體實(shí)施例中，所述識(shí)別位點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞是外源的，因此并非天然存在于細(xì)胞的基因組中。在另外的實(shí)施例中，所述識(shí)別位點(diǎn)對(duì)于細(xì)胞是外源的，對(duì)于期望將其定位在靶基因座處的目標(biāo)多核苷酸也是外源的。在另外的實(shí)施例中，宿主細(xì)胞的基因組中只存在一處外源或內(nèi)源的識(shí)別位點(diǎn)。在具體實(shí)施例中，鑒定在基因組內(nèi)僅出現(xiàn)一次的內(nèi)源或天然位點(diǎn)。隨后可使用這種位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)將在內(nèi)源識(shí)別位點(diǎn)處產(chǎn)生切口或雙鏈斷裂的核酸酶試劑。識(shí)別位點(diǎn)的長(zhǎng)度可能有變，包括例如鋅指核酸酶(zfn)對(duì)的約30至36bp識(shí)別位點(diǎn)(即，針對(duì)每個(gè)zfn約15至18bp)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)的約36bp識(shí)別位點(diǎn)，或者crispr/cas9向?qū)na的約20bp識(shí)別位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，每種核酸酶試劑單體識(shí)別至少含9個(gè)核苷酸的識(shí)別位點(diǎn)。在其他實(shí)施例中，所述識(shí)別位點(diǎn)的長(zhǎng)度為約9至約12個(gè)核苷酸、約12至約15個(gè)核苷酸、約15至約18個(gè)核苷酸、或約18至約21個(gè)核苷酸，以及此類(lèi)子范圍的任意組合(例如，9至18個(gè)核苷酸)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，給定核酸酶試劑可結(jié)合所述識(shí)別位點(diǎn)并切割該結(jié)合位點(diǎn)；另選地，核酸酶試劑可結(jié)合至不同于所述識(shí)別位點(diǎn)的序列。此外，術(shù)語(yǔ)“識(shí)別位點(diǎn)”既包括核酸酶試劑結(jié)合位點(diǎn)，又包括切口/裂解位點(diǎn)(不管切口/裂解位點(diǎn)是在核酸酶試劑結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)、還是核酸酶試劑結(jié)合位點(diǎn)外)。在另一種變型中，核酸酶試劑引起的裂解可發(fā)生在彼此直接相對(duì)的核苷酸位置處，以產(chǎn)生平頭末端切口，或者在其他情況下，所述切口可交錯(cuò)而產(chǎn)生單鏈懸垂(也稱(chēng)為“粘性末端”)，其可為5'懸垂或3'懸垂。用于誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂到期望識(shí)別位點(diǎn)中的任何核酸酶試劑都可用于本文所公開(kāi)的方法和組合物。可采用天然存在的或天然的核酸酶試劑，只要這種核酸酶試劑在期望的識(shí)別位點(diǎn)中誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂即可。另選地，可采用經(jīng)修飾的或經(jīng)改造的核酸酶試劑?！敖?jīng)改造的核酸酶試劑”包括從其天然形式進(jìn)行改造(修飾或衍生)以特異性地識(shí)別并誘導(dǎo)期望的識(shí)別位點(diǎn)中的切口或雙鏈斷裂的核酸酶。因此，經(jīng)改造的核酸酶試劑可衍生自天然的、天然存在的核酸酶試劑，也可人工產(chǎn)生或合成。對(duì)核酸酶試劑的修飾可能只發(fā)生在蛋白裂解試劑中的一個(gè)氨基酸處或核酸裂解試劑中的一個(gè)核苷酸處。在一些實(shí)施例中，經(jīng)改造的核酸酶在識(shí)別位點(diǎn)中誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂，其中所述識(shí)別位點(diǎn)是原本不會(huì)被天然的(未經(jīng)改造或未經(jīng)修飾的)核酸酶試劑識(shí)別的序列。在識(shí)別位點(diǎn)或其他dna中產(chǎn)生切口或雙鏈斷裂在本文中可稱(chēng)為“切割”或“裂解”識(shí)別位點(diǎn)或其他dna。還提供了示例性識(shí)別位點(diǎn)的活性變體和片段。此類(lèi)活性變體可與給定的識(shí)別位點(diǎn)至少具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性變體保留生物活性，因此能夠被核酸酶試劑以序列特異性方式識(shí)別和裂解。用核酸酶試劑測(cè)量識(shí)別位點(diǎn)的雙鏈斷裂的測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的(例如，qpcr測(cè)定法，frendeweyd.etal.,methodsinenzymology,2010,476:295-307(frendeweyd.等人，《酶學(xué)方法》，2010年，第476卷，第295-307頁(yè))，該文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文)。在具體實(shí)施例中，所述識(shí)別位點(diǎn)位于編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸內(nèi)。這種位置可位于選擇標(biāo)記的編碼區(qū)內(nèi)或影響選擇標(biāo)記表達(dá)的調(diào)控區(qū)內(nèi)。因此，核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)可位于選擇標(biāo)記的內(nèi)含子中，或者編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控區(qū)或任何非蛋白編碼區(qū)中。在具體實(shí)施例中，識(shí)別位點(diǎn)處出現(xiàn)的切口或雙鏈斷裂破壞了選擇標(biāo)記的活性。用來(lái)測(cè)定功能性選擇標(biāo)記存在與否的方法是已知的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸酶試劑為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)。tal效應(yīng)物核酸酶是一類(lèi)序列特異性核酸酶，可用于在原核或真核生物體的基因組中的特定靶序列處產(chǎn)生雙鏈斷裂。tal效應(yīng)物核酸酶是通過(guò)將天然的或經(jīng)改造的轉(zhuǎn)錄激活因子樣(tal)效應(yīng)物或其功能部分融合至內(nèi)切核酸酶(諸如foki)的催化結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生的。獨(dú)特的模塊化tal效應(yīng)物dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域允許設(shè)計(jì)具有潛在的任何給定dna識(shí)別特異性的蛋白質(zhì)。因此，tal效應(yīng)物核酸酶的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被改造以識(shí)別特定的dna靶位點(diǎn)，因而用于在期望的靶序列處產(chǎn)生雙鏈斷裂。參見(jiàn)wo2010/079430；morbitzeretal.(2010)pnas10.1073/pnas.1013133107(morbitzer等人，2010年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，doi號(hào)：10.1073/pnas.1013133107)；scholze&boch(2010)virulence1:428-432(scholze和boch，2010年，《毒力》，第1卷，第428-432頁(yè))；christianetal.genetics(2010)186:757-761(christian等人，《遺傳學(xué)》，2010年，第186卷，第757-761頁(yè))；lietal.(2010)nuc.acidsres.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704(li等人，2010年，《核酸研究》，doi號(hào)：10.1093/nar/gkq704)；以及milleretal.(2011)naturebiotechnology29:143–148(miller等人，2011年，《自然生物技術(shù)》，第29卷，第143-148頁(yè))；所有這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文。合適tal核酸酶的例子以及用于制備合適tal核酸酶的方法公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)no.2011/0239315a1、no.2011/0269234a1、no.2011/0145940a1、no.2003/0232410a1、no.2005/0208489a1、no.2005/0026157a1、no.2005/0064474a1、no.2006/0188987a1以及no.2006/0063231a1中(每份專(zhuān)利申請(qǐng)據(jù)此以引用方式并入)。在各種實(shí)施例中，tal效應(yīng)物核酸酶被改造成在例如目標(biāo)基因座或目標(biāo)基因組座位中的靶核酸序列之中或附近進(jìn)行切割，其中所述靶核酸序列位于靶向載體將要修飾的序列之處或附近。適合與本文所提供的各種方法和組合物一起使用的tal核酸酶包括被特別設(shè)計(jì)成在本文所述的靶向載體將要修飾的靶核酸序列之處或附近結(jié)合的那些tal核酸酶。在一個(gè)實(shí)施例中，talen的每個(gè)單體包含經(jīng)由兩個(gè)高變殘基識(shí)別單堿基對(duì)的33至35個(gè)tal重復(fù)序列。在一個(gè)實(shí)施例中，核酸酶試劑為包含有效連接至獨(dú)立核酸酶的基于tal重復(fù)序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，獨(dú)立核酸酶為foki內(nèi)切核酸酶。在一個(gè)實(shí)施例中，核酸酶試劑包含第一基于tal重復(fù)序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二基于tal重復(fù)序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一基于tal重復(fù)序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二基于tal重復(fù)序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域每一者均有效連接至foki核酸酶，其中所述第一基于tal重復(fù)序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二基于tal重復(fù)序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別dna靶序列每條鏈中被不同長(zhǎng)度(12-20bp)的間隔序列隔開(kāi)的兩條鄰接dna靶序列，并且其中所述foki核酸酶亞基發(fā)生二聚化，從而生成能在靶序列處產(chǎn)生雙鏈斷裂的活性核酸酶。在本文所公開(kāi)的各種方法和組合物中采用的核酸酶試劑還可包括鋅指核酸酶(zfn)。在一個(gè)實(shí)施例中，zfn的每個(gè)單體包含3個(gè)或更多個(gè)基于鋅指的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)基于鋅指的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合于3bp亞位點(diǎn)。在其他實(shí)施例中，zfn為包含有效連接至獨(dú)立核酸酶的、基于鋅指的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，獨(dú)立內(nèi)切核酸酶為foki內(nèi)切核酸酶。在一個(gè)實(shí)施例中，核酸酶試劑包含第一zfn和第二zfn，其中所述第一zfn和第二zfn每一者均有效連接至foki核酸酶亞基，其中所述第一zfn和第二zfn識(shí)別dna靶序列每條鏈中被約5至7bp間隔序列隔開(kāi)的兩條鄰接dna靶序列，并且其中所述foki核酸酶亞基發(fā)生二聚化，從而生成能產(chǎn)生雙鏈斷裂的活性核酸酶。參見(jiàn)例如us20060246567、us20080182332、us20020081614、us20030021776、wo/2002/057308a2、us20130123484、us20100291048、wo/2011/017293a2，以及gajetal.(2013)trendsinbiotechnology,31(7):397-405(gaj等人，2013年，《生物技術(shù)趨勢(shì)》，第31卷，第7期，第397-405頁(yè))；這些文獻(xiàn)各自以引用方式并入本文。在又一個(gè)實(shí)施例中，核酸酶試劑為大范圍核酸酶。已基于保守序列基序?qū)⒋蠓秶怂崦阜诸?lèi)為四個(gè)家族，這些家族是laglidadg、giy-yig、h-n-h和his-cys框家族。這些基序參與金屬離子的配位和磷酸二酯鍵的水解。大范圍核酸酶以其長(zhǎng)識(shí)別位點(diǎn)及耐受其dna底物中的一些序列多態(tài)性而著稱(chēng)。大范圍核酸酶的結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)和功能是已知的，參見(jiàn)例如，guhanandmuniyappa(2003)critrevbiochemmolbiol38:199-248(guhan和muniyappa，2003年，《生物化學(xué)與分子生物學(xué)評(píng)論》，第38卷，第199-248頁(yè))；lucasetal.,(2001)nucleicacidsres29:960-9(lucas等人，2001年，《核酸研究》，第29卷，第960-969頁(yè))；juricaandstoddard,(1999)cellmollifesci55:1304-26(jurica和stoddard，1999年，《細(xì)胞和分子生命科學(xué)》，第55卷，第1304-1326頁(yè))；stoddard,(2006)qrevbiophys38:49-95(stoddard，2006年，《生物物理學(xué)季評(píng)》，第38卷，第49-95頁(yè))；以及moureetal.,(2002)natstructbiol9:764(moure等人，2002年，《自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》，第9卷，第764頁(yè))。在一些例子中，使用天然存在的變體和/或經(jīng)改造的衍生大范圍核酸酶。用于調(diào)整動(dòng)力學(xué)、輔因子相互作用、表達(dá)、最適條件和/或識(shí)別位點(diǎn)特異性以及篩選活性的方法是已知的，參見(jiàn)例如，epinatetal.,(2003)nucleicacidsres31:2952-62(epinat等人，2003年，《核酸研究》，第31卷，第2952-2962頁(yè))；chevalieretal.,(2002)molcell10:895-905(chevalier等人，2002年，《分子細(xì)胞》，第10卷，第895-905頁(yè))；gimbleetal.,(2003)molbiol334:993-1008(gimble等人，2003年，《分子生物學(xué)》，第334卷，第993-1008頁(yè))；seligmanetal.,(2002)nucleicacidsres30:3870-9(seligman等人，2002年，《核酸研究》，第30卷，第3870-3879頁(yè))；sussmanetal.,(2004)jmolbiol342:31-41(sussman等人，2004年，《分子生物學(xué)雜志》，第342卷，第31-41頁(yè))；rosenetal.,(2006)nucleicacidsres34:4791-800(rosen等人，2006年，《核酸研究》，第34卷，第4791-4800頁(yè))；chamesetal.,(2005)nucleicacidsres33:e178(chames等人，2005年，《核酸研究》，第33卷，第e178頁(yè))；smithetal.,(2006)nucleicacidsres34:e149(smith等人，2006年，《核酸研究》，第34卷，第e149頁(yè))；gruenetal.,(2002)nucleicacidsres30:e29(gruen等人，2002年，《核酸研究》，第30卷，第e29頁(yè))；chenandzhao,(2005)nucleicacidsres33:e154(chen和zhao，2005年，《核酸研究》，第33卷，第e154頁(yè))；wo2005105989、wo2003078619、wo2006097854、wo2006097853、wo2006097784，以及wo2004031346。可在本文中使用任何大范圍核酸酶，包括但不限于i-scei、i-sceii、i-sceiii、i-sceiv、i-scev、i-scevi、i-scevii、i-ceui、i-ceuaiip、i-crei、i-crepsbip、i-crepsbiip、i-crepsbiiip、i-crepsbivp、i-tlii、i-ppoi、pi-pspi、f-scei、f-sceii、f-suvi、f-tevi、f-tevii、i-amai、i-anii、i-chui、i-cmoei、i-cpai、i-cpaii、i-csmi、i-cvui、i-cvuaip、i-ddii、i-ddiii、i-diri、i-dmoi、i-hmui、i-hmuii、i-hsnip、i-llai、i-msoi、i-naai、i-nani、i-nciip、i-ngrip、i-niti、i-njai、i-nsp236ip、i-paki、i-pboip、i-pcuip、i-pcuai、i-pcuvi、i-pgrip、i-pobip、i-pori、i-poriip、i-pbpip、i-spbetaip、i-scai、i-sexip、i-sneip、i-spomi、i-spomcp、i-spomip、i-spomiip、i-squip、i-ssp6803i、i-sthphijp、i-sthphist3p、i-sthphiste3bp、i-tdeip、i-tevi、i-tevii、i-teviii、i-uarap、i-uarhgpaip、i-uarhgpa13p、i-vinip、i-zbiip、pi-mtui、pi-mtuhippi-mtuhiip、pi-pfui、pi-pfuii、pi-pkoi、pi-pkoii、pi-rma43812ip、pi-spbetaip、pi-scei、pi-tfui、pi-tfuii、pi-thyi、pi-tlii、pi-tliii，或它們的任何活性變體或片段。在一個(gè)實(shí)施例中，所述大范圍核酸酶識(shí)別12至40個(gè)堿基對(duì)的雙鏈dna序列。在一個(gè)實(shí)施例中，所述大范圍核酸酶識(shí)別基因組中的一個(gè)完全匹配的靶序列。在一個(gè)實(shí)施例中，所述大范圍核酸酶為歸巢核酸酶。在一個(gè)實(shí)施例中，所述歸巢核酸酶為歸巢核酸酶的laglidadg家族。在一個(gè)實(shí)施例中，歸巢核酸酶的laglidadg家族選自i-scei、i-crei和i-dmol。核酸酶試劑還可包括限制性?xún)?nèi)切核酸酶，它們包括i型、ii型、iii型和iv型內(nèi)切核酸酶。i型和iii型限制性?xún)?nèi)切核酸酶識(shí)別特異性識(shí)別位點(diǎn)，但通常在離核酸酶結(jié)合位點(diǎn)的可變位置處裂解，該核酸酶結(jié)合位點(diǎn)離裂解位點(diǎn)(識(shí)別位點(diǎn))可達(dá)數(shù)百個(gè)堿基對(duì)。在ii型系統(tǒng)中，限制性酶切活性獨(dú)立于任何甲基化酶活性，并且通常在結(jié)合位點(diǎn)之內(nèi)或附近的特異性位點(diǎn)處發(fā)生裂解。大多數(shù)ii型酶切割回文序列，但是iia型酶識(shí)別非回文識(shí)別位點(diǎn)并在識(shí)別位點(diǎn)之外裂解，iib型酶在識(shí)別位點(diǎn)之外的兩個(gè)位點(diǎn)處切割序列兩次，并且iis型酶識(shí)別非對(duì)稱(chēng)識(shí)別位點(diǎn)并在一側(cè)且離識(shí)別位點(diǎn)約1至20個(gè)核苷酸的限定距離處裂解。iv型限制性酶靶向甲基化dna。限制性酶進(jìn)一步在例如rebase數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行說(shuō)明和分類(lèi)(地址為rebase.neb.com的網(wǎng)頁(yè)；robertsetal.,(2003)nucleicacidsres31:418-20(roberts等人，2003年，《核酸研究》，第31卷，第418-420頁(yè))，robertsetal.,(2003)nucleicacidsres31:1805-12(roberts等人，2003年，《核酸研究》，第31卷，第1805-1812頁(yè))，以及belfortetal.,(2002)inmobilednaii,pp.761-783,eds.craigieetal.,(asmpress,washington,dc)(belfort等人，2002年，載于《可移動(dòng)的dnaii》，第761-783頁(yè)，craigie等人編輯，華盛頓特區(qū)asm出版社))。在各種方法和組合物中采用的核酸酶試劑還可包括crispr/cas系統(tǒng)。此類(lèi)系統(tǒng)可采用cas9核酸酶，其在一些情況下針對(duì)要在其中表達(dá)的所需細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行密碼子優(yōu)化。該系統(tǒng)還采用融合的crrna-tracrrna構(gòu)建體，該構(gòu)建體與經(jīng)密碼子優(yōu)化的cas9一起發(fā)揮作用。該單一rna通常稱(chēng)為向?qū)na或grna。在grna內(nèi)，crrna部分被確定為給定識(shí)別位點(diǎn)的“靶序列”，并且tracrrna通常稱(chēng)為“支架”。已證實(shí)該系統(tǒng)可在多種真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中發(fā)揮作用。簡(jiǎn)而言之，包含靶序列的短dna片段被插入到向?qū)na表達(dá)質(zhì)粒中。grna表達(dá)質(zhì)粒包含靶序列(在一些實(shí)施例中約20個(gè)核苷酸)、一種形式的tracrrna序列(支架)，以及在細(xì)胞中有活性的合適啟動(dòng)子和用于在真核細(xì)胞中正確加工的必要元件。這些系統(tǒng)中的多種系統(tǒng)依賴(lài)于定制的互補(bǔ)寡核苷酸，這些寡核苷酸退火而形成雙鏈dna，接著克隆到grna表達(dá)質(zhì)粒中。然后將grna表達(dá)盒與cas9表達(dá)盒引入細(xì)胞。參見(jiàn)例如malipetal.(2013)science2013feb15；339(6121):823-6(malip等人，2013年，《科學(xué)》，2013年2月15日，第339卷，第6121期，第823-826頁(yè))；jinekmetal.science2012aug17；337(6096):816-21(jinekm等人，《科學(xué)》，2012年8月17日，第337卷，第6096期，第816-821頁(yè))；hwangwyetal.natbiotechnol2013mar；31(3):227-9(hwangwy等人，《自然生物技術(shù)》，2013年3月，第31卷，第3期，第227-229頁(yè))；jiangwetal.natbiotechnol2013mar；31(3):233-9(jiangw等人，《自然生物技術(shù)》，2013年3月，第31卷，第3期，第233-239頁(yè))；以及congletal.science2013feb15；339(6121):819-23(congl等人，《科學(xué)》，2013年2月15日，第339卷，第6121期，第819-823頁(yè))，這些文獻(xiàn)各自以引用方式并入本文。本文所公開(kāi)的方法和組合物可利用成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)/crispr相關(guān)(cas)系統(tǒng)或此類(lèi)系統(tǒng)的組分來(lái)修飾細(xì)胞內(nèi)的基因組。crispr/cas系統(tǒng)包括參與cas基因的表達(dá)或指導(dǎo)cas基因的活性的轉(zhuǎn)錄物和其他元件。crispr/cas系統(tǒng)可為i型、ii型或iii型系統(tǒng)。本文所公開(kāi)的方法和組合物通過(guò)利用crispr復(fù)合物(包含與cas蛋白復(fù)合的向?qū)na(grna))來(lái)采用crispr/cas系統(tǒng)對(duì)核酸進(jìn)行定點(diǎn)裂解。用于本文所公開(kāi)的方法中的一些crispr/cas系統(tǒng)為非天然存在的?！胺翘烊淮嬖诘摹毕到y(tǒng)包括指示受到人工干預(yù)的任何系統(tǒng)，諸如系統(tǒng)的一種或多種組分從其天然存在的狀態(tài)改變或突變，至少基本上不含其在自然界中與之天然關(guān)聯(lián)的至少一種其他組分，或和其不與之天然關(guān)聯(lián)的至少一種其他組分相關(guān)聯(lián)。例如，一些crispr/cas系統(tǒng)采用非天然存在的crispr復(fù)合物，這些復(fù)合物包含在天然情況下不會(huì)同時(shí)存在的grna和cas蛋白。(i)a.casrna指導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶cas蛋白一般包含至少一個(gè)rna識(shí)別或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此類(lèi)結(jié)構(gòu)域可與向?qū)na(grna，下文更詳細(xì)說(shuō)明)相互作用。cas蛋白還可包含核酸酶結(jié)構(gòu)域(例如，dna酶或rna酶結(jié)構(gòu)域)、dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域、解旋酶結(jié)構(gòu)域、蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域、二聚化結(jié)構(gòu)域以及其他結(jié)構(gòu)域。核酸酶結(jié)構(gòu)域具有用于核酸裂解的催化活性。裂解包括核酸分子共價(jià)鍵的斷裂。裂解可產(chǎn)生平頭末端或交錯(cuò)末端，并且其可為單鏈或雙鏈裂解。cas蛋白的例子包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas5e(casd)、cas6、cas6e、cas6f、cas7、cas8a1、cas8a2、cas8b、cas8c、cas9(csn1或csx12)、cas10、casl0d、casf、casg、cash、csy1、csy2、csy3、cse1(casa)、cse2(casb)、cse3(case)、cse4(casc)、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4和cu1966，以及它們的同源物或修飾形式。cas蛋白可來(lái)自ii型crispr/cas系統(tǒng)。例如，cas蛋白可為cas9蛋白或衍生自cas9蛋白。這些cas9蛋白通常共用具有保守架構(gòu)的四個(gè)關(guān)鍵基序?；?、2和4為ruvc樣基序，基序3為hnh基序。cas9蛋白可來(lái)自例如化膿性鏈球菌(streptococcuspyogenes)、嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophilus)、鏈球菌屬物種(streptococcussp.)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、達(dá)氏擬諾卡氏菌(nocardiopsisdassonvillei)、始旋鏈霉菌(streptomycespristinaespiralis)、綠色產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesviridochromogenes)、綠色產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesviridochromogenes)、粉紅鏈孢囊菌(streptosporangiumroseum)、粉紅鏈孢囊菌(streptosporangiumroseum)、酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(alicyclobachlusacidocaldarius)、假蕈狀芽孢桿菌(bacilluspseudomycoides)、還原硒酸鹽芽孢桿菌(bacillusselenitireducens)、西伯利亞微小桿菌(exiguobacteriumsibiricum)、德氏乳桿菌(lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳桿菌(lactobacillussalivarius)、海洋微顫菌(microscillamarina)、伯克氏菌(burkholderialesbacterium)、萘降解極地單胞菌(polaromonasnaphthalenivorans)、極地單胞菌屬物種(polaromonassp.)、瓦氏鱷球藻(crocosphaerawatsonii)、藍(lán)桿藻屬物種(cyanothecesp.)、銅綠微囊藻(microcystisaeruginosa)、聚球藻屬物種(synechococcussp.)、阿拉伯糖醋鹽桿菌(acetohalobiumarabaticum)、制氨菌(ammonifexdegensii)、熱解纖維素菌(caldicelulosiruptorbecscii)、candidatusdesulforudis、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、大芬戈?duì)柕戮?finegoldiamagna)、嗜熱鹽堿厭氧菌(natranaerobiusthermophilus)、丙酸互營(yíng)細(xì)菌(pelotomaculumthermopropionicum)、喜溫嗜酸硫桿菌(acidithiobacilluscaldus)、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、紫色硫細(xì)菌(allochromatiumvinosum)、海桿菌屬物種(marinobactersp.)、嗜鹽亞硝化球菌(nitrosococcushalophilus)、瓦氏亞硝化球菌(nitrosococcuswatsoni)、游海假交替單胞菌(pseudoalteromonashaloplanktis)、纖線桿菌(ktedonobacterracemifer)、甲烷鹽菌(methanohalobiumevestigatum)、多變魚(yú)腥藻anabaenavariabilis)、泡沫節(jié)球藻(nodulariaspumigena)、念珠藻屬物種(nostocsp.)、極大節(jié)螺藻(arthrospiramaxima)、鈍頂節(jié)螺藻(arthrospiraplatensis)、節(jié)螺藻屬物種(arthrospirasp.)、鞘絲藻屬物種(lyngbyasp.)、原型微鞘藻(microcoleuschthonoplastes)、顫藻屬物種(oscillatoriasp.)、運(yùn)動(dòng)石袍菌(petrotogamobilis)、非洲棲熱腔菌(thermosiphoafricanus)或深海單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌(acaryochlorismarina)。cas9家族成員的附加例子在wo2014/131833中有所描述，該專(zhuān)利全文以引用方式并入本文。來(lái)自化膿性鏈球菌(s.pyogenes)或從其衍生的cas9蛋白是優(yōu)選的酶。來(lái)自化膿性鏈球菌的cas9蛋白被分配了swissprot登記號(hào)q99zw2。cas蛋白可為野生型蛋白(即，自然界存在的蛋白)、經(jīng)修飾的cas蛋白(即，cas蛋白變體)，或者野生型或經(jīng)修飾的cas蛋白的片段。cas蛋白也可以是野生型或經(jīng)修飾的cas蛋白的活性變體或片段?；钚宰凅w或片段可與野生型或經(jīng)修飾的cas蛋白或者其一部分至少具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性變體保留了在所需裂解位點(diǎn)處切割的能力，從而保留了切口誘導(dǎo)活性或雙鏈斷裂誘導(dǎo)活性。對(duì)切口誘導(dǎo)活性或雙鏈斷裂誘導(dǎo)活性的測(cè)定法是已知的，并且一般測(cè)量cas蛋白對(duì)包含裂解位點(diǎn)的dna底物的總體活性和特異性?？尚揎梒as蛋白以提高或降低核酸結(jié)合親和力、核酸結(jié)合特異性和/或酶活性。還可修飾cas蛋白以改變蛋白的任何其他活性或特性，諸如穩(wěn)定性。例如，cas蛋白的一個(gè)或多個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域可以被修飾、缺失或失活，或者cas蛋白可以被截短以去除對(duì)于蛋白質(zhì)的功能并非必要的結(jié)構(gòu)域、或優(yōu)化(例如，增強(qiáng)或降低)cas蛋白的活性。一些cas蛋白包含至少兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，諸如dna酶結(jié)構(gòu)域。例如，cas9蛋白可包含ruvc樣核酸酶結(jié)構(gòu)域和hnh樣核酸酶結(jié)構(gòu)域。ruvc結(jié)構(gòu)域和hnh結(jié)構(gòu)域各自可切割雙鏈dna的不同鏈，從而在dna中產(chǎn)生雙鏈斷裂。參見(jiàn)例如jineketal.(2012)science337:816-821(jinek等人，2012年，《科學(xué)》，第337卷，第816-821頁(yè))，該文獻(xiàn)全文據(jù)此以引用方式并入。這些核酸酶結(jié)構(gòu)域中的一者或兩者可以被缺失或突變，使得它們不再有功能或具有降低的核酸酶活性。如果這兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域之一被缺失或突變，則所得的cas蛋白(例如，cas9)可稱(chēng)為切口酶，并且可在雙鏈dna內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列處生成單鏈斷裂，而不會(huì)生成雙鏈斷裂(即，其可裂解互補(bǔ)鏈或非互補(bǔ)鏈，但無(wú)法同時(shí)裂解兩者)。如果這兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域都被缺失或突變，則所得的cas蛋白(例如，cas9)裂解雙鏈dna兩條鏈的能力會(huì)降低。將cas9轉(zhuǎn)變?yōu)榍锌诿傅耐蛔兊睦邮莵?lái)自化膿性鏈球菌的cas9的ruvc結(jié)構(gòu)域中的d10a(cas9的第10位處天冬氨酸至丙氨酸)突變。同樣，來(lái)自化膿性鏈球菌的cas9的hnh結(jié)構(gòu)域中的h939a(氨基酸位置839處組氨酸至丙氨酸)或h840a(氨基酸位置840處組氨酸至丙氨酸)可將cas9轉(zhuǎn)變?yōu)榍锌诿?。將cas9轉(zhuǎn)變?yōu)榍锌诿傅耐蛔兊钠渌影▉?lái)自嗜熱鏈球菌(s.thermophilus)的cas9的對(duì)應(yīng)突變。參見(jiàn)例如sapranauskasetal.(2011)nucleicacidsresearch39:9275-9282(sapranauskas等人，2011年，《核酸研究》，第39卷，第9275-9282頁(yè))和wo2013/141680，這些文獻(xiàn)每一者的全文均以引用方式并入本文。此類(lèi)突變可使用諸如定點(diǎn)誘變、pcr介導(dǎo)的誘變或全基因合成的方法來(lái)生成。其他形成切口酶的突變的例子可見(jiàn)于例如wo/2013/176772a1和wo/2013/142578a1中，這些專(zhuān)利各自以引用方式并入本文。cas蛋白也可為融合蛋白。例如，cas蛋白可融合到裂解結(jié)構(gòu)域、表觀遺傳修飾結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)構(gòu)域。參見(jiàn)wo2014/089290，該專(zhuān)利全文以引用方式并入本文。cas蛋白也可融合到異源多肽，從而提供增強(qiáng)或減弱的穩(wěn)定性。融合的結(jié)構(gòu)域或異源多肽可位于n端、c端或cas蛋白的內(nèi)部。cas蛋白可融合到有助于亞細(xì)胞定位的異源多肽。此類(lèi)異源肽包括例如用于靶向細(xì)胞核的核定位信號(hào)(nls)諸如sv40nls、用于靶向線粒體的線粒體定位信號(hào)、er滯留信號(hào)，等等。參見(jiàn)例如langeetal.(2007)j.biol.chem.282:5101-5105(lange等人，2007年，《生物化學(xué)雜志》，第282卷，第5101-5105頁(yè))。此類(lèi)亞細(xì)胞定位信號(hào)可位于n端、c端或cas蛋白內(nèi)的任何位置處。nls可包含一段堿性氨基酸，并且可為單分型序列或雙分型序列。cas蛋白也可連接至細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域。例如，細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可衍生自hiv-1tat蛋白、來(lái)自人乙肝病毒的tlm細(xì)胞穿透基序、mpg、pep-1、vp22、來(lái)自單純性皰疹病毒的細(xì)胞穿透肽，或多聚精氨酸肽序列。參見(jiàn)例如wo2014/089290，該專(zhuān)利全文以引用方式并入本文。細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可位于n端、c端或cas蛋白內(nèi)的任何位置處。cas蛋白還可包含便于示蹤或純化的異源多肽，諸如熒光蛋白、純化標(biāo)簽或表位標(biāo)簽。熒光蛋白的例子包括綠色熒光蛋白(例如，gfp、gfp-2、taggfp、turbogfp、egfp、emerald、azamigreen、monomericazamigreen、copgfp、acegfp、zsgreenl)、黃色熒光蛋白(例如，yfp、eyfp、citrine、venus、ypet、phiyfp、zsyellowl)、藍(lán)色熒光蛋白(例如，ebfp、ebfp2、azurite、mkalamal、gfpuv、sapphire、t-sapphire)、青色熒光蛋白(例如，ecfp、cerulean、cypet、amcyanl、midoriishi-cyan)、紅色熒光蛋白(mkate、mkate2、mplum、dsredmonomer、mcherry、mrfp1、dsred-express、dsred2、dsred-monomer、hcred-tandem、hcredl、asred2、eqfp611、mraspberry、mstrawberry、jred)、橙色熒光蛋白(morange、mko、kusabira-orange、monomerickusabira-orange、mtangerine、tdtomato)，以及任何其他合適的熒光蛋白。標(biāo)簽的例子包括谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(cbp)、麥芽糖結(jié)合蛋白、硫氧還蛋白(trx)、多聚(nanp)、串聯(lián)親和純化(tap)標(biāo)簽、myc、acv5、au1、au5、e、ecs、e2、flag、血凝素(ha)、nus、softag1、softag3、strep、sbp、glu-glu、hsv、kt3、s、s1、t7、v5、vsv-g、組氨酸(his)、生物素羧基載體蛋白(bccp)以及鈣調(diào)蛋白。cas蛋白可以任何形式提供。例如，cas蛋白可以蛋白的形式提供，諸如與grna復(fù)合的cas蛋白。另選地，cas蛋白可以編碼cas蛋白的核酸的形式提供，諸如rna(例如，信使rna(mrna))或dna。任選地，編碼cas蛋白的核酸可進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以便在特定的細(xì)胞或生物體中有效地翻譯成蛋白。編碼cas蛋白的核酸可穩(wěn)定地整合在細(xì)胞的基因組中，并有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。另選地，編碼cas蛋白的核酸可有效連接至表達(dá)構(gòu)建體中的啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體包括能夠指導(dǎo)目標(biāo)基因或其他核酸序列(例如，cas基因)的表達(dá)并且可將這種目標(biāo)核酸序列轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的任何核酸構(gòu)建體?？捎糜诒磉_(dá)構(gòu)建體的啟動(dòng)子包括例如在大鼠、真核、哺乳動(dòng)物、非人哺乳動(dòng)物、人、嚙齒動(dòng)物、小鼠或倉(cāng)鼠多能細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子的例子在本文別處有所描述。(ii)b.向?qū)na(grna)“向?qū)na”或“grna”包括結(jié)合于cas蛋白并使cas蛋白靶向靶dna內(nèi)的特定位置的rna分子。向?qū)na可包含兩個(gè)區(qū)段：“dna靶向區(qū)段”和“蛋白結(jié)合區(qū)段”?！皡^(qū)段”包括分子的區(qū)段、部分或區(qū)域，諸如rna中的一個(gè)鄰接核苷酸段。一些grna包含兩個(gè)單獨(dú)的rna分子：“激活因子-rna”和“靶向因子-rna”。其他grna為單個(gè)rna分子(單條rna多核苷酸)，其也可稱(chēng)為“單分子grna”、“單向?qū)na”或“sgrna”。參見(jiàn)例如wo/2013/176772a1、wo/2014/065596a1、wo/2014/089290a1、wo/2014/093622a2、wo/2014/099750a2、wo/2013142578a1以及wo2014/131833a1，這些專(zhuān)利各自以引用方式并入本文。術(shù)語(yǔ)“向?qū)na”和“grna”包括雙分子grna和單分子grna兩者。示例性雙分子grna包含crrna樣(“crisprrna”或“靶向因子-rna”或“crrna”或“crrna重復(fù)序列”)分子以及對(duì)應(yīng)的tracrrna樣(“反式作用crisprrna”或“激活因子-rna”或“tracrrna”或“支架”)分子。crrna包含grna的dna靶向區(qū)段(單鏈)和一段核苷酸，這段核苷酸形成grna的蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體的一半。對(duì)應(yīng)的tracrrna(激活因子-rna)包含一段核苷酸，這段核苷酸形成grna的蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體的另一半。crrna的一段核苷酸與tracrrna的一段核苷酸互補(bǔ)并雜交，從而形成grna的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的dsrna雙鏈體。因此，每個(gè)crrna可以說(shuō)成具有對(duì)應(yīng)的tracrrna。crrna和對(duì)應(yīng)的tracrrna雜交而形成grna。crrna另外提供了與crisprrna識(shí)別序列雜交的單鏈dna靶向區(qū)段。如果用于細(xì)胞內(nèi)的修飾，則給定crrna或tracrrna分子的準(zhǔn)確序列可被設(shè)計(jì)成對(duì)于將在其中使用這些rna分子的物種具有特異性。參見(jiàn)例如malietal.(2013)science339:823-826(mali等人，2013年，《科學(xué)》，第339卷，第823-826頁(yè))；jineketal.(2012)science337:816-821(jinek等人，2012年，《科學(xué)》，第337卷，第816-821頁(yè))；hwangetal.(2013)nat.biotechnol.31:227-229(hwang等人，2013年，《自然生物技術(shù)》，第31卷，第227-229頁(yè))；jiangetal.(2013)nat.biotechnol.31:233-239(jiang等人，2013年，《自然生物技術(shù)》，第31卷，第233-239頁(yè))；以及congetal.(2013)science339:819-823(cong等人，2013年，《科學(xué)》，第339卷，第819-823頁(yè))，這些文獻(xiàn)各自以引用方式并入本文。給定grna的dna靶向區(qū)段(crrna)包含與靶dna中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。grna的dna靶向區(qū)段通過(guò)雜交(即，堿基配對(duì))以序列特異性方式與靶dna相互作用。因此，dna靶向區(qū)段的核苷酸序列可能有變，并且決定grna和靶dna將與之相互作用的靶dna內(nèi)的位置?？尚揎棇?duì)象grna的dna靶向區(qū)段，以與靶dna內(nèi)的任何所需序列雜交。天然存在的crrna因cas9系統(tǒng)和生物體不同而異，但通常包含21至72個(gè)核苷酸長(zhǎng)的靶向區(qū)段，該靶向區(qū)段側(cè)接21至46個(gè)核苷酸長(zhǎng)的兩個(gè)正向重復(fù)序列(dr)(參見(jiàn)例如wo2014/131833)。就化膿性鏈球菌而言，dr為36個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并且靶向區(qū)段為30個(gè)核苷酸長(zhǎng)。位于3’的dr與對(duì)應(yīng)的tracrrna互補(bǔ)并雜交，該tracrrna又結(jié)合于cas9蛋白。dna靶向區(qū)段的長(zhǎng)度可為約12個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸。例如，dna靶向區(qū)段的長(zhǎng)度可為約12個(gè)核苷酸(nt)至約80nt、約12nt至約50nt、約12nt至約40nt、約12nt至約30nt、約12nt至約25nt、約12nt至約20nt、或約12nt至約19nt。另選地，dna靶向區(qū)段的長(zhǎng)度可為約19nt至約20nt、約19nt至約25nt、約19nt至約30nt、約19nt至約35nt、約19nt至約40nt、約19nt至約45nt、約19nt至約50nt、約19nt至約60nt、約19nt至約70nt、約19nt至約80nt、約19nt至約90nt、約19nt至約100nt、約20nt至約25nt、約20nt至約30nt、約20nt至約35nt、約20nt至約40nt、約20nt至約45nt、約20nt至約50nt、約20nt至約60nt、約20nt至約70nt、約20nt至約80nt、約20nt至約90nt、或約20nt至約100nt。dna靶向區(qū)段內(nèi)與靶dna的核苷酸序列(crisprrna識(shí)別序列)互補(bǔ)的核苷酸序列的長(zhǎng)度可為至少約12nt。例如，dna靶向序列(即，dna靶向區(qū)段內(nèi)與靶dna內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列互補(bǔ)的序列)的長(zhǎng)度可為至少約12nt、至少約15nt、至少約18nt、至少約19nt、至少約20nt、至少約25nt、至少約30nt、至少約35nt、或至少約40nt。另選地，dna靶向序列的長(zhǎng)度可為約12個(gè)核苷酸(nt)至約80nt、約12nt至約50nt、約12nt至約45nt、約12nt至約40nt、約12nt至約35nt、約12nt至約30nt、約12nt至約25nt、約12nt至約20nt、約12nt至約19nt、約19nt至約20nt、約19nt至約25nt、約19nt至約30nt、約19nt至約35nt、約19nt至約40nt、約19nt至約45nt、約19nt至約50nt、約19nt至約60nt、約20nt至約25nt、約20nt至約30nt、約20nt至約35nt、約20nt至約40nt、約20nt至約45nt、約20nt至約50nt、或約20nt至約60nt。在一些情況下，dna靶向序列的長(zhǎng)度可為約20nt。tracrrna可為任何形式(例如，全長(zhǎng)tracrrna或活性的部分tracrrna)并具有不同長(zhǎng)度。它們可包括初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或加工形式。例如，tracrrna(作為單向?qū)na的一部分或作為雙分子grna一部分形式的單獨(dú)分子)可包含以下部分或由以下部分組成：野生型tracrrna序列的全部或一部分(例如，野生型tracrrna序列的約或大于約20、26、32、45、48、54、63、67、85個(gè)或更多個(gè)核苷酸)。來(lái)自化膿性鏈球菌的野生型tracrrna序列的例子包括171個(gè)核苷酸、89個(gè)核苷酸、75個(gè)核苷酸以及65個(gè)核苷酸的形式。參見(jiàn)例如deltchevaetal.(2011)nature471:602-607(deltcheva等人，2011年，《自然》，第471卷，第602-607頁(yè))；wo2014/093661，這些文獻(xiàn)每一者的全文均以引用方式并入本文。單向?qū)na(sgrna)內(nèi)的tracrrna的例子包括存在于+48、+54、+67和+85形式的sgrna內(nèi)的tracrrna區(qū)段，其中“+n”指示野生型tracrrna的至多+n核苷酸包含在sgrna中。參見(jiàn)us8,697,359，該專(zhuān)利全文以引用方式并入本文。dna靶向序列與靶dna內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列之間的互補(bǔ)性百分比可為至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。dna靶向序列與靶dna內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列之間的互補(bǔ)性百分比在約20個(gè)鄰接核苷酸內(nèi)可為至少60％。例如，dna靶向序列與靶dna內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列之間的互補(bǔ)性百分比在靶dna的互補(bǔ)鏈內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列的5’端的14個(gè)鄰接核苷酸內(nèi)為100％，而在其余部分內(nèi)低至0％。在這種情況下，dna靶向序列可被視為14個(gè)核苷酸長(zhǎng)。又如，dna靶向序列與靶dna內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列之間的互補(bǔ)性百分比在靶dna的互補(bǔ)鏈內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列的5’端的7個(gè)鄰接核苷酸內(nèi)為100％，而在其余部分內(nèi)低至0％。在這種情況下，dna靶向序列可被視為7個(gè)核苷酸長(zhǎng)。grna的蛋白結(jié)合區(qū)段可包含彼此互補(bǔ)的兩段核苷酸。所述蛋白結(jié)合區(qū)段的兩條互補(bǔ)核苷酸雜交而形成雙鏈rna雙鏈體(dsrna)。對(duì)象grna的蛋白結(jié)合區(qū)段與cas蛋白相互作用，并且grna經(jīng)由dna靶向區(qū)段將結(jié)合的cas蛋白引導(dǎo)至靶dna內(nèi)的特異性核苷酸序列。向?qū)na可包括提供額外所需特征(例如，經(jīng)改良或調(diào)控的穩(wěn)定性；亞細(xì)胞靶向；用熒光標(biāo)記示蹤；蛋白或蛋白復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)；等等)的修飾或序列。此類(lèi)修飾的例子包括例如5'帽(例如，7-甲基鳥(niǎo)苷酸帽(m7g))；3'多聚腺苷酸化尾(即，3'多聚(a)尾)；核糖開(kāi)關(guān)序列(例如，以實(shí)現(xiàn)經(jīng)調(diào)控的穩(wěn)定性和/或經(jīng)調(diào)控的蛋白和/或蛋白復(fù)合物可及性)；穩(wěn)定性控制序列；形成dsrna雙鏈體(即，發(fā)夾)的序列)；使rna靶向亞細(xì)胞位置(例如，細(xì)胞核、線粒體、葉綠體等)的修飾或序列；提供示蹤的修飾或序列(例如，與熒光分子的直接綴合、與有利于熒光檢測(cè)的部分的綴合、允許熒光檢測(cè)的序列等)；為蛋白(例如，作用于dna的蛋白，包括轉(zhuǎn)錄激活因子、轉(zhuǎn)錄阻遏物、dna甲基轉(zhuǎn)移酶、dna去甲基化酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙酰化酶等)提供結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列；以及它們的組合。向?qū)na可以任何形式提供。例如，grna可以rna的形式(作為兩個(gè)分子(單獨(dú)的crrna和tracrrna)或作為一個(gè)分子(sgrna))提供，并任選地以與cas蛋白的復(fù)合物的形式提供。grna也可以編碼rna的dna形式提供。編碼grna的dna可編碼單個(gè)rna分子(sgrna)或單獨(dú)的rna分子(例如，單獨(dú)的crrna和tracrrna)。在后一種情況下，編碼grna的dna可作為分別編碼crrna和tracrrna的單獨(dú)dna分子提供。編碼grna的dna可穩(wěn)定地整合在細(xì)胞的基因組中，并有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。另選地，編碼grna的dna可有效連接至表達(dá)構(gòu)建體中的啟動(dòng)子。此類(lèi)啟動(dòng)子可例如在大鼠、真核、哺乳動(dòng)物、非人哺乳動(dòng)物、人、嚙齒動(dòng)物、小鼠或倉(cāng)鼠多能細(xì)胞中有活性。在一些情況下，所述啟動(dòng)子為rna聚合酶iii啟動(dòng)子，諸如人u6啟動(dòng)子、大鼠u6聚合酶iii啟動(dòng)子或小鼠u6聚合酶iii啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子的例子在本文別處有所描述。另選地，可通過(guò)各種其他方法制備grna。例如，可通過(guò)采用例如t7rna聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄來(lái)制備grna(參見(jiàn)例如wo2014/089290和wo2014/065596)。向?qū)na也可為通過(guò)化學(xué)合成制備的合成產(chǎn)生的分子。(iii)c.crisprrna識(shí)別序列術(shù)語(yǔ)“crisprrna識(shí)別序列”包括只要存在結(jié)合的充分條件，grna的dna靶向區(qū)段就將與之結(jié)合的、存在于靶dna中的核酸序列。例如，crisprrna識(shí)別序列包括向?qū)na被設(shè)計(jì)成與之具有互補(bǔ)性的序列，其中crisprrna識(shí)別序列與dna靶向序列之間的雜交促進(jìn)crispr復(fù)合物形成。完全互補(bǔ)性不是必需的，只要存在引起雜交并促進(jìn)crispr復(fù)合物形成的充分互補(bǔ)性即可。crisprrna識(shí)別序列還包括下文更詳細(xì)說(shuō)明的cas蛋白裂解位點(diǎn)。crisprrna識(shí)別序列可包含任何多核苷酸，所述多核苷酸可位于例如細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中、或細(xì)胞的細(xì)胞器(諸如線粒體或葉綠體)內(nèi)。靶dna內(nèi)的crisprrna識(shí)別序列可被cas蛋白或grna靶向(即，被cas蛋白或grna結(jié)合，或者與cas蛋白或grna雜交，或者與cas蛋白或grna互補(bǔ))。合適的dna/rna結(jié)合條件包括通常存在于細(xì)胞中的生理?xiàng)l件。其他合適的dna/rna結(jié)合條件(例如，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的條件)是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.(sambrooketal.,harborlaboratorypress2001)(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第3版，sambrook等人，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，2001年))。與cas蛋白或grna互補(bǔ)并雜交的靶dna鏈可稱(chēng)為“互補(bǔ)鏈”，而與“互補(bǔ)鏈”互補(bǔ)(因此不與cas蛋白和grna互補(bǔ))的靶dna鏈可稱(chēng)為“非互補(bǔ)鏈”或“模板鏈”。cas蛋白可在grna的dna靶向區(qū)段將與之結(jié)合的、存在于靶dna中的核酸序列之內(nèi)或之外的位點(diǎn)處裂解核酸。“裂解位點(diǎn)”包括cas蛋白產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂的核酸位置。例如，crispr復(fù)合物(包含與crisprrna識(shí)別序列雜交并與cas蛋白復(fù)合的grna)的形成，可導(dǎo)致grna的dna靶向區(qū)段將與之結(jié)合的、存在于靶dna中的核酸序列之中或附近(例如，在相距1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50個(gè)或更多個(gè)堿基對(duì)內(nèi))的一條或兩條鏈裂解。如果裂解位點(diǎn)位于grna的dna靶向區(qū)段將與之結(jié)合的核酸序列之外，則裂解位點(diǎn)仍被視為在“crisprrna識(shí)別序列”內(nèi)。裂解位點(diǎn)可只位于核酸的一條鏈上，或可位于核酸的兩條鏈上。裂解位點(diǎn)可位于核酸的兩條鏈上的相同位置處(產(chǎn)生平頭末端)，或可位于每條鏈上的不同位點(diǎn)處(產(chǎn)生交錯(cuò)末端)。可例如通過(guò)使用兩種cas蛋白來(lái)產(chǎn)生交錯(cuò)末端，每種cas蛋白在每條鏈上的不同裂解位點(diǎn)處產(chǎn)生單鏈斷裂，從而產(chǎn)生雙鏈斷裂。例如，第一切口酶可在雙鏈dna(dsdna)的第一鏈上形成單鏈斷裂，而第二切口酶可在dsdna的第二鏈上形成單鏈斷裂，因此形成懸垂序列。在一些情況下，第一鏈上的切口酶crisprrna識(shí)別序列與第二鏈上的切口酶crisprrna識(shí)別序列相隔至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、250、500或1,000個(gè)堿基對(duì)。cas9對(duì)靶dna的位點(diǎn)特異性裂解可在由以下兩者決定的位置處發(fā)生：(i)grna與靶dna之間的堿基配對(duì)互補(bǔ)性，以及(ii)靶dna中的短基序，稱(chēng)為前間區(qū)序列鄰近基序(pam)。pam可在crisprrna識(shí)別序列的旁側(cè)。任選地，crisprrna識(shí)別序列可側(cè)接pam。例如，cas9的裂解位點(diǎn)可為pam序列上游或下游的約1至約10個(gè)、或者約2至約5個(gè)堿基對(duì)(例如，3個(gè)堿基對(duì))。在一些情況下(例如，當(dāng)使用來(lái)自化膿性鏈球菌的cas9或密切相關(guān)的cas9時(shí))，非互補(bǔ)鏈的pam序列可為5'-n1gg-3'，其中，n1為任何dna核苷酸并且緊鄰靶dna的非互補(bǔ)鏈的crisprrna識(shí)別序列的3'。因此，互補(bǔ)鏈的pam序列將為5'-ccn2-3'，其中，n2為任何dna核苷酸并且緊鄰靶dna的互補(bǔ)鏈的crisprrna識(shí)別序列的5'。在一些此類(lèi)情況下，n1和n2可為互補(bǔ)的，并且n1-n2堿基對(duì)可為任何堿基對(duì)(例如，n1＝c且n2＝g；n1＝g且n2＝c；n1＝a且n2＝t；n1＝t且n2＝a)。crisprrna識(shí)別序列的例子包括與grna的dna靶向區(qū)段互補(bǔ)的dna序列、或除pam序列之外的這種dna序列。例如，靶基序可為緊接在cas蛋白所識(shí)別的ngg基序前面的含20個(gè)核苷酸的dna序列(參見(jiàn)例如wo2014/165825)。5’端的鳥(niǎo)嘌呤可有利于rna聚合酶在細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。crisprrna識(shí)別序列的其他例子可包括5’端處的兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(例如，ggn20ngg；seqidno:9)，以利于t7聚合酶在體外進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄。參見(jiàn)例如wo2014/065596。crisprrna識(shí)別序列可為細(xì)胞內(nèi)源或外源的任何核酸序列。crisprrna識(shí)別序列可為編碼基因產(chǎn)物(例如，蛋白)的序列或非編碼序列(例如，調(diào)控序列)，或者可包括這兩者。在一個(gè)實(shí)施例中，靶序列緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。在一個(gè)實(shí)施例中，目標(biāo)基因座包含seqidno:1的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，grna包含編碼成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)rna(crrna)和反式激活crisprrna(tracrrna)的第三核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施例中，大鼠多能細(xì)胞的基因組包含與靶序列互補(bǔ)的靶dna區(qū)。在一些此類(lèi)方法中，cas蛋白為cas9。在一些實(shí)施例中，grna包括(a)seqidno:2的核酸序列的嵌合rna；或(b)seqidno:3的核酸序列的嵌合rna。在一些此類(lèi)方法中，crrna包含seqidno:4、seqidno:5或seqidno:6所示的序列。在一些此類(lèi)方法中，tracrrna包含seqidno:7或seqidno:8所示的序列。還提供了核酸酶試劑的活性變體和片段(即，經(jīng)改造的核酸酶試劑)。此類(lèi)活性變體可與天然核酸酶試劑至少具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中所述活性變體保留在所需識(shí)別位點(diǎn)處切割的能力，從而保留了切口或雙鏈斷裂誘導(dǎo)活性。例如，本文所述的任何核酸酶試劑可由天然內(nèi)切核酸酶序列修飾而成，并且可設(shè)計(jì)成在不被天然核酸酶試劑識(shí)別的識(shí)別位點(diǎn)處識(shí)別并誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂。因此，在一些實(shí)施例中，經(jīng)改造的核酸酶具有在與對(duì)應(yīng)天然核酸酶試劑識(shí)別位點(diǎn)不同的識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂的特異性。對(duì)切口或雙鏈斷裂誘導(dǎo)活性的測(cè)定法是已知的，并且一般測(cè)量?jī)?nèi)切核酸酶對(duì)包含識(shí)別位點(diǎn)的dna底物的總體活性和特異性?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式將核酸酶試劑引入細(xì)胞?？蓪⒕幋a核酸酶試劑的多肽直接引入細(xì)胞。另選地，可將編碼核酸酶試劑的多核苷酸引入細(xì)胞。將編碼核酸酶試劑的多核苷酸引入細(xì)胞時(shí)，核酸酶試劑可在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)地、有條件地或組成性地表達(dá)。因此，編碼核酸酶試劑的多核苷酸可包含在表達(dá)盒中，并有效連接至條件啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。此類(lèi)目標(biāo)啟動(dòng)子在本文別處進(jìn)一步詳細(xì)討論。另選地，將核酸酶試劑作為編碼核酸酶試劑的mrna引入細(xì)胞。在具體實(shí)施例中，編碼核酸酶試劑的多核苷酸穩(wěn)定地整合在細(xì)胞的基因組中，并有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。在其他實(shí)施例中，編碼核酸酶試劑的多核苷酸位于包含插入多核苷酸的同一靶向載體中，而在其他情況下，編碼核酸酶試劑的多核苷酸位于與包含插入多核苷酸的靶向載體分離的載體或質(zhì)粒中。當(dāng)通過(guò)引入編碼核酸酶試劑的多核苷酸來(lái)向細(xì)胞提供核酸酶試劑時(shí)，可修飾這種編碼核酸酶試劑的多核苷酸，以替換成與編碼核酸酶試劑的天然存在的多核苷酸序列相比在目標(biāo)細(xì)胞中具有更高使用頻率的密碼子。例如，可修飾編碼核酸酶試劑的多核苷酸，以替換成與天然存在的多核苷酸序列相比在給定的目標(biāo)原核或真核細(xì)胞(包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、人細(xì)胞、非人細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞或任何其他目標(biāo)宿主細(xì)胞)中具有更高使用頻率的密碼子。b.聯(lián)合采用crispr/cas系統(tǒng)和大靶向載體(ltvec)或小靶向載體(smalltvec)來(lái)修飾挑戰(zhàn)性基因組座位或y染色體基因座用于修飾挑戰(zhàn)性基因組座位或y染色體基因座的非限制性方法包括在存在包含至少10kb核酸序列的大靶向載體(ltvec)的情況下使染色體(即，y染色體)暴露于cas蛋白和crisprrna，其中在暴露于cas蛋白、crisprrna和ltvec后，染色體(即，y染色體)被修飾成包含至少10kb的核酸序列。該方法可采用本文所述的ltvec或smalltvec中的任何一種。在非限制性實(shí)施例中，ltvec或smalltvec包含至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb或至少200kb的核酸序列。在其他實(shí)施例中，ltvec的5’和3’同源臂的總和為約10kb至約150kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約120kb、或約120kb至150kb。在另一個(gè)實(shí)施例中，smalltvec的5’和3’同源臂的總和為約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、約2kb至約3kb、約3kb至約4kb、約4kb至約5kb、約5kb至約6kb、約6kb至約7kb、約8kb至約9kb，或?yàn)橹辽?0kb。還提供了用于修飾挑戰(zhàn)性靶基因座或y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供包含挑戰(zhàn)性靶基因座或y染色體上的靶基因組座位的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述靶基因組座位包含向?qū)na(grna)靶序列；(b)向該哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入：(i)包含第一核酸的大靶向載體(ltvec)，所述第一核酸側(cè)接有與靶基因組座位同源的靶向臂，其中所述ltvec為至少10kb；(ii)包含第一啟動(dòng)子的第一表達(dá)構(gòu)建體，所述第一啟動(dòng)子有效連接至編碼cas蛋白的第二核酸，以及(iii)包含第二啟動(dòng)子的第二表達(dá)構(gòu)建體，所述第二啟動(dòng)子有效連接至編碼向?qū)na(grna)的第三核酸，所述向?qū)na包含雜交至grna靶序列和反式激活crisprrna(tracrrna)的核苷酸序列，其中所述第一啟動(dòng)子和第二啟動(dòng)子在該哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性；以及(c)鑒定在挑戰(zhàn)性靶基因組座位處或在y染色體上的靶基因組座位處包含靶向遺傳修飾的經(jīng)修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在具體實(shí)施例中，第一表達(dá)構(gòu)建體和第二表達(dá)構(gòu)建體位于單個(gè)核酸分子上。在其他實(shí)施例中，y染色體的靶基因組座位為sry基因座。如上文概述，在一個(gè)實(shí)施例中，cas蛋白可包括cas9蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，grna靶序列緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。該方法可采用本文所述的ltvec或smalltvec中的任何一種。在非限制性實(shí)施例中，ltvec或smalltvec為至少0.5kb、至少1kb、至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb、至少90kb、至少100kb、至少150kb或至少200kb。在其他實(shí)施例中，ltvec的5’和3’同源臂的總和為約10kb至約150kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約120kb、或約120kb至150kb。可對(duì)例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞或倉(cāng)鼠細(xì)胞執(zhí)行采用crispr/cas系統(tǒng)的各種方法(或本文所公開(kāi)的任何方法)。所述細(xì)胞可為多能細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞、大鼠胚胎干(es)細(xì)胞、人胚胎干(es)細(xì)胞或發(fā)育受限的人祖細(xì)胞。如下文詳細(xì)討論，在采用例如使用上文概述的crispr/cas系統(tǒng)對(duì)非人多能細(xì)胞的挑戰(zhàn)性基因組座位或y染色體上的目標(biāo)基因組座位(即，sry基因座)進(jìn)行修飾之后，可將所產(chǎn)生的經(jīng)遺傳修飾的非人多能細(xì)胞引入非人宿主胚胎；然后在代孕母體中孕育包含經(jīng)修飾的多能細(xì)胞的非人宿主胚胎。代孕母體產(chǎn)生包含靶向遺傳修飾的f0子代。在具體實(shí)施例中，靶向遺傳修飾能夠通過(guò)種系傳遞。c.選擇標(biāo)記可在本文所公開(kāi)的用于修飾y染色體上的靶基因組座位或挑戰(zhàn)性靶基因組座位的方法和組合物中使用各種選擇標(biāo)記。此類(lèi)標(biāo)記在本文別處公開(kāi)，包括但不限于賦予對(duì)諸如g418、潮霉素、殺稻瘟菌素、新霉素或嘌呤霉素等抗生素的抗性的選擇標(biāo)記。編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。此類(lèi)表達(dá)盒及其各種調(diào)控組分在本文別處進(jìn)一步詳細(xì)討論。d.靶基因組座位提供了可實(shí)現(xiàn)在y染色體上的靶基因組座位或挑戰(zhàn)性靶基因組座位處整合至少一個(gè)插入多核苷酸的各種方法和組合物。如本文所用，“y染色體上的靶基因組座位”包含y染色體上希望整合插入多核苷酸的任何dna區(qū)段或區(qū)域。要靶向的y染色體上的基因組座位或挑戰(zhàn)性靶基因組座位對(duì)于細(xì)胞可為天然的，或另選地可包含整合到細(xì)胞染色體中的異源或外源dna區(qū)段。此類(lèi)異源或外源dna區(qū)段可包括轉(zhuǎn)基因、表達(dá)盒、編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸，或基因組dna的異源或外源區(qū)域。y染色體上的靶基因組座位或挑戰(zhàn)性靶基因組座位可包含所靶向基因組整合系統(tǒng)中的任何一種，包括例如識(shí)別位點(diǎn)、選擇標(biāo)記、此前整合的插入多核苷酸、編碼核酸酶試劑的多核苷酸、啟動(dòng)子等。另選地，y染色體上的靶基因組座位或挑戰(zhàn)性靶基因組座位可位于適當(dāng)宿主細(xì)胞中所含的酵母人工染色體(yac)、細(xì)菌人工染色體(bac)、人類(lèi)人工染色體或任何其他經(jīng)改造的基因組區(qū)域內(nèi)。因此，在具體實(shí)施例中，y染色體上的所靶向基因組座位或挑戰(zhàn)性靶基因組座位可包含來(lái)自非人哺乳動(dòng)物、非人細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物、人、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、兔、豬、牛、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、白鼬、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物或農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物、或任何其他目標(biāo)生物體、或它們的組合的天然、異源或外源基因組核酸序列。y染色體上的靶基因組座位的非限制性例子包括sry基因、uty基因、eif2s3y基因、ddx3y基因、基因、ube1y基因、tspy基因、usp9y基因、zfy1基因和zfy2基因，以及y染色體上包含kdm5d基因、eif2s3y基因、tspy基因、uty基因、ddx3y基因和usp9y基因的區(qū)域。y染色體上的這種基因座可來(lái)自非人哺乳動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、人、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、兔、豬、牛、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、白鼬、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物或農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物、或任何其他目標(biāo)生物體、或它們的組合。此類(lèi)細(xì)胞包括多能細(xì)胞，包括例如誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞、大鼠胚胎干(es)細(xì)胞、人胚胎干(es)細(xì)胞或發(fā)育受限的人祖細(xì)胞。如本文別處所述，提供了包含sry蛋白活性或水平降低的xy多能細(xì)胞和/或全能細(xì)胞(諸如xyes細(xì)胞或ips細(xì)胞)的各種方法和組合物。本文所述的修飾y染色體上的基因組座位的各種方法也可用于將靶向的遺傳修飾引入不位于y染色體上的目標(biāo)多核苷酸。e.靶向載體和插入多核苷酸如上文概述，本文所提供的方法和組合物采用了單獨(dú)的或與核酸酶試劑組合的靶向載體。按照慣例，“同源重組”用來(lái)指在同源區(qū)內(nèi)的交叉位點(diǎn)處兩個(gè)dna分子之間的dna片段交換。i.插入多核苷酸如本文所用，術(shù)語(yǔ)“插入多核苷酸”包含希望在靶基因組座位處整合的dna區(qū)段。在具體實(shí)施例中，靶基因組座位位于y染色體上。在其他實(shí)施例中，靶基因組座位為挑戰(zhàn)性基因組座位。在一個(gè)實(shí)施例中，插入多核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)多核苷酸。在其他實(shí)施例中，插入多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒。給定表達(dá)盒可包含目標(biāo)多核苷酸、編碼選擇標(biāo)記和/或報(bào)告基因的多核苷酸，以及影響表達(dá)的各種調(diào)控組分。可包含在插入多核苷酸內(nèi)的目標(biāo)多核苷酸、選擇標(biāo)記和報(bào)告基因的非限制性例子在本文別處詳細(xì)討論。在具體實(shí)施例中，插入多核苷酸可包含基因組核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，基因組核酸衍生自動(dòng)物、小鼠、人、非人、嚙齒動(dòng)物、非人、大鼠、倉(cāng)鼠、兔、豬、牛、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、白鼬、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物或農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、或任何其他目標(biāo)生物體、或它們的組合。在另外的實(shí)施例中，插入多核苷酸包含條件性等位基因。在一個(gè)實(shí)施例中，條件性等位基因?yàn)槿鐄s2011/0104799中所述的多功能等位基因，該專(zhuān)利全文以引用方式并入。在具體實(shí)施例中，條件性等位基因包含：(a)相對(duì)于靶基因的轉(zhuǎn)錄呈有義取向的起動(dòng)序列，以及呈有義或反義取向的藥物選擇盒；(b)呈反義取向的目標(biāo)核苷酸序列(nsi)和倒轉(zhuǎn)條件模塊(coin，其利用外顯子斷裂內(nèi)含子和可倒轉(zhuǎn)的基因誘捕樣模塊；參見(jiàn)例如us2011/0104799，該專(zhuān)利全文以引用方式并入)；以及(c)在暴露于第一重組酶后重組以形成條件性等位基因的可重組單元，所述條件性等位基因(i)缺乏起動(dòng)序列和dsc，并且(ii)含有呈有義取向的nsi和呈反義取向的coin。插入多核苷酸可為約5kb至約200kb、約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約30kb、約30kb至約40kb、約40kb至約50kb、約60kb至約70kb、約80kb至約90kb、約90kb至約100kb、約100kb至約110kb、約120kb至約130kb、約130kb至約140kb、約140kb至約150kb、約150kb至約160kb、約160kb至約170kb、約170kb至約180kb、約180kb至約190kb、約190kb至約200kb、約200kb至約250kb、約250kb至約300kb、約300kb至約350kb、或約350kb至約400kb。在具體實(shí)施例中，插入多核苷酸包含側(cè)接有位點(diǎn)特異性重組靶序列的核酸。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，盡管整條插入多核苷酸可側(cè)接這種位點(diǎn)特異性重組靶序列，但該插入多核苷酸內(nèi)的任何區(qū)域或單獨(dú)的目標(biāo)多核苷酸也可側(cè)接此類(lèi)位點(diǎn)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組位點(diǎn)”包括由位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別且可充當(dāng)重組事件的底物的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“位點(diǎn)特異性重組酶”包括可促進(jìn)在重組位點(diǎn)之間的重組的一組酶，其中這兩個(gè)重組位點(diǎn)在單個(gè)核酸分子內(nèi)或在分離的核酸分子上物理分隔。位點(diǎn)特異性重組酶的例子包括但不限于cre、flp和dre重組酶。位點(diǎn)特異性重組酶可通過(guò)任何方式引入細(xì)胞，包括將重組酶多肽引入細(xì)胞或?qū)⒕幋a位點(diǎn)特異性重組酶的多核苷酸引入宿主細(xì)胞。編碼位點(diǎn)特異性重組酶的多核苷酸可位于插入多核苷酸內(nèi)或單獨(dú)的多核苷酸內(nèi)。位點(diǎn)特異性重組酶可有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子，包括例如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、對(duì)于細(xì)胞為內(nèi)源的啟動(dòng)子、對(duì)于細(xì)胞為異源的啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子?？稍诓迦攵嗪塑账崤詡?cè)或在插入多核苷酸中的任何目標(biāo)多核苷酸旁側(cè)的位點(diǎn)特異性重組靶序列可包括但不限于loxp、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxm2、lox5171、frt、frt11、frt71、attp、att、frt、rox以及它們的組合。在其他實(shí)施例中，位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)在插入多核苷酸內(nèi)所含的編碼選擇標(biāo)記和/或報(bào)告基因的多核苷酸旁側(cè)。在此類(lèi)情況下，在所靶向的基因組座位處整合插入多核苷酸之后，可除去在位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的序列。在一個(gè)實(shí)施例中，插入多核苷酸包含編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸。此類(lèi)選擇標(biāo)記包括但不限于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neor)、潮霉素b磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygr)、嘌呤霉素-n-乙酰轉(zhuǎn)移酶(puror)、殺稻瘟菌素s脫氨酶(bsrr)、黃嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)、單純性皰疹病毒胸苷激酶(hsv-k)或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。在將目標(biāo)多核苷酸連續(xù)拼接到所靶向的基因組座位中之后，選擇標(biāo)記可包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，如上文所概述。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸側(cè)接有位點(diǎn)特異性重組靶序列。插入多核苷酸還可包含有效連接至啟動(dòng)子的報(bào)告基因，其中所述報(bào)告基因編碼報(bào)告蛋白，所述報(bào)告蛋白選自lacz、mplum、mcherry、tdtomato、mstrawberry、j-red、dsred、morange、mko、mcitrine、venus、ypet、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(eyfp)、emerald、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)、cypet、青色熒光蛋白(cfp)、cerulean、t-sapphire、熒光素酶、堿性磷酸酶以及它們的組合。此類(lèi)報(bào)告基因可有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。此類(lèi)啟動(dòng)子可為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、對(duì)于報(bào)告基因或細(xì)胞為內(nèi)源的啟動(dòng)子、對(duì)于報(bào)告基因或細(xì)胞為異源的啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。ii.靶向載體靶向載體用于將插入多核苷酸引入y染色體上的所靶向基因組座位中，或引入挑戰(zhàn)性靶基因座中，或引入另一個(gè)目標(biāo)染色體上。靶向載體包含插入多核苷酸，并且還包含上游同源臂和下游同源臂，這些同源臂在插入多核苷酸的旁側(cè)。在插入多核苷酸旁側(cè)的同源臂對(duì)應(yīng)于所靶向基因組座位內(nèi)的基因組區(qū)域。為了便于提及，所靶向基因組座位內(nèi)的對(duì)應(yīng)基因組區(qū)域在本文中稱(chēng)為“靶位點(diǎn)”。因此，在一個(gè)例子中，靶向載體可包含第一插入多核苷酸，所述第一插入多核苷酸側(cè)接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂與位置足夠接近編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸內(nèi)的第一識(shí)別位點(diǎn)的第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。因此，靶向載體由此有助于經(jīng)由在細(xì)胞的基因組內(nèi)的同源臂與對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)之間發(fā)生的同源重組事件將插入多核苷酸整合到所靶向的基因組座位中。靶向載體的同源臂可具有足以促進(jìn)與對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)發(fā)生同源重組事件的任何長(zhǎng)度，包括例如約400bp至約500bp、約500bp至約600bp、約600bp至約700bp、約700bp至約800bp、約800bp至約900bp、或約900bp至約1000bp；或至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、100-200、或200-300千堿基長(zhǎng)或更長(zhǎng)。在具體實(shí)施例中，靶向臂的總和為至少0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb或至少10kb。在其他實(shí)施例中，同源臂的總和為約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、約2kb至約3kb、約3kb至約4kb、約4kb至約5kb、約5kb至約6kb、約6kb至約7kb、約7kb至約8kb、約8kb至約9kb、或約10kb至約150kb。如下文進(jìn)一步詳細(xì)概述，大靶向載體可采用更大長(zhǎng)度的靶向臂。與靶向載體的上游同源臂和下游同源臂對(duì)應(yīng)的、所靶向基因組座位內(nèi)的靶位點(diǎn)的位置“足夠接近識(shí)別位點(diǎn)”，該識(shí)別位點(diǎn)位于編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸中。如本文所用，靶向載體的上游同源臂和下游同源臂“位置足夠接近”識(shí)別位點(diǎn)，這一說(shuō)法在所述距離能促進(jìn)在識(shí)別位點(diǎn)處出現(xiàn)切口或雙鏈斷裂后在靶位點(diǎn)與同源臂之間發(fā)生同源重組事件時(shí)成立。因此，在具體實(shí)施例中，與靶向載體的上游同源臂和/或下游同源臂相對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)位于給定識(shí)別位點(diǎn)至少10個(gè)核苷酸至約14kb內(nèi)。在具體實(shí)施例中，識(shí)別位點(diǎn)緊鄰靶位點(diǎn)中的至少一者或兩者。對(duì)應(yīng)于靶向載體的同源臂的靶位點(diǎn)與編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸內(nèi)的識(shí)別位點(diǎn)的空間關(guān)系可能有變。例如，這兩個(gè)靶位點(diǎn)可位于識(shí)別位點(diǎn)的5’，這兩個(gè)靶位點(diǎn)可位于識(shí)別位點(diǎn)的3’，或靶位點(diǎn)可在識(shí)別位點(diǎn)的旁側(cè)。在具體實(shí)施例中，靶基因組座位包含(i)與5’同源臂同源的5’靶序列，以及(ii)與3’同源臂同源的3’靶序列。在具體實(shí)施例中，5’靶序列和3’靶序列相隔至少5kb但少于3mb、至少5kb但少于10kb、至少10kb但少于20kb、至少20kb但少于40kb、至少40kb但少于60kb、至少60kb但少于80kb、至少約80kb但少于100kb、至少100kb但少于150kb、或至少150kb但少于200kb、至少約200kb但少于約300kb、至少約300kb但少于約400kb、至少約400kb但少于約500kb、至少約500kb但少于約1mb、至少約1mb但少于約1.5mb、至少約1.5mb但少于約2mb、至少約2mb但少于約2.5mb、或至少約2.5mb但少于約3mb。如本文所用，在兩個(gè)區(qū)域彼此共有水平足夠高的序列同一性時(shí)，同源臂和靶位點(diǎn)彼此“對(duì)應(yīng)”，從而充當(dāng)同源重組反應(yīng)的底物。所謂“同源性”，意指dna序列與對(duì)應(yīng)序列相同或共有序列同一性。給定靶位點(diǎn)與存在于靶向載體上的對(duì)應(yīng)同源臂之間的序列同一性，可為允許同源重組發(fā)生的任何程度的序列同一性。例如，靶向載體的同源臂(或其片段)與靶位點(diǎn)(或其片段)共有的序列同一性的大小可為至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，使得所述序列經(jīng)歷同源重組。此外，同源臂與對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)之間的對(duì)應(yīng)同源區(qū)可具有足以促進(jìn)在裂解的識(shí)別位點(diǎn)處發(fā)生同源重組的任何長(zhǎng)度。例如，給定同源臂和/或?qū)?yīng)靶位點(diǎn)可包含對(duì)應(yīng)同源區(qū)，所述對(duì)應(yīng)同源區(qū)為約400bp至約500bp、約500bp至約600bp、約600bp至約700bp、約700bp至約800bp、約800bp至約900bp、或約900bp至約1000bp(諸如針對(duì)本文別處所述的smalltvec載體描述的)；或至少約5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、100-200、或200-300千堿基長(zhǎng)或更長(zhǎng)(諸如本文別處所述的ltvec載體中描述的)，使得同源臂與在細(xì)胞的基因組內(nèi)的對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)具有足以經(jīng)歷同源重組的同源性。為了便于提及，同源臂在本文中指上游同源臂和下游同源臂。該術(shù)語(yǔ)涉及同源臂與插入多核苷酸在靶向載體內(nèi)的相對(duì)位置。靶向載體的同源臂因此被設(shè)計(jì)成與具有y染色體上的所靶向基因組座位或位于挑戰(zhàn)性靶基因座內(nèi)的靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)。因此，同源臂可與對(duì)于細(xì)胞為天然的基因組座位相對(duì)應(yīng)，或另選地，同源臂可與整合到y(tǒng)染色體中的異源或外源dna區(qū)段的區(qū)域相對(duì)應(yīng)，所述區(qū)域包括但不限于轉(zhuǎn)基因、表達(dá)盒、或者異源或外源基因組dna區(qū)域。另選地，靶向載體的同源臂可與酵母人工染色體(yac)、細(xì)菌人工染色體(bac)、人類(lèi)人工染色體的區(qū)域、或在適當(dāng)宿主細(xì)胞中包含的任何其他經(jīng)改造的基因組區(qū)域相對(duì)應(yīng)。更進(jìn)一步，靶向載體的同源臂可與bac文庫(kù)、粘粒文庫(kù)或p1噬菌體文庫(kù)的區(qū)域相對(duì)應(yīng)，或可衍生自bac文庫(kù)、粘粒文庫(kù)或p1噬菌體文庫(kù)的區(qū)域。因此，在具體實(shí)施例中，靶向載體的同源臂與對(duì)于以下生物為天然、異源或外源的y染色體上的基因組座位或挑戰(zhàn)性靶基因座相對(duì)應(yīng)：非人哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、人、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、兔、豬、牛、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、白鼬、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物或農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)或任何其他目標(biāo)生物體。在另外的實(shí)施例中，同源臂與細(xì)胞中這樣的基因組座位相對(duì)應(yīng)：在不存在核酸酶試劑所誘導(dǎo)的切口或雙鏈斷裂的情況下，該基因組座位無(wú)法使用常規(guī)方法靶向，或者只可不正確地靶向或只以明顯較低的效率靶向。在一個(gè)實(shí)施例中，同源臂衍生自合成dna。在其他實(shí)施例中，上游同源臂和下游同源臂對(duì)應(yīng)于與所靶向基因組相同的基因組。在一個(gè)實(shí)施例中，同源臂來(lái)自相關(guān)基因組，例如，所靶向基因組為第一品系的小鼠基因組，而靶向臂來(lái)自第二品系的小鼠基因組，其中所述第一品系與第二品系不同。在其他實(shí)施例中，同源臂來(lái)自相同動(dòng)物的基因組或來(lái)自相同品系的基因組，例如，所靶向基因組為第一品系的小鼠基因組，而靶向臂來(lái)自相同小鼠的小鼠基因組或來(lái)自相同品系的小鼠基因組。靶向載體(諸如大靶向載體)還可包含如本文別處所討論的選擇盒或報(bào)告基因。選擇盒可包含編碼選擇標(biāo)記的核酸序列，其中所述核酸序列有效連接至啟動(dòng)子。此類(lèi)啟動(dòng)子可為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、對(duì)于報(bào)告基因或細(xì)胞為內(nèi)源的啟動(dòng)子、對(duì)于報(bào)告基因或細(xì)胞為異源的啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇標(biāo)記選自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neor)、潮霉素b磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygr)、嘌呤霉素-n-乙酰轉(zhuǎn)移酶(puror)、殺稻瘟菌素s脫氨酶(bsrr)、黃嘌呤/鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)、和單純性皰疹病毒胸苷激酶(hsv-k)以及它們的組合。靶向載體的選擇標(biāo)記可側(cè)接上游同源臂和下游同源臂，或可存在于同源臂的5’或3’。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向載體(諸如大靶向載體)包含有效連接至啟動(dòng)子的報(bào)告基因，其中所述報(bào)告基因編碼報(bào)告蛋白，所述報(bào)告蛋白選自lacz、mplum、mcherry、tdtomato、mstrawberry、j-red、dsred、morange、mko、mcitrine、venus、ypet、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(eyfp)、emerald、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)、cypet、青色熒光蛋白(cfp)、cerulean、t-sapphire、熒光素酶、堿性磷酸酶以及它們的組合。此類(lèi)報(bào)告基因可有效連接至細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。此類(lèi)啟動(dòng)子可為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、對(duì)于報(bào)告基因或細(xì)胞為內(nèi)源的啟動(dòng)子、對(duì)于報(bào)告基因或細(xì)胞為異源的啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，與單獨(dú)使用靶向載體相比，聯(lián)合使用靶向載體(包括例如大靶向載體)與核酸酶試劑導(dǎo)致靶向效率提高。在一個(gè)實(shí)施例中，與單獨(dú)使用靶向載體時(shí)相比，將靶向載體與核酸酶試劑結(jié)合使用時(shí)，靶向載體的靶向效率提高至少兩倍、至少三倍、至少四倍或至少十倍。iii.大靶向載體如本文所用，術(shù)語(yǔ)“大靶向載體”或“l(fā)tvec”包括這樣的大靶向載體：其包含對(duì)應(yīng)于且衍生自比通常由意欲在細(xì)胞中執(zhí)行同源靶向的其他方法使用的那些核酸序列大的核酸序列的同源臂，并且/或者包含具有比通常由意欲在細(xì)胞中執(zhí)行同源重組靶向的其他方法使用的那些核酸序列大的核酸序列的插入多核苷酸。在具體實(shí)施例中，ltvec的同源臂和/或插入多核苷酸包含真核細(xì)胞的基因組序列。ltvec的尺寸過(guò)大，無(wú)法通過(guò)例如southern印跡和長(zhǎng)片段(例如，1kb至5kb)pcr的常規(guī)測(cè)定法來(lái)篩選靶向事件。ltvec的例子包括但不限于衍生自細(xì)菌人工染色體(bac)、人類(lèi)人工染色體或酵母人工染色體(yac)的載體。ltvec及其制備方法的非限制性例子描述于例如美國(guó)專(zhuān)利no.6,586,251、no.6,596,541、no.7,105,348和wo2002/036789(pct/us01/45375)中，這些專(zhuān)利各自以引用方式并入本文。ltvec可具有任何長(zhǎng)度，包括但不限于至少約10kb、約15kb、約20kb、約30kb、約40kb、約50kb、約60kb、約70kb、約80kb、約90kb、約100kb、約150kb、約200kb、約10kb至約15kb、約15kb至約20kb、約20kb至約30kb、約30kb至約50kb、約50kb至約300kb、約50kb至約75kb、約75kb至約100kb、約100kb至125kb、約125kb至約150kb、約150kb至約175kb、約175kb至約200kb、約200kb至約225kb、約225kb至約250kb、約250kb至約275kb、或約275kb至約300kb。在一個(gè)實(shí)施例中，ltvec包含在約5kb至約200kb、約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約30kb、約30kb至約40kb、約40kb至約50kb、約60kb至約70kb、約80kb至約90kb、約90kb至約100kb、約100kb至約110kb、約120kb至約130kb、約130kb至約140kb、約140kb至約150kb、約150kb至約160kb、約160kb至約170kb、約170kb至約180kb、約180kb至約190kb、或約190kb至約200kb、約200kb至約250kb、約250kb至約300kb、約300kb至約350kb、或約350kb至約400kb范圍內(nèi)的插入多核苷酸。在其他情況下，ltvec設(shè)計(jì)可使得允許替換如本文所述的約5kb至約200kb、或約5kb至約3.0mb的給定序列。在一個(gè)實(shí)施例中，所述替換為約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約30kb、約30kb至約40kb、約40kb至約50kb、約50kb至約60kb、約60kb至約70kb、約80kb至約90kb、約90kb至約100kb、約100kb至約110kb、約110kb至約120kb、約120kb至約130kb、約130kb至約140kb、約140kb至約150kb、約150kb至約160kb、約160kb至約170kb、約170kb至約180kb、約180kb至約190kb、約190kb至約200kb、約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、或約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb。在一個(gè)實(shí)施例中，ltvec的同源臂衍生自bac文庫(kù)、粘粒文庫(kù)或p1噬菌體文庫(kù)。在其他實(shí)施例中，同源臂衍生自細(xì)胞的所靶向基因組座位；在一些情況下，ltvec被設(shè)計(jì)用來(lái)靶向其的靶基因組座位無(wú)法使用常規(guī)方法靶向。在其他實(shí)施例中，同源臂衍生自合成dna。在一個(gè)實(shí)施例中，ltvec中的上游同源臂和下游同源臂的總和為至少10kb。在其他實(shí)施例中，上游同源臂在約5kb至約100kb的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施例中，下游同源臂在約5kb至約100kb的范圍內(nèi)。在其他實(shí)施例中，上游同源臂和下游同源臂的總和為約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約30kb、約30kb至約40kb、約40kb至約50kb、約50kb至約60kb、約60kb至約70kb、約70kb至約80kb、約80kb至約90kb、約90kb至約100kb、約100kb至約110kb、約110kb至約120kb、約120kb至約130kb、約130kb至約140kb、約140kb至約150kb、約150kb至約160kb、約160kb至約170kb、約170kb至約180kb、約180kb至約190kb、或約190kb至約200kb。在一個(gè)實(shí)施例中，所述缺失的尺寸與ltvec的5'同源臂和3'同源臂的總和的尺寸相同或相似。在一個(gè)實(shí)施例中，ltvec包含如本文別處所討論的選擇盒或報(bào)告基因。iv.通過(guò)同源重組在y染色體上的識(shí)別位點(diǎn)附近整合插入多核苷酸的方法提供了用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，(b)向該細(xì)胞中引入包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接與第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的第一同源臂和第二同源臂；以及(c)鑒定在其基因組中包含在y染色體上的靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞?？蓤?zhí)行類(lèi)似方法以靶向挑戰(zhàn)性染色體基因座。如本文別處詳細(xì)討論，在具體實(shí)施例中，靶向載體的第一同源臂和第二同源臂的總和為約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、約2kb至約3kb、約3kb至約4kb、約4kb至約5kb、約5kb至約6kb、約6kb至約7kb、約8kb至約9kb，或?yàn)橹辽?0kb或至少10kb且少于150kb。在具體實(shí)施例中，采用ltvec。在其他具體實(shí)施例中，采用smalltvec。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，執(zhí)行此類(lèi)方法，其采用促進(jìn)本文所公開(kāi)的xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基，從而生成xyf0可育雌性動(dòng)物。在其他情況下，本文所述的方法用于在sry基因中產(chǎn)生靶向遺傳修飾，如本文別處所討論。還提供了用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，(b)向該細(xì)胞中引入(i)核酸酶試劑，其中所述核酸酶試劑在第一識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和第二同源臂與位置足夠接近第一識(shí)別位點(diǎn)的第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)；以及(c)鑒定在其基因組中包含在y染色體上的靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞。可執(zhí)行類(lèi)似方法以靶向挑戰(zhàn)性靶基因座。如本文別處詳細(xì)討論，在具體實(shí)施例中，靶向載體的第一同源臂和第二同源臂的總和為約0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、約0.5kb至約1kb、約1kb至約1.5kb、約1.5kb至約2kb、約2kb至約3kb、約3kb至約4kb、約4kb至約5kb、約5kb至約6kb、約6kb至約7kb、約8kb至約9kb，或?yàn)橹辽?0kb或至少10kb且少于150kb。在具體實(shí)施例中，采用ltvec。在其他具體實(shí)施例中，采用smalltvec。在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，執(zhí)行此類(lèi)方法，其采用促進(jìn)本文所公開(kāi)的xyf0可育雌性發(fā)育的培養(yǎng)基，從而生成xyf0可育雌性動(dòng)物。在其他情況下，本文所述的方法用于在sry基因中產(chǎn)生靶向遺傳修飾，如本文別處所討論。還可采用各種方法來(lái)鑒定具有在靶基因組座位處整合的插入多核苷酸的細(xì)胞。插入多核苷酸在靶基因組座位處的插入產(chǎn)生“等位基因修飾”。術(shù)語(yǔ)“等位基因修飾”或“moa”包括對(duì)基因組中一個(gè)或多個(gè)基因或染色體基因座的一個(gè)等位基因的精確dna序列的修飾?！暗任换蛐揎?moa)”的例子包括但不限于缺失、置換或插入少至單個(gè)核苷酸，或跨一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因或染色體基因座缺失數(shù)千堿基，以及這兩個(gè)末端之間的任何以及所有可能的修飾。在各種實(shí)施例中，為了促進(jìn)對(duì)靶向修飾的鑒定，采用高通量定量測(cè)定法，也就是等位基因修飾(moa)測(cè)定法。本文所述的moa測(cè)定法允許在遺傳修飾之后大規(guī)模篩選在親本染色體中的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾等位基因。moa測(cè)定法可經(jīng)由各種分析技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于定量pcr，例如實(shí)時(shí)pcr(qpcr)。例如，實(shí)時(shí)pcr包括識(shí)別靶基因座的第一引物探針組和識(shí)別非靶向參考基因座的第二引物探針組。此外，引物探針組包含識(shí)別擴(kuò)增序列的熒光探針。定量測(cè)定法還可經(jīng)由多種分析技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于熒光介導(dǎo)原位雜交(fish)、比較基因組雜交、等溫dna擴(kuò)增、與固定探針的定量雜交、invader、mmp、分子信標(biāo)和eclipsetm探針技術(shù)。(參見(jiàn)例如us2005/0144655，該專(zhuān)利全文以引用方式并入本文)。在各種實(shí)施例中，在存在切口或雙鏈斷裂的情況下，靶向載體(諸如ltvec或smalltvec)在靶基因組座位處的靶向效率是不存在切口或雙鏈斷裂(使用例如相同的靶向載體和相同的同源臂以及在目標(biāo)基因組座位處的對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)，但不存在會(huì)造成切口或雙鏈斷裂的所添加核酸酶試劑)時(shí)的至少約2倍高、至少約3倍高、至少約4倍高。可依次地重復(fù)上述各種方法，以允許任何數(shù)量的插入多核苷酸在y染色體上的給定所靶向基因組座位中或在挑戰(zhàn)性靶基因座中靶向整合。因此，所述各種方法可以實(shí)現(xiàn)在y染色體上的靶基因組座位中或在挑戰(zhàn)性靶基因座中插入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)或更多個(gè)插入多核苷酸。在特定實(shí)施例中，此類(lèi)順序拼接方法允許將來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞或來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞(即，人、非人、嚙齒動(dòng)物、小鼠、猴、大鼠、倉(cāng)鼠、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物或農(nóng)業(yè)動(dòng)物)的大基因組區(qū)域重建到y(tǒng)染色體上的所靶向基因組座位中。在此類(lèi)情況下，包含編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩者的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)移和重建允許通過(guò)至少部分地保留在天然基因組區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的編碼區(qū)、非編碼區(qū)和拷貝數(shù)變異來(lái)保持給定區(qū)域的復(fù)雜性。因此，所述各種方法提供了例如在任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞或目標(biāo)動(dòng)物內(nèi)生成“異源”或“外源”基因組區(qū)域的方法。在一個(gè)非限制性例子中，在非人動(dòng)物內(nèi)生成了“人源化”基因組區(qū)域。還已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，除了修飾y染色體上的靶基因組座位以外，本文所公開(kāi)的各種方法和組合物還可用于在另一個(gè)染色體上生成所靶向的遺傳修飾。v.目標(biāo)多核苷酸任何目標(biāo)多核苷酸都可包含在各種插入多核苷酸中，由此在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座中整合。本文所公開(kāi)的方法提供整合到所靶向基因組座位中的至少1、2、3、4、5、6個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)多核苷酸。插入多核苷酸內(nèi)的目標(biāo)多核苷酸在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座處整合時(shí)，可將一個(gè)或多個(gè)遺傳修飾引入細(xì)胞中。所述遺傳修飾可包括缺失內(nèi)源核酸序列以及/或者將外源或異源或直系同源多核苷酸添加到靶基因組座位中。在一個(gè)實(shí)施例中，所述遺傳修飾包括在靶基因組座位處用外源目標(biāo)多核苷酸替換內(nèi)源核酸序列。因此，本文所提供的方法允許在y染色體上的靶基因組座位中生成遺傳修飾，所述遺傳修飾包括敲除、缺失、插入、替換(“敲入”)、點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)域交換、外顯子交換、內(nèi)含子交換、調(diào)控序列交換、基因交換或它們的組合。此類(lèi)修飾可在將第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或任何后續(xù)的插入多核苷酸整合到靶基因組座位中之后發(fā)生。在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在靶基因組座位處整合的目標(biāo)多核苷酸可包括對(duì)于其引入的細(xì)胞為天然或同源的序列、對(duì)于其引入的細(xì)胞可為異源的目標(biāo)多核苷酸、對(duì)于其引入的細(xì)胞可為外源的目標(biāo)多核苷酸、對(duì)于其引入的細(xì)胞可為直系同源的目標(biāo)多核苷酸，或者所述目標(biāo)多核苷酸可來(lái)自與其引入的細(xì)胞不同的物種。如本文所用，與序列有關(guān)的“同源”，是指序列對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是天然的。如本文所用，與序列有關(guān)的“異源”，是指序列來(lái)源于外來(lái)物種，而如果來(lái)源于相同物種，則通過(guò)有意人為干預(yù)，從其天然形式進(jìn)行組成和/或基因組座位方面的實(shí)質(zhì)修飾。如本文所用，與序列有關(guān)的“外源”，是指序列來(lái)源于外來(lái)物種。如本文所用，“直系同源”是指來(lái)自一種物種的多核苷酸在功能上等同于另一物種(即，物種變體)中的已知參考序列。目標(biāo)多核苷酸可來(lái)自任何目標(biāo)生物體，包括但不限于非人、嚙齒動(dòng)物、倉(cāng)鼠、小鼠、大鼠、人、猴、鳥(niǎo)類(lèi)、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物或非農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物。目標(biāo)多核苷酸還可包含編碼區(qū)、非編碼區(qū)、調(diào)控區(qū)或基因組dna。因此，第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7插入多核苷酸和/或任何后續(xù)插入多核苷酸可包含此類(lèi)序列。在一個(gè)實(shí)施例中，在插入多核苷酸內(nèi)和/或在y染色體上的靶基因組座位處整合的目標(biāo)多核苷酸與小鼠核酸序列、人核酸、非人核酸、嚙齒動(dòng)物核酸、大鼠核酸、倉(cāng)鼠核酸、猴核酸、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物核酸或非農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物核酸是同源的。在更進(jìn)一步的實(shí)施例中，在靶基因座處整合的目標(biāo)多核苷酸為基因組核酸的片段。在一個(gè)實(shí)施例中，基因組核酸為小鼠基因組核酸、人基因組核酸、非人核酸、嚙齒動(dòng)物核酸、大鼠核酸、倉(cāng)鼠核酸、猴核酸、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物核酸或非農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物核酸，或它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，如上所述，目標(biāo)多核苷酸可在約500個(gè)核苷酸至約200kb的范圍內(nèi)。目標(biāo)多核苷酸可為約500個(gè)核苷酸至約5kb、約5kb至約200kb、約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約30kb、約30kb至約40kb、約40kb至約50kb、約60kb至約70kb、約80kb至約90kb、約90kb至約100kb、約100kb至約110kb、約120kb至約130kb、約130kb至約140kb、約140kb至約150kb、約150kb至約160kb、約160kb至約170kb、約170kb至約180kb、約180kb至約190kb、或約190kb至約200kb。在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在y染色體上的靶基因組座位處或挑戰(zhàn)性靶基因座之中插入的目標(biāo)多核苷酸可編碼多肽，可編碼mirna，可編碼長(zhǎng)非編碼rna，或者可包含任何目標(biāo)調(diào)控區(qū)或非編碼區(qū)，包括例如調(diào)控序列、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)合序列，或非蛋白編碼序列的缺失，但不包含蛋白編碼序列的缺失。另外，在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座處插入的目標(biāo)多核苷酸可編碼在神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)或它們的組合中表達(dá)的蛋白。在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座處整合的目標(biāo)多核苷酸可在編碼序列中包含遺傳修飾。此類(lèi)遺傳修飾包括但不限于編碼序列的缺失突變或兩個(gè)編碼序列的融合。在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座處整合的目標(biāo)多核苷酸可包括編碼突變體蛋白的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，所述突變體蛋白的特征在于結(jié)合特性改變、定位改變、表達(dá)改變和/或表達(dá)模式改變。在一個(gè)實(shí)施例中，在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座處整合的目標(biāo)多核苷酸包含至少一個(gè)疾病等位基因。在此類(lèi)情況下，所述疾病等位基因可為顯性等位基因或隱性等位基因。此外，所述疾病等位基因可包括單核苷酸多態(tài)性(snp)等位基因。編碼突變體蛋白的目標(biāo)多核苷酸可來(lái)自任何生物體，包括但不限于編碼突變體蛋白的哺乳動(dòng)物、非人哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、人、猴、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物多核苷酸。在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座處整合的目標(biāo)多核苷酸還可包含調(diào)控序列，包括例如啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄阻遏物結(jié)合序列或轉(zhuǎn)錄終止子序列。在具體實(shí)施例中，在插入多核苷酸內(nèi)的和/或在y染色體上的靶基因組座位處或在挑戰(zhàn)性靶基因座處整合的目標(biāo)多核苷酸包含具有非蛋白編碼序列的缺失的多核苷酸，但不包含蛋白編碼序列的缺失。在一個(gè)實(shí)施例中，所述非蛋白編碼序列的缺失包括調(diào)控序列的缺失。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述調(diào)控元件的缺失包括啟動(dòng)子序列的缺失。在一個(gè)實(shí)施例中，所述調(diào)控元件的缺失包括增強(qiáng)子序列的缺失。這種目標(biāo)多核苷酸可來(lái)自任何生物體，包括但不限于編碼突變體蛋白的哺乳動(dòng)物、非人哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、人、猴、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物多核苷酸。本文所公開(kāi)的各種方法可用于在挑戰(zhàn)性基因組座位中或在y染色體基因座(諸如sry)中生成多種修飾。此類(lèi)修飾包括例如用同源或直系同源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列；內(nèi)源核酸序列的缺失；內(nèi)源核酸序列的缺失，其中所述缺失在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約600kb、約600kb至約700kb、約700kb至約800kb、約800kb至約900kb、約900kb至約1mb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb的范圍內(nèi)；外源核酸序列的插入；外源核酸序列的插入，所述插入在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、約150kb至約200kb、約200kb至約250kb、約250kb至約300kb、約300kb至約350kb、或約350kb至約400kb的范圍內(nèi)；包含同源或直系同源核酸序列的外源核酸序列的插入；包含人和非人核酸序列的嵌合核酸序列的插入；側(cè)接有位點(diǎn)特異性重組酶靶序列的條件性等位基因的插入；有效連接至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的第三啟動(dòng)子的可選標(biāo)記或報(bào)告基因的插入；或它們的組合。iii.引入序列并生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法如上文概述，本文提供了實(shí)現(xiàn)位于y染色體上的、位于挑戰(zhàn)性靶基因座處的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)多核苷酸的靶向遺傳修飾，或者sry蛋白水平和/或活性降低的方法和組合物。還已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，除了對(duì)y染色體上或挑戰(zhàn)性靶染色體基因座上的序列進(jìn)行靶向遺傳修飾以外，還可對(duì)其他染色體進(jìn)行附加的靶向遺傳修飾?？蓪?shí)現(xiàn)這些靶向遺傳修飾的此類(lèi)系統(tǒng)可采用多種組分，為了便于提及，本文中的術(shù)語(yǔ)“靶向基因組整合系統(tǒng)”通常包括整合事件所需的所有組分(即，各種核酸酶試劑、識(shí)別位點(diǎn)、插入dna多核苷酸、靶向載體、靶基因組座位和目標(biāo)多核苷酸)。本文所提供的方法包括向細(xì)胞中引入包含靶向基因組整合系統(tǒng)的各種組分的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸或多肽構(gòu)建體。“引入”意指以使得序列(多肽或多核苷酸)能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的方式將序列呈遞到細(xì)胞。本文所提供的方法并不取決于將靶向基因組整合系統(tǒng)的任何組分引入細(xì)胞中的特定方法，只要使多核苷酸能夠進(jìn)入至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部即可。用于將多核苷酸引入各種細(xì)胞類(lèi)型中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法和病毒介導(dǎo)的方法。在一些實(shí)施例中，在所述方法和組合物中采用的細(xì)胞具有穩(wěn)定地?fù)饺肫浠蚪M中的dna構(gòu)建體。“穩(wěn)定地?fù)饺搿被颉胺€(wěn)定地引入”意指將多核苷酸引入細(xì)胞中，使得核苷酸序列整合到細(xì)胞的基因組中且能夠被其子代遺傳。可使用任何方案穩(wěn)定地?fù)饺雂na構(gòu)建體或靶向基因組整合系統(tǒng)的各種組分。轉(zhuǎn)染方案以及用于將多肽或多核苷酸序列引入細(xì)胞中的方案可能有變。非限制性轉(zhuǎn)染方法包括基于化學(xué)的轉(zhuǎn)染方法，其包括使用脂質(zhì)體、納米粒子、磷酸鈣(grahametal.(1973).virology52(2):456–67(graham等人，1973年，《病毒學(xué)》，第52卷，第2期，第456–467頁(yè))，bacchettietal.(1977)procnatlacadsciusa74(4):1590–4(bacchetti等人，1977年，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》，第74卷，第4期，第1590–1594頁(yè))以及kriegler,m(1991).transferandexpression:alaboratorymanual.newyork:w.h.freemanandcompany.pp.96–97(kriegler,m，1991年，《轉(zhuǎn)移和表達(dá)：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，紐約w.h.弗里曼公司，第96–97頁(yè)))、樹(shù)狀體或陽(yáng)離子聚合物(諸如deae-葡聚糖或聚乙烯亞胺)。非化學(xué)方法包括電穿孔、聲孔效應(yīng)和光學(xué)轉(zhuǎn)染?；陬w粒的轉(zhuǎn)染包括使用基因槍、磁鐵輔助轉(zhuǎn)染(bertram,j.(2006)currentpharmaceuticalbiotechnology7,277–28(bertram,j.，2006年，《當(dāng)今藥物生物技術(shù)》，第7卷，第277–28頁(yè)))。病毒方法也可用于轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施例中，將核酸酶試劑與靶向載體、smalltvec或大靶向載體(ltvec)同時(shí)引入細(xì)胞中。另選地，在一段時(shí)間內(nèi)將核酸酶試劑與靶向載體、smalltvec或ltvec分別引入。在一個(gè)實(shí)施例中，在引入靶向載體、smalltvec或ltvec之前引入核酸酶試劑，而在其他實(shí)施例中，在引入靶向載體、smalltvec或ltvec之后引入核酸酶試劑。可采用本文所公開(kāi)的各種方法生成非人動(dòng)物。此類(lèi)方法包括：(1)采用本文所公開(kāi)的方法在非人動(dòng)物多能細(xì)胞的y染色體的靶基因組座位處整合一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)多核苷酸，以生成在y染色體的所靶向基因組座位中包含插入多核苷酸的經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞；(2)選擇在y染色體的靶基因組座位處具有一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)多核苷酸的經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞；(3)將經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞引入處于桑椹胚前期的非人動(dòng)物宿主胚胎中；以及(4)將包含經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞的宿主胚胎植入代孕母體中，以生成衍生自經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞的f0代?？刹捎妙?lèi)似方法靶向挑戰(zhàn)性靶染色體基因座。所述非人動(dòng)物可為非人哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、猴、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物、或魚(yú)類(lèi)、或禽類(lèi)。所述多能細(xì)胞可為人es細(xì)胞、非人es細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物es細(xì)胞、小鼠es細(xì)胞、大鼠es細(xì)胞、倉(cāng)鼠es細(xì)胞、猴es細(xì)胞、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物es細(xì)胞或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物es細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人多能細(xì)胞、人es細(xì)胞、人成體干細(xì)胞、發(fā)育受限的人祖細(xì)胞、人ips細(xì)胞、人細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、倉(cāng)鼠細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述靶向遺傳修飾降低sry蛋白的水平和/或活性。在此類(lèi)情況下，所述多能細(xì)胞可包括xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞。培養(yǎng)此類(lèi)細(xì)胞以促進(jìn)f0可育xy雌性動(dòng)物發(fā)育的方法在本文別處詳細(xì)描述。也可使用核移植技術(shù)生成非人哺乳動(dòng)物。簡(jiǎn)而言之，用于核移植的方法包括以下步驟：(1)將卵母細(xì)胞去核；(2)分離供體細(xì)胞或核，準(zhǔn)備與去核卵母細(xì)胞合并；(3)將所述細(xì)胞或核插入所述去核卵母細(xì)胞中，形成重建細(xì)胞；(4)將所述重建細(xì)胞植入動(dòng)物的子宮，以形成胚胎；以及(5)允許所述胚胎發(fā)育。在此類(lèi)方法中，一般從處死的動(dòng)物體內(nèi)取出卵母細(xì)胞，不過(guò)也可從活體動(dòng)物的輸卵管和/或卵巢中分離卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞可在去核之前在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種培養(yǎng)基中成熟。將卵母細(xì)胞去核可采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的多種方式執(zhí)行。將供體細(xì)胞或核插入去核卵母細(xì)胞中以形成重建細(xì)胞，通常借助在融合之前在透明帶下顯微注射供體細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。融合可通過(guò)跨接觸/融合平面施加直流電脈沖(電融合)、通過(guò)將細(xì)胞暴露于促進(jìn)融合的化學(xué)品(諸如聚乙二醇)、或借助滅活病毒(諸如仙臺(tái)病毒)來(lái)誘導(dǎo)。重建細(xì)胞通常在核供體和受體卵母細(xì)胞融合之前、期間和/或之后，通過(guò)電力方式和/或非電力方式激活。激活方法包括電脈沖、化學(xué)誘導(dǎo)沖擊、精液滲透、增加二價(jià)陽(yáng)離子在卵母細(xì)胞中的水平以及降低細(xì)胞蛋白在卵母細(xì)胞中的磷酸化(如借助激酶抑制劑)。激活的重建細(xì)胞或胚胎通常在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后移植到動(dòng)物的子宮中。參見(jiàn)例如us20080092249、wo/1999/005266a2、us20040177390、wo/2008/017234a1以及美國(guó)專(zhuān)利no.7,612,250，這些專(zhuān)利各自以引用方式并入本文。提供了用于制備在其種系中包含一個(gè)或多個(gè)如本文所述的遺傳修飾的非人動(dòng)物的其他方法，包括：(a)采用本文所述的各種方法在原核細(xì)胞中修飾非人動(dòng)物的y染色體上的所靶向基因組座位；(b)選擇在所靶向基因組座位處包含遺傳修飾的經(jīng)修飾的原核細(xì)胞；(c)從經(jīng)修飾的原核細(xì)胞的基因組分離經(jīng)遺傳修飾的靶向載體；(d)將經(jīng)遺傳修飾的靶向載體引入非人動(dòng)物的多能細(xì)胞中，以生成在y染色體上的所靶向基因組座位處包含插入核酸的經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞；(e)選擇經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞；(f)將經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞引入處于桑椹胚前期的非人動(dòng)物宿主胚胎中；以及(g)將包含經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞的宿主胚胎植入代孕母體中，以生成衍生自經(jīng)遺傳修飾的多能細(xì)胞的f0代。在此類(lèi)方法中，所述靶向載體可包括大靶向載體或smalltvec?？刹捎妙?lèi)似方法靶向挑戰(zhàn)性靶基因座。所述非人動(dòng)物可為非人哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、猴、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物。所述多能細(xì)胞可為人es細(xì)胞、非人es細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物es細(xì)胞、小鼠es細(xì)胞、大鼠es細(xì)胞、倉(cāng)鼠es細(xì)胞、猴es細(xì)胞、農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物es細(xì)胞或家養(yǎng)哺乳動(dòng)物es細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人多能細(xì)胞、人es細(xì)胞、人成體干細(xì)胞、發(fā)育受限的人祖細(xì)胞、人ips細(xì)胞、人細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、倉(cāng)鼠細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，所述靶向遺傳修飾降低sry蛋白的水平和/或活性。在此類(lèi)情況下，所述多能細(xì)胞可包括xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞。培養(yǎng)此類(lèi)細(xì)胞以促進(jìn)f0可育xy雌性動(dòng)物發(fā)育的方法在本文別處詳細(xì)描述。在另外的方法中，分離步驟(c)還包括(c1)使經(jīng)遺傳修飾的靶向載體(即，經(jīng)遺傳修飾的ltvec)線性化。在更進(jìn)一步的實(shí)施例中，引入步驟(d)還包括(d1)將如本文所述的核酸酶試劑引入多能細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇步驟(b)和/或(e)通過(guò)將如本文所述的選擇性試劑施加到所述原核細(xì)胞或所述多能細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇步驟(b)和/或(e)經(jīng)由如本文所述的等位基因修飾(moa)測(cè)定法進(jìn)行。提供了經(jīng)由在原核細(xì)胞中的細(xì)菌同源重組(bhr)來(lái)修飾動(dòng)物細(xì)胞的靶基因組座位的另外的方法，包括：(a)提供包含y染色體的靶基因組座位的原核細(xì)胞；(b)向所述原核細(xì)胞中引入包含側(cè)接有第一上游同源臂和第一下游同源臂的插入多核苷酸的靶向載體(如上所述)，其中所述插入多核苷酸包含哺乳動(dòng)物基因組區(qū)域，然后向所述原核細(xì)胞中引入在第一識(shí)別位點(diǎn)處或附近產(chǎn)生切口或雙鏈斷裂的核酸酶試劑，以及(c)選擇在所述染色體的靶基因組座位處包含插入多核苷酸的所靶向原核細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞能夠表達(dá)介導(dǎo)bhr的重組酶?？刹捎妙?lèi)似方法靶向挑戰(zhàn)性靶基因座。步驟(a)至(c)可如本文公開(kāi)的那樣連續(xù)地重復(fù)，以允許在原核細(xì)胞中的所靶向基因組座位處引入多個(gè)插入多核苷酸。一旦所靶向基因組座位用原核細(xì)胞“構(gòu)建”，則包含y染色體的經(jīng)修飾靶基因組座位的靶向載體就可從原核細(xì)胞分離并引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的y染色體的靶基因組座位中。隨后可將包含y染色體的經(jīng)修飾基因組座位的哺乳動(dòng)物細(xì)胞制成非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。提供了經(jīng)由在原核細(xì)胞中的細(xì)菌同源重組(bhr)來(lái)修飾動(dòng)物細(xì)胞的靶基因組座位的另外的方法，包括：(a)提供包含y染色體的靶基因組座位的原核細(xì)胞；(b)向所述原核細(xì)胞中引入包含側(cè)接有第一上游同源臂和第一下游同源臂的插入多核苷酸的靶向載體(如上所述)，其中所述插入多核苷酸包含哺乳動(dòng)物基因組區(qū)域，以及(c)選擇在所述染色體的靶基因組座位處包含插入多核苷酸的所靶向原核細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞能夠表達(dá)介導(dǎo)bhr的重組酶。可采用類(lèi)似方法靶向挑戰(zhàn)性靶基因座。步驟(a)至(c)可如本文公開(kāi)的那樣連續(xù)地重復(fù)，以允許在原核細(xì)胞中的所靶向基因組座位處引入多個(gè)插入多核苷酸。一旦所靶向基因組座位用原核細(xì)胞“構(gòu)建”，包含y染色體的經(jīng)修飾靶基因組座位的靶向載體就可從原核細(xì)胞分離并引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的y染色體的靶基因組座位中。隨后可將包含y染色體的經(jīng)修飾基因組座位的哺乳動(dòng)物細(xì)胞制成非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，本文所述的靶基因組座位的各種遺傳修飾可使用衍生自細(xì)菌人工染色體(bac)dna的ltvec，通過(guò)基因工程技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行一系列同源重組反應(yīng)(bhr)來(lái)實(shí)施(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利no.6,586,251以及valenzuela,d.m.etal.(2003),high-throughputengineeringofthemousegenomecoupledwithhigh-resolutionexpressionanalysis,naturebiotechnology21(6):652-659(valenzuela,d.m.等人，2003年，“與高解析度表達(dá)分析相結(jié)合的小鼠基因組的高通量工程改造”，《自然生物技術(shù)》，第21卷，第6期，第652-659頁(yè))，所述文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文)。在一些實(shí)施例中，將包含如本文所述的各種遺傳修飾的所靶向xy多能細(xì)胞和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)用作插入供體細(xì)胞，經(jīng)由方法引入來(lái)自對(duì)應(yīng)生物體的桑椹胚前期胚胎如8-細(xì)胞期小鼠胚胎中(參見(jiàn)例如us7,576,259、us7,659,442、us7,294,754和us2008-0078000a1，所有這些專(zhuān)利全文以引用方式并入本文)。將包含經(jīng)遺傳修飾的xy多能細(xì)胞和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的非人動(dòng)物胚胎孵育直至囊胚期，隨后植入代孕母體中以產(chǎn)生f0代。在一些實(shí)施例中，將包含如本文所述的各種遺傳修飾的所靶向哺乳動(dòng)物es細(xì)胞引入囊胚期胚胎中?？山?jīng)由如本文所述的等位基因修飾(moa)測(cè)定法鑒定具有y染色體的經(jīng)遺傳修飾的基因組座位的非人動(dòng)物。將衍生自經(jīng)遺傳修飾的xy多能細(xì)胞和/或全能細(xì)胞(即，xyes細(xì)胞或xyips細(xì)胞)的所得f0代非人動(dòng)物與野生型非人動(dòng)物雜交，得到f1代后代。在用特異性引物和/或探針進(jìn)行基因分型之后，使對(duì)于經(jīng)遺傳修飾的基因組座位為雜合的f1非人動(dòng)物彼此雜交，從而產(chǎn)生對(duì)于y染色體的經(jīng)遺傳修飾的基因組座位或?qū)τ诮?jīng)遺傳修飾的挑戰(zhàn)性靶基因座為純合的f2代非人動(dòng)物后代。iv.細(xì)胞與表達(dá)盒本文所述的各種方法采用細(xì)胞中對(duì)于y染色體或?qū)τ谔魬?zhàn)性靶基因座的基因組座位靶向系統(tǒng)。此類(lèi)細(xì)胞包括原核細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞，包括大腸桿菌(e.coli)；或真核細(xì)胞，諸如酵母、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、兔細(xì)胞、豬細(xì)胞、牛細(xì)胞、鹿細(xì)胞、綿羊細(xì)胞、山羊細(xì)胞、雞細(xì)胞、貓細(xì)胞、狗細(xì)胞、白鼬細(xì)胞、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，狨猴、恒河猴)細(xì)胞等，以及來(lái)自家養(yǎng)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或來(lái)自農(nóng)業(yè)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。一些細(xì)胞為非人細(xì)胞，特別是非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，對(duì)于不易獲得合適的可遺傳修飾的多能細(xì)胞的那些哺乳動(dòng)物而言，采用其他方法將體細(xì)胞重新編程為多能細(xì)胞，例如經(jīng)由向體細(xì)胞中引入多能誘導(dǎo)性因子的組合來(lái)重新編程，所述多能誘導(dǎo)性因子包括但不限于oct3/4、sox2、klf4、myc、nanog、lin28和glis1。在此類(lèi)方法中，所述細(xì)胞也可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞、非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞、非人細(xì)胞，來(lái)自嚙齒動(dòng)物、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠的細(xì)胞，成纖維細(xì)胞或任何其他宿主細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，所述細(xì)胞為多能細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞、非人胚胎干(es)細(xì)胞。此類(lèi)細(xì)胞包括多能細(xì)胞，包括例如誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞、大鼠胚胎干(es)細(xì)胞、人胚胎(es)細(xì)胞或發(fā)育受限的人祖細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物胚胎干(es)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞或大鼠胚胎干(es)細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”在本文中可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋核苷酸序列等。多核苷酸可為任選地含有合成、非天然或改變的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈的rna或dna聚合物。dna聚合物形式的多核苷酸可由cdna、基因組dna、合成dna或它們的混合物的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段構(gòu)成。多核苷酸可包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，包括天然存在的分子與合成類(lèi)似物兩者、以及這些的任意組合。本文提供的多核苷酸還涵蓋所有形式的序列，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。還提供了重組多核苷酸。術(shù)語(yǔ)“重組多核苷酸”和“重組dna構(gòu)建體”在本文中可互換使用。重組構(gòu)建體包含核酸序列的人工或異源組合，例如自然界中不共存的調(diào)控序列和編碼序列。在其他實(shí)施例中，重組構(gòu)建體可包含衍生自不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或衍生自相同來(lái)源但以與自然界中所存在的方式不同的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。這種構(gòu)建體可獨(dú)自使用，也可結(jié)合載體使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。例如，可使用質(zhì)粒載體。篩選尤其可通過(guò)dna的southern分析、mrna表達(dá)的northern分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析或表型分析來(lái)實(shí)現(xiàn)。在具體實(shí)施例中，可在表達(dá)盒中提供本文所述組分中的一者或多者，以便在多能和/或全能細(xì)胞中表達(dá)。所述盒可包含有效連接至本文所提供的多核苷酸的5'調(diào)控序列和3'調(diào)控序列?！坝行нB接”意指兩個(gè)或更多個(gè)元件之間的功能性連接。例如，目標(biāo)多核苷酸與調(diào)控序列(即，啟動(dòng)子)之間的有效連接為允許表達(dá)目標(biāo)多核苷酸的功能性連接。有效連接的元件可為鄰接的或不鄰接的。使用“有效連接”來(lái)提及兩個(gè)蛋白編碼區(qū)的連接時(shí)，意指編碼區(qū)位于同一個(gè)閱讀框中。在另一種情況下，編碼蛋白的核酸序列可有效連接至調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子序列等)以保持恰當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控。所述盒可另外包含將共同引入es細(xì)胞中的至少一個(gè)額外的目標(biāo)多核苷酸。另選地，所述額外的目標(biāo)多核苷酸可在多個(gè)表達(dá)盒上提供。這種表達(dá)盒具有多個(gè)限制位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)，以使重組多核苷酸的插入處于調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。所述表達(dá)盒可另外包含選擇標(biāo)記基因。所述表達(dá)盒在5'至3'轉(zhuǎn)錄方向上可包含在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或目標(biāo)宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即，啟動(dòng)子)、本文所提供的重組多核苷酸，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即，終止區(qū))。所述調(diào)控區(qū)(即，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū))和/或本文所提供的多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞或?qū)τ诒舜丝蔀樘烊?類(lèi)似的。另選地，所述調(diào)控區(qū)和/或本文所提供的多核苷酸對(duì)于宿主細(xì)胞或?qū)τ诒舜丝蔀楫愒吹摹＠?，有效連接至異源多核苷酸的啟動(dòng)子來(lái)自與多核苷酸來(lái)源物種不同的物種，而如果來(lái)自相同/類(lèi)似的物種，則一者或兩者從其原始形式和/或基因組座位進(jìn)行實(shí)質(zhì)修飾，或者啟動(dòng)子不是有效連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。另選地，本文所提供的調(diào)控區(qū)和/或重組多核苷酸可以是完全合成的。所述終止區(qū)對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言可為天然的，對(duì)于有效連接的重組多核苷酸而言可為天然的，對(duì)于宿主細(xì)胞而言可為天然的，或者可衍生自對(duì)于啟動(dòng)子、重組多核苷酸、宿主細(xì)胞或它們的任何組合而言為另一種的(即，外來(lái)的或異源的)來(lái)源。在制備表達(dá)盒時(shí)，可對(duì)各種dna片段進(jìn)行操縱，以便提供處于正確取向的dna序列。為此目的，可采用銜接子或接頭將dna片段連接在一起，或者可涉及其他的操縱以提供便利的限制位點(diǎn)、去除多余的dna、去除限制位點(diǎn)，等等。出于這個(gè)目的，可能涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切、退火、再置換(例如轉(zhuǎn)換和顛換)。多種啟動(dòng)子可用于本文所提供的表達(dá)盒中?？筛鶕?jù)期望的結(jié)果來(lái)選擇啟動(dòng)子。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，不同的應(yīng)用可通過(guò)在表達(dá)盒中使用不同的啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)，從而調(diào)整目標(biāo)多核苷酸表達(dá)的時(shí)機(jī)、位置和/或水平。如果需要，此類(lèi)表達(dá)構(gòu)建體還可包含啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)(例如，賦予可誘導(dǎo)的、組成型的、環(huán)境或發(fā)育調(diào)控的、或細(xì)胞或組織特異性/選擇性的表達(dá))、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna加工信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多聚腺苷酸化信號(hào)。非限制性實(shí)施例包括：1.一種體外培養(yǎng)物，包含：(a)具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的非人哺乳動(dòng)物xy胚胎干(es)細(xì)胞；以及(b)適用于在培養(yǎng)中維持非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞、包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基表現(xiàn)出以下一種或多種特征：約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓；約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或這些特征之中任何兩種或更多種的組合。2.根據(jù)實(shí)施例1所述的體外培養(yǎng)物，其中所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。3.根據(jù)實(shí)施例2所述的體外培養(yǎng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物為小鼠。4.根據(jù)實(shí)施例3所述的體外培養(yǎng)物，其中所述小鼠xyes細(xì)胞為vgf1小鼠es細(xì)胞。5.根據(jù)實(shí)施例2所述的體外培養(yǎng)物，其中所述嚙齒動(dòng)物為大鼠或倉(cāng)鼠。6.根據(jù)實(shí)施例1至5中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述sry蛋白的水平和/或活性降低源自sry基因中的遺傳修飾。7.根據(jù)實(shí)施例6所述的體外培養(yǎng)物，其中所述sry基因中的所述遺傳修飾包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、敲除、敲入、用異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列，或它們的組合。8.根據(jù)實(shí)施例1至7中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞包含一種、兩種、三種或更多種靶向遺傳修飾。9.根據(jù)實(shí)施例8所述的體外培養(yǎng)物，其中所述靶向遺傳修飾包括插入、缺失、敲除、敲入、點(diǎn)突變或它們的組合。10.根據(jù)實(shí)施例8所述的體外培養(yǎng)物，其中所述靶向遺傳修飾包括異源多核苷酸在所述xyes細(xì)胞的基因組中的至少一個(gè)插入。11.根據(jù)實(shí)施例8至10中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述靶向遺傳修飾位于常染色體上。12.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出50±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及218±22mosm/kg。13.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約3mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及218mosm/kg。14.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及261±26mosm/kg。15.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及261mosm/kg。16.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出110±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及294±29mosm/kg。17.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約6.4mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及294mosm/kg。18.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及270±27mosm/kg。19.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及270mosm/kg。20.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽、86±5mm葡萄糖以及322±32mosm/kg。21.根據(jù)實(shí)施例1至11中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉、15.5mg/ml葡萄糖以及322mosm/kg。22.根據(jù)實(shí)施例1至21中任一項(xiàng)所述的體外培養(yǎng)物，其中在將所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中并接著孕育所述宿主胚胎之后，至少80％的f0非人哺乳動(dòng)物為xy雌性，在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。23.一種用于在f0代中產(chǎn)生可育雌性xy非人哺乳動(dòng)物的方法，包括：(a)在適用于在培養(yǎng)中維持非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞、包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)具有降低sry蛋白水平和/或活性的修飾的供體非人哺乳動(dòng)物xy胚胎干(es)細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基表現(xiàn)出包括以下一者或多者的特征：約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓；約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度；和/或這些特征之中任何兩種或更多種的組合；(b)將所述供體xy非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞引入宿主胚胎中；(c)孕育所述宿主胚胎；以及(d)獲得f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物，其中在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。24.根據(jù)實(shí)施例23所述的方法，其中所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。25.根據(jù)實(shí)施例24所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物為小鼠。26.根據(jù)實(shí)施例25所述的方法，其中所述小鼠xyes細(xì)胞為vgf1小鼠es細(xì)胞。27.根據(jù)實(shí)施例24所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物為大鼠或倉(cāng)鼠。28.根據(jù)實(shí)施例23至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述sry蛋白的水平和/或活性降低源自sry基因中的遺傳修飾。29.根據(jù)實(shí)施例28所述的方法，其中所述sry基因中的所述遺傳修飾包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換、敲除、敲入、用異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列，或它們的組合。30.根據(jù)實(shí)施例23至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非人哺乳動(dòng)物es細(xì)胞包含一種、兩種、三種或更多種靶向遺傳修飾。31.根據(jù)實(shí)施例30所述的方法，其中所述靶向遺傳修飾包括插入、缺失、敲除、敲入、點(diǎn)突變或它們的組合。32.根據(jù)實(shí)施例30所述的方法，其中所述靶向遺傳修飾包括異源多核苷酸在所述xyes細(xì)胞的基因組中的至少一個(gè)插入。33.根據(jù)實(shí)施例30至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶向遺傳修飾位于常染色體上。34.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出50±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及218±22mosm/kg。35.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約3mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及218mosm/kg。36.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及261±26mosm/kg。37.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及261mosm/kg。38.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出110±5mmnacl、18±5mm碳酸鹽以及294±29mosm/kg。39.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約6.4mg/mlnacl、1.5mg/ml碳酸氫鈉以及294mosm/kg。40.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽以及270±27mosm/kg。41.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉以及270mosm/kg。42.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出87±5mmnacl、26±5mm碳酸鹽、86±5mm葡萄糖以及322±32mosm/kg。43.根據(jù)實(shí)施例23至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基表現(xiàn)出約5.1mg/mlnacl、2.2mg/ml碳酸氫鈉、15.5mg/ml葡萄糖以及322mosm/kg。44.一種在f1代中產(chǎn)生對(duì)于靶向遺傳突變?yōu)榧兒系霓D(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法，包括：(a)使所述sry蛋白的水平和/或活性降低的f0xy可育雌性與衍生自相同es細(xì)胞克隆的同齡群無(wú)性系同胞f0xy雄性非人哺乳動(dòng)物雜交，其中所述f0xy可育雌性非人哺乳動(dòng)物和所述f0xy雄性非人哺乳動(dòng)物各自對(duì)于所述遺傳突變均為雜合的；以及(b)獲得對(duì)于所述遺傳修飾為純合的f1子代小鼠。45.一種用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，(b)向所述細(xì)胞中引入(i)所述核酸酶試劑，其中所述核酸酶試劑在第一識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂與位置足夠接近第一識(shí)別位點(diǎn)的第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂的總和為至少4kb但少于150kb；以及(c)鑒定在其基因組中包含在所述靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞。46.一種用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，(b)向所述細(xì)胞中引入包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接與第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂的總和為至少4kb但少于150kb；以及(c)鑒定至少一個(gè)在其基因組中包含在所述靶基因組座位處整合的所述第一插入多核苷酸的細(xì)胞。47.根據(jù)實(shí)施例45或46所述的方法，其中所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。48.根據(jù)實(shí)施例47所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非人細(xì)胞。49.根據(jù)實(shí)施例47所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。50.根據(jù)實(shí)施例49所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物為大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠。51.根據(jù)實(shí)施例45至50中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為多能細(xì)胞。52.根據(jù)實(shí)施例45至50中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞。53.根據(jù)實(shí)施例51所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為非人胚胎干(es)細(xì)胞。54.根據(jù)實(shí)施例51所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為嚙齒動(dòng)物胚胎干(es)細(xì)胞、小鼠胚胎干(es)細(xì)胞或大鼠胚胎干(es)細(xì)胞。55.根據(jù)實(shí)施例45以及47至54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸酶試劑為編碼核酸酶的mrna。56.根據(jù)實(shí)施例45以及47至54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸酶試劑為鋅指核酸酶(zfn)。57.根據(jù)實(shí)施例45以及47至54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸酶試劑為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)。58.根據(jù)實(shí)施例45以及47至54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸酶試劑為大范圍核酸酶。59.根據(jù)實(shí)施例45以及47至54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸酶試劑為crisprrna指導(dǎo)的cas9內(nèi)切核酸酶。60.一種用于修飾y染色體的方法，包括在存在包含至少10kb核酸序列的大靶向載體(ltvec)的情況下使y染色體暴露于cas蛋白和crisprrna，其中在暴露于cas蛋白、crisprrna和ltvec后，y染色體被修飾成包含至少10kb的核酸序列。61.根據(jù)實(shí)施例60所述的方法，其中所述ltvec包含至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb或至少90kb的核酸序列。62.根據(jù)實(shí)施例60所述的方法，其中所述ltvec包含至少100kb、至少150kb或至少200kb的核酸序列。63.一種用于修飾y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述靶基因組座位包含向?qū)na(grna)靶序列；(b)向該哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入：(i)包含第一核酸的大靶向載體(ltvec)，所述第一核酸側(cè)接有與靶基因組座位同源的靶向臂，其中所述ltvec為至少10kb；(ii)包含第一啟動(dòng)子的第一表達(dá)構(gòu)建體，所述第一啟動(dòng)子有效連接至編碼cas蛋白的第二核酸，以及(iii)包含第二啟動(dòng)子的第二表達(dá)構(gòu)建體，所述第二啟動(dòng)子有效連接至編碼向?qū)na(grna)的第三核酸，所述向?qū)na包含雜交至grna靶序列和反式激活crisprrna(tracrrna)的核苷酸序列，其中所述第一啟動(dòng)子和所述第二啟動(dòng)子在該哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性；以及(c)鑒定在y染色體上的靶基因組座位處包含靶向遺傳修飾的經(jīng)修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。64.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述ltvec為至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb、至少50kb、至少60kb、至少70kb、至少80kb或至少90kb。65.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述ltvec為至少100kb、至少150kb或至少200kb。66.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞。67.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。68.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。69.根據(jù)實(shí)施例68所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物為大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠。70.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為多能細(xì)胞。71.根據(jù)實(shí)施例70所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞。72.根據(jù)實(shí)施例70所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為小鼠胚胎干(es)細(xì)胞或大鼠胚胎干(es)細(xì)胞。73.根據(jù)實(shí)施例70所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為發(fā)育受限的人祖細(xì)胞。74.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述cas蛋白為cas9蛋白。75.根據(jù)實(shí)施例74所述的方法，其中所述grna靶序列緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。76.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述ltvec的5’同源臂和3’同源臂的總和為約10kb至約150kb。77.根據(jù)實(shí)施例76所述的方法，其中所述ltvec的5’同源臂和3’同源臂的總和為約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約120kb、或約120kb至150kb。78.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述靶向遺傳修飾包括：(a)用同源或直系同源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列；(b)內(nèi)源核酸序列的缺失；(c)內(nèi)源核酸序列的缺失，其中所述缺失在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、或約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb的范圍內(nèi)；(d)外源核酸序列的插入；(e)外源核酸序列的插入，所述插入在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、約150kb至約200kb、約200kb至約250kb、約250kb至約300kb、約300kb至約350kb、或約350kb至約400kb的范圍內(nèi)；(f)包含同源或直系同源核酸序列的外源核酸序列的插入；(g)包含人和非人核酸序列的嵌合核酸序列的插入；(h)側(cè)接有位點(diǎn)特異性重組酶靶序列的條件性等位基因的插入；(i)有效連接至在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的第三啟動(dòng)子的可選標(biāo)記或報(bào)告基因的插入；或(j)它們的組合。79.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述靶基因組座位包含(i)與5’同源臂同源的5’靶序列，以及(ii)與3’同源臂同源的3’靶序列。80.根據(jù)實(shí)施例79所述的方法，其中所述5’靶序列和所述3’靶序列相隔至少5kb但少于3mb。81.根據(jù)實(shí)施例79所述的方法，其中所述5’靶序列和所述3’靶序列相隔至少5kb但少于10kb、至少10kb但少于20kb、至少20kb但少于40kb、至少40kb但少于60kb、至少60kb但少于80kb、至少約80kb但少于100kb、至少100kb但少于150kb、或至少150kb但少于200kb、至少約200kb但少于約300kb、至少約300kb但少于約400kb、至少約400kb但少于約500kb、至少約500kb但少于約1mb、至少約1mb但少于約1.5mb、至少約1.5mb但少于約2mb、至少約2mb但少于約2.5mb、或至少約2.5mb但少于約3mb。82.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述第一表達(dá)構(gòu)建體和所述第二表達(dá)構(gòu)建體位于單個(gè)核酸分子上。83.根據(jù)實(shí)施例63所述的方法，其中所述靶基因組座位包括所述sry基因座。84.一種用于非人動(dòng)物y染色體上的靶向遺傳修飾的方法，包括：(a)根據(jù)實(shí)施例4所述的方法修飾非人多能細(xì)胞的y染色體上的目標(biāo)基因組座位，從而產(chǎn)生在y染色體上包含靶向遺傳修飾的經(jīng)遺傳修飾的非人多能細(xì)胞；(b)將(a)的所述經(jīng)修飾的非人多能細(xì)胞引入非人宿主胚胎中；以及(c)在代孕母體中孕育包含所述經(jīng)修飾的多能細(xì)胞的所述非人宿主胚胎，其中所述代孕母體產(chǎn)生包含所述靶向遺傳修飾的f0子代，其中所述靶向遺傳修飾能夠通過(guò)種系傳遞。85.根據(jù)實(shí)施例84所述的方法，其中所述目標(biāo)基因組座位包括所述sry基因座。86.一種用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含靶基因組座位的細(xì)胞，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，(b)向所述細(xì)胞中引入(i)所述核酸酶試劑，其中所述核酸酶試劑在第一識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂；和(ii)包含第一插入多核苷酸的第一靶向載體，所述第一插入多核苷酸側(cè)接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂與位置足夠接近第一識(shí)別位點(diǎn)的第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，其中所述第一同源臂和/或所述第二同源臂的長(zhǎng)度為至少400bp但少于1000bp；以及(c)鑒定在其基因組中包含在所述靶基因組座位處整合的第一插入多核苷酸的至少一個(gè)細(xì)胞。87.根據(jù)實(shí)施例86所述的方法，其中所述第一同源臂和/或所述第二同源臂的長(zhǎng)度為約700bp至約800bp。88.根據(jù)實(shí)施例86所述的方法，其中所述修飾包括內(nèi)源核酸序列的缺失。89.根據(jù)實(shí)施例88所述的方法，其中所述缺失在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、或約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb的范圍內(nèi)。90.根據(jù)實(shí)施例88所述的方法，其中所述缺失為至少500kb。本發(fā)明的方法和組合物可按許多不同的形式實(shí)施，并且不應(yīng)理解為局限于本文所給出的實(shí)施例；相反，提供這些實(shí)施例是為了使得本公開(kāi)滿足適用的法律要求。全文中類(lèi)似的數(shù)字指代類(lèi)似的要素。本文所述方法和組合物所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在獲得以上說(shuō)明和相關(guān)的附圖中給出的教導(dǎo)的益處后，可以想到這些方法和組合物的許多修改形式和其他實(shí)施例。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所述方法和組合物并不局限于所公開(kāi)的具體實(shí)施例，并且這些修改形式和其他實(shí)施例也包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。盡管本文采用了專(zhuān)用術(shù)語(yǔ)，但是這些術(shù)語(yǔ)只以一般的說(shuō)明性意義使用，而非用于限制。以下實(shí)例是以說(shuō)明性方式而非限制性方式提供的。實(shí)例實(shí)例1.在talen或crispr協(xié)助下靶向y染色體基因sry使用靶向載體形成包含sry的lacz替換等位基因的靶向缺失，該靶向載體依次包含大約700bp的上游同源臂；β-半乳糖苷酶編碼序列(lacz)后接多聚腺苷酸化信號(hào)；側(cè)接包含人泛素c啟動(dòng)子的loxp位點(diǎn)的新霉素抗性盒，其包含第一外顯子、第一內(nèi)含子及部分第二外顯子、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列和多聚腺苷酸化信號(hào)；以及大約650bp的下游同源臂。使用靶向載體正確靶向sry基因所形成的等位基因，包含大約1kbsry開(kāi)放閱讀框的缺失以及用lacz-neo盒進(jìn)行的替換，使得β-半乳糖苷酶編碼序列在sry起始密碼子處框內(nèi)融合。使用靶向載體來(lái)靶向vgb6(亦稱(chēng)b6a6)c57bl/6和vgf1(亦稱(chēng)f1h4)c57bl6/129f1雜交es細(xì)胞系中的sry基因。vgf1(f1h4)小鼠es細(xì)胞來(lái)源于通過(guò)使雌性c57bl/6ntac小鼠與雄性129s6/svevtac小鼠雜交而產(chǎn)生的雜交胚胎。因此，vgf1es細(xì)胞包含來(lái)自129s6/svevtac小鼠的y染色體。由vgf1細(xì)胞系產(chǎn)生的雌性xy小鼠包含來(lái)源于129s6/svevtac小鼠的y染色體。實(shí)例2.y染色體基因sry中的talen或crispr誘導(dǎo)突變?cè)趖alen或crispr向?qū)na與cas9dna內(nèi)切核酸酶聯(lián)合作用下，在sry基因中形成在3bp至1.2kb及更大的范圍內(nèi)的缺失突變，這大概是雙鏈dna斷裂的非同源性末端接合(nhej)修復(fù)的結(jié)果(參見(jiàn)圖1)。在sry基因中包含talen誘導(dǎo)突變和crispr誘導(dǎo)突變的es細(xì)胞還攜帶了nihkomp項(xiàng)目vg12778ltvec(可經(jīng)由互聯(lián)網(wǎng)在萬(wàn)維網(wǎng)(www)上以u(píng)rl“velocigene.com/komp/detail/12778”獲取)的隨機(jī)轉(zhuǎn)基因插入，其包括sry編碼序列的缺失，以及用包含lacz的插入盒進(jìn)行的替換，所述lacz與sry起始密碼子和新霉素抗性基因框內(nèi)融合，所述新霉素抗性基因側(cè)接38kb同源臂和37kb同源臂并基于來(lái)自bmq文庫(kù)的bac(129s7/svevbrd-hprtb-m2)。ltvec在其同源臂中包含用于sry表達(dá)的所有已知控制元件。其lacz編碼的β-半乳糖苷酶充當(dāng)sry基因的組織特異性和發(fā)育階段特異性表達(dá)的報(bào)告子。在vgb6(亦稱(chēng)b6a6)和vgf1(亦稱(chēng)f1h4)es細(xì)胞系兩者中均形成了伴隨ltvec插入的talen誘導(dǎo)突變和crispr誘導(dǎo)突變。我們獲得了talen(talen-1)，其被設(shè)計(jì)成靶向sry基因中的部分hmg框dna結(jié)合基序編碼序列(上游識(shí)別序列：5'-tcccgtggtgagaggcac-3'；下游識(shí)別序列：5'-tattttgcatgctgggat-3')。在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中，talen-1都在sry基因座處有效形成了nhej突變。vgb6和vgf1小鼠es細(xì)胞均形成有talen誘導(dǎo)突變。表1包含所有克隆及其攜帶的缺失突變的尺寸的列表。(表1中的nd指示通過(guò)qpcr測(cè)定法檢測(cè)到突變，但尚未確定該突變的確切分子性質(zhì)。)所有克隆也攜帶至少一個(gè)拷貝的nihkomp項(xiàng)目vg12778ltvec。表1*還包含50bp插入sry突變體克隆的顯微注射結(jié)果示于表2中，而性逆轉(zhuǎn)雌性的繁育結(jié)果示于表3中。表2表3*必須在產(chǎn)前對(duì)xy雌性id#1460406實(shí)施安樂(lè)死，因?yàn)槠溆薪阍挛Ｏ?，無(wú)法分娩。通過(guò)解剖取出其死亡幼仔(4只雄性，5只雌性)，任何一只幼仔均未攜帶sry突變。所有來(lái)源于vgb6es細(xì)胞的帶有sry突變的velocimice均為雌性，正如對(duì)sry失活所預(yù)料的那樣(表2)。那些不帶有sry突變但攜帶至少一個(gè)拷貝的nihkompvg12778ltvec的克隆僅產(chǎn)生雄性velocimice(表2，克隆gb4和gg1)。當(dāng)對(duì)17只sry突變體雌性b6velocimice進(jìn)行測(cè)交時(shí)，在繁育啟動(dòng)約四個(gè)月后僅一只受孕(表3)，并且必須在產(chǎn)前對(duì)該雌性實(shí)施安樂(lè)死，因?yàn)槠溆薪阍挛Ｏ?，無(wú)法分娩。通過(guò)解剖取出的其死亡幼仔(4只雄性，5只雌性)全為野生型，任何一只幼仔均未攜帶sry突變。得出如下結(jié)論：幾乎所有由vgb6es細(xì)胞形成的sry突變體小鼠都是不育的，這與有關(guān)sry突變的文獻(xiàn)一致。然而，我們的數(shù)據(jù)顯示用vgf1克隆得出了迥然不同的結(jié)果。首先，像往常一樣，在我們的ko-dmem樣低滲透壓強(qiáng)度生長(zhǎng)培養(yǎng)基中維持vgf1es細(xì)胞，該培養(yǎng)基具有雌性化作用：在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的一些經(jīng)顯微注射的xy克隆將產(chǎn)生可育xy雌性，即xy雌性現(xiàn)象，即便它們并未攜帶突變也是如此。一個(gè)例子是克隆th4，其不具有sry突變但攜帶至少一個(gè)拷貝的nihkompvg12778ltvec。該克隆產(chǎn)生2只雌性和6只雄性velocimice(表2)。另兩個(gè)不帶有sry突變的vgf1克隆(ta3和ta4，表2)僅產(chǎn)生雄性velocimice。我們希望確定在sry中具有突變的vgf1xyes細(xì)胞是否也可能通過(guò)該培養(yǎng)基進(jìn)行雌性化。換句話講，它們是否與vgb6sry突變體es細(xì)胞不同，會(huì)產(chǎn)生一些可育xysry突變體雌性？(應(yīng)當(dāng)注意，vgb6es細(xì)胞無(wú)法在ko-dmem樣低滲透壓強(qiáng)度培養(yǎng)基中維持并保留產(chǎn)生小鼠的能力。)答案是肯定的，如表3中所示。顯微注射了六個(gè)vgf1es細(xì)胞克隆，這些克隆具有5bp至超過(guò)1kb范圍內(nèi)的talen誘導(dǎo)的小段缺失。所有克隆都產(chǎn)生了雌性velocimice，讓其中32只交配。結(jié)果引人注目，所有sry突變體xy雌性velocimice都是可育的；每只至少產(chǎn)下一窩幼仔(表3)。許多sry突變體xy雌性產(chǎn)下幼仔數(shù)正常的多窩幼仔，而一些xy雌性?xún)H產(chǎn)下幼仔數(shù)較少的一窩或兩窩幼仔。在由這些繁育操作得到的經(jīng)過(guò)基因分型的299只f1小鼠之中，大約一半(146只，49％)是正常的xy雄性或正常的xx雌性。174只(58％)f1小鼠為表型雌性，而125只(42％)為表型雄性。26只雌性(雌性中的15％，總f1代中的8.7％)為遺傳了突變體sry等位基因的xy雌性。由于與xy卵母細(xì)胞相關(guān)的減數(shù)分裂不分離事件，在sry突變體xy雌性velocimice的f1子代中觀察到許多異常的基因型-xxy、xyy、xo、xxyy-其中一些包含突變體sry等位基因。已發(fā)現(xiàn)了由xyes細(xì)胞有效形成可育xy雌性velocimice的方法。如果在es細(xì)胞中形成sry基因中的失活性突變而這些es細(xì)胞一直維持在雌性化生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，則得到高比例的可育xy雌性小鼠，這些小鼠在與雄性交配時(shí)產(chǎn)下大多數(shù)具有正常的x染色體和y染色體的雄性小鼠和雌性小鼠。實(shí)例3.在y染色體sry基因中的talen誘導(dǎo)突變后在ko-dmem或dmem中進(jìn)行胚胎回收通過(guò)對(duì)來(lái)源于f0雌性(其為xy且攜帶sry突變)的f1后代進(jìn)行基因分型，確認(rèn)或否定ltvec已正確地靶向小鼠sry。f1小鼠中l(wèi)acz/neo盒與sry突變的共分離(如通過(guò)sryloa測(cè)定法評(píng)估)非常明確地提示靶向正確。lacz/neo未能與該突變共分離則指示初始克隆包含sry缺失突變(由talen誘導(dǎo))，外加基因組中別處的lacz/neo轉(zhuǎn)基因插入。來(lái)自帶有sry突變的xy雌性的后代高頻率地表現(xiàn)出多種異常核型(包括xxy、xyy和xo)。通過(guò)對(duì)x染色體和y染色體上的基因使用不相關(guān)等位基因丟失(loa)測(cè)定法，來(lái)評(píng)估性染色體計(jì)數(shù)。然后使用loa測(cè)定法確定sry的拷貝數(shù)。推斷在y染色體拷貝數(shù)超過(guò)sry拷貝數(shù)(例如，1個(gè)拷貝的y和0個(gè)拷貝的sry，或2個(gè)拷貝的y和1個(gè)拷貝的sry)的小鼠中存在突變體sry等位基因。最后使用taqman測(cè)定法確定是否存在lacz和neo。在初始組克隆(由sryltvec與talen核酸酶一起形成并在ko-dmem中生長(zhǎng))中，明顯的是，lacz/neo盒未與sry突變共分離。來(lái)自這些克隆的樣本窩仔示于表4中。表4：由sryltvec與talen核酸酶一起生成的克隆的篩選在后續(xù)組克隆(由sryltvec與talen核酸酶一起形成并在dmem中生長(zhǎng))中，lacz/neo盒完全與sry突變共分離，表明靶向正確。來(lái)自這些克隆的典型窩仔示于表5中。表5：由sryltvec與talen核酸酶一起形成的克隆的篩選結(jié)果實(shí)例4：在talen和crispr協(xié)助下smalltvec或ltvec對(duì)sry的靶向如圖2所示，一起使用ltvec或小靶向載體(smalltvec)與talen核酸酶或crispr向?qū)na，并聯(lián)合cas9dna內(nèi)切核酸酶來(lái)形成包含sry的lacz替換等位基因的靶向缺失。smalltvec依次包含大約700至800bp的上游同源臂；β-半乳糖苷酶編碼序列(lacz)后接多聚腺苷酸化信號(hào)；側(cè)接包含人泛素c啟動(dòng)子的loxp位點(diǎn)的新霉素抗性盒，其包含第一外顯子、第一內(nèi)含子及部分第二外顯子、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列和多聚腺苷酸化信號(hào)；以及大約700至800bp的下游同源臂。使用靶向載體正確靶向sry基因所形成的等位基因，包含大約1kbsry開(kāi)放閱讀框的缺失以及用lacz-neo盒進(jìn)行的替換，使得β-半乳糖苷酶編碼序列在sry起始密碼子處框內(nèi)融合。使用靶向載體來(lái)靶向vgf1(亦稱(chēng)f1h4)c57bl6/129f1雜交es細(xì)胞系中及vgb6es細(xì)胞系(亦稱(chēng)b6a6)中的sry基因。如表6中所示，產(chǎn)生了使用四個(gè)不同grna和一個(gè)talen對(duì)而產(chǎn)生的克隆，并通過(guò)taqman測(cè)定法針對(duì)裂解和等位基因丟失進(jìn)行篩選。表6：裂解和等位基因丟失的篩選結(jié)果ltvec轉(zhuǎn)基因克隆產(chǎn)生了具有相同lacz模式的胚胎。圖3示出了胚胎中的lacz表達(dá)。表7報(bào)告了來(lái)源于生長(zhǎng)在常規(guī)dmem類(lèi)培養(yǎng)基中的es細(xì)胞的xy雌性的可育性結(jié)果，這些es細(xì)胞具有在talen協(xié)助下對(duì)sry的ltvec靶向缺失-替換突變。與采用生長(zhǎng)在ko-demem類(lèi)培養(yǎng)基中的es細(xì)胞進(jìn)行的類(lèi)似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(表3)相比，我們意外地發(fā)現(xiàn)，dmem類(lèi)培養(yǎng)基中的ltvec靶向產(chǎn)生了具有正確靶向的sry缺失和lacz-neo插入的克隆。來(lái)源于四個(gè)靶向克隆的41只xysry(lacz)雌性之中有四十只在交配后產(chǎn)下了活產(chǎn)幼仔-可育率為98％。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了由突變體es細(xì)胞產(chǎn)生高度可育xy雌性的兩種新方法：(1)使生長(zhǎng)在ko-dmem類(lèi)培養(yǎng)基中的es細(xì)胞發(fā)生sry中的talen誘導(dǎo)失活性突變；以及(2)使生長(zhǎng)在dmem類(lèi)培養(yǎng)基中的es細(xì)胞中發(fā)生talen協(xié)助的ltvec靶向精確缺失-替換突變。表7：srytalen突變體xy雌性的產(chǎn)生實(shí)例5：由zfn介導(dǎo)的y染色體上的大段缺失如圖4中所示，使用zfn靶向kdm5d和usp9y基因，在y染色體上產(chǎn)生大段缺失(500kb或更大)。表8提供了y染色體上的鋅指序列的例子。表8：y染色體上的鋅指序列在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用zfnmrna對(duì)kdm5d-zfn5(nm011419-r17347a1)/zfn6(nm011419-17353a1)和usp9y-zfn3(nm148943-r11830a1)/zfn4(nm148943-11836a1)(各10μg)并使用靶向ch25h基因的ltvec(0.67μg)，對(duì)來(lái)自vgb6克隆d-g5和e-g7(表3)的330萬(wàn)個(gè)es細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，從而提供對(duì)嘌呤霉素抗性的選擇。挑取嘌呤霉素抗性集落，針對(duì)缺失進(jìn)行篩選。結(jié)果示于表9中。表9：12778d-g5和12778e-g7中的大段y染色體缺失的篩選結(jié)果親本克隆嘌呤霉素抗性集落數(shù)篩選的集落數(shù)確認(rèn)的缺失克隆數(shù)12778d-g5244192412778e-g76383848表10示出了大于500kb缺失的確切尺寸，這些尺寸針對(duì)來(lái)源于e-g7親本克隆(表3)的一個(gè)缺失克隆(4306a-d5)以及來(lái)源于d-g5親本克隆(表3)的兩個(gè)缺失克隆(4306e-c4和4306f-a12)進(jìn)行精確確定。表10：zfn介導(dǎo)的kdm5d和usp9y缺失克隆y染色體上的缺失坐標(biāo)尺寸(bp)4306a-d5250569-7854045348354306e-c4520363-7854025350394306f-a12250373-785404535031kdm5d、eif2s3y、uty、ddx3y和usp9y基因的缺失(圖4)在缺失等位基因丟失測(cè)定法及如圖5中所示的dna測(cè)序中進(jìn)行確認(rèn)。克隆4306a-d5在顯微注射到8-細(xì)胞期胚胎中并移植進(jìn)代孕母體之后，產(chǎn)生了九只xy雌性全es細(xì)胞來(lái)源的velocimice。來(lái)自克隆4306a-d5的xy雌性均不可育。實(shí)例6：由crispr/cas介導(dǎo)的y染色體上的大段缺失聯(lián)合利用crispr向?qū)na和cas9dna內(nèi)切核酸酶，來(lái)形成靶向kdm5d基因與usp9y基因之間的區(qū)域的y染色體上的大段缺失。grna被設(shè)計(jì)成靶向kdm5d基因和usp9y基因。以下grna被設(shè)計(jì)成靶向kdm5d：kdm5dga(向?qū)?1)uuugccgaauaugcucucgu(seqidno:66)；kdm5dgb(向?qū)?2)uugccgaauaugcucucgug(seqidno:67)；以及kdm5dgc(向?qū)?5)cgggcaucuccauacucccu(seqidno:68)。以下grna被設(shè)計(jì)成靶向usp9y：usp9yga(向?qū)?1)uagcucguuguguagcaccu(seqidno:69)；usp9ygb(向?qū)?1)uauaguuucuucgggguaac(seqidno:70)；以及usp9ygc(向?qū)?2)ggauacccuucuauaggccc(seqidno:71)。使用5μg表達(dá)cas9的質(zhì)粒及各10μg表達(dá)kdm5dgrnab和usp9ygrnac的質(zhì)粒并使用靶向ch25h基因的ltvec(0.67μg)，對(duì)vgf1小鼠es細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，從而提供對(duì)嘌呤霉素抗性的選擇。如圖4中所示，使用kdm5dgb(grnab)和usp9ygc(grnac)來(lái)靶向kdm5d基因和usp9y基因的缺失。通過(guò)對(duì)kdm5d基因、usp9y基因、這兩者間的基因(eif2s3y、uty和ddx3y)以及靶向缺失外部的基因(zfy2和sry)的序列執(zhí)行等位基因丟失測(cè)定法，來(lái)篩選所得克隆的缺失。如表11中所示，獲得了包含大段缺失的四個(gè)克隆?？寺-a8在顯微注射到8-細(xì)胞期胚胎中并移植進(jìn)代孕母體之后，產(chǎn)生了七只xy雄性和3只xy雌性全es細(xì)胞來(lái)源的velocimice。表11：taqman測(cè)定法確認(rèn)由crispr向?qū)na和cas9介導(dǎo)的大段缺失本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)都表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)均以引用方式并入本文，其程度就如同每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體且單獨(dú)地指明以引用方式并入。如果與引用相關(guān)的信息諸如保藏號(hào)隨時(shí)間而變化，則指的是在本申請(qǐng)的有效提交日期時(shí)生效的信息版本，所述有效提交日期意指實(shí)際提交日期或首先提供該引用的優(yōu)先申請(qǐng)的日期。本發(fā)明的方面、步驟或特征可與任何其他方面、步驟或特征組合使用，除非從任何實(shí)施例的上下文可以明顯看出不是這樣。對(duì)范圍的提及包括該范圍內(nèi)的任何整數(shù)、該范圍內(nèi)的任何子范圍。對(duì)多個(gè)范圍的提及包括此類(lèi)范圍的組合。權(quán)利要求書(shū)(按照條約第19條的修改)1.一種用于制備能夠在f0代中產(chǎn)生可育xy雌性非人哺乳動(dòng)物的非人哺乳動(dòng)物xy胚胎干(es)細(xì)胞系的方法，包括：(a)修飾非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞，以包含降低sry蛋白的水平和/或活性的修飾；以及(b)在一定條件下培養(yǎng)所述經(jīng)修飾的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞，所述條件允許制備能夠在f0代中產(chǎn)生可育xy雌性非人哺乳動(dòng)物的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括：(c)將所述經(jīng)修飾的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中；(d)孕育所述宿主胚胎；以及(e)獲得f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物，其中在達(dá)到性成熟后，所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物是可育的。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物為小鼠或大鼠。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞為來(lái)自129品系或c57bl/6品系的小鼠xyes細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述小鼠xyes細(xì)胞包含來(lái)源于所述129品系的y染色體。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述小鼠xyes細(xì)胞為vgf1小鼠es細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中sry蛋白的水平和/或活性降低由包含sry基因的基因組座位處的靶向遺傳修飾引起。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中sry基因中的所述遺傳修飾包括：(i)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入；(ii)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失；(iii)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換；(iv)敲除；(v)敲入；(vi)用同源、直系同源或異源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列；(vii)點(diǎn)突變；(viii)可選標(biāo)記和/或報(bào)告基因的插入，所述可選標(biāo)記和/或報(bào)告基因有效連接至在所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子；以及(ix)報(bào)告基因的插入，所述報(bào)告基因有效連接至內(nèi)源sry啟動(dòng)子，任選其中所述報(bào)告基因編碼報(bào)告蛋白lacz。10.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞在所述y染色體上包含靶基因組座位，所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)，其中所述靶基因組座位為sry基因，并且其中修飾步驟(a)包括：(i)向所述非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞中引入：(a)所述核酸酶試劑，其中所述核酸酶試劑在所述識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂；和(b)包含插入多核苷酸的靶向載體，所述插入多核苷酸側(cè)接第一同源臂和第二同源臂，所述第一同源臂和所述第二同源臂與位置足夠接近所述識(shí)別位點(diǎn)的第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)；以及(ii)鑒定在其基因組中包含在所述靶基因組座位處整合的所述插入多核苷酸的經(jīng)修飾非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述核酸酶試劑為編碼核酸酶的mrna。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述核酸酶試劑為：(a)鋅指核酸酶(zfn)；(b)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)；(c)大范圍核酸酶；或(d)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(cas)蛋白和向?qū)na(grna)。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸酶試劑為所述cas蛋白和所述grna，其中所述cas蛋白為cas9，并且其中所述grna包含：(a)靶向所述第一識(shí)別位點(diǎn)的crisprrna(crrna)，其中所述識(shí)別位點(diǎn)緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列；和(b)反式激活crisprrna(tracrrna)。14.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)向所述細(xì)胞中引入降低sry蛋白的水平和/或活性的多核苷酸，來(lái)降低sry蛋白的水平和/或活性，其中所述多核苷酸阻止srymrna的翻譯、編碼抑制sry基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的多肽，或編碼抑制sry蛋白的活性的多肽。15.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞包含降低sry蛋白的活性和/或水平的條件性sry等位基因。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括在適用于在培養(yǎng)中維持所述經(jīng)修飾的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞、包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)充物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述經(jīng)修飾的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基為表現(xiàn)出約200mosm/kg至小于約329mosm/kg的滲透壓的低滲透壓培養(yǎng)基。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述低滲透壓培養(yǎng)基表現(xiàn)出以下一種或多種特征：(i)約11ms/cm至約13ms/cm的電導(dǎo)率；(ii)約50mm至約110mm的堿金屬鹵化物鹽濃度；(iii)約17mm至約30mm的碳酸鹽濃度；以及(iv)約85mm至約130mm的堿金屬鹵化物鹽和碳酸鹽總濃度。18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中在將所述經(jīng)修飾的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞引入宿主胚胎中并接著孕育所述宿主胚胎之后，至少80％的所述f0非人哺乳動(dòng)物為xy雌性，在達(dá)到性成熟后，所述xy雌性是可育的。19.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述f0xy雌性非人哺乳動(dòng)物為小鼠，并且在與野生型小鼠雜交時(shí)是可育的。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述野生型小鼠為c57bl/6小鼠。21.一種體外培養(yǎng)物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的非人哺乳動(dòng)物xyes細(xì)胞系。22.一種在f1代中產(chǎn)生對(duì)于靶向遺傳突變?yōu)榧兒系霓D(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法，包括：(a)使sry蛋白的水平和/或活性降低的f0xy可育雌性非人哺乳動(dòng)物與衍生自相同es細(xì)胞克隆的f0xy雄性非人哺乳動(dòng)物同齡群無(wú)性系同胞雜交，其中所述f0xy可育雌性非人哺乳動(dòng)物和所述f0xy雄性非人哺乳動(dòng)物各自對(duì)于所述遺傳突變均為雜合的；以及(b)獲得對(duì)于所述遺傳修飾為純合的f1子代非人哺乳動(dòng)物。23.一種用于修飾細(xì)胞中y染色體上的靶基因組座位的方法，包括：(a)提供在y染色體上包含所述靶基因組座位的細(xì)胞，其中所述靶基因組座位包含核酸酶試劑的識(shí)別位點(diǎn)；(b)向所述細(xì)胞中引入包含插入多核苷酸的靶向載體，所述插入多核苷酸側(cè)接與第一靶位點(diǎn)和第二靶位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的第一同源臂和第二同源臂；以及(c)鑒定至少一個(gè)在其基因組中包含在所述靶基因組座位處整合的所述插入多核苷酸的細(xì)胞。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中步驟(b)還包括向所述細(xì)胞中引入所述核酸酶試劑，其中所述核酸酶試劑在所述識(shí)別位點(diǎn)處誘導(dǎo)切口或雙鏈斷裂，其中所述第一靶位點(diǎn)和所述第二靶位點(diǎn)的位置足夠接近所述識(shí)別位點(diǎn)。25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂的總和為至少4kb但少于150kb。26.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述第一同源臂和所述第二同源臂的總和為至少10kb。27.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述第一同源臂和/或所述第二同源臂的長(zhǎng)度為至少400bp但少于1000bp。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述第一同源臂和/或所述第二同源臂的長(zhǎng)度為約700bp至約800bp。29.根據(jù)權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非人細(xì)胞。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自嚙齒動(dòng)物。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述嚙齒動(dòng)物為大鼠、小鼠或倉(cāng)鼠。33.根據(jù)權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為多能細(xì)胞。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干(ips)細(xì)胞或非人胚胎干(es)細(xì)胞。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為嚙齒動(dòng)物胚胎干(es)細(xì)胞、小鼠es細(xì)胞或大鼠es細(xì)胞。36.根據(jù)權(quán)利要求23至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸酶試劑為編碼核酸酶的mrna。37.根據(jù)權(quán)利要求23至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸酶試劑為：(a)鋅指核酸酶(zfn)；(b)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)；(c)大范圍核酸酶；或(d)成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)相關(guān)(cas)蛋白和向?qū)na(grna)。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述核酸酶試劑為所述cas蛋白和所述grna，其中所述cas蛋白為cas9，并且其中所述grna包含：(a)靶向所述第一識(shí)別位點(diǎn)的crisprrna(crrna)，其中所述識(shí)別位點(diǎn)緊鄰地側(cè)接前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列；和(b)反式激活crisprrna(tracrrna)。39.根據(jù)權(quán)利要求23至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述插入多核苷酸的長(zhǎng)度為約5kb至約200kb、約200kb至約250kb、約250kb至約300kb、約300kb至約350kb、或約350kb至約400kb。40.根據(jù)權(quán)利要求23至39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述插入多核苷酸包含條件性等位基因、編碼選擇標(biāo)記的多核苷酸、側(cè)接位點(diǎn)特異性重組靶序列的核酸、或有效連接至啟動(dòng)子的報(bào)告基因，其中所述報(bào)告基因編碼報(bào)告蛋白，所述報(bào)告蛋白選自lacz、mplum、mcherry、tdtomato、mstrawberry、j-red、dsred、morange、mko、mcitrine、venus、ypet、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(eyfp)、emerald、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)、cypet、青色熒光蛋白(cfp)、cerulean、t-sapphire、熒光素酶、堿性磷酸酶以及它們的組合。41.根據(jù)權(quán)利要求23至40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾包括內(nèi)源核酸序列的缺失、敲除、敲入、點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)域交換、外顯子交換、內(nèi)含子交換、調(diào)控序列交換、基因交換或它們的組合。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述修飾包括內(nèi)源核酸序列的缺失，其中：(a)所述缺失在約5kb至約10kb、約10kb至約20kb、約20kb至約40kb、約40kb至約60kb、約60kb至約80kb、約80kb至約100kb、約100kb至約150kb、或約150kb至約200kb、約200kb至約300kb、約300kb至約400kb、約400kb至約500kb、約500kb至約1mb、約1mb至約1.5mb、約1.5mb至約2mb、約2mb至約2.5mb、或約2.5mb至約3mb的范圍內(nèi)；或者(b)所述缺失為至少500kb。43.根據(jù)權(quán)利要求23至42中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述修飾包括用外源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述修飾包括用同源或直系同源核酸序列替換內(nèi)源核酸序列。45.根據(jù)權(quán)利要求23至44中任一項(xiàng)所述的方法，其中y染色體上的所述靶基因組座位為sry基因、uty基因、eif2s3y基因、ddx3y基因、ube1y基因、tspy基因、usp9y基因、zfy1基因、zfy2基因，或涵蓋kdm5d基因、eif2s3y基因、tspy基因、uty基因、ddx3y基因和usp9y基因的區(qū)域。46.根據(jù)權(quán)利要求23至44中任一項(xiàng)所述的方法，其中y染色體上的所述靶基因組座位包含所述sry基因。當(dāng)前第1頁(yè)12