相關(guān)申請(qǐng)

此申請(qǐng)依照35u.s.c.§119(e)要求2015年10月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?62,239,241和2014年11月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?62/080,201的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，這些申請(qǐng)以引用的方式整體并入本文。

關(guān)于聯(lián)邦資助的研究的聲明

本發(fā)明在國(guó)立衛(wèi)生研究院(thenationalinstitutesofhealth)授予的政府資助號(hào)r01gm101420-01a1的支持下完成。政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

本文所述的主題涉及化合物或組合物的細(xì)胞內(nèi)遞送。

背景

許多藥物主要集中在小分子藥物的開(kāi)發(fā)。這些藥物之所以如此命名的原因在于它們相對(duì)較小的尺寸，這使得它們能夠在體內(nèi)自由擴(kuò)散以達(dá)到其靶標(biāo)。這些分子還能夠橫跨基本上不受阻礙的另外不滲透的細(xì)胞膜。然而，下一代基于蛋白質(zhì)、dna或rna的療法不能輕易穿過(guò)細(xì)胞膜且因此需要細(xì)胞修飾以便于遞送。確定的方法使用化學(xué)或物理手段以突破膜并遞送材料到細(xì)胞質(zhì)中。適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)遞送是下一代治療劑的研究、開(kāi)發(fā)及實(shí)施中的重要步驟。

在遞送材料到細(xì)胞中的電穿孔過(guò)程中，dna分子積聚并且在電脈沖期間與電滲透化的質(zhì)膜相互作用。然后，那些dna聚集物內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中且隨后造成基因表達(dá)(golzio,m.等人,proc.natl.acad.sci.99,1292–1297(2002)；paganin-gioanni,a.等人proc.natl.acad.sci.u.s.a.108,10443–7(2011)；rosazza,c.等人,mol.ther.21,2217–2226(2013)；boukany,p.e.等人nat.nanotechnol.6,747–54(2011)；teissie,j.等人,biochim.biophys.acta1724,270–80(2005)；yarmush,m.l.等人,annu.rev.biomed.eng.16,295–320(2014)；geng,t.&lu,c.,labchip13,3803–21(2013))。dna質(zhì)粒未必能夠僅僅經(jīng)由擴(kuò)散行進(jìn)通過(guò)粘稠和擁擠的細(xì)胞質(zhì)而到達(dá)核(lechardeur,d.等人,adv.drugdeliv.rev.57,755–767(2005)；dowty,m.e.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.92,4572–4576(1995))。一些研究顯示dna從質(zhì)膜向核的轉(zhuǎn)運(yùn)是經(jīng)由細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)運(yùn)如經(jīng)由微管和肌動(dòng)蛋白網(wǎng)的主動(dòng)的生物過(guò)程(rosazza,c.等人,mol.ther.21,2217–2226(2013))。已發(fā)現(xiàn)微管和肌動(dòng)蛋白網(wǎng)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的dna轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，并且所述過(guò)程的時(shí)間標(biāo)度可為數(shù)小時(shí)，這取決于細(xì)胞類型。質(zhì)膜與核之間的dna轉(zhuǎn)移的不清楚的機(jī)制和復(fù)雜的性質(zhì)妨礙了電穿孔性能在難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的增強(qiáng)。此外，用于當(dāng)前電穿孔技術(shù)中的強(qiáng)場(chǎng)可導(dǎo)致顯著的損傷或死亡(yarmush,m.l.等人,annu.rev.biomed.eng.16,295–320(2014)；geng,t.&lu,c.,labchip13,3803–21(2013))。需要可直接將有效負(fù)載送到細(xì)胞和細(xì)胞器中的技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供對(duì)與向胞質(zhì)和亞細(xì)胞細(xì)胞器(如細(xì)胞核)遞送化合物和/或化合物的混合物的較早方法有關(guān)的問(wèn)題和缺點(diǎn)的解決方法。本發(fā)明的方面提供一種用于在細(xì)胞膜中引起擾動(dòng)的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括限定管腔并被配置為使得懸浮于緩沖液中的細(xì)胞可通過(guò)所述管腔的微流體通道。所述系統(tǒng)和方法適用于遞送貨物如大分子如dna、rna、蛋白質(zhì)、肽、糖聚合物、納米材料，以及小分子穿過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞中，例如真核生物的或原核細(xì)胞。微流體通道包括細(xì)胞變形縮窄部。縮窄部的直徑可隨細(xì)胞直徑而變并且不大于細(xì)胞的直徑。微流體通道在縮窄部的下游包括能量場(chǎng)的來(lái)源或發(fā)射體。在各個(gè)實(shí)施方案中，微流體系統(tǒng)包括一個(gè)或多個(gè)電極以產(chǎn)生電場(chǎng)、磁體或電磁體以產(chǎn)生磁場(chǎng)、聲源以產(chǎn)生聲場(chǎng)，和/或光源。在一些實(shí)施方案中，能源包括叉指電極。細(xì)胞變形縮窄部與細(xì)胞對(duì)能量場(chǎng)(如上所述的那些)的后續(xù)暴露的組合在貨物分子向細(xì)胞中的遞送和/或貨物分子在細(xì)胞內(nèi)部向亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如核或線粒體的移位中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞對(duì)至少兩種不同力(例如物理緊縮力和電力)的暴露在遞送的效率和遞送貨物的活性(例如，由遞送核酸實(shí)現(xiàn)的編碼蛋白質(zhì)的表達(dá))上產(chǎn)生了驚人的優(yōu)點(diǎn)。

在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)電極、磁體、聲學(xué)裝置或光源接近于細(xì)胞變形縮窄部，例如以串聯(lián)形式，并且產(chǎn)生場(chǎng)。舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)或多個(gè)電極、磁體、聲學(xué)裝置或光源被安置在相對(duì)于縮窄部的位置的上游、下游或以便同時(shí)向細(xì)胞遞送電、磁或聲信號(hào)。例如，細(xì)胞在細(xì)胞變形縮窄事件之后暴露于電場(chǎng)、磁場(chǎng)、聲場(chǎng)或光場(chǎng)。

在某些實(shí)施方案中，所述場(chǎng)或場(chǎng)發(fā)射體/來(lái)源和微流體通道為系統(tǒng)的單個(gè)裝置的一部分?；蛘撸⒘黧w系統(tǒng)可具有第一裝置和第二裝置，其中微流體通道為第一裝置的一部分并且發(fā)射體/來(lái)源在系統(tǒng)的第二裝置內(nèi)。場(chǎng)暴露當(dāng)細(xì)胞在第一裝置內(nèi)或初始(第一)裝置外時(shí)出現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，微流體系統(tǒng)可具有第一裝置和第二裝置，其中微流體通道是一種裝置(第一裝置)的一部分并且來(lái)源/發(fā)射體在另一裝置(第二、第三或另外的裝置)內(nèi)以便能量場(chǎng)從具有來(lái)源/發(fā)射體的裝置中發(fā)射通過(guò)具有微流體通道的裝置。

在某些實(shí)施方案中，磁體(如電磁體)、聲學(xué)裝置，或光源/發(fā)射體及微流體通道為系統(tǒng)的單個(gè)裝置的一部分。例如，磁體或聲學(xué)裝置可在微流體通道中的細(xì)胞變形縮窄部的下游處。在其中微流體系統(tǒng)具有第一裝置和第二裝置的其他實(shí)施方案中，微流體通道為第一裝置的一部分并且磁體、聲學(xué)裝置或光源/發(fā)射體在系統(tǒng)的第二裝置內(nèi)。場(chǎng)暴露當(dāng)細(xì)胞在第一裝置內(nèi)或初始(第一)裝置外時(shí)出現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，微流體系統(tǒng)可具有第一裝置和第二裝置，其中微流體通道是一種裝置(第一裝置)的一部分并且磁體、聲學(xué)裝置或光源/發(fā)射體在另一裝置(第二、第三或另外的裝置)內(nèi)以便能量場(chǎng)從具有一個(gè)或多個(gè)電極的裝置中發(fā)射通過(guò)具有微流體通道的裝置。

在某些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)電極和微流體通道為系統(tǒng)的單個(gè)裝置的一部分?；蛘?，微流體系統(tǒng)可具有第一裝置和第二裝置，其中微流體通道為第一裝置的一部分并且所述一個(gè)或多個(gè)電極在系統(tǒng)的第二裝置內(nèi)。場(chǎng)暴露當(dāng)細(xì)胞在系統(tǒng)的第一裝置內(nèi)或初始(第一)裝置外時(shí)出現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，微流體系統(tǒng)可具有第一裝置和第二裝置，其中微流體通道是一種裝置(第一裝置)的一部分并且所述一個(gè)或多個(gè)電極在另一裝置(第二、第三或另外的裝置)內(nèi)以便電場(chǎng)從具有所述一個(gè)或多個(gè)電極的裝置中發(fā)射通過(guò)具有微流體通道的裝置。

在其中至少一個(gè)電極、磁體、聲學(xué)裝置或光和微流體通道為單個(gè)裝置的一部分的一些實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)電極、磁體、聲學(xué)裝置或光可在細(xì)胞變形縮窄部的下游處。

在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，選擇所述縮窄部的直徑以誘發(fā)細(xì)胞膜的足夠大的臨時(shí)擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)，并且細(xì)胞以連續(xù)流動(dòng)形式通過(guò)縮窄部到場(chǎng)(即，電、磁、聲或光場(chǎng))中。在通過(guò)縮窄部之后，細(xì)胞可接觸或通過(guò)場(chǎng)的一部分，盡管有臨時(shí)擾動(dòng)，所述場(chǎng)強(qiáng)度仍足以驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞在通過(guò)縮窄部之后進(jìn)入并保留在縮窄部下游的裝置的區(qū)或室內(nèi)。在此區(qū)或室內(nèi)的細(xì)胞隨后與場(chǎng)接觸。

本發(fā)明的方面還涉及用于將化合物或組合物遞送到細(xì)胞中的方法。方法可例如包括提供在含有效負(fù)載的溶液中的細(xì)胞；使所述溶液通過(guò)包括細(xì)胞變形縮窄部的微流體通道；使細(xì)胞通過(guò)所述縮窄部以便壓力被施加于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)；并且使細(xì)胞通過(guò)或與電場(chǎng)、磁場(chǎng)、聲場(chǎng)或光場(chǎng)接觸，這些場(chǎng)將有效負(fù)載進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)到細(xì)胞中和/或?qū)⒂行ж?fù)載從細(xì)胞內(nèi)的第一位置(例如細(xì)胞膜)移位到另一或第二位置，例如核或其他亞細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)(如線粒體)。例如，第一位置包括胞質(zhì)位置或在胞質(zhì)/質(zhì)膜界面處或附近的區(qū)域且第二位置包括線粒體或核位置。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是根據(jù)時(shí)間順序進(jìn)行處理：首先使細(xì)胞破裂(例如擠壓，變形或壓縮)，然后暴露于所施加的能量場(chǎng)，例如電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)。

在一些實(shí)施方案中，有效負(fù)載可在細(xì)胞破裂之后且在細(xì)胞與場(chǎng)(如電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng))的一部分接觸或通過(guò)場(chǎng)的一部分之前或同時(shí)被添加到含有細(xì)胞的溶液中，這些場(chǎng)將有效負(fù)載進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)到細(xì)胞中和/或?qū)⒂行ж?fù)載從細(xì)胞內(nèi)的第一位置(例如細(xì)胞膜)移位到另一或第二位置，例如核或其他亞細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)(如線粒體)。

在與多肽有效負(fù)載有關(guān)的某些實(shí)施方案中，所述多肽可包括定位信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，多肽有效負(fù)載是包含定位信號(hào)的融合蛋白。例如，所述多肽可包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)、核定位信號(hào)、核仁定位信號(hào)、線粒體靶向信號(hào)，或過(guò)氧物酶體靶向信號(hào)。這類信號(hào)在本領(lǐng)域中是已知的，并且非限制性實(shí)例描述于kalderon等人,(1984)cell39(3pt2):499–509；makkerh等人,(1996)currbiol.6(8):1025–7；dingwall等人,(1991)trendsinbiochemicalsciences16(12):478–81；scott等人,(2011)bmcbioinformatics12:317(7頁(yè))；omurat(1998)jbiochem.123(6):1010-6；rapaportd(2003)emborep.4(10):948-52；及brocard&hartig(2006)biochimicaetbiophysicaacta(bba)-molecularcellresearch1763(12):1565–1573中，其各自的內(nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。

在與電場(chǎng)有關(guān)的實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)可由至少一個(gè)電極或在微流體通道或區(qū)/室的兩側(cè)處的一組兩個(gè)電極產(chǎn)生。在與磁場(chǎng)有關(guān)的實(shí)施方案中，所述磁場(chǎng)可由至少一個(gè)磁體產(chǎn)生。適用于與磁場(chǎng)有關(guān)的各種實(shí)施方案中的磁體的非限制性實(shí)例為暫時(shí)磁體、永久磁體，和電磁體。在與聲場(chǎng)有關(guān)的實(shí)施方案中，所述聲場(chǎng)可由至少一個(gè)聲學(xué)裝置產(chǎn)生。聲學(xué)裝置的一個(gè)非限制性實(shí)例為揚(yáng)聲器。在與光場(chǎng)有關(guān)的實(shí)施方案中，所述光場(chǎng)可由任何發(fā)光裝置產(chǎn)生或可使用環(huán)境光。發(fā)光裝置的非限制性實(shí)例包括發(fā)光二極管(led)、激光、白熾燈泡，或可見(jiàn)電磁輻射的其他來(lái)源。

在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中，細(xì)胞通過(guò)第一裝置中的微流體通道，然后從所述第一裝置處移走并在第二裝置中與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸。在其他實(shí)施方式中，微流體通道與電場(chǎng)、磁場(chǎng)，和聲場(chǎng)在一個(gè)裝置內(nèi)。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞可以連續(xù)流動(dòng)形式通過(guò)縮窄部到場(chǎng)中，并且在通過(guò)所述縮窄部之后，細(xì)胞可接觸或通過(guò)場(chǎng)的一部分，盡管有臨時(shí)擾動(dòng)，所述場(chǎng)強(qiáng)度仍足以驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載。或者，在通過(guò)所述縮窄部之后，細(xì)胞可流入并保留在其中細(xì)胞與場(chǎng)接觸的裝置的區(qū)內(nèi)。

微流體系統(tǒng)可包括多個(gè)微流體通道。所述多個(gè)微流體通道的每個(gè)通道限定一個(gè)管腔并且被配置為使得懸浮于緩沖液中的細(xì)胞可通過(guò)管腔。另外，每個(gè)微流體通道包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞變形縮窄部。在一些實(shí)施方案中，縮窄部的直徑可隨細(xì)胞的直徑而變化。因此，在本發(fā)明的微流體系統(tǒng)內(nèi)可存在許多微流體通道。例如，微流體系統(tǒng)可包括多個(gè)平行排列的微流體通道，例如2、5、10、20、40、45、50、75、100、500、1,000或更多個(gè)。

具有多個(gè)平行微流體通道的微流體系統(tǒng)允許有效負(fù)載向細(xì)胞的高通量遞送。許多細(xì)胞可一個(gè)接一個(gè)地通過(guò)每個(gè)并行通道。細(xì)胞可在通過(guò)微流體通道期間或之后暴露于電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)。在通過(guò)每個(gè)微流體通道的多個(gè)細(xì)胞的情況下，大量細(xì)胞可在短時(shí)間內(nèi)被處理。應(yīng)當(dāng)理解，取決于上下文，在本文中對(duì)“細(xì)胞”的提及可指的是一個(gè)以上細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)被施加于細(xì)胞變形縮窄部下游處的細(xì)胞，即，細(xì)胞通過(guò)縮窄部，由此變形/使細(xì)胞膜不穩(wěn)定并且允許有效負(fù)載進(jìn)入細(xì)胞。在那個(gè)事件之后，細(xì)胞經(jīng)歷電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)。電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的有效負(fù)載(所述有效負(fù)載由于先前的縮窄步驟而已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中)移位到細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，例如核。

在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，選擇所述縮窄部的直徑以誘發(fā)細(xì)胞膜的足夠大的臨時(shí)擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)。應(yīng)理解，縮窄部的直徑可基于細(xì)胞類型和有效負(fù)載而調(diào)整。

關(guān)于電極、磁體或聲學(xué)裝置的位置的多個(gè)變動(dòng)是可能的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，電極僅位于細(xì)胞變形縮窄部的一端。在其他實(shí)施方案中，電極位于細(xì)胞變形縮窄部的兩端，例如細(xì)胞進(jìn)入端和離開(kāi)端。微流體系統(tǒng)可包括兩個(gè)或更多個(gè)電極，所述電極產(chǎn)生電場(chǎng)以驅(qū)動(dòng)或推動(dòng)核酸進(jìn)入懸浮于緩沖液中的細(xì)胞中，或進(jìn)入細(xì)胞核中。舉例來(lái)說(shuō)，電場(chǎng)使核或其他亞細(xì)胞細(xì)胞器(例如線粒體)的膜不穩(wěn)定，由此促進(jìn)貨物進(jìn)入亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。

在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)的強(qiáng)度小于電穿孔細(xì)胞，例如引入核酸穿過(guò)細(xì)胞的質(zhì)膜所需的強(qiáng)度。例如，較低強(qiáng)度的電場(chǎng)可用于dfe中以為特定的細(xì)胞類型獲得給定的有效負(fù)載的相同水平的遞送。不同于需要足夠強(qiáng)度的場(chǎng)來(lái)使細(xì)胞膜破裂并將材料向胞質(zhì)驅(qū)動(dòng)的電穿孔，此表現(xiàn)通過(guò)機(jī)械變形提供膜的破裂并且利用場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)力增加材料向細(xì)胞胞質(zhì)和亞細(xì)胞區(qū)室中的移位。通過(guò)消除使用電能作為供細(xì)胞膜破裂的唯一來(lái)源和/或通過(guò)場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力將材料包埋到質(zhì)膜中，dfe允許使用能夠?qū)⒉牧洗┻^(guò)機(jī)械破壞的膜而直接遞送到胞質(zhì)和亞細(xì)胞區(qū)室中的較低場(chǎng)強(qiáng)度。在同一及其他實(shí)施方案中，縮窄部與電場(chǎng)的組合提高核酸向細(xì)胞核中遞送的效率。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)可增強(qiáng)膜的滲透性。例如，電場(chǎng)可增強(qiáng)亞細(xì)胞膜的滲透性，所述亞細(xì)胞膜不能由機(jī)械構(gòu)件直接破壞。不希望受理論約束，外膜的機(jī)械破壞可由于不存在未受損的外膜而將內(nèi)膜暴露于場(chǎng)效應(yīng)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，通過(guò)微流體系統(tǒng)并接收有效負(fù)載的細(xì)胞的活力比用電穿孔處理的相應(yīng)細(xì)胞更高。例如，與用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔條件單獨(dú)處理的相應(yīng)細(xì)胞群體相比，有基本上或約1-50％、1-10％，或約5、10、15、20、25、30、35、40、40、50、60、70或80％更多的通過(guò)微流體系統(tǒng)的細(xì)胞是活的。

微流體系統(tǒng)可包括多個(gè)電極對(duì)，其中電極對(duì)之間的電極尺寸不同(圖2)。在非限制性實(shí)例中，多個(gè)電極對(duì)被配置到至少第一和第二列電極對(duì)中，并且第一列電極對(duì)偏離第二列電極對(duì)。在一些實(shí)施方案中，微流體系統(tǒng)包括配置到至少第一和第二列電極中的多個(gè)電極。第一列電極可偏離第二列電極。應(yīng)當(dāng)理解，存在不同列的電極或電極對(duì)可彼此偏離的多種方式(例如，按多個(gè)角度在x、y和/或z平面上取向)。例如，第一陣列可在水平、垂直，或?qū)蔷€平面上以基本上或約1°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、70°、80°、90°、1-10°、1-20°、1-30°、1-45°，或1-90°的角度偏離于第二陣列。

細(xì)胞對(duì)于電場(chǎng)的許多不同暴露時(shí)間是可能的。舉例來(lái)說(shuō)并在優(yōu)選實(shí)施方案中，暴露時(shí)間為基本上或約10-50ms、50-100ms或10-100ms。本發(fā)明的方面包括在兩個(gè)或更多個(gè)電極之間基本上恒定的電場(chǎng)。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)是恒定或脈沖直流電。優(yōu)選地，電場(chǎng)是脈沖調(diào)制的。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)是在約50-200μs下脈沖調(diào)制。電場(chǎng)的強(qiáng)度也可變化。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度可為基本上或約1-3kv/cm或0.1至0.5、0.1至1、0.1至1.5、0.1至2、0.1至2.5，或0.1至3kv/cm。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度可為基本上或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2，或2.5kv/cm。場(chǎng)強(qiáng)度可在0.1-10kv/cm的范圍內(nèi)或甚至更寬，取決于具體的病例。舉例來(lái)說(shuō)，電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度是基本上或約0.1-20kv/cm，或小于1kv/cm。在各個(gè)實(shí)施方案中，電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度是基本上或約10-20kv/cm，或小于1kv/cm。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，電場(chǎng)是以基本上或約0.1、0.1-2，或0.1-2000ms的持續(xù)時(shí)間和1-20、0.1-2000，或1-200ms的周期來(lái)脈沖調(diào)制。在一些情況下，電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度可小于電穿孔細(xì)胞所必需的強(qiáng)度。舉例來(lái)說(shuō)，電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度可比電穿孔細(xì)胞所必需的強(qiáng)度小基本上或約50、1-50、50-99，或1-99％。

在一些實(shí)施方案中，使用直流電產(chǎn)生電場(chǎng)。在其他實(shí)施方案中，使用交流電產(chǎn)生電場(chǎng)。交流電可均勻地振蕩，或可具有不對(duì)稱振蕩以便存在電場(chǎng)力的凈調(diào)制。不對(duì)稱振蕩可例如通過(guò)施加具有非零偏壓的交流電來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前主題合并了以下無(wú)病毒載體遞送的優(yōu)點(diǎn)：引起臨時(shí)擾動(dòng)的快速機(jī)械細(xì)胞變形，和有助于以高效率將有效負(fù)載如dna遞送通過(guò)擾動(dòng)并進(jìn)入細(xì)胞中的電場(chǎng)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前主題利用比一些常規(guī)電穿孔技術(shù)強(qiáng)度更低但比一些傳感應(yīng)用(其例如可感測(cè)細(xì)胞電阻率)強(qiáng)度更高的電場(chǎng)。示例性感測(cè)方法描述于2009年11月12日公開(kāi)的美國(guó)專利公布號(hào)2009/0280518(adamo等人)中。因此，對(duì)于固定的遞送效率，一些實(shí)施方案使用較低電場(chǎng)強(qiáng)度的電穿孔。核酸的遞送和表達(dá)也可更快地完成。核酸的更快遞送和表達(dá)提供了與電穿孔單獨(dú)或沒(méi)有場(chǎng)情況下的細(xì)胞擠壓相比關(guān)于dna表達(dá)的重要優(yōu)點(diǎn)。還存在使用dfe遞送其他帶電有效負(fù)載(如rna)的突出優(yōu)點(diǎn)。例如，與電穿孔或沒(méi)有場(chǎng)情況下的細(xì)胞擠壓相比，使用dfe技術(shù)，更多的rna可被遞送到給定的細(xì)胞中。

電場(chǎng)和磁場(chǎng)特別適用于驅(qū)動(dòng)帶電的有效負(fù)載到細(xì)胞和亞細(xì)胞區(qū)室(如細(xì)胞器)中。有效負(fù)載可被修飾以便任選地增加其電荷，從而改善由dfe完成的遞送。在一些實(shí)施方案中，具有低或無(wú)電荷的有效負(fù)載被修飾以增強(qiáng)其使用電場(chǎng)或磁場(chǎng)的遞送。例如，蛋白質(zhì)可被綴合到帶電化合物上，優(yōu)選使用共價(jià)鍵。所述綴合可例如在n端或c端處(例如，經(jīng)由肽鍵)或在氨基酸側(cè)鏈處(例如，經(jīng)由與半胱氨酸的二硫鍵或與硒代半胱氨酸的鍵)。此方法不限于蛋白質(zhì)，并且可應(yīng)用于本文所公開(kāi)的各種有效負(fù)載。

在一些實(shí)施方案中，綴合是經(jīng)由二硫鍵或在細(xì)胞中容易斷裂的另一鍵?？删Y合到有效負(fù)載上的帶電化合物的實(shí)例包括單一帶電氨基酸(即，具有電荷的氨基酸單體)和/或多個(gè)帶電氨基酸的區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，帶電氨基酸的區(qū)段包含具有正電荷的不同氨基酸的混合物。在其他實(shí)施方案中，帶電氨基酸的區(qū)段包含具有負(fù)電荷的不同氨基酸的混合物。或者，帶電氨基酸的區(qū)段具有同一氨基酸的重復(fù)。氨基酸可為天然的、非天然的，或其組合。區(qū)段的長(zhǎng)度可根據(jù)有待修飾的有效負(fù)載的尺寸和有待添加到有效負(fù)載中的所需電荷而變化。在各個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸的區(qū)段包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50，或1-50個(gè)氨基酸。

天然存在的帶正電氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、組氨酸和賴氨酸。天然存在的帶負(fù)電氨基酸的實(shí)例包括天冬氨酸和谷氨酸。非天然存在的氨基酸的實(shí)例包括具有正電荷的那些，如精氨酸、組氨酸和賴氨酸的d立體異構(gòu)體；以及具有負(fù)電荷的那些，如天冬氨酸和谷氨酸的d立體異構(gòu)體。因此，有效負(fù)載可使用一種或多種以下氨基酸或其任何組合進(jìn)行修飾以具有增加的正電荷：天然存在的氨基酸，如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；和/或非天然氨基酸，如精氨酸、組氨酸和賴氨酸的d立體異構(gòu)體。或者，有效負(fù)載可使用一種或多種以下氨基酸或其任何組合進(jìn)行修飾以具有增加的負(fù)電荷：天然存在的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；和/或非天然氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸的d立體異構(gòu)體。

在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)緩沖液或溶液的ph以增加有效負(fù)載的電荷。例如，ph可低于或高于有效負(fù)載的等電點(diǎn)(ph(i))。有效負(fù)載將具有在低于有效負(fù)載的ph(i)的ph下的凈正電荷和在高于其ph(i)的ph下的凈負(fù)電荷。

本發(fā)明的實(shí)施方式還可提供一個(gè)或多個(gè)以下特征。使細(xì)胞變形包括使細(xì)胞變形持續(xù)基本上或約1μs至10ms，例如10μs、50μs、100μs、500μs，和750μs。培育進(jìn)行持續(xù)0.0001秒至20分鐘，例如基本上或約1秒、30秒、90秒、270秒，和900秒。

細(xì)胞通過(guò)微流體通道的壓力和速度也可以變化。在一些實(shí)施方案中，基本上或約10-35psi的壓力被用于使含有細(xì)胞的溶液通過(guò)微流體通道?？沙鲇诙喾N原因而調(diào)整速度，包括在維持高有效負(fù)載遞送的同時(shí)提高所處理細(xì)胞的活力。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞以基本上或約以下的速度通過(guò)微流體通道：300mm/s、100-300mm/s、200-700mm/s、250-400mm/s、1-1000mm/s、1m/s、2m/s、3m/s、4m/s、5m/s、6m/s、7m/s、8m/s、9m/s、10m/s、0.01-5m/s、5-10m/s，或0.01-10m/s。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞以基本上或約100、170、300、100-300、200-700、250-400、100-1000mm/s，或1-1000mm/s的速度通過(guò)電場(chǎng)。當(dāng)細(xì)胞為多個(gè)細(xì)胞時(shí)，基本上或約80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、90-95，或80-100％的細(xì)胞在通過(guò)縮窄部和電場(chǎng)之后可為活的。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞以0m/s的速度與電場(chǎng)接觸。例如，所述場(chǎng)可通過(guò)其中細(xì)胞與電場(chǎng)接觸的裝置的區(qū)、區(qū)域或貯器。所述場(chǎng)可在斷電之前打開(kāi)一段時(shí)間。在此情況下，細(xì)胞不通過(guò)場(chǎng)，但場(chǎng)暴露仍為臨時(shí)的。

細(xì)胞膜中的臨時(shí)擾動(dòng)的大小和持續(xù)時(shí)間可通過(guò)調(diào)整各種因素來(lái)修改，如細(xì)胞變形縮窄部的直徑和細(xì)胞通過(guò)縮窄部的速度。關(guān)于本文所提供的擾動(dòng)的大小和持續(xù)時(shí)間的公開(kāi)不應(yīng)解釋為限制性的。擾動(dòng)和恢復(fù)的非限制性說(shuō)明提供于sharei等人,(2014)integr.biol.,6,470-475中，其以引用的方式整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞膜的擾動(dòng)可表征為基本上或約以下最大直徑：1-20、1-600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500，或600nm。在各個(gè)實(shí)施方案中，具有基本上或約1-20、1-600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500，或600nm的最大直徑的細(xì)胞膜的擾動(dòng)在細(xì)胞膜上持續(xù)至少基本上或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或1-10分鐘或更久(11、13、15、18、20分鐘或更久)。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可主要被流體流壓縮。在一些實(shí)施方案中，所述直徑小于細(xì)胞的直徑。舉例來(lái)說(shuō)，縮窄部的直徑可為細(xì)胞直徑的基本上或約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或20-99％。縮窄部的直徑的非限制性實(shí)例包括基本上或約4、5、6、7、8、9、10、15、204-10μm，或10-20μm。縮窄部的不同長(zhǎng)度也是可能的?？s窄部長(zhǎng)度的非限制性實(shí)例包括基本上或約10、15、20、24、30、40、50、60、10-40、10-50、10-60，或10-40μm。

許多細(xì)胞的直徑在5-20μm之間，例如，幼稚t細(xì)胞的直徑為7-8μm。例如，對(duì)于單細(xì)胞的處理，縮窄部的直徑為4.5、5、5.5、6，或6.5μm。在另一實(shí)例中，用于處理人卵細(xì)胞的壓縮部的尺寸/直徑在60μm與80μm之間，但較大和較小縮窄部也是可能的(人卵細(xì)胞的直徑為大約100μm)。在又一實(shí)例中，使用直徑在12μm與17μm之間的縮窄部處理胚胎(例如，2-3個(gè)細(xì)胞的簇)。在與幼稚t和b細(xì)胞有關(guān)的非限制性實(shí)例中，所述裝置包括具有約10、15、20、25、30，或10-30μm的長(zhǎng)度，約3、3.5、4，或3-4μm的寬度，約15、20、25，或15-25μm的深度，和/或約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或5-15度的角度的縮窄部。適用于將有效負(fù)載遞送到免疫細(xì)胞中的微流體裝置的實(shí)例描述于2015年10月30日提交的pct國(guó)際專利公布號(hào)pct/us2015/058489,deliveryofbiomoleculestoimmunecells中，其以引用的方式整體并入本文。

所述裝置和方法適用于使用專職抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞的疫苗開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)。例如，刺激抗原呈遞的方法是通過(guò)以下操作來(lái)進(jìn)行：使樹突細(xì)胞經(jīng)歷受控制的損傷如短暫的縮窄或高剪切的脈沖并且使樹突細(xì)胞與包含靶抗原的溶液接觸。所述方法與先前的刺激方法相比產(chǎn)生高度活化的抗原呈遞細(xì)胞。疫苗生產(chǎn)是通過(guò)以下操作進(jìn)行：驅(qū)使樹突細(xì)胞或其他抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)含有縮窄部的裝置(由此使細(xì)胞經(jīng)受快速拉伸事件)，然后在含有有效負(fù)載(例如抗原)的溶液中培育細(xì)胞。在細(xì)胞快速變形之后，將細(xì)胞孵育在含有一種或多種抗原(或編碼一種或多種抗原的核酸)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，但細(xì)胞可在快速變形事件/過(guò)程之前、期間，和/或之后與抗原接觸。在一些實(shí)施方案中，dfe被用于遞送核酸如mrna或dna，其編碼抗原或其他基因產(chǎn)物以便在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。dfe還可用于遞送dna到細(xì)胞中以便生成car-t細(xì)胞。

例如，編碼嵌合抗原受體(car)的構(gòu)建體可使用dfe遞送給t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，car是細(xì)胞外識(shí)別結(jié)構(gòu)域(例如，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域，和一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合物。

在一些實(shí)施方案中，所述化合物為編碼mhc復(fù)合體的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述化合物為編碼mhci類或mhcii類復(fù)合體的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼嵌合抗原受體，如嵌合t細(xì)胞受體。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼重組t細(xì)胞受體。舉例來(lái)說(shuō)，編碼嵌合抗原受體的核酸以無(wú)病毒的方式(即，通過(guò)細(xì)胞擠壓)被引入t細(xì)胞中以維持car-t的表達(dá)。例如，dna的引入在不使用病毒粒子的情況下完成。然而，核酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)可包括病毒基因組元件，其可有助于作為染色體外核酸的整合或維持。

在與dna向細(xì)胞中的遞送有關(guān)的一些實(shí)施方案中，dna可包含具有整合元件的構(gòu)建體，所述整合元件有助于核酸序列插入到細(xì)胞的基因組中。

示例性核酸包括但不限于重組核酸、dna、重組dna、cdna、基因組dna、rna、sirna、mrna、sarna、mirna、lncrna、trna，和shrna。在一些實(shí)施方案中，所述核酸與細(xì)胞中的核酸同源。在一些實(shí)施方案中，所述核酸與細(xì)胞中的核酸異源。在一些實(shí)施方案中，所述核酸呈質(zhì)粒形式。在一些實(shí)施方案中，所述核酸是治療性核酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸編碼治療性多肽。

在一些實(shí)施方案中，核酸編碼報(bào)道分子或可選擇標(biāo)記。示例性報(bào)道分子標(biāo)記包括但不限于綠色熒光蛋白(gfp)、紅色熒光蛋白(rfp)、發(fā)光蛋白、β-半乳糖苷酶、尿卟啉原(urogen)iii甲基轉(zhuǎn)移酶(umt)，和熒光素酶。示例性可選擇標(biāo)記包括但不限于殺稻瘟菌素、g418/遺傳霉素、潮霉素b、嘌呤霉素、吉?dú)W霉素、腺嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶，和胸苷激酶。

表面活性劑(例如0.1-10％w/w)任選地在流動(dòng)緩沖液中使用(例如，泊洛沙姆、動(dòng)物來(lái)源的血清、白蛋白)。分子向細(xì)胞中的遞送不受表面活性劑存在的影響；然而，表面活性劑任選地用于減少手術(shù)期間裝置的堵塞。

在一些方面中，所述裝置是由硅、金屬(例如不銹鋼)、塑料(例如聚苯乙烯)、陶瓷，或適用于形成一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)尺寸的通道或?qū)Ч艿娜魏纹渌牧现瞥?。在一些方面中，所述裝置是由適用于蝕刻微米尺寸的特征的材料形成并且包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞從其中通過(guò)的通道或?qū)Ч堋９枋翘貏e適合的，因?yàn)槲⒚讏D案化方法在用此材料時(shí)得到充分確立，因此更容易制造新型裝置、改變?cè)O(shè)計(jì)等。另外，硅的剛度可提供與更柔性的襯底像聚二甲硅氧烷(pdms)相比的優(yōu)點(diǎn)，例如，更快的遞送速率。舉例來(lái)說(shuō)，裝置包括2、10、20、25、45、5075、100個(gè)或更多個(gè)通道。裝置是通過(guò)蝕刻硅來(lái)微制造。細(xì)胞通過(guò)施加壓力移動(dòng)(例如推動(dòng))通過(guò)通道或?qū)Ч堋＜?xì)胞驅(qū)動(dòng)器可施加壓力。細(xì)胞驅(qū)動(dòng)器可包括例如壓力泵、氣瓶、壓縮機(jī)、真空泵、注射器、注射器泵、蠕動(dòng)泵、手動(dòng)注射器、移液管、活塞、毛細(xì)管作用，和重力。作為通道的替代，細(xì)胞可通過(guò)呈網(wǎng)狀或緊密放置的板形式的縮窄部。在上述任一種情況下，細(xì)胞橫穿過(guò)的縮窄部的寬度為有待在其未縮窄(即懸浮)狀態(tài)下處理的細(xì)胞的寬度或直徑的20-99％。溫度可影響組合物的攝取并影響活力。所述方法在室溫(例如20℃)、生理溫度(例如39℃)、高于生理溫度，或低溫(例如0.1℃)，或在這些示例性溫度之間的溫度(例如0.1至40℃)下進(jìn)行。

在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞經(jīng)歷縮窄、拉伸，和/或高剪切率的脈沖的受控制的損傷之后，將細(xì)胞在含有化合物或分子(希望將其引入細(xì)胞中)的遞送溶液中培育。細(xì)胞可當(dāng)在含有化合物或分子的溶液中時(shí)與場(chǎng)接觸。受控制的損傷可表征為細(xì)胞膜中的小(例如直徑200nm)缺損。細(xì)胞的恢復(fù)期為大約幾分鐘以閉合由通過(guò)縮窄部所引起的損傷。遞送期包括1-10分鐘或更久，例如15、20、30、60分鐘或更久，其中當(dāng)在室溫下操作時(shí)2-5分鐘為最佳。

本發(fā)明的各種實(shí)施方式可提供一種或多種以下能力。遞送的更大精度和可縮放性可在與先前技術(shù)相比時(shí)實(shí)現(xiàn)。材料向細(xì)胞的遞送可為自動(dòng)的。如蛋白質(zhì)、rna、sirna、肽、dna及不滲透的染料的材料可植入到細(xì)胞中，如胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)、原代細(xì)胞或永生化細(xì)胞系。所述裝置和方法可以采用任何細(xì)胞類型，并且縮窄部的尺寸適于有待處理的細(xì)胞類型。所述裝置和方法可提供顯著的優(yōu)點(diǎn)。例如，在當(dāng)前系統(tǒng)中的實(shí)驗(yàn)噪聲當(dāng)與先前技術(shù)相比時(shí)可為減少的。材料的遞送量在細(xì)胞群體中可為一致的。細(xì)胞可單獨(dú)處理，而非成批處理。本發(fā)明還證實(shí)了向胞質(zhì)遞送多種納米顆粒和蛋白質(zhì)的相當(dāng)獨(dú)特的機(jī)會(huì)?，F(xiàn)有方法在執(zhí)行所述功能時(shí)相當(dāng)不可靠或效率低。

本發(fā)明的方法和裝置將核酸比其他方法更快和更有效地遞送到細(xì)胞以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(例如，核和線粒體)。電穿孔導(dǎo)致dna積聚并且在電脈沖期間與電滲透化的質(zhì)膜相互作用，從而造成dna聚集物內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中并且積聚在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜附近(圖12和圖21)。dna不能輕易僅經(jīng)由擴(kuò)散行進(jìn)通過(guò)粘稠和復(fù)雜的細(xì)胞質(zhì)而到達(dá)核。通過(guò)dfe使用電場(chǎng)向胞質(zhì)和核(以及線粒體)中遞送核酸是快速且有效的，同時(shí)維持了細(xì)胞活力，由此克服了電穿孔單獨(dú)使用時(shí)的長(zhǎng)期缺點(diǎn)。

本發(fā)明的各種實(shí)施方式還可提供一種或多種以下能力。dna可遞送到難以遞送的細(xì)胞如干細(xì)胞、原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞中?？蓪?shí)現(xiàn)極大質(zhì)粒(甚至整個(gè)染色體)的遞送。還可容易地實(shí)現(xiàn)向細(xì)胞中定量遞送已知量的基因構(gòu)建體以便研究所關(guān)注的基因的表達(dá)水平及其對(duì)濃度的敏感性。可實(shí)現(xiàn)已知量的dna序列連同已知量的促進(jìn)dna重組的酶的遞送以便完成較容易/更有效的穩(wěn)定遞送、同源重組，和位點(diǎn)特異性誘變。本文所述的方法和裝置還可適用于定量遞送rna，以用于更有效/確鑿的rna研究。還容易實(shí)現(xiàn)小干擾rna(sirna)向細(xì)胞的胞質(zhì)中的遞送。

本發(fā)明的各種實(shí)施方式還可提供一種或多種以下能力。rna可被遞送到細(xì)胞中用于在不需要脂質(zhì)體下的rna沉默。已知量的rna分子連同已知量的dicer分子一起可被遞送以在不同條件下在多個(gè)細(xì)胞系中獲得標(biāo)準(zhǔn)化、有效的rna。mrna可被遞送到細(xì)胞中以研究在轉(zhuǎn)錄后水平下基因表達(dá)調(diào)控的方面。所述方法還適用于遞送一定量的rna標(biāo)記以研究rna的半衰期以及在線粒體dna的情況下使用基于rna的干擾，例如mirna和lncrna?？蓪?shí)現(xiàn)通用的蛋白質(zhì)遞送?？蛇f送已知量的標(biāo)記蛋白質(zhì)以研究其在細(xì)胞中的半衰期?？蓪?shí)現(xiàn)標(biāo)記蛋白質(zhì)的遞送以研究蛋白質(zhì)定位?？蛇f送已知量的標(biāo)記的蛋白質(zhì)以研究在細(xì)胞環(huán)境中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用?？蓪?shí)現(xiàn)標(biāo)記抗體向活細(xì)胞中的遞送以用于免疫染色和基于熒光的蛋白質(zhì)印跡。

本發(fā)明的各種實(shí)施方式還可提供一種或多種以下臨床和研究能力。可實(shí)現(xiàn)藥物向細(xì)胞模型的定量遞送以用于提高篩選和劑量研究。所述方法可被部署為篩選胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)活性的高通量方法以幫助鑒別蛋白質(zhì)治療劑或理解疾病機(jī)制。所述應(yīng)用目前受到當(dāng)前蛋白質(zhì)遞送方法的嚴(yán)重限制，因?yàn)樗鼈兊牡托?。所述裝置和技術(shù)適用于藥物向循環(huán)血細(xì)胞的特定亞群(例如淋巴細(xì)胞)中的細(xì)胞內(nèi)遞送、糖向細(xì)胞中的高通量遞送以改善細(xì)胞(特別是卵母細(xì)胞)的低溫保存、通過(guò)引入蛋白質(zhì)、mrna、dna和/或生長(zhǎng)因子進(jìn)行的靶細(xì)胞分化、遺傳或蛋白質(zhì)材料的遞送以誘發(fā)細(xì)胞重編程產(chǎn)生ips細(xì)胞、dna和/或重組酶向胚胎干細(xì)胞中的遞送用于開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞系、dna和/或重組酶向受精卵中的遞送用于開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因生物體、dc細(xì)胞活化、ipsc生成，和干細(xì)胞分化、納米顆粒遞送用于診斷和/或機(jī)械研究以及量子點(diǎn)的引入。還使用本文所述的裝置和方法修飾關(guān)于整形外科使用的皮膚細(xì)胞。

涉及為dfe使用電場(chǎng)的方法和裝置特別適用于遞送核酸及其他帶電化合物。dfe在遞送帶電材料方面比細(xì)胞單獨(dú)擠壓顯著更有效。參見(jiàn)，例如圖12b和12c。

在本文所述的裝置和方法的一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞或祖細(xì)胞如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)通過(guò)縮窄通道不誘導(dǎo)分化，但可靠地誘導(dǎo)組合物向細(xì)胞中的攝取。舉例來(lái)說(shuō)，分化因子被引入所述細(xì)胞中。在攝取引入的因子之后，細(xì)胞在由引入因子指定的分化途徑上繼續(xù)進(jìn)行，而沒(méi)有與借此一個(gè)或多個(gè)因子被引入細(xì)胞中的方法有關(guān)的并發(fā)癥。

除單細(xì)胞之外，甚至極大的細(xì)胞，例如卵細(xì)胞；直徑為大約200μm，細(xì)胞簇，例如2-5個(gè)細(xì)胞簇，如包含2-3個(gè)細(xì)胞的胚胎，也被處理以吸收靶組合物?？椎某叽缦鄳?yīng)地被調(diào)整，即，以使得縮窄部的寬度恰巧低于簇的尺寸。舉例來(lái)說(shuō)，通道的寬度為細(xì)胞簇寬度的20-99％。

將細(xì)胞或細(xì)胞簇針對(duì)所需細(xì)胞類型進(jìn)行純化/分離或富集。用于所述方法中的樹突細(xì)胞或其他細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞、t細(xì)胞，或干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞或ips，可被純化或富集。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞是借助于其細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)或其他鑒別特征來(lái)分離或富集。樹突細(xì)胞是借助于其β-整合素、cd11c或其他鑒別細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)鑒別和分離。就細(xì)胞而言，術(shù)語(yǔ)“分離”意指細(xì)胞基本上不含其他細(xì)胞類型或與其一起天然存在的細(xì)胞物質(zhì)。例如，具體組織類型或表型的細(xì)胞樣品當(dāng)是細(xì)胞群體的至少60％時(shí)為“基本上純的”。優(yōu)選地，制劑是至少75％、更優(yōu)選至少90％、且最優(yōu)選至少99％或100％的細(xì)胞群體。通過(guò)任何合適的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過(guò)熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(facs)測(cè)量純度。

有效負(fù)載組合物如多核苷酸、多肽或其他試劑可被純化和/或分離。具體來(lái)說(shuō)，如本文所用，“分離的”或“純化的”核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)，或當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)的培養(yǎng)基，或當(dāng)以化學(xué)方法合成時(shí)的化學(xué)品前體或其他化學(xué)品。純化的化合物是至少60重量％(干重)所關(guān)注的化合物。優(yōu)選地，制劑是至少75重量％、更優(yōu)選至少90重量％、且最優(yōu)選至少99重量％所關(guān)注的化合物。例如，純化的化合物是至少90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％，或100重量％(w/w)所需化合物。通過(guò)任何合適的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過(guò)柱色譜法、薄層色譜法，或高效液相色譜(hplc)分析測(cè)量純度。純化的或分離的多核苷酸(核糖核酸(rna)或脫氧核糖核酸(dna))不含在其天然存在狀態(tài)下側(cè)接的基因或序列。分離的或純化的核酸分子的實(shí)例包括：(a)dna，其為天然存在的基因組dna分子的一部分，但不被在其天然存在的生物體基因組中側(cè)接分子的那個(gè)部分的兩個(gè)核酸序列所側(cè)接；(b)以使得所生成的分子與任何天然存在的載體或基因組dna不同的方式并入載體或原核生物或真核生物的基因組dna中的核酸；(c)單獨(dú)的分子，如cdna、基因組片段、通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)產(chǎn)生的片段，或限制片段；以及(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因的一部分，即編碼融合蛋白的基因。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子還包括合成產(chǎn)生的分子以及已在化學(xué)上改性和/或具有修飾的主鏈的任何核酸。

雖然一些應(yīng)用需要純度，但在其他應(yīng)用中，使用本發(fā)明的方法和裝置的遞送使用化合物的非均勻混合物。在一些實(shí)施方案中，高純度并不為有效遞送所需。

懸浮液溶液是任何生理或細(xì)胞相容的(例如，其中細(xì)胞可在經(jīng)歷dfe的同時(shí)存活或其中細(xì)胞增殖的緩沖液或溶液)緩沖液或溶液。舉例來(lái)說(shuō)，懸浮液溶液是細(xì)胞培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖鹽水。用于例如希拉細(xì)胞的合適的緩沖液的一個(gè)非限制性實(shí)例為25mmkcl、0.3mmkh2po4、0.85mmk2hpo4、36mm肌醇，ph7.2，克分子滲透壓濃度為約90mosm/l，和/或?qū)щ娐试?5℃下為約0.1-5ms/cm、0.1-4ms/cm，例如約3.5ms/cm。此緩沖液可在保持其有效負(fù)載遞送性能的同時(shí)變更或修改。例如，肌醇可以相同濃度的葡萄糖替換，但仍提供相似性能。緩沖液或溶液可基于許多因素和考慮來(lái)調(diào)整，如場(chǎng)的類型和強(qiáng)度、細(xì)胞類型，和所用的縮窄部?？朔肿訚B透壓濃度和導(dǎo)電率以及離子如鉀和鈣的存在或不存在可被調(diào)整。在某些實(shí)施方案中，溶液或緩沖液具有基本上或約1ms-10ms或0.5ms-15ms的導(dǎo)電率，和/或1-310或10-300mosm/l的克分子滲透壓濃度。在一些實(shí)施方案中，緩沖液的ph為基本上或約4-10、5-9、6-8、6.5-7.5，或7。在一些實(shí)施方案中，緩沖液為適用于電穿孔所處理的細(xì)胞類型的那種緩沖液。電穿孔合適的緩沖液可用于不管電場(chǎng)強(qiáng)度是否足以滿足電穿孔的實(shí)施方案中。

可選擇縮窄部的直徑以誘發(fā)細(xì)胞膜足夠大的臨時(shí)擾動(dòng)以便當(dāng)有效負(fù)載由電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)穿過(guò)擾動(dòng)時(shí)供所述有效負(fù)載通過(guò)。可使用本發(fā)明的微流體系統(tǒng)遞送的有效負(fù)載的非限制性實(shí)例包括：蛋白質(zhì)(如抗體及其片段)；小分子；碳水化合物；糖；生物、合成、有機(jī)，或無(wú)機(jī)分子的聚合物；脫氧核糖核酸(dna)；核糖核酸(rna)(如短干擾rna、發(fā)夾rna、重復(fù)相關(guān)的短干擾rna、微小rna、自擴(kuò)增的rna及mrna分子)；包含增加dna或rna體內(nèi)或體外的穩(wěn)定性或半衰期的修飾的核苷酸的dna或rna；肽核酸(pna)；甲基化的dna；天然存在的染色體或其一部分；和/或表達(dá)載體，如質(zhì)粒。在一些實(shí)施方案中，有效負(fù)載包括不同化合物的混合物，例如，以下一種或多種的混合物：蛋白質(zhì)、小分子、碳水化合物、糖、聚合物、dna、rna、修飾的或甲基化的dna或rna、pna、天然存在的染色體或其部分，和/或表達(dá)載體，如質(zhì)粒。在一些實(shí)施方案中，dna分子為單鏈、雙鏈、環(huán)形、線性，或超螺旋的。在涉及雙鏈線性dna的實(shí)施方案中，dna可具有例如平末端或一個(gè)或多個(gè)核酸的或5’或3’突出端。小分子可為例如尺寸小于1kda的有機(jī)化合物。在一些實(shí)施方案中，有效負(fù)載為帶電的，且在其他實(shí)施方案中，有效負(fù)載為不帶電的。不希望受任何科學(xué)理論的約束，不帶電以及帶電分子可使用本文所提供的方法和系統(tǒng)來(lái)遞送，這是因?yàn)橛呻妶?chǎng)所引起的流體流作為與場(chǎng)相互作用的鹽。

在其中有效負(fù)載遞送給真核細(xì)胞的實(shí)施方案中，有效負(fù)載可被驅(qū)動(dòng)到細(xì)胞的胞質(zhì)、細(xì)胞器(如線粒體)，和/或核中。舉例來(lái)說(shuō)，有效負(fù)載在細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)的同時(shí)，或在細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)之后小于基本上或約0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5，或4小時(shí)被驅(qū)動(dòng)到細(xì)胞核中。在涉及有效負(fù)載向多個(gè)細(xì)胞中遞送的實(shí)施方案中，至少基本上或約10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100、0-65，或10-100％的所述多個(gè)細(xì)胞在所述多個(gè)細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)之后基本上或約0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、0.1-4，或0.1-48小時(shí)內(nèi)表達(dá)dna。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞為原核細(xì)胞。原核細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞(例如，革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性、致病、非致病、共生、球菌、桿菌，和/或螺旋形細(xì)菌細(xì)胞)和古細(xì)菌細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，細(xì)胞為真核細(xì)胞。真核細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括原生動(dòng)物、海藻、真菌、酵母、植物、動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物，和人細(xì)胞。細(xì)胞可為例如單細(xì)胞機(jī)體或多細(xì)胞機(jī)體的細(xì)胞。細(xì)胞可為例如原代真核細(xì)胞或永生化真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞為癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞不為人細(xì)胞。在各個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞可在兩種或更多種細(xì)胞類型的混合物中或者多個(gè)細(xì)胞可為兩種或更多種細(xì)胞類型的混合物。細(xì)胞類型的混合物可為多個(gè)細(xì)胞類型(如兩種或更多種本文所公開(kāi)的那些細(xì)胞類型)的共培養(yǎng)物或一起天然存在于如全血中的細(xì)胞類型的混合物。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是外周血單核細(xì)胞。在各個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞懸液包含純化的細(xì)胞群。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是原代細(xì)胞或細(xì)胞系細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是血細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，血細(xì)胞是免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是t細(xì)胞、b細(xì)胞、天然殺傷(nk)細(xì)胞、樹突細(xì)胞(dc)、nkt細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，或中性粒細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是適應(yīng)性免疫細(xì)胞，如t細(xì)胞和b細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是先天性免疫細(xì)胞。示例性先天性免疫細(xì)胞包括先天性淋巴樣細(xì)胞(ilc1、ilc2或ilc3)、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、nk細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，和單核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是記憶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是原代人t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是小鼠、狗、貓、馬、大鼠、山羊、猴或兔細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞懸液包含非哺乳動(dòng)物細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是雞、蛙、昆蟲或線蟲細(xì)胞。涉及細(xì)胞的本發(fā)明的方面也適用于血小板。因此，本文對(duì)于“細(xì)胞”的提及同樣可適用于血小板。

在一些實(shí)施方案中，微流體通道具有單個(gè)細(xì)胞變形縮窄部(即，不超過(guò)一個(gè))。在其他實(shí)施方案中，微流體通道具有多個(gè)串聯(lián)的細(xì)胞變形縮窄部。

在各個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞在離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之后基本上或約0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005、0.0001-10、0.0001-20、0.0001-30秒或更久(例如，約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.1-10、1-15、or1-15分鐘或更久)，或在離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之后約0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005、0.0001-10、0.0001-20、0.0001-30秒或約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.1-10、1-15，或1-15分鐘內(nèi)與電場(chǎng)接觸。應(yīng)當(dāng)理解，電極與縮窄部之間的距離可根據(jù)如細(xì)胞行進(jìn)的速度等因素而變化。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞變形縮窄事件誘導(dǎo)足夠大的細(xì)胞膜的臨時(shí)擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)。在一些方面中，至少一個(gè)電極接近于細(xì)胞變形縮窄部以使得在細(xì)胞膜上存在臨時(shí)擾動(dòng)的同時(shí)細(xì)胞暴露于電場(chǎng)?！敖咏庇诩?xì)胞變形縮窄部的距離的非限制性實(shí)例為基本上或約0.1、0.5、1、2、3、4、5、0.1-5cm、1-10、1-100，或1-1000cm。

如上所述的任何方法是在體外、離體或體內(nèi)進(jìn)行。對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，裝置可被植入血管管腔中，例如管道支架。本發(fā)明的這些及其他能力，連同本發(fā)明本身一起，將在回顧以下附圖、詳細(xì)說(shuō)明及權(quán)利要求之后得到更充分理解。

本發(fā)明的方面提供一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞中的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以使得壓力被施加于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)。細(xì)胞可在其離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之前、期間和/或之后與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸。

在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的表達(dá)早于在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中。舉例來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因可早于在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)在細(xì)胞中表達(dá)。

在各個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞中的最大限度轉(zhuǎn)基因表達(dá)以比在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的最大限度轉(zhuǎn)基因表達(dá)更快的速率完成。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞中的最大限度轉(zhuǎn)基因表達(dá)可早于在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的最大限度轉(zhuǎn)基因表達(dá)0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)完成。

在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中以與在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相比更大的程度表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可比在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)多至少基本上或約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更大倍數(shù)。

本發(fā)明的方面還涉及一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞群體中的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)。在離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之前、期間或之后，細(xì)胞可與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸。

在一些實(shí)施方案中，在群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例大于在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例。舉例來(lái)說(shuō)，在群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例可比在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例大至少基本上或約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更大倍數(shù)。

在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞通過(guò)縮窄部之后基本上或約0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可比在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)多至少基本上或約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更大倍數(shù)。

在某些實(shí)施方案中，在群體中表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例大于在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例。例如，在群體中表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例比在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞比例大至少基本上或約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更大倍數(shù)。在一些實(shí)施方案中，“高水平”的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是比通過(guò)電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的細(xì)胞中的平均轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平高50％的細(xì)胞中的表達(dá)水平。用于測(cè)定轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的方法的非限制性實(shí)例包括定量聚合酶鏈反應(yīng)(qpcr)測(cè)定、rna印跡、蛋白質(zhì)印跡，和基于微陣列的測(cè)定。

本文所公開(kāi)的每個(gè)實(shí)施方案預(yù)期可應(yīng)用于每個(gè)其他所公開(kāi)的實(shí)施方案。因此，本文所述的各種要素的所有組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

還描述了相關(guān)裝置、系統(tǒng)、技術(shù)和制品。

本文所述的主題的一個(gè)或多個(gè)變動(dòng)的細(xì)節(jié)在附圖及以下描述中闡述。本文所述的主題的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將從描述、附圖以及權(quán)利要求書中顯而易見(jiàn)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1為用于向細(xì)胞遞送有效負(fù)載如dna或rna以用于遺傳工程的微流體裝置的一個(gè)示例性實(shí)施方式的圖像。

圖2為圖1中示出的電極的一個(gè)替代實(shí)施方式。電極中的偏置有利于細(xì)胞向電場(chǎng)的暴露，不管當(dāng)其流過(guò)時(shí)處于通道中的何處。

圖3為示出了例如被驅(qū)動(dòng)通過(guò)微流體系統(tǒng)以遞送有效負(fù)載dna的細(xì)胞的dna轉(zhuǎn)染率的條形圖。dfe10-6表示dfe裝置的縮窄部尺寸，第一數(shù)字對(duì)應(yīng)于縮窄部長(zhǎng)度，而第二數(shù)字對(duì)應(yīng)于寬度(以微米計(jì))。

圖4為示出了細(xì)胞活力的條形圖。

圖5為示出了dna轉(zhuǎn)染和活力的線圖。

圖6為示出了在處理之前對(duì)這種緩沖液的暴露時(shí)間是如何影響dna遞送和細(xì)胞活力的條形圖。

圖7為示出了當(dāng)細(xì)胞速度增加時(shí)細(xì)胞活力也提高的線圖。

圖8a為示出了單個(gè)縮窄通道的微流體系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。

圖8b為描繪深度、寬度和長(zhǎng)度的微流體系統(tǒng)的單個(gè)縮窄通道的直觀圖。

圖9a-9c為裝置結(jié)構(gòu)和工作機(jī)制的描繪。(圖9a)示出了工作機(jī)制的示意圖：細(xì)胞的機(jī)械破壞在當(dāng)細(xì)胞通過(guò)縮窄部時(shí)在質(zhì)膜上生成孔洞。以下電脈沖驅(qū)動(dòng)dna通過(guò)孔洞進(jìn)入胞質(zhì)和核中。(圖9b)一組相同的平行微流體縮窄部被蝕刻到硅晶片上，且一組電極沉積在pyrex晶片上。(圖9c)由硅晶片和pyrex層鍵合的完成的裝置的光學(xué)圖像。裝置制造的更多細(xì)節(jié)可見(jiàn)于圖13中。

圖10a和10b為示出了取決于電脈沖的轉(zhuǎn)染性能的條形圖。處理之后24h的dna轉(zhuǎn)染效率(圖10a)和細(xì)胞活力(圖10b)，其隨所施加的電場(chǎng)振幅而變化。電轉(zhuǎn)染之前機(jī)械破壞的引入顯著地增強(qiáng)dna轉(zhuǎn)染，而對(duì)細(xì)胞活力造成可忽略的損害。碘化丙啶染色之后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量gfp質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活力。如圖10a所示，與電泳相比在每個(gè)場(chǎng)強(qiáng)度下實(shí)現(xiàn)更多的dna表達(dá)，表明與電泳相比，較低的能量水平為電場(chǎng)dfe所需。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)一式三份收集并且誤差線代表2sd。x軸單位為伏特/60um。1v/60um相當(dāng)于約0.1667kv/cm。

圖11a-11c為示出了來(lái)自使用不同方法向希拉細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染的比較研究的結(jié)果的圖。(圖11a)gfp表達(dá)效率隨處理后的時(shí)間而變化。效率被定義為在處理之后表達(dá)gfp的細(xì)胞對(duì)比總的活細(xì)胞。10-7芯片被用于擠壓及破環(huán)和場(chǎng)實(shí)現(xiàn)的遞送(dfe)。如本文所用，裝置尺寸是由一系列指示長(zhǎng)度和寬度(例如，10-7表示具有長(zhǎng)度10μm和寬度7μm的單個(gè)縮窄部的裝置)的數(shù)字表示。在200hz頻率下的0.1ms/10v脈沖被用于ep和me(微流體(無(wú)縮窄部)+電場(chǎng))，且15ms/15000v的單脈沖被用于bep。(圖11b)通過(guò)在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)下測(cè)量差異的gfp表達(dá)來(lái)分析dna表達(dá)的動(dòng)態(tài)。超過(guò)80％的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在顯微注射和dfe中處理之后1h內(nèi)表達(dá)gfp。相比之下，在處理之后4至48h，在me(60％)、bep(70％)和lp2000(95％)中的大多數(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)gfp。同樣示出了在每種方法的每次處理中的希拉細(xì)胞數(shù)目，指示了每種技術(shù)的通量(圖11c)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)一式三份進(jìn)行，并且誤差線代表2sd。

圖12a-12c是顯示熒光標(biāo)記的質(zhì)粒dna(ldna)向希拉細(xì)胞遞送的目測(cè)的圖片。在核和質(zhì)膜染色之后，將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前與cy3標(biāo)記的質(zhì)粒dna混合。處理之后，將細(xì)胞用optimem洗滌，用細(xì)胞固定試劑盒固定，并且準(zhǔn)備好共焦成像。(圖12a)在bep中，當(dāng)細(xì)胞以500mm/s的速度(當(dāng)細(xì)胞通過(guò)縮窄部時(shí))流過(guò)芯片時(shí)在10v下施加0.1ms(200hz)的電脈沖。dna積聚見(jiàn)于質(zhì)膜上。(圖12b)僅僅通過(guò)細(xì)胞擠壓，幾乎沒(méi)有或沒(méi)有l(wèi)dna信號(hào)見(jiàn)于細(xì)胞中，在500mm/s的細(xì)胞速度下使用10-7芯片。(圖12c)在dfe中，觀察到充滿胞質(zhì)和核的顯著cy3熒光。在500mm/s的細(xì)胞速度下使用10-7芯片，其中在10v下施加0.1ms(200hz)的電脈沖。

圖13為示例性裝置制造工藝的圖解。(圖13a-d)在pyrex層上的電極制造包括金屬沉積工藝和后續(xù)剝離工藝。(圖13e-h)在硅晶片上的微通道制造使用兩次光刻和drie工藝。(i)硅襯底與pyrex層之間的鍵合。

圖14為示出了取決于細(xì)胞速度的遞送性能的線圖。在處理之后24小時(shí)測(cè)量3kda葡聚糖的遞送效率、dna轉(zhuǎn)染效率，和細(xì)胞活力。使用10-8芯片和在10v下0.1ms(200hz)的電脈沖。dna轉(zhuǎn)染的收率為接近300mm/s的細(xì)胞速度的最大值。

圖15a和15b示出了希拉細(xì)胞的熒光圖像。(圖15a)通過(guò)dfe、bep和lp2000的gfp質(zhì)粒dna的表達(dá)的比較。細(xì)胞的熒光顯微鏡圖像顯示gfp表達(dá)在dfe中比bep和lp2000更快的出現(xiàn)。(圖15b)示出了包括8小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的dfe與bep的比較。

圖16為示出了在使用dfe和neon(bep)處理后的不同時(shí)間下的gfp熒光強(qiáng)度分布的直方圖。在處理后的不同時(shí)間點(diǎn)下通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量的希拉細(xì)胞的gfp熒光強(qiáng)度分布示于直方圖中。結(jié)果表明在dfe中，dna轉(zhuǎn)錄在遞送后立即出現(xiàn)，而在bep中，dna的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)需要幾個(gè)小時(shí)。細(xì)胞在dfe處理之后立即開(kāi)始表達(dá)gfp，而在電穿孔中，處理之后需要花費(fèi)超過(guò)4小時(shí)來(lái)轉(zhuǎn)錄dna。dfe的平均熒光強(qiáng)度似乎高于bep的。表達(dá)細(xì)胞的直方圖對(duì)于dfe比對(duì)于neon更多地右移，這表明甚至在24小時(shí)處的更多蛋白質(zhì)表達(dá)。

圖17示出了24h之后的mesc的gfpdna表達(dá)。熒光顯微鏡圖像示出了在gfpdna質(zhì)粒的dfe遞送之后24小時(shí)小鼠胚胎干細(xì)胞(mesc)中的gfp表達(dá)。

圖18為示出了向細(xì)胞中共遞送dna、mrna及蛋白質(zhì)(igg2)的線圖。此圖示出了當(dāng)共遞送時(shí)在不同振幅下每種材料的遞送效率。y軸為表達(dá)/遞送％。因此對(duì)于mrna和dna，其為表達(dá)％，而對(duì)于igg2，其為遞送％。

圖19示出了本發(fā)明的示例性裝置。

圖20為采用裝置參數(shù)的非限制性實(shí)例的草圖。

圖21a-21c為示出了使用(a)電穿孔、(b)單獨(dú)的細(xì)胞擠壓，和(c)dfe遞送的dna的分布的草圖。也參見(jiàn)圖12a-12c。如圖12a中所示且如圖21a中所描繪，通過(guò)電穿孔遞送的dna積聚在質(zhì)膜上。圖12b(圖21b中所示)示出了單獨(dú)用細(xì)胞擠壓的低或無(wú)dna遞送。然而，圖12c(圖22c中所描繪)顯示了使用dfe時(shí)遍及細(xì)胞的dna遞送的快速和顯著增加。

在各附圖中，相同的參考符號(hào)代表相同的部件。

發(fā)明詳述

大分子如dna和rna的細(xì)胞內(nèi)遞送為許多治療和研究應(yīng)用中的關(guān)鍵步驟。基因遞送可通過(guò)病毒介導(dǎo)的、化學(xué)、電及機(jī)械轉(zhuǎn)染完成?；诓《据d體的方法對(duì)于某些應(yīng)用可有效，但其常常具有染色體整合的風(fēng)險(xiǎn)并且具有體內(nèi)使用的安全風(fēng)險(xiǎn)。靶分子的化學(xué)修飾還可促進(jìn)膜穿孔或胞內(nèi)遞送，但這些方法常受到靶分子的結(jié)構(gòu)和靶細(xì)胞類型的限制。顯微注射具有低通量。電穿孔顯示出對(duì)于先前難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來(lái)說(shuō)在dna和rna遞送應(yīng)用中的效力。然而，此方法可引起細(xì)胞死亡和敏感材料如量子點(diǎn)的損傷，這歸因于高強(qiáng)度電場(chǎng)?？s窄部微流體平臺(tái)可產(chǎn)生暫時(shí)的細(xì)胞膜破環(huán)，這促進(jìn)了大多數(shù)材料向幾乎任何細(xì)胞類型的胞質(zhì)中的被動(dòng)擴(kuò)散。所述遞送平臺(tái)具有高通量、不依賴于外源性材料或場(chǎng)、以及高細(xì)胞活力的優(yōu)點(diǎn)。示例性膜破壞遞送平臺(tái)描述于2014年9月25日公開(kāi)的美國(guó)專利公布號(hào)2014/0287509中，其內(nèi)容以引用的方式明確地整體并入本文。然而，與電場(chǎng)的耦合實(shí)現(xiàn)了響應(yīng)于質(zhì)粒dna的遞送對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)。本主題包括可向任何細(xì)胞類型中遞送任何功能性靶分子的細(xì)胞內(nèi)遞送技術(shù)和平臺(tái)。

當(dāng)前主題包括高通量、無(wú)載體的微流體裝置以供使用機(jī)械臨時(shí)細(xì)胞膜破環(huán)和電場(chǎng)細(xì)胞內(nèi)遞送dna。

圖1為用于向細(xì)胞遞送有效負(fù)載如dna或rna(以用于基因工程)的微流體裝置100的示例性實(shí)施方式的圖像。微流體裝置100包括一個(gè)或多個(gè)縮窄通道105和至少一個(gè)電極110用于產(chǎn)生電場(chǎng)。所述至少一個(gè)電極110可包括一對(duì)具有不同尺寸的電極?？s窄通道105在左邊示出，并且被調(diào)整尺寸以便在細(xì)胞通過(guò)通道105的縮窄點(diǎn)107處時(shí)壓縮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞通過(guò)具有小于細(xì)胞直徑的最小尺寸的縮窄點(diǎn)107時(shí)，所述細(xì)胞經(jīng)歷快速的機(jī)械變形，這造成了孔洞的暫時(shí)膜破環(huán)。

來(lái)自周圍介質(zhì)的分子可隨后通過(guò)這些孔洞擴(kuò)散到細(xì)胞胞質(zhì)中。在通過(guò)縮窄點(diǎn)107之后，細(xì)胞進(jìn)入由安置在縮窄點(diǎn)107下游的電極110產(chǎn)生的電場(chǎng)，其中有效負(fù)載如dna通過(guò)由電場(chǎng)產(chǎn)生的電泳效應(yīng)被驅(qū)動(dòng)到細(xì)胞中。如果有效負(fù)載帶電，那么有效負(fù)載可直接被驅(qū)動(dòng)，而如果有效負(fù)載不帶電，那么有效負(fù)載可例如通過(guò)將有效負(fù)載懸浮在具有帶電組分(例如鹽)的緩沖液中被間接驅(qū)動(dòng)，所述帶電組分可當(dāng)在由電場(chǎng)產(chǎn)生的電泳效應(yīng)下時(shí)用于驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載。電極110示于圖1的右側(cè)。

圖2為圖1中示出的電極110的替代實(shí)施方式。電極的寬度和電極之間的間隔都是50μm。電極的長(zhǎng)度為8mm。在一個(gè)實(shí)施方式中，取決于具體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用，這種尺寸的范圍可在100nm至10cm內(nèi)。圖2中電極的移位設(shè)計(jì)幫助每個(gè)細(xì)胞通過(guò)有待暴露于電場(chǎng)的通道，從而得到更高的dna轉(zhuǎn)染效力。在其當(dāng)前的實(shí)施方式中，金電極在平面中的玻璃側(cè)(頂部)。然而，電極可在硅層(底部)或這兩層(頂部和底部)上實(shí)施。電流電極配置(圖2)是由一系列直電極組成，所述直電極更改了通道半途中的位置以確保在以下流體通道中通過(guò)的任何細(xì)胞暴露于場(chǎng)，即，如果細(xì)胞直接在電極下行進(jìn)，那么在移位之后，其現(xiàn)將安置在兩個(gè)電極之間且因此暴露于場(chǎng)。此考慮之所以重要是因?yàn)槠浯_保了大多數(shù)(至少20、50、75、80、85、90、95、99％或更多)或所有細(xì)胞暴露于電場(chǎng)。位差角可在1-90度的范圍內(nèi)，其可在沿電極長(zhǎng)度的任一點(diǎn)處，例如，在中間點(diǎn)處(如圖2所示)或在介于電極之間距離的5、10、20、25、35、50、60、75、80、85、90、95％或更長(zhǎng)的點(diǎn)處。還可垂直于細(xì)胞流在對(duì)角線角度(在1-90度的范圍內(nèi))上實(shí)施電極。

微流體平臺(tái)可通過(guò)使用深反應(yīng)離子蝕刻將微流體通道蝕刻到硅晶片中制成?？墒褂霉饪谭ê蛣冸x將電極沉積在pyrex晶片上。然后，那兩個(gè)晶片可鍵合在一起以密封微流體通道，例如通過(guò)陽(yáng)極或另一鍵合手段。在一些實(shí)例中，電極位于頂(例如玻璃)板/晶片(即，不存在于底部(硅晶片)上；或者，電極位于底板(不存在于頂板/晶片)上。在一些實(shí)施方案中，電極位于裝置的兩側(cè)，例如在頂和底板或晶片上或中。圖2中的水平線描繪了連接到負(fù)墊片或正墊片(圖中的矩形)上的電極。在此配置中，細(xì)胞在位于玻璃晶片中的電極下面從左流到右。為了確保每個(gè)細(xì)胞都暴露于電場(chǎng)，電極在電極配置中的一點(diǎn)(例如，電極的灰色部分)處偏置。例如，如圖2所示，偏置是在約1-90°，例如20-80°，例如約45°的角度處。以此方式，沿直線流過(guò)微流體裝置的細(xì)胞將在其橫穿微流體通道長(zhǎng)度的至少一部分期間遇到電場(chǎng)。

電場(chǎng)可為例如0.1kv/m-2000kv/m、10-2000kv/m或0.1kv/m-100mv/m、優(yōu)選在50-500kv/m下。另外，細(xì)胞可暴露于電場(chǎng)持續(xù)已知的時(shí)間。脈沖寬度1ns-1s和周期100ns–10s是一個(gè)實(shí)例。優(yōu)選地，在0.05-0.5ms脈沖寬度和1-20ms周期下。遞送所需的電場(chǎng)強(qiáng)度可低于常規(guī)的電穿孔。因此，對(duì)于固定的遞送效率，當(dāng)前主題可需要比電穿孔低的電場(chǎng)強(qiáng)度。如圖3所示，使用本發(fā)明方法的dna轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于在不同場(chǎng)強(qiáng)度下的電穿孔，表明與電穿孔單獨(dú)相比，較低的場(chǎng)強(qiáng)度可用于獲得相同類似或更大的轉(zhuǎn)染效率。

電穿孔涉及脈沖強(qiáng)度和脈沖寬度的組合。舉例來(lái)說(shuō)，在轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中，脈沖通常為0.3-1kv.cm，其中脈沖寬度為5ms-50ms。在包括電場(chǎng)的一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)強(qiáng)度類似于用于電穿孔的強(qiáng)度，但脈沖寬度比用于電穿孔的低得多。較低脈沖寬度的使用造成細(xì)胞對(duì)能量的較低暴露，和更高活力。另外且盡管有較低能量暴露，dna仍被遞送到核(及細(xì)胞的其他區(qū)域)且與電穿孔單獨(dú)相比更快速地表達(dá)。

在示例性操作中，細(xì)胞可在恒壓(5psi-100psi)下被驅(qū)動(dòng)通過(guò)縮窄部通道105。然后細(xì)胞與由函數(shù)發(fā)生器驅(qū)動(dòng)的脈沖電場(chǎng)接觸。在一個(gè)實(shí)例中，集成電路用于提供電信號(hào)以驅(qū)動(dòng)電極。cascadeblue標(biāo)記的3-kda葡聚糖分子的遞送效率和表達(dá)綠色熒光蛋白(gfp)的質(zhì)粒dna的表達(dá)是通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)表征以評(píng)估性能。結(jié)果顯示對(duì)于3k葡聚糖70％的遞送效率和對(duì)于dna轉(zhuǎn)染63％，而細(xì)胞活力保持在90％。小分子和大分子兩者的這種同時(shí)遞送對(duì)于其他技術(shù)是難題。

本文所述的主題可提供許多優(yōu)點(diǎn)。例如，基因表達(dá)可被極大地增加。在一個(gè)實(shí)施方式中，在僅有縮窄部的裝置中的基因表達(dá)小于5％并且可通過(guò)包括電場(chǎng)而增至63％。在一些實(shí)施方案中，在僅有縮窄部的裝置中的基因表達(dá)小于約1、2、3、4，或5％并且通過(guò)將擠壓的細(xì)胞暴露于電場(chǎng)而增至60-100或65、70、75、80、85、90、95，或100％。包括細(xì)胞變形縮窄部和電極兩者的裝置對(duì)于不同類型的有效負(fù)載遞送是有利的。例如，所述裝置借助于暴露于縮窄部然后是電場(chǎng)將相對(duì)較大和較小的分子在穿過(guò)裝置的過(guò)程或通道中都有效地遞送到細(xì)胞中。例如，所述系統(tǒng)特別適用于遞送編碼基因產(chǎn)物的核酸(例如質(zhì)粒dna)到細(xì)胞中并到核中以實(shí)現(xiàn)遞送基因的表達(dá)。例如，在通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部之后細(xì)胞對(duì)電場(chǎng)的暴露促進(jìn)質(zhì)粒進(jìn)入核中。此方法也可實(shí)現(xiàn)各種材料(如蛋白質(zhì)和核酸)的同時(shí)遞送。細(xì)胞變形要素將促進(jìn)外膜的破環(huán)以便于胞質(zhì)蛋白質(zhì)遞送，而電場(chǎng)促進(jìn)潛在的核破壞并且實(shí)現(xiàn)材料向細(xì)胞中的電泳流。

圖3為示出了例如被驅(qū)動(dòng)通過(guò)微流體系統(tǒng)100以遞送有效負(fù)載dna并在培育24小時(shí)之后的細(xì)胞的dna轉(zhuǎn)染率的條形圖300。每個(gè)細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)所花費(fèi)的時(shí)間為36ms并且脈沖電信號(hào)在5ms的周期下具有0.1ms的持續(xù)時(shí)間。在處理之前將細(xì)胞懸浮于hypoosmolar緩沖液中，然后注射穿過(guò)微流體芯片以便擠壓和通過(guò)電場(chǎng)。然后收集細(xì)胞并等待3分鐘，之后添加到培養(yǎng)基中。在24小時(shí)培育之后使用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(facs)分析dna轉(zhuǎn)染。圖3中所示的結(jié)果顯示細(xì)胞擠壓顯著地增強(qiáng)通過(guò)電場(chǎng)期間的dna轉(zhuǎn)染。

圖4為示出了細(xì)胞活力的條形圖400。每個(gè)細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)所花費(fèi)的時(shí)間為36ms；脈沖電信號(hào)在5ms的周期下具有0.1ms的持續(xù)時(shí)間；在處理之前將細(xì)胞懸浮于hypoosmolar緩沖液中，然后注射穿過(guò)微流體芯片以便擠壓和通過(guò)電場(chǎng)。然后收集細(xì)胞并等待3分鐘，之后添加到培養(yǎng)基中。在24小時(shí)培育之后使用facs分析dna轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示細(xì)胞擠壓顯著地增強(qiáng)通過(guò)電場(chǎng)期間的dna轉(zhuǎn)染。

圖5為示出了dna轉(zhuǎn)染和活力的線圖500。每個(gè)細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)所花費(fèi)的時(shí)間為24ms；脈沖電信號(hào)在5ms的周期下具有0.1ms的持續(xù)時(shí)間；使用10-8x芯片。在處理之前將細(xì)胞懸浮于低滲透的緩沖液中并且與gfp-dna質(zhì)粒和3kda葡聚糖混合，然后注射穿過(guò)微流體芯片以便擠壓和通過(guò)電場(chǎng)。然后收集細(xì)胞并且(虛線)等待3分鐘，之后或立即(實(shí)線)添加到培養(yǎng)基中。在24小時(shí)培育之后使用facs分析dna轉(zhuǎn)染。

圖6是示出了在處理之前對(duì)這種緩沖液的暴露時(shí)間是如何影響dna遞送和細(xì)胞活力的條形圖600。每個(gè)細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)所花費(fèi)的時(shí)間為24ms；脈沖電信號(hào)在5ms的周期下具有0.1ms的持續(xù)時(shí)間；使用10-8x芯片。將細(xì)胞懸浮于低滲透的緩沖液中并且與gfpdna質(zhì)粒和3kda葡聚糖混合。確定了至多40分鐘的暴露時(shí)間，如圖6中所示。然后收集細(xì)胞并立即(實(shí)線)添加到培養(yǎng)基中。在24小時(shí)培育之后使用facs分析dna轉(zhuǎn)染。

圖7為示出了當(dāng)細(xì)胞速度增加時(shí)細(xì)胞活力也提高的線圖700，這意味著電場(chǎng)主要用于細(xì)胞活力的減小。每個(gè)細(xì)胞通過(guò)電場(chǎng)所花費(fèi)的時(shí)間為24ms；脈沖電信號(hào)在10ms的周期下具有0.1ms的持續(xù)時(shí)間；使用10-7x芯片。遞送性能取決于細(xì)胞速度，細(xì)胞速度受到所施加壓力的控制。將細(xì)胞懸浮于低滲透的緩沖液中并且與gfpdna質(zhì)粒混合；處理之后，細(xì)胞被立即添加到培養(yǎng)基中。在更高的速度下，膜的破環(huán)更嚴(yán)重，但場(chǎng)暴露可減少。

圖8a為示出了單個(gè)縮窄部通道105的微流體系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖。圖8b為描繪深度、寬度和長(zhǎng)度的微流體系統(tǒng)的單個(gè)縮窄部通道105的直觀圖。細(xì)胞通過(guò)縮窄點(diǎn)107，該縮窄點(diǎn)在細(xì)胞膜中引入暫時(shí)的膜破環(huán)(例如孔洞)。細(xì)胞行進(jìn)穿過(guò)由兩個(gè)電極110產(chǎn)生胞質(zhì)電場(chǎng)并且將有效負(fù)載如dna遞送到細(xì)胞胞質(zhì)。

一般定義和一般技術(shù)

除非另外明確定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)將具有與本領(lǐng)域(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)及生物化學(xué)中)普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。

雖然上面已經(jīng)詳細(xì)描述了幾個(gè)變化形式，但其他修改或添加也是可能的。例如，本主題不限于dna和rna，但可以高通量遞送廣泛多種材料(包括納米顆粒、蛋白質(zhì)、量子點(diǎn)及dna)到幾乎任何種類的細(xì)胞類型中。在某些實(shí)施方案中，dna或rna可合并修飾的核苷酸，如具有對(duì)核糖主鏈中的2′-oh基團(tuán)的化學(xué)修飾的那些核苷酸，如2′-o-甲基(2′ome)、2′-氟(2′f)取代；以及含有2′ome，或2′f，或2′-脫氧，或“鎖定核酸”(lna)修飾的那些核苷酸。

在本文的描述和權(quán)利要求書中，短語(yǔ)如“至少一種”或“一種或多種”可在要素或特征的聯(lián)合列表之后出現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“和/或”也可在兩種或更多種要素或特征的列表中出現(xiàn)。除非另外隱含地或明確地與使用其的上下文相矛盾，所述短語(yǔ)意圖指的是單獨(dú)的任何所列要素或特征或以與任何其他所述要素或特征組合的任何所述要素或特征。例如，短語(yǔ)“a和b中的至少一個(gè)”；“一個(gè)或多個(gè)a和b”；“a和/或b”各自意圖指的是“a單獨(dú)、b單獨(dú)，或a和b一起”。類似的說(shuō)明也意圖是包括三個(gè)或更多個(gè)物品的列表。舉例來(lái)說(shuō)，短語(yǔ)“a、b和c中的至少一個(gè)”；“一個(gè)或多個(gè)a、b和c”；以及“a、b和/或c”各自意圖指的是“a單獨(dú)、b單獨(dú)、c單獨(dú)、a和b一起、a和c一起、b和c一起，或a和b和c一起”。另外，在本文和權(quán)利要求書中術(shù)語(yǔ)“基于”的使用意圖指的是“至少部分基于”，以便未提及的特征或要素也是允許的。

除非上下文需要更有限的范圍，如本文所用的術(shù)語(yǔ)“約”和“基本上”在數(shù)值或范圍的上下文中意指所述或所要求的數(shù)值或范圍的±10％。

如本文所用，“占空比”意指脈沖持續(xù)時(shí)間在脈沖周期內(nèi)的比率。

在其廣義上來(lái)說(shuō)，“破壞和場(chǎng)實(shí)現(xiàn)的遞送”或“dfe”意指擠壓和與能量場(chǎng)接觸的組合以便將有效負(fù)載遞送到細(xì)胞中。

術(shù)語(yǔ)“質(zhì)膜”與“細(xì)胞膜”在本文中可互換使用，并且是指將細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞外的環(huán)境分隔開(kāi)的半透膜。

如本文所用，“表達(dá)載體”是能夠?qū)崿F(xiàn)一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的表達(dá)的dna或rna載體。優(yōu)選地，表達(dá)載體還能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。表達(dá)載體可為原核細(xì)胞或真核生物的，且通常是質(zhì)粒。本發(fā)明的表達(dá)載體包括在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用(即，指導(dǎo)基因表達(dá))的任何載體，包括在本文所述的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的一個(gè)中的例如革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性、致病、非致病、共生、球菌、桿菌或螺旋形細(xì)菌細(xì)胞；古細(xì)菌細(xì)胞；或原生動(dòng)物、海藻、真菌、酵母、植物、動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人類細(xì)胞。本發(fā)明的表達(dá)載體含有調(diào)控序列，如轉(zhuǎn)錄控制序列、翻譯控制序列、復(fù)制起點(diǎn)，和與宿主細(xì)胞相容并且控制多核苷酸表達(dá)的其他調(diào)控序列。具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄控制序列。轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄的起始、延伸，和終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄控制序列是控制轉(zhuǎn)錄起始的那些序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和阻抑子序列。合適的轉(zhuǎn)錄控制序列包括可在本發(fā)明的至少一個(gè)細(xì)胞中發(fā)揮作用的任何轉(zhuǎn)錄控制序列。多種這類轉(zhuǎn)錄控制序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法不包括病毒載體如腺病毒遞送核酸分子或構(gòu)建體的使用。

應(yīng)理解當(dāng)提供參數(shù)范圍時(shí)，本發(fā)明還提供在那個(gè)范圍內(nèi)的全部整數(shù)及其十分位。舉例來(lái)說(shuō)，“0.2-5mg”是0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg等至5.0mg的公開(kāi)。

本發(fā)明的實(shí)施方案提供以下技術(shù)：向細(xì)胞施加受控制的變形持續(xù)預(yù)定量的時(shí)間以便在細(xì)胞膜中引起擾動(dòng)，從而可將材料遞送到細(xì)胞內(nèi)部。所述變形可由例如壓力引起，該壓力是由機(jī)械應(yīng)力或剪切力誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)例中，微流體系統(tǒng)包括通過(guò)將流體在幾何上限制在小規(guī)模(例如，亞毫升體積，如微升、納升，或皮升)來(lái)控制和/或操縱流體的結(jié)構(gòu)。微流體系統(tǒng)能夠?qū)?shí)際上任何有效負(fù)載細(xì)胞內(nèi)遞送到細(xì)胞中。所述系統(tǒng)是由一個(gè)或多個(gè)微流體通道組成，所述微流體通道具有細(xì)胞從其中通過(guò)的縮窄部。優(yōu)選地，細(xì)胞流過(guò)懸浮于液體介質(zhì)中的微流體通道，所述液體介質(zhì)被壓力驅(qū)動(dòng)通過(guò)系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞通過(guò)縮窄部時(shí)，其膜受到擾動(dòng)，從而在膜中引起臨時(shí)破環(huán)并且造成存在于周圍介質(zhì)中的有效負(fù)載的攝取?？s窄部隨靶細(xì)胞的大小而變化，但優(yōu)選與細(xì)胞直徑處于相同數(shù)量級(jí)或小于細(xì)胞直徑。多個(gè)縮窄部可平行和/或串聯(lián)放置。細(xì)胞中的擾動(dòng)是在細(xì)胞中的突破，從而允許材料從細(xì)胞外部移動(dòng)到細(xì)胞中(例如，經(jīng)由孔洞、破口、腔洞、孔口、孔隙、裂口、間隙、穿孔)。由本文所述的方法制造的擾動(dòng)(例如間隙或孔洞)不是由于蛋白質(zhì)亞基的裝配以形成多聚孔結(jié)構(gòu)(如由補(bǔ)體或細(xì)菌溶血素所生成的結(jié)構(gòu))而形成。其他實(shí)施方案在所描述主題的范圍內(nèi)。

除非另外隱含地或明確地與使用其的上下文相矛盾，對(duì)細(xì)胞“擠壓(squeeze)”、“擠壓(squeezing)”、“變形”等的提及是指用于以極低細(xì)胞毒性將大分子直接遞送到細(xì)胞胞質(zhì)中的過(guò)程。此方法的基本原理是通過(guò)靶細(xì)胞的快速機(jī)械變形或擠壓造成的臨時(shí)膜破環(huán)，這允許經(jīng)由擴(kuò)散攝取在流體介質(zhì)中的大分子，且隨后進(jìn)行細(xì)胞膜修復(fù)(參見(jiàn)，例如2014年9月25日公開(kāi)的美國(guó)專利公布號(hào)2014/0287509，和2015年10月30日提交的pct國(guó)際專利公布號(hào)pct/us2015/058489，其各自的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文)。

線粒體疾病

線粒體疾病是由功能障礙的線粒體造成。線粒體疾病可例如由在線粒體dna(mtdna)或編碼線粒體組分的核基因中的獲得性或遺傳性突變引起。疾病也可以是獲得性線粒體功能障礙的結(jié)果，這歸因于藥物的副作用、感染，或其他環(huán)境原因。線粒體疾病的實(shí)例包括線粒體肌?。惶悄虿∧I??；一些形式的糖尿病和耳聾(dad)；leber遺傳性視神經(jīng)病變(lhon)；leigh綜合征；神經(jīng)病、共濟(jì)失調(diào)、色素性視網(wǎng)膜炎，和上瞼下垂(narp)；肌神經(jīng)源性胃腸腦病(mngie)；具有破碎紅纖維的肌陣攣性癲癇(merrf)；線粒體肌病、腦肌病、乳酸性酸中毒、中風(fēng)樣癥狀(melas)；以及線粒體神經(jīng)消化道腦肌病(mngie)。

向線粒體中遞送化合物是特別困難且無(wú)法預(yù)見(jiàn)的。線粒體存在于細(xì)胞內(nèi)并且還具有其自己的外(和內(nèi))膜。對(duì)于線粒體疾病的治療選擇以及用于在活細(xì)胞中改變線粒體功能或標(biāo)記線粒體的工具是有限的(marriage等人,jamdietassoc(2003)103(8):1029–38；kolesnikova等人,hum.mol.genet.(2004)13(20):2519-2534)。

本發(fā)明的方面涉及用于預(yù)防或治療線粒體疾病的方法，所述方法包括向線粒體遞送化合物(如核酸)。在一些實(shí)施方案中，使用本文所述的裝置和/或方法將核酸構(gòu)建體遞送到含有功能障礙線粒體的受精或未受精的卵中。在其他實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體被遞送到從受試者血液獲得并含有功能障礙線粒體的循環(huán)細(xì)胞(如免疫細(xì)胞)。遞送給具有功能障礙線粒體的細(xì)胞的構(gòu)建體可例如含有表達(dá)線粒體蛋白的重組基因，所述線粒體蛋白在功能障礙的線粒體中不產(chǎn)生、在缺乏的水平下產(chǎn)生，或有缺陷。如圖21所示，使用dfe遞送的核酸到達(dá)核和線粒體兩者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸被直接遞送到細(xì)胞中的功能障礙的線粒體。

本發(fā)明的方面還涉及遞送化合物用于研究線粒體疾病和/或功能。舉例來(lái)說(shuō)，可使用本文所述的裝置和方法將抗體、有機(jī)分子，或調(diào)節(jié)線粒體功能和/或標(biāo)記線粒體的其他化合物遞送到細(xì)胞。

電場(chǎng)

本發(fā)明的方面涉及，與標(biāo)準(zhǔn)或先前描述的電穿孔參數(shù)相比，較低電場(chǎng)強(qiáng)度的使用或?qū)τ陔妶?chǎng)的較短暴露。已經(jīng)報(bào)告了針對(duì)眾多細(xì)胞類型的電穿孔參數(shù)。參見(jiàn)，例如在www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/transfection---selection-misc/neon-transfection-system/neon-protocols-cell-line-data.html處關(guān)于轉(zhuǎn)染系統(tǒng)獲得的信息。也參見(jiàn)kim等人,(2008)biosensbioelectron,23(9):1353-1360，其內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。舉例來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可使用0.3-1kv/cm的電場(chǎng)，其中脈沖持續(xù)時(shí)間為5ms-50ms。轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的示例性電穿孔參數(shù)也提供于下表中。

人細(xì)胞類型的電穿孔參數(shù)

用于驅(qū)動(dòng)化合物和組合物到細(xì)胞中的場(chǎng)

與標(biāo)準(zhǔn)或先前公開(kāi)的電穿孔系統(tǒng)相比，dfe產(chǎn)生了更有效且更快速的核酸遞送(及后續(xù)功能，例如，編碼基因產(chǎn)物的表達(dá))，伴有增強(qiáng)的細(xì)胞活力。本發(fā)明提供了方法、系統(tǒng)和裝置，其中能量場(chǎng)如電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載通過(guò)由細(xì)胞變形縮窄部所引起的細(xì)胞膜中的擾動(dòng)或驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載從細(xì)胞中的一個(gè)位置到另一位置，例如從接近細(xì)胞膜處到一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞器。雖然一些示例性實(shí)施方式使用電場(chǎng)，但其他驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)也是適用的。舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)或多個(gè)電場(chǎng)、磁場(chǎng)和聲場(chǎng)可充當(dāng)驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。

如本文所用，電極是指可被配置為具有電荷并產(chǎn)生電場(chǎng)的任何電導(dǎo)體。一些實(shí)施方式可包括產(chǎn)生電場(chǎng)和/或磁場(chǎng)的交替方法和/或結(jié)構(gòu)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)被用于驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到細(xì)胞中。應(yīng)當(dāng)理解，電力工程領(lǐng)域的技術(shù)人員將通曉多種產(chǎn)生電場(chǎng)的方式。電場(chǎng)的實(shí)例在發(fā)明概述的通篇提供；然而，這些描述都不應(yīng)視為限制性的。例如，電場(chǎng)可由電極或除電極以外的手段產(chǎn)生。恒定或脈沖電場(chǎng)預(yù)期在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用。電場(chǎng)可為恒定或脈沖直流電。

在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，磁場(chǎng)被用于驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到細(xì)胞中?？僧a(chǎn)生磁場(chǎng)以便當(dāng)細(xì)胞移動(dòng)通過(guò)磁場(chǎng)時(shí)向細(xì)胞的有效負(fù)載施加力。磁場(chǎng)可例如由電磁體產(chǎn)生，電磁體可包括纏繞在鐵芯周圍的絕緣電線線圈。磁場(chǎng)還可由永久磁體(例如來(lái)自鐵磁材料)產(chǎn)生。

在磁轉(zhuǎn)染中，磁場(chǎng)可將磁性粒子集中在細(xì)胞表面上以增強(qiáng)胞吞樣過(guò)程以供細(xì)胞內(nèi)遞送。在優(yōu)選實(shí)施方案中，磁場(chǎng)的強(qiáng)度低于磁轉(zhuǎn)染所必需的。在涉及磁場(chǎng)的一些實(shí)施方案中，磁場(chǎng)強(qiáng)度為0.01t至10t。磁場(chǎng)的強(qiáng)度可基于許多因素而變化，包括有效負(fù)載的磁學(xué)特性。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，可生成介于1與1000t/m^-1之間的場(chǎng)梯度。

在本發(fā)明的額外實(shí)施方案中，聲場(chǎng)被用于驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到細(xì)胞中。例如，細(xì)胞可在離開(kāi)本發(fā)明的細(xì)胞變形縮窄部之后與聲場(chǎng)接觸。聲場(chǎng)可例如由揚(yáng)聲器、換能器或其他類似裝置生成。揚(yáng)聲器為將電磁波轉(zhuǎn)換成聲波的換能器。揚(yáng)聲器可接收來(lái)自如計(jì)算機(jī)或音頻接收器的裝置的音頻輸入。此輸入可呈模擬或數(shù)字形式。模擬揚(yáng)聲器可只是將模擬電磁波放大為聲波。因?yàn)槁暡ㄊ且阅M形式產(chǎn)生，所以數(shù)字揚(yáng)聲器必須首先將數(shù)字輸入轉(zhuǎn)換成模擬信號(hào)，然后生成聲波。聲波可在不同的頻率和振幅下生成。在一些實(shí)施方式中，在緩沖液或其他液體中的交替低壓和高壓波造成小真空泡的形成和塌陷，這可稱為空化?？栈鸶咚倥鲎惨后w射流和強(qiáng)流體動(dòng)力剪切力，這可用于操縱有效負(fù)載和細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，超聲處理用于產(chǎn)生聲場(chǎng)。

在與聲場(chǎng)有關(guān)的一些實(shí)施方案中，聲能強(qiáng)度可為例如1-1000j/cm²。然而，所用的能量可低于或高于此范圍，這取決于如暴露時(shí)間、細(xì)胞類型、所用的溶液或緩沖液、空化尺寸等因素。頻率的非限制性實(shí)例包括10khz-10mhz。

在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，光場(chǎng)被用于驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到細(xì)胞中。舉例來(lái)說(shuō)，可見(jiàn)的電磁輻射可用于在細(xì)胞離開(kāi)本發(fā)明的細(xì)胞變形縮窄部之后驅(qū)動(dòng)材料到細(xì)胞中?？梢?jiàn)的電磁輻射來(lái)源的實(shí)例包括發(fā)光二極管(led)、激光，和白熾燈泡。

cart細(xì)胞

通過(guò)修飾t細(xì)胞以表達(dá)識(shí)別癌癥特異性抗原的嵌合抗原受體(car)，可引發(fā)細(xì)胞識(shí)別并殺死腫瘤細(xì)胞，否則這些腫瘤細(xì)胞將逃脫免疫檢測(cè)。該過(guò)程涉及提取患者的t細(xì)胞，用car的基因轉(zhuǎn)染它們，然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞重新輸注到患者中。

這些人工t細(xì)胞受體(又名嵌合t細(xì)胞受體、嵌合免疫受體或car)是工程化的的受體，其將任意的特異性移植到免疫效應(yīng)細(xì)胞上。通常，這些受體用于將單克隆抗體的特異性移植到t細(xì)胞上。在本發(fā)明之前，核酸編碼序列的轉(zhuǎn)移通常由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體促成。本文所述的方法不利用或包括病毒載體。使用在所述裝置下的細(xì)胞擠壓(而無(wú)需病毒載體)將編碼序列或蛋白質(zhì)car遞送到免疫細(xì)胞(如t細(xì)胞)的胞質(zhì)。

對(duì)于治療性應(yīng)用，患者的t細(xì)胞是從外周血獲得(并任選富集或純化)并且被修飾以表達(dá)對(duì)特定的癌癥相關(guān)抗原有特異性的人工(嵌合)受體。修飾之后，t細(xì)胞識(shí)別并殺死癌癥。例如，示例性car識(shí)別cd19，一種在b細(xì)胞血液惡性腫瘤中表達(dá)的抗原。在t細(xì)胞被修飾以表達(dá)car之后，修飾的t細(xì)胞被重新輸注給患者。工程化的細(xì)胞識(shí)別并殺死癌細(xì)胞。這類療法已用于all、非何杰金氏淋巴瘤，和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(cll)，并且適于任何類型癌癥的治療，包括血液傳播癌，如白血病、b細(xì)胞惡性腫瘤(例如，急性淋巴母細(xì)胞性白血病(all)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病)以及實(shí)體癌。本文所述的細(xì)胞處理方法代表了一種用于產(chǎn)生cart細(xì)胞的優(yōu)良工藝。

在一些實(shí)施方案中，患者為人。在其他實(shí)施方案中，患者不是人。

示例性實(shí)施方案

本發(fā)明的方面提供一種用于在細(xì)胞膜中引起擾動(dòng)的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：限定管腔并被配置為使得懸浮于緩沖液中的細(xì)胞可從其中通過(guò)的微流體通道，其中所述微流體通道包括細(xì)胞變形縮窄部，其中所述縮窄部的直徑隨細(xì)胞的直徑而變化；和(a)能量場(chǎng)；或(b)安置在所述縮窄部的下游、上游，或上游和下游的能量場(chǎng)的來(lái)源或發(fā)射體。

本發(fā)明的方面還提供一種用于將有效負(fù)載遞送至細(xì)胞的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：限定管腔并被配置為使得懸浮于緩沖液中的細(xì)胞可從其中通過(guò)的微流體通道，其中所述微流體通道包括細(xì)胞變形縮窄部，其中所述縮窄部的直徑隨細(xì)胞的直徑而變化；和(a)能量場(chǎng)；或(b)安置在所述縮窄部的下游的能量場(chǎng)的來(lái)源或發(fā)射體。

在一些實(shí)施方案中，所述能量場(chǎng)包括電場(chǎng)且所述來(lái)源發(fā)射體包括電極。在某些實(shí)施方案中，所述能量場(chǎng)包括磁場(chǎng)且所述來(lái)源或發(fā)射體包括磁體或電磁體。在各個(gè)實(shí)施方案中，所述能量場(chǎng)包括(a)聲場(chǎng)且所述來(lái)源或發(fā)射體包括揚(yáng)聲器，或(b)光場(chǎng)且所述來(lái)源或發(fā)射體包括發(fā)光二極管(led)、激光，或白熾燈泡。

在各個(gè)實(shí)施方案中，(a)選擇所述縮窄部的直徑以誘發(fā)細(xì)胞膜的足夠大的臨時(shí)擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)，且細(xì)胞以連續(xù)流動(dòng)通過(guò)所述縮窄部到場(chǎng)中，其中通過(guò)所述縮窄部之后，細(xì)胞接觸或通過(guò)場(chǎng)的一部分，盡管有臨時(shí)擾動(dòng)，所述場(chǎng)的強(qiáng)度仍足以驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載；或(b)在通過(guò)所述縮窄部之后，細(xì)胞進(jìn)入并保留在所述縮窄部下游的所述裝置的區(qū)內(nèi)，其中所述區(qū)內(nèi)的細(xì)胞與場(chǎng)接觸。

在某些實(shí)施方案中，所述微流體通道是微流體系統(tǒng)中的多個(gè)平行微流體通道中的一個(gè)，所述多個(gè)平行微流體通道的每個(gè)微流體通道限定管腔并且被配置為使得懸浮于緩沖液中的細(xì)胞從其中通過(guò)，其中每個(gè)微流體通道包括細(xì)胞變形縮窄部，其中所述縮窄部的直徑隨細(xì)胞的直徑而變化。

在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)平行微流體通道包含至少約2、5、10、20、25、30、40、45、50、75、100、500、1,000，或2-1,000個(gè)微流體通道。

在各個(gè)實(shí)施方案中，選擇所述縮窄部的直徑以誘發(fā)細(xì)胞膜的足夠大的臨時(shí)擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)。

在某些實(shí)施方案中，所述電極包括產(chǎn)生電場(chǎng)的兩個(gè)電極以驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到懸浮于緩沖液中的細(xì)胞中。

在一些實(shí)施方案中，所述有效負(fù)載包括以下一種或多種：(a)脫氧核糖核酸(dna)；(b)核糖核酸(rna)；(c)包含一個(gè)或多個(gè)增加dna或rna的體內(nèi)或體外穩(wěn)定性或半衰期的修飾的核苷酸的dna或rna；(d)肽核酸(pna)；(e)甲基化的dna；(f)天然存在的染色體或其一部分；(g)表達(dá)載體；(h)蛋白質(zhì)；(i)小分子；(j)糖；(k)生物、合成、有機(jī)，或無(wú)機(jī)分子的聚合物；(l)帶電分子或包含帶電分子的組合物；或(m)不帶電分子。例如，(a)至(m)的任一種或任何混合物都可遞送給細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述有效負(fù)載是包含定位信號(hào)的多肽。

在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的微流體系統(tǒng)可進(jìn)一步包括多個(gè)電極對(duì)，其中電極對(duì)之間的電極尺寸不同。

在一些實(shí)施方案中，微流體系統(tǒng)包括(a)被配置到至少第一列和第二列電極中的多個(gè)電極，其中所述第一列電極偏離所述第二列電極，或(b)被配置到至少第一列和第二列電極對(duì)中的多個(gè)電極對(duì)，其中所述第一列電極對(duì)偏離所述第二列電極對(duì)。在各個(gè)實(shí)施方案中，第一列與第二列在水平、垂直或?qū)蔷€平面上以如下角度偏離：約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、1-10、1-20、1-30、1-45，或1-90°。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的微流體系統(tǒng)進(jìn)一步包括函數(shù)發(fā)生器，其耦合到至少一個(gè)電極并且驅(qū)動(dòng)至少一個(gè)電極產(chǎn)生電場(chǎng)以便在細(xì)胞被細(xì)胞變形縮窄部收縮之后驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到懸浮于緩沖液中的細(xì)胞中；或函數(shù)發(fā)生器，其經(jīng)由感應(yīng)驅(qū)動(dòng)至少一個(gè)電極產(chǎn)生電場(chǎng)以便在細(xì)胞被細(xì)胞變形縮窄部收縮之后驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到懸浮于緩沖液中的細(xì)胞中。

在一些實(shí)施方案中，所述函數(shù)發(fā)生器被配置來(lái)驅(qū)動(dòng)至少一個(gè)電極產(chǎn)生具有以下強(qiáng)度的電場(chǎng)：約0.1-0.5、0.1-1、0.1-1.5、0.1-2、0.1-2.5、0.1-3kv/cm、1-3kv/cm、0.1-10kv/cm、10-200kv/m，或10-2000kv/m。

在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的微流體系統(tǒng)包括細(xì)胞驅(qū)動(dòng)器以便驅(qū)動(dòng)細(xì)胞在壓力下通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部。

在某些實(shí)施方案中，懸浮于緩沖液中的細(xì)胞的流體流被引導(dǎo)到所述縮窄部中以便細(xì)胞主要被所述流體流壓縮。

在一些實(shí)施方案中，縮窄部的直徑為從其中通過(guò)的細(xì)胞直徑的約20-99％。

在某些實(shí)施方案中，縮窄部的直徑為約4、5、6、7、8、9、10、15、204-10μm，或10-20μm和/或縮窄部的長(zhǎng)度為約10、15、20、24、30、40、50、60、10-40、10-50、10-60，或10-40μm。

在各個(gè)實(shí)施方案中，所述微流體通道包括單個(gè)細(xì)胞變形縮窄部或多個(gè)串聯(lián)的細(xì)胞變形縮窄部。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之后約0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005，或0.0001-10秒或在離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之后約0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.01、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005，或0.0001-10秒內(nèi)與電場(chǎng)接觸。

在某些實(shí)施方案中，電場(chǎng)具有以下強(qiáng)度：約0.1-0.5、0.1-1、0.1-1.5、0.1-2、0.1-2.5、0.1-3kv/cm、1-3kv/cm、0.1-10kv/cm、10-200kv/m，或10-2000kv/m。

本發(fā)明的方面提供一種用于將化合物或組合物遞送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括：提供在含有效負(fù)載的溶液中的細(xì)胞；使所述溶液通過(guò)包括細(xì)胞變形縮窄部的微流體通道；使細(xì)胞通過(guò)所述縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞的胞質(zhì)中；使細(xì)胞與電場(chǎng)、磁場(chǎng)、聲場(chǎng)，或光場(chǎng)接觸，這些場(chǎng)將有效負(fù)載從細(xì)胞中的第一位置移位到細(xì)胞內(nèi)的第二位置。

本發(fā)明的方面還提供一種用于將化合物或組合物遞送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括：提供在含有效負(fù)載的溶液中的細(xì)胞；使所述溶液通過(guò)包括細(xì)胞變形縮窄部的微流體通道；使細(xì)胞通過(guò)所述縮窄部以便所述通過(guò)引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞的胞質(zhì)中；使細(xì)胞與電場(chǎng)、磁場(chǎng)、聲場(chǎng)，或光場(chǎng)接觸，這些場(chǎng)將有效負(fù)載從細(xì)胞中的第一位置移位到細(xì)胞內(nèi)的第二位置。

本發(fā)明的方面提供一種用于將化合物或組合物遞送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括：提供在含有效負(fù)載的溶液中的細(xì)胞；使所述溶液通過(guò)包括細(xì)胞變形縮窄部的微流體通道；使細(xì)胞通過(guò)所述縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供有效負(fù)載通過(guò)細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞的胞質(zhì)中；使細(xì)胞與電場(chǎng)、磁場(chǎng)、聲場(chǎng)或光場(chǎng)接觸，這些場(chǎng)驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到細(xì)胞中。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞與磁場(chǎng)接觸，且所述磁場(chǎng)是由至少一個(gè)電磁體產(chǎn)生。在各個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞與電場(chǎng)接觸，且所述電場(chǎng)是由一個(gè)或多個(gè)電極產(chǎn)生。

在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞在第一裝置中通過(guò)微流體通道，然后從所述第一裝置處移走并在第二裝置中與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸。

在各個(gè)實(shí)施方案中，所述微流體通道與所述電場(chǎng)、磁場(chǎng)及聲場(chǎng)在一個(gè)裝置內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，(a)細(xì)胞以連續(xù)流動(dòng)形式通過(guò)所述縮窄部到場(chǎng)中，其中在通過(guò)所述縮窄部之后，細(xì)胞接觸或通過(guò)所述場(chǎng)的一部分，盡管有臨時(shí)擾動(dòng)，所述場(chǎng)的強(qiáng)度仍足以驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載；或(b)在通過(guò)所述縮窄部之后，細(xì)胞流入并保留在其中細(xì)胞與場(chǎng)接觸的裝置的區(qū)內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是多個(gè)細(xì)胞，并且每個(gè)細(xì)胞通過(guò)多個(gè)平行微流體通道中的一個(gè)，其中所述多個(gè)平行微流體通道的每個(gè)微流體通道包括細(xì)胞變形縮窄部，且其中所述多個(gè)細(xì)胞通過(guò)所述電場(chǎng)。

在各個(gè)實(shí)施方案中，選擇所述縮窄部的直徑以誘發(fā)細(xì)胞膜足夠大的臨時(shí)擾動(dòng)供所述有效負(fù)載當(dāng)由電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)時(shí)通過(guò)。

在一些實(shí)施方案中，所述有效負(fù)載包括以下一種或多種：(a)脫氧核糖核酸(dna)；(b)核糖核酸(rna)；(c)包含一個(gè)或多個(gè)增加dna或rna的體內(nèi)或體外穩(wěn)定性或半衰期的修飾的核苷酸的dna或rna；(d)肽核酸(pna)；(e)甲基化的dna；(f)天然存在的染色體或其一部分；(g)表達(dá)載體；(h)蛋白質(zhì)；(i)小分子；(j)糖；(k)生物、合成、有機(jī)，或無(wú)機(jī)分子的聚合物；(l)帶電分子或包含帶電分子的組合物；或(m)不帶電分子。例如，(a)至(m)的任一種或任何混合物都可遞送給細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述有效負(fù)載是包含定位信號(hào)的多肽。

在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞與電場(chǎng)接觸，且所述有效負(fù)載被驅(qū)動(dòng)到以下一個(gè)或多個(gè)中：(a)所述細(xì)胞的核；(b)所述細(xì)胞的線粒體；或(c)除所述細(xì)胞的核或線粒體以外的所述細(xì)胞的細(xì)胞器。

在各個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞與電場(chǎng)接觸，且所述有效負(fù)載在所述細(xì)胞通過(guò)所述電場(chǎng)時(shí)或在所述細(xì)胞通過(guò)所述電場(chǎng)之后小于0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-48小時(shí)被驅(qū)動(dòng)到所述細(xì)胞的核中。

在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是多個(gè)細(xì)胞且所述有效負(fù)載是在細(xì)胞核中時(shí)表達(dá)的dna，且其中至少約10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100、0-65，或10-100％所述多個(gè)細(xì)胞在所述多個(gè)細(xì)胞通過(guò)所述電場(chǎng)之后約0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、0.1-4，或0.1-48小時(shí)內(nèi)表達(dá)所述dna。

在某些實(shí)施方案中，電場(chǎng)是由兩個(gè)電極產(chǎn)生以驅(qū)動(dòng)有效負(fù)載到懸浮于緩沖液中的細(xì)胞中。

在各個(gè)實(shí)施方案中，電場(chǎng)是由多個(gè)電極對(duì)產(chǎn)生，其中電極對(duì)之間的電極尺寸不同。

在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)電極是由耦合到所述電極上的函數(shù)發(fā)生器驅(qū)動(dòng)，所述函數(shù)發(fā)生器驅(qū)動(dòng)所述電極產(chǎn)生電場(chǎng)用于在所述細(xì)胞被所述細(xì)胞變形縮窄部收縮之后驅(qū)動(dòng)所述有效負(fù)載到懸浮于緩沖液中的細(xì)胞中。

在某些實(shí)施方案中，懸浮于緩沖液中的細(xì)胞的流體流被引導(dǎo)到所述縮窄部中以便細(xì)胞主要被所述流體流壓縮。

在一些實(shí)施方案中，縮窄部的直徑為從其中通過(guò)的細(xì)胞直徑的約20-99％。在一些實(shí)施方案中，所述縮窄部的直徑為約4、5、6、7、8、9、10、15、204-10μm，或10-20μm。在一些實(shí)施方案中，所述縮窄部的長(zhǎng)度為約10、15、20、24、30、40、50、60、10-40、10-50、10-60，或10-40μm。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之后約0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005，或0.0001-10秒或在離開(kāi)細(xì)胞變形縮窄部之后約0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005，或0.0001-10秒內(nèi)與電場(chǎng)接觸。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞對(duì)所述電場(chǎng)的暴露時(shí)間為約10-50ms、50-100ms或10-100ms。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)是恒定的。在一些實(shí)施方案中，電場(chǎng)是恒定或脈沖直流電。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)是脈沖調(diào)制的。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)是在約50-200μs下脈沖調(diào)制。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度為約1-3kv/cm或0.1-10kv/cm，或0.1至0.5、0.1至1、0.1至1.5、0.1至2、0.1至2.5，或0.1至3kv/cm。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度小于電穿孔所述細(xì)胞所必需的強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，所述脈沖寬度小于遞送相同量的有效負(fù)載到相應(yīng)細(xì)胞所必需的脈沖寬度。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度比電穿孔所述細(xì)胞所必需的強(qiáng)度小約50、1-50、50-99，或1-99％。在一些實(shí)施方案中，約10-35psi的壓力被用于使溶液通過(guò)所述微流體通道。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞以約300、100-300、200-700、250-400、100-1000mm/s，或1-1000mm/s的速度通過(guò)所述微流體通道。在一些實(shí)施方案中，所述微流體通道包括多個(gè)串聯(lián)的細(xì)胞變形縮窄部。在一些實(shí)施方案中，所述微流體通道包括單個(gè)細(xì)胞變形縮窄部。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是多個(gè)細(xì)胞，并且約80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、90-95，或80-100％的所述細(xì)胞在通過(guò)所述電場(chǎng)之后是活的。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)的強(qiáng)度或脈沖強(qiáng)度為約10-2000kv/m，或小于100kv/m。在一些實(shí)施方案中，所述電場(chǎng)是以約0.1、0.1-2，或0.1-2000ms的持續(xù)時(shí)間，1-20、0.1-2000，或1-200ms的周期脈沖調(diào)制。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞以約100、170、300、100-300、200-700、250-400、100-1000mm/s，或1-1000mm/s的速度通過(guò)電場(chǎng)。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞膜的擾動(dòng)包括約1-20、1-600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500，或600nm的最大直徑。在一些實(shí)施方案中，具有約1-20、1-600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500，或600nm的最大直徑的所述細(xì)胞膜的擾動(dòng)在所述細(xì)胞膜上持續(xù)至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或1-10分鐘。

在各個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為紅細(xì)胞、t細(xì)胞、b細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、nk細(xì)胞、ilc，或其任何組合。

本發(fā)明的方面提供一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括：使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)；使所述溶液通過(guò)由至少一個(gè)電極生成的電場(chǎng)以便驅(qū)動(dòng)所述表達(dá)載體到細(xì)胞中，其中所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中以比在通過(guò)電場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)更快的速率表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中早于在與電場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)表達(dá)。

本發(fā)明的方面還提供一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括：使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)；使所述溶液通過(guò)由至少一個(gè)電極生成的電場(chǎng)以便驅(qū)動(dòng)所述表達(dá)載體到細(xì)胞中，其中所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的最大限度表達(dá)以比在通過(guò)電場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的細(xì)胞中的所述表達(dá)更快的速率完成或檢測(cè)到。

在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的表達(dá)早于在與電場(chǎng)、磁場(chǎng)或聲場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的所述表達(dá)約0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)完成。

本發(fā)明的方面還提供一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括：使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)；使所述溶液通過(guò)由至少一個(gè)電極生成的電場(chǎng)以便驅(qū)動(dòng)所述表達(dá)載體到細(xì)胞中，其中所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中以與在通過(guò)電場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相比更大的程度表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞通過(guò)縮窄部并且與場(chǎng)接觸之后，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平大于通過(guò)電場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的表達(dá)水平。

在各個(gè)實(shí)施方案中，在所述細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)比在與電場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)多至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。

在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞通過(guò)縮窄部之后約0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)內(nèi)，在所述細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)比在與電場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)多至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。

本發(fā)明的方面提供一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞群體中的方法，所述方法包括：使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)；使所述溶液通過(guò)由至少一個(gè)電極生成的電場(chǎng)以便驅(qū)動(dòng)所述表達(dá)載體到細(xì)胞中，其中在群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例大于在通過(guò)電場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例。

在一些實(shí)施方案中，在群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞比例比在與電場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞比例大至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。

在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞通過(guò)縮窄部之后約0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)內(nèi)，在群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞比例比在與電場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞比例大至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。

本發(fā)明的方面還提供一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞群體中的方法，所述方法包括：使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)；使所述溶液通過(guò)由至少一個(gè)電極生成的電場(chǎng)以便驅(qū)動(dòng)所述表達(dá)載體到細(xì)胞中，其中在群體中表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例大于在通過(guò)電場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的細(xì)胞群體中表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例。

在某些實(shí)施方案中，在群體中表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例比在與電場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例大至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。

在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞通過(guò)縮窄部之后約0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)內(nèi)，在群體中表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例比在與電場(chǎng)接觸而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞群體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的比例大至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或?yàn)?倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。

本發(fā)明的方面提供一種用于將編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體遞送到細(xì)胞中的方法，所述方法包括：使包含細(xì)胞和表達(dá)載體的溶液通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部以便施加壓力于細(xì)胞上，從而引起足夠大的細(xì)胞膜擾動(dòng)供表達(dá)載體通過(guò)；使所述溶液通過(guò)由至少一個(gè)電極生成的電場(chǎng)以便驅(qū)動(dòng)所述表達(dá)載體到細(xì)胞中，其中所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的表達(dá)早于在通過(guò)電場(chǎng)而不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。

在各個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因在所述細(xì)胞中比在與電場(chǎng)接觸但不通過(guò)細(xì)胞變形縮窄部的相應(yīng)細(xì)胞中的表達(dá)早約0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小時(shí)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：用于dna遞送的微流體平臺(tái)

已為dna轉(zhuǎn)染開(kāi)發(fā)了許多技術(shù)。基于載體的方法如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染非常依賴載體與細(xì)胞膜之間的相互作用以及dna的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)(一個(gè)生物活性過(guò)程)。顯微注射已用于直接遞送dna到核中以供轉(zhuǎn)錄，然而，其受到通量的限制。電穿孔已廣泛用于dna轉(zhuǎn)染，然而，其機(jī)制仍有爭(zhēng)議并且還受到電脈沖之后其對(duì)從質(zhì)膜到核的主動(dòng)dna轉(zhuǎn)運(yùn)的依賴的限制。在此，描述了一個(gè)細(xì)胞內(nèi)遞送的概念，其被稱為破環(huán)和場(chǎng)實(shí)現(xiàn)的遞送(dfe；此術(shù)語(yǔ)不限于本實(shí)施例的實(shí)施方案)。在dfe中，首先通過(guò)破環(huán)打開(kāi)質(zhì)膜中的擾動(dòng)，然后通過(guò)那些間隙實(shí)現(xiàn)dna向胞質(zhì)和核中的遞送。此策略涉及將機(jī)械破壞與電場(chǎng)組合，其中貨物分子或其混合物如gfp質(zhì)粒dna被直接遞送到核中并在處理之后1小時(shí)內(nèi)表達(dá)，其比如電穿孔的其他方法更快速。此新型策略適用于難以轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)基因遞送，和廣泛范圍材料的共遞送。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)于在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的許多研究是必需的。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，包括生物、化學(xué)和物理方法。生物/化學(xué)方法通常依賴于載體，如病毒、囊泡、肽或納米顆粒(nayak等人,genether.17,295–304(2010)；wu等人,biotechnol.progr.18,617–622(2002)；schmid等人,gut41,549–556(1997)；lee等人,nat.nanotechnol.7,389–393(2012))。物理方法主要使用膜破環(huán)技術(shù)，如微量注射、電穿孔、激光穿孔，和粒子轟擊用于基因遞送(o’brien&lummis,natureprotoc.1,977–981(2006)；wells,d.j.genether.11,1363–1369(2004)；meacham等人,j.lab.autom.19,1–18(2014)；capecchi,cell22,479–488(1980)；nagy等人,manipulatingthemouseembryo:alaboratorymanual(coldspringlaboratory,2003))。裸核酸向細(xì)胞中的遞送對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染而言可能是最安全且最牢靠的方法(wolff&budker,advancesingenetics,54,3–20(2005))。在可遞送裸遺傳物質(zhì)的物理方法之中，電穿孔是迄今為止最流行的，這歸因于其簡(jiǎn)易性、相當(dāng)良好的效率，和其處理某些激發(fā)的原代細(xì)胞的能力(neumann等人,emboj.1,841–845(1982))。自從其首次在20世紀(jì)80年代初期報(bào)道以來(lái)，電穿孔，又名電滲透，已廣泛用于生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中許多不同細(xì)胞的核酸的細(xì)胞內(nèi)遞送。雖然電穿孔已顯示出它的優(yōu)點(diǎn)并且廣泛用于dna轉(zhuǎn)染，但其遞送的基本原理仍未得到充分理解(escoffre等人,mol.biotechnol.41,286–95(2009)；vasilkoski等人,phys.rev.e74,021904(2006)；klenchin等人,electricallyinduceddnauptakebycellsisafastprocessinvolvingdnaelectrophoresis.60,(1991)；weaver等人,bioelectrochemistry87,236–43(2012)；jordan等人(編著)(2013)electroporationandelectrofusionincellbiology.springerscience&businessmedia)。已經(jīng)普遍接受的是，在電穿孔過(guò)程中，dna分子積聚并在電脈沖期間與電滲透化的質(zhì)膜相互作用。之后，那些dna聚集物則內(nèi)化到胞質(zhì)中且隨后造成基因表達(dá)(golzio等人,proc.natl.acad.sci.99,1292–1297(2002)；paganin-gioanni等人proc.natl.acad.sci.u.s.a.108,10443–7(2011)；rosazza等人mol.ther.21,2217–2226(2013)；boukany等人,nat.nanotechnol.6,747–54(2011)；teissie等人,biochim.biophys.acta1724,270–80(2005)；yarmush等人,annu.rev.biomed.eng.16,295–320(2014)；geng&lu,labchip13,3803–21(2013))。dna質(zhì)粒未必能夠僅僅經(jīng)由擴(kuò)散行進(jìn)通過(guò)粘稠和擁擠的細(xì)胞質(zhì)而到達(dá)核(lechardeur等人,adv.drugdeliv.rev.57,755–767(2005)；dowty等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.92,4572–4576(1995))。一些研究顯示dna從質(zhì)膜向核的轉(zhuǎn)運(yùn)是經(jīng)由細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)運(yùn)如經(jīng)由微管和肌動(dòng)蛋白網(wǎng)的主動(dòng)的生物過(guò)程(rosazza等人mol.ther.21,2217–2226(2013))。已發(fā)現(xiàn)微管和肌動(dòng)蛋白網(wǎng)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的dna轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，并且所述過(guò)程的時(shí)間標(biāo)度可為數(shù)小時(shí)，這取決于細(xì)胞類型。質(zhì)膜與核之間的dna轉(zhuǎn)移的不清楚的機(jī)制和復(fù)雜的性質(zhì)妨礙了電穿孔在難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的進(jìn)一步應(yīng)用和改善。此外，用于當(dāng)前電穿孔技術(shù)中的強(qiáng)場(chǎng)可導(dǎo)致顯著的損傷或死亡(yarmush等人,annu.rev.biomed.eng.16,295–320(2014)；geng&lu,labchip13,3803–21(2013))，一個(gè)由本文所述的dfe避免的問(wèn)題。就此而言，對(duì)于創(chuàng)造可將裸dna直接送到核中而不依賴不明確的運(yùn)輸途徑的技術(shù)有相當(dāng)大的興趣。較早的方法或手段在技術(shù)上常常較為復(fù)雜，具有相對(duì)較低的通量并且與某些原代細(xì)胞不相容。

dna向核中的高通量、有效遞送

本文公開(kāi)了破壞和場(chǎng)實(shí)現(xiàn)的遞送(dfe)概念的部署。在此方法中，首先通過(guò)機(jī)械過(guò)程破壞細(xì)胞膜，之后將細(xì)胞暴露于場(chǎng)以驅(qū)動(dòng)材料到靶細(xì)胞中。已開(kāi)發(fā)一種微流體裝置，其可將dna以高通量直接遞送到細(xì)胞核中。dfe概念的一個(gè)實(shí)施方式涉及使用細(xì)胞擠壓來(lái)暫時(shí)破壞細(xì)胞膜，之后使細(xì)胞暴露于電場(chǎng)，該電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)帶負(fù)電的dna通過(guò)膜破環(huán)，例如核膜或線粒體膜，并且在貨物遞送到細(xì)胞的胞質(zhì)中之后進(jìn)入到細(xì)胞核中。cellsqueeze技術(shù)已顯示出在遞送多種材料穿過(guò)細(xì)胞類型上的穩(wěn)固能力，但在分離中在促進(jìn)dna的核遞送方面是無(wú)效的(shalek等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.107,1870–5(2010))。不同于其中dna分子電泳式地向質(zhì)膜遷移并在質(zhì)膜上聚集的電穿孔，在dfe過(guò)程中，dna分子通過(guò)由機(jī)械破壞在細(xì)胞膜中產(chǎn)生的擾動(dòng)或間隙遷移到細(xì)胞中和/或細(xì)胞內(nèi)。參見(jiàn)，例如圖9a。此組合過(guò)程(dfe)在貨物(例如帶電化合物，例如dna)向胞質(zhì)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的遞送上產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)。協(xié)同作用是通過(guò)測(cè)量所遞送貨物的功能，例如所遞送的dna的基因表達(dá)來(lái)證明。

此實(shí)施例描述了一種獨(dú)特的微流體裝置，其可通過(guò)將機(jī)械破壞與對(duì)電場(chǎng)的暴露組合以高通量直接遞送dna到核中。細(xì)胞擠壓技術(shù)已被證明是用于機(jī)械地破壞質(zhì)膜的有效技術(shù)。當(dāng)細(xì)胞流過(guò)具有小于細(xì)胞直徑的最小尺寸的縮窄通道時(shí)，短暫的變形導(dǎo)致在質(zhì)膜中形成孔洞，周圍材料可通過(guò)這些孔洞直接擴(kuò)散到細(xì)胞胞質(zhì)中。

每個(gè)裝置是由一組平行、相同的縮窄通道和一組電極集成，如圖9a-c所示。在此實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)中，使用drie(深反應(yīng)離子蝕刻)將75個(gè)平行通道蝕刻到硅晶片中并且通過(guò)用電極圖案化的pyrex的陽(yáng)極鍵合來(lái)密封(對(duì)于更多的制造細(xì)節(jié)，參見(jiàn)圖13)?？s窄部的寬度和長(zhǎng)度分別在4-10um和10-30um范圍內(nèi)。每個(gè)電極的長(zhǎng)度、寬度，和電極之間的間隙距離分別為8mm、60um，和40um。施加于裝置的電脈沖的持續(xù)時(shí)間和占空比在50-200us和1％-5％范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法可在極高的通量下操作。舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)胞可在以下通量下處理：至少約10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、1百萬(wàn)，或1至1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/s。細(xì)胞和所需材料的混合物通過(guò)由調(diào)節(jié)器控制的氣體壓力(例如氮?dú)鈮毫?被驅(qū)動(dòng)到入口中。當(dāng)樣品被置于裝置中時(shí)將電脈沖施加于裝置上，以便細(xì)胞在擠壓之后恰好經(jīng)歷電場(chǎng)。細(xì)胞在電場(chǎng)中的暴露時(shí)間通常在10-50ms范圍內(nèi)，這取決于流速。

為了探究dna遞送的工作機(jī)制，進(jìn)行了許多實(shí)驗(yàn)來(lái)表征使用模型細(xì)胞和模型貨物的此dfe技術(shù)的性能，如圖10a和10b中所示。使用不同的脈沖振幅，用dfe裝置處理希拉細(xì)胞和gfp質(zhì)粒dna的混合物。然后在37c下培育細(xì)胞24小時(shí)。通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量gfp熒光來(lái)表征dna表達(dá)。將dfe10-6裝置用于此實(shí)驗(yàn)中。dfe10-6表示dfe裝置的縮窄部尺寸，第一數(shù)字對(duì)應(yīng)于縮窄部長(zhǎng)度，而第二數(shù)字對(duì)應(yīng)于寬度(以微米計(jì))。影響機(jī)械破壞性能的兩個(gè)控制參數(shù)包括細(xì)胞速度和縮窄部尺寸，并且控制電場(chǎng)性能的三個(gè)參數(shù)是電脈沖分布、強(qiáng)度，和脈沖數(shù)量(取決于通道中的細(xì)胞速度)。首先研究脈沖強(qiáng)度如何影響dna轉(zhuǎn)染。在dfe10-6處理中，當(dāng)所施加的振幅分別增至8v和10v時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染達(dá)到60％和90％以上，如圖10a中的紅色柱所示。作為對(duì)照組，使用具有相同電場(chǎng)和細(xì)胞速度但沒(méi)有縮窄部結(jié)構(gòu)的裝置(在此實(shí)驗(yàn)中，速度而非壓力是受控制的)處理細(xì)胞。在其中細(xì)胞僅經(jīng)歷電場(chǎng)但沒(méi)有機(jī)械破壞的這種設(shè)計(jì)中，dna轉(zhuǎn)染效力在所施加的振幅增至14v之后達(dá)到60％。兩個(gè)情況具有類似的細(xì)胞活力，如圖10b中所示，表明機(jī)械破壞在較低場(chǎng)強(qiáng)度下顯著地提高dna遞送，同時(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生可忽略的損害。質(zhì)膜的機(jī)械破壞促進(jìn)以下電轉(zhuǎn)染過(guò)程。

還研究了細(xì)胞速度對(duì)轉(zhuǎn)染的影響。例如，如圖14所示，在10v的所施加脈沖下，當(dāng)細(xì)胞速度提高時(shí)，dna表達(dá)減少，這歸因于細(xì)胞在行進(jìn)穿過(guò)電場(chǎng)時(shí)所接受的脈沖數(shù)目的減少。細(xì)胞活力與dna表達(dá)之間的所需平衡在接近300mm/s的細(xì)胞速度下實(shí)現(xiàn)。這些示例性條件平衡了在低速下潛在嚴(yán)重的電損傷與在高速下的機(jī)械損傷的影響。不透膜的、cascadeblue標(biāo)記的3-kda葡聚糖分子向活的希拉細(xì)胞的遞送效率首先下降，然后隨著細(xì)胞速度的提高而提高，表明對(duì)于此分子的遞送的潛在主要作用從機(jī)械破壞轉(zhuǎn)換到電場(chǎng)，然后回到機(jī)械破壞。在3kda葡聚糖與dna情況之間的性能差異進(jìn)一步突顯了電場(chǎng)效應(yīng)對(duì)于dna的重要性。

為了進(jìn)一步研究dfe遞送的機(jī)制，對(duì)使用dfe及其他四種廣泛使用的dna轉(zhuǎn)染技術(shù)用gfp質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染希拉細(xì)胞的能力進(jìn)行比較研究：顯微注射、lipofectormine2000、me(微流體(無(wú)擠壓)+電場(chǎng))和bep(批量電穿孔，使用neon電穿孔系統(tǒng)，一種常用的市售電穿孔工具)。在用每種技術(shù)處理之后，使用流式細(xì)胞術(shù)分析gfp表達(dá)，如圖11所示。bep和me顯示，與gfp類似的表達(dá)動(dòng)力學(xué)在處理之后首個(gè)24小時(shí)內(nèi)逐漸表達(dá)。70％的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在4-48小時(shí)之間表達(dá)gfp。然而，在顯微注射和dfe中，超過(guò)80％的表達(dá)gfp的細(xì)胞(在48小時(shí)之后表達(dá)gfp熒光的細(xì)胞)在處理后的第一個(gè)小時(shí)內(nèi)具有可測(cè)量的表達(dá)，表明在處理不久以后出現(xiàn)dna轉(zhuǎn)錄/翻譯。剩余的20％最終表達(dá)gfp的細(xì)胞(在48小時(shí)之后表達(dá)gfp的細(xì)胞)在處理后1至4小時(shí)具有可檢測(cè)的表達(dá)。顯微注射被廣泛接受為促進(jìn)材料向核中直接注射的手段。顯微注射和dfe具有相似的dna表達(dá)動(dòng)力學(xué)的事實(shí)是以下強(qiáng)有力的證據(jù)：由dfe遞送的dna對(duì)于核中的轉(zhuǎn)錄是立即可得的。相反，在脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofectamine2000)情況中，極少的gfp熒光見(jiàn)于處理后的首個(gè)4小時(shí)內(nèi)，并且超過(guò)95％的轉(zhuǎn)染細(xì)胞在處理之后4-48h之間表達(dá)gfp。通過(guò)dfe、bep和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的表達(dá)gfp的細(xì)胞的熒光圖像示于圖15中。為了更好地理解dfe的機(jī)制，在統(tǒng)計(jì)上比較希拉細(xì)胞中表達(dá)的gfp的熒光強(qiáng)度，如圖16所示。在bep中，向核的遷移及后續(xù)轉(zhuǎn)錄需要許多小時(shí)，并且gfp熒光在整個(gè)24小時(shí)內(nèi)都是增加的。大部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在處理后馬上開(kāi)始增加并且在6小時(shí)內(nèi)變得飽和，表明當(dāng)dna被送到核中時(shí)dna轉(zhuǎn)錄從相似的起始時(shí)點(diǎn)開(kāi)始出現(xiàn)。

為了進(jìn)一步探究dna轉(zhuǎn)移的工作機(jī)制，使用cy3標(biāo)記的質(zhì)粒dna在單細(xì)胞水平下直接目測(cè)dna的分布。將細(xì)胞首先用dapi和cellmask綠色質(zhì)膜染色劑培育以用于核和膜染色，然后在dfe、bep及機(jī)械破壞處理之前馬上與標(biāo)記的dna混合。處理之后，將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培育2分鐘，然后使用細(xì)胞固定試劑盒進(jìn)行固定。使用nikona1r共焦顯微鏡進(jìn)行光學(xué)測(cè)量。當(dāng)施加15ms/1200v的電脈沖(已知用于滲透細(xì)胞)時(shí)，強(qiáng)烈的cy3熒光在質(zhì)膜水平下出現(xiàn)，表明dna在膜上的吸收和積聚。此結(jié)果與先前論證dna不對(duì)稱埋入質(zhì)膜中的研究一致。在機(jī)械破壞中，用共焦顯微鏡幾乎沒(méi)有或沒(méi)有在胞質(zhì)中檢測(cè)到標(biāo)記dna的熒光，但基于流式細(xì)胞術(shù)的早先研究已論證了標(biāo)記dna的一些遞送。在dfe中，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的dna熒光分布在胞質(zhì)、核和質(zhì)膜中。有趣的是，質(zhì)膜中的dna以相對(duì)于bep的單極分布的雙極方式分布，潛在地指示標(biāo)記的dna在其暴露于電場(chǎng)期間進(jìn)入和離開(kāi)細(xì)胞的途徑。dna在胞質(zhì)和核中的直接目測(cè)進(jìn)一步指示dfe能夠直接更有效的遞送dna到核中。所述結(jié)果證明dfe提供促進(jìn)功能性材料向細(xì)胞內(nèi)部的胞質(zhì)、核及其他亞細(xì)胞器中的有效遞送的更有力手段。

細(xì)胞內(nèi)遞送是在多種應(yīng)用中起重要作用的有挑戰(zhàn)性的過(guò)程?；谥|(zhì)體和納米顆粒的方法難以轉(zhuǎn)用于原代細(xì)胞或非核酸，電穿孔具有毒性問(wèn)題并且對(duì)于不高度帶電的大分子可能無(wú)效，且機(jī)械破壞方法可努力提供足夠的核遞送。dfe將機(jī)械膜破環(huán)的效力與場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)力組合，因此保持機(jī)械破壞的穩(wěn)固遞送能力，同時(shí)提高帶電貨物如核酸(例如質(zhì)粒)的核遞送。

dna從質(zhì)膜到核的轉(zhuǎn)運(yùn)及后續(xù)轉(zhuǎn)錄是復(fù)雜的、很可能主動(dòng)的過(guò)程，其可能耗費(fèi)數(shù)小時(shí)，并且在不同的細(xì)胞類型中可顯著不同。此過(guò)程在電穿孔和基于載體的方法如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染中是重要的，并且被認(rèn)為妨礙難以轉(zhuǎn)移的細(xì)胞如免疫細(xì)胞和干細(xì)胞的dna轉(zhuǎn)染。本文所述的數(shù)據(jù)證明dfe通過(guò)聯(lián)合機(jī)械破壞和電場(chǎng)將dna直接遞送到胞質(zhì)和核中。細(xì)胞首先通過(guò)具有縮窄部的微通道以在質(zhì)膜上產(chǎn)生擾動(dòng)。不希望受任何科學(xué)理論的約束，結(jié)果顯示在暴露于電場(chǎng)之后，驅(qū)動(dòng)周圍dna到胞質(zhì)和核中。希拉細(xì)胞、gfp質(zhì)粒dna，和cy3熒光標(biāo)記的質(zhì)粒dna被用于研究和探討dfe在單細(xì)胞水平和統(tǒng)計(jì)水平下的工作機(jī)制。這是裸dna質(zhì)粒在高通量設(shè)置下的最快表達(dá)，表明無(wú)載體輔助。比較使用不同技術(shù)的dna轉(zhuǎn)移的可視化過(guò)程。圖10中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的dna表達(dá)動(dòng)態(tài)顯示dna向核的轉(zhuǎn)移及后續(xù)轉(zhuǎn)錄在希拉細(xì)胞中可能需要4小時(shí)有余。用常規(guī)電穿孔的dna表達(dá)略快一些。關(guān)于dna在電穿孔過(guò)程期間如何遷移到核中一直有爭(zhēng)議。一些人相信電脈沖滲透細(xì)胞膜并且電泳驅(qū)動(dòng)dna直接到核中，而其他人觀察到dna首先在質(zhì)膜的電滲透化區(qū)域處形成聚集物，然后經(jīng)由生物活性過(guò)程向核遷移。在此實(shí)施例中描述的bep結(jié)果中，在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)20％的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)gfp且在接下來(lái)的20小時(shí)期間80％表達(dá)。這可能是上述機(jī)制都在bep中出現(xiàn)的跡象。在處理之后立即表達(dá)gfp的小部分細(xì)胞可直接電泳dna到核中，而在4小時(shí)之后表達(dá)gfp(像脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)的大部分細(xì)胞必須轉(zhuǎn)運(yùn)dna到核中用于表達(dá)。

dfe遞送模式將膜破環(huán)與場(chǎng)效應(yīng)合并以實(shí)現(xiàn)與任何單獨(dú)技術(shù)相比的更大效力，例如協(xié)同效應(yīng)。電穿孔可解決許多細(xì)胞類型的dna轉(zhuǎn)染，但在遞送一些材料如蛋白質(zhì)上具有限制，并且可有毒性。機(jī)械破壞技術(shù)(如擠壓)在以極小毒性遞送多種材料(包括蛋白質(zhì)和納米材料)到多種細(xì)胞類型顯示出了重大成功。然而，其在dna上具有有限的成功，這大概是因?yàn)闊o(wú)效的核遞送。通過(guò)將機(jī)械破壞與電場(chǎng)效應(yīng)組合，dfe顯示出了對(duì)于dna表達(dá)的更佳(例如協(xié)同)結(jié)果并且能夠遞送蛋白質(zhì)，這是用任何上述方法單獨(dú)難以實(shí)現(xiàn)的里程碑。

裝置制造和實(shí)驗(yàn)設(shè)置

硅晶片鍵合到pyrex晶片上以形成dfe微流體裝置。制造包括兩個(gè)主要步驟：(1)在硅晶片上制造微流體通道，和(2)在pyrex晶片上制造微流體電極。將裝置安裝到具有入口和出口貯器的保持件上。電脈沖是由函數(shù)發(fā)生器(agilente4422b)產(chǎn)生并且經(jīng)由放大器增益以通過(guò)使用導(dǎo)電環(huán)氧樹脂鍵合到電極墊片上的電線驅(qū)動(dòng)裝置。將與所需遞送材料(貨物化合物或組合物)混合的細(xì)胞溶液置于入口貯器中。然后將此貯器連接到由調(diào)節(jié)器控制的壓縮空氣管線上。壓力(0-20psi)被用于驅(qū)動(dòng)流體通過(guò)該裝置，當(dāng)細(xì)胞通過(guò)的同時(shí)施加電脈沖于裝置上。從出口貯器處收集細(xì)胞，以便經(jīng)歷進(jìn)一步處理。

如上所指出，微流體裝置的制造中涉及兩個(gè)主要步驟(圖13)：(1)在pyrex晶片上制造電極，和(2)在硅晶片上制造微流體通道。圖13(a-d)示出了電極的過(guò)程。將一層光刻膠(spr3012,microchem,newton,ma)旋涂在6英寸的pyrex晶片上，用uv光源圖案化，并且在光刻膠顯影劑(mfcd-26,microposit)中顯影。隨后使用電子束蒸發(fā)器(semicorecorp)將雙層金屬(ti/pt，)沉積在晶片上，然后進(jìn)行剝離工藝以除去光刻膠并形成電極和墊片。涉及光刻法的兩個(gè)步驟來(lái)制造硅微流體通道，如圖13(e-h)所示。硅晶片首先由光刻膠(shipley1827,microchem,newton,ma)來(lái)圖案化并且通過(guò)深反應(yīng)離子蝕刻(drie,adixen,hingham,ma)進(jìn)行蝕刻。施用第二光刻法和drie來(lái)經(jīng)由硅晶片蝕刻以形成微流體裝置的入口和出口。

最終，使用在300和800v下的陽(yáng)極鍵合，用pyrex層密封硅層，并且切割成具有6×23mm²尺寸的單獨(dú)芯片。最終裝置示于圖9b中。設(shè)置中所用的電極指狀物的寬度和裝置的空間間隙分別為40μm和60μm。硅襯底中微流體通道的高度為20μm。

細(xì)胞培養(yǎng)：將希拉細(xì)胞在含有補(bǔ)充有10％胎牛血清(fbs,invitrogen16000)的20mldmem培養(yǎng)基的75t燒瓶中培養(yǎng)。在含有5％co2的濕潤(rùn)氣氛中，在37c下將細(xì)胞接種于t燒瓶中。

遞送材料：將包括葡聚糖和質(zhì)粒dna的熒光標(biāo)記分子以0.1mg/ml的濃度與細(xì)胞溶液混合。gfpdna質(zhì)粒被用于測(cè)量dna轉(zhuǎn)染。

脂質(zhì)轉(zhuǎn)染：lipofectamine2000dna轉(zhuǎn)染試劑盒被用于代表脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)。通過(guò)將2ul的lipofection2000試劑與1ug的dna質(zhì)粒在100ul的opti-mem培養(yǎng)基中合并來(lái)制備dna-脂質(zhì)復(fù)合體。

顯微注射：在麻省理工學(xué)院(massachusettsinstituteoftechnology)由經(jīng)驗(yàn)豐富和訓(xùn)練有素的人員操作dna質(zhì)粒向希拉細(xì)胞中的顯微注射。每輪注射30個(gè)細(xì)胞。在緩沖液中的dna濃縮物用于注射。

其他實(shí)施方案

本文所述的主題可以系統(tǒng)、裝置、方法和/或制品實(shí)施，取決于所需配置。在以上說(shuō)明中列舉的實(shí)施方式不代表符合本文所述主題的所有實(shí)施方式。其僅僅是符合與所述主題有關(guān)的方面的一些實(shí)施例。雖然上面已經(jīng)詳細(xì)描述了幾個(gè)變化形式，但其他修改或添加也是可能的。具體說(shuō)來(lái)，除了本文列舉的那些之外，也可提供進(jìn)一步的特征和/或變化形式。例如，如上所述的實(shí)施方式可涉及所公開(kāi)特征的各種組合和子組合和/或以上所公開(kāi)的若干進(jìn)一步特征的組合和子組合。另外，附圖中所描繪和/或本文所述的邏輯流程不一定需要所示的特別次序，或相繼次序，以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果。其他實(shí)施方式可在以下權(quán)利要求范圍內(nèi)。

本文涉及的專利和科學(xué)文獻(xiàn)確立本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得的知識(shí)。本文引用的所有美國(guó)專利及公開(kāi)或未公開(kāi)的美國(guó)專利申請(qǐng)都以引用的方式并入。本文引用的所有公開(kāi)的外國(guó)專利和專利申請(qǐng)據(jù)此以引用的方式并入。由本文引用的登錄號(hào)表示的genbank和ncbi遞交據(jù)此以引用的方式并入。本文引用的所有其他公開(kāi)的參考文獻(xiàn)、文件、手稿及科學(xué)文獻(xiàn)據(jù)此以引用的方式并入。