發(fā)明背景

已經(jīng)研究了基于腫瘤特異性t細(xì)胞的免疫療法，包含使用工程化改造的t細(xì)胞的療法用于抗腫瘤治療。在一些情況下，用于該療法的t細(xì)胞在體內(nèi)維持不了足夠長時間的活性。在一些情況下，t細(xì)胞的腫瘤特異性相對低。因而，本領(lǐng)域需要具有較長期抗腫瘤功能發(fā)揮的腫瘤特異性癌癥療法。

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(malignantgliomas，mg)，其包含多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(aa-iii級)和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(gbm-iv級)，在美國每年具有大概20,000例診斷的新病例的發(fā)生率。根據(jù)美國腦腫瘤協(xié)會(americanbraintumorassociation)，基于美國2010人口普查數(shù)據(jù)，遭受惡性腦腫瘤的個體的總體患病率粗略地為140,000人。盡管mg是稀有疾病，但是在其惡性行為方面其為高度攻擊性并且是異質(zhì)的，并幾乎一律致命。目前用于高級mg的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)療法僅產(chǎn)生短期益處，并且這些腦腫瘤事實上是不能治愈的。的確，即使利用現(xiàn)代手術(shù)和放射治療技術(shù)(其經(jīng)常加劇通過定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)強加的早已嚴(yán)重的發(fā)病率)，5年的存活率也是非常低的。此外，對于復(fù)發(fā)疾病的大多數(shù)患者，存在很少的治療選擇。因此，明顯需要更有效的療法，特別用于已經(jīng)在一線療法后復(fù)發(fā)/進(jìn)展的那些患者，并且保證該患者群體參與臨床試驗。

利用嵌合抗原受體(car)工程化改造的t細(xì)胞的過繼性t細(xì)胞療法(act)可以提供安全且有效的方式來減少mg的復(fù)發(fā)率，因為cart細(xì)胞可以被工程化改造以特異識別抗原不同的腫瘤群體(cartellieri等2010jbiomedbiotechnol2010:956304；ahmed等2010clincancerres16:474；sampson等2014clincancerres20:972；brown等2013clincancerres201218:2199；chow等2013molther21:629)，并且t細(xì)胞可以通過腦實質(zhì)遷移以靶向并殺死浸潤性惡性細(xì)胞(hong等2010clincancerres16:4892；brown等2007jimmunol179:3332；hong等2010clincancerres16:4892；yaghoubi2009natclinpractoncol6:53)。臨床前研究已經(jīng)證明靶向il13rα2的car+t細(xì)胞針對干細(xì)胞樣和分化型神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞顯示有效的不依賴主要組織相容性復(fù)合體(mhc)的il13rα2-特異性細(xì)胞溶解活性，并且在體內(nèi)誘導(dǎo)建立的神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物的消退(kahlon等2004cancerres64:9160；brown等2012clincancerres18:2199)。

發(fā)明概述

本文描述的是嵌合跨膜免疫受體(嵌合抗原受體或“car”)，其包含胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。胞外域由結(jié)合白介素-13rα2(il13rα2)的il-13配體，和任選地，間隔物(包含例如部分人fc域)構(gòu)成?？缒げ糠职琧d4跨膜域、cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3跨膜域或4ibb跨膜域。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域包含來自人cd3復(fù)合體的ζ鏈(cd3ζ)的信號傳導(dǎo)域和一個或多個共刺激域，例如4-1bb共刺激域。當(dāng)在t細(xì)胞表面上表達(dá)時，胞外域使得car能夠指導(dǎo)t細(xì)胞活性導(dǎo)向表達(dá)il13rα2的那些細(xì)胞，所述il13rα2是在腫瘤細(xì)胞，包含神經(jīng)膠質(zhì)瘤的表面上表達(dá)的受體。重要的是，car的il13rα2結(jié)合部分包含氨基酸修飾，如e13y突變，其增加結(jié)合特異性。胞內(nèi)區(qū)中包含串聯(lián)cd3ζ的共刺激域，如4-1bb(cd137)共刺激域使得t細(xì)胞能夠接受共刺激信號?？梢怨こ袒脑靦細(xì)胞，例如患者特異的自體t細(xì)胞以表達(dá)本文所述的car并且可以擴(kuò)大工程化改造的細(xì)胞并將其用于act?？梢允褂酶鞣Nt細(xì)胞亞群。此外，可以在其他免疫細(xì)胞，如nk細(xì)胞中表達(dá)car。在利用表達(dá)本文所述的car的免疫細(xì)胞治療患者時，所述細(xì)胞可以是自體或同種異體t細(xì)胞。在一些情況中，所用的細(xì)胞是cd4+和cd8+中央記憶型t細(xì)胞(tcm)，其是cd45ro+cd62l+，并且使用此類細(xì)胞相比于使用其他類型的患者特異性t細(xì)胞可以提高過繼性轉(zhuǎn)移后細(xì)胞的長期存活。

本文描述的是編碼嵌合抗原受體(car)r的核酸分子，其中所述嵌合抗原受體包含：人il-13或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體；跨膜域，其選自：cd4跨膜域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體、cd8跨膜域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體、cd28跨膜域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體，和cd3ζ跨膜域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體；共刺激域；和cd3ζ信號傳導(dǎo)域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體(cd3ζsignalingdomainofavariantthereofhaving1-10(e.g.,1or2)aminoacidmodifications)。

在多個實施方案中，共刺激域選自：cd28共刺激域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體、4-ibb共刺激域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體和ox40共刺激域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體。在某些實施方案中，存在4ibb共刺激域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體。

另外的實施方案，car包含：人il13的變體，其具有增加對il13rα2相對于il13rα1的結(jié)合特異性的1-10個氨基酸修飾；人il-13或其變體是il-13變體，其包含seqidno:3的氨基酸序列，具有1-5個氨基酸修飾，條件是seqidno:3的位置11上的氨基酸不是e；兩個不同的共刺激域，其選自：cd28共刺激域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體、4ibb共刺激域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體和ox40共刺激域或其具有1-10(例如1或2)個氨基酸修飾的變體；兩個不同的共刺激域，其選自：cd28共刺激域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體、4ibb共刺激域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體和ox40共刺激域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體；人il-13或其具有1-2個氨基酸修飾的變體；跨膜域，其選自：cd4跨膜域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體、cd8跨膜域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體、cd28跨膜域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體，和cd3ζ跨膜域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體；共刺激域；和cd3ζ信號傳導(dǎo)域或其具有1-2個氨基酸修飾的變體；定位在il-13或其變體與跨膜域之間的間隔物區(qū)(例如，間隔物區(qū)包含選自seqidno:4、14-20、50和52的氨基酸序列)；間隔物包含igg鉸鏈區(qū)；間隔物區(qū)包含10-150個氨基酸；4-1bb信號傳導(dǎo)域包含seqidno:6的氨基酸序列；cd3ζ信號傳導(dǎo)域包含seqidno:7的氨基酸序列；和定位在共刺激域與cd3ζ信號傳導(dǎo)域或其變體之間的3-15氨基酸的接頭。在某些實施方案中，在存在兩個共刺激域的情況下，一個是4-ibb共刺激域，另一個是選自cd28和cd28gg的共刺激域。

在一些實施方案中：核酸分子表達(dá)包含選自seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列的多肽；嵌合抗原受體包含il-13/igg4/cd4t/41-bb區(qū)(其包含seqidno:11的氨基酸)和cd3ζ信號傳導(dǎo)域(其包含seqidno:7的氨基酸序列)；并且嵌合抗原受體包含seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列。

還公開的是通過包含編碼嵌合抗原受體的表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的人t細(xì)胞群，其中嵌合抗原受體包含：人il-13或其具有1-10個氨基酸修飾的變體；跨膜域，其選自：cd4跨膜域或其具有1-10個氨基酸修飾的變體、cd8跨膜域或其具有1-10個氨基酸修飾的變體、cd28跨膜域或其具有1-10個氨基酸修飾的變體，和cd3ζ跨膜域或其具有1-10個氨基酸修飾的變體；共刺激域；和cd3ζ信號傳導(dǎo)域或其具有1-10個氨基酸修飾的變體。在多個實施方案中：人t細(xì)胞群包含表達(dá)嵌合抗原受體的載體，所述嵌合抗原受體包含選自seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列；人t細(xì)胞群包含中央記憶型t細(xì)胞(tcm細(xì)胞)(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的細(xì)胞是tcm細(xì)胞；至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm細(xì)胞是cd4+，并且至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm細(xì)胞是cd8+)。

還描述的是在患者中治療癌癥的方法，其包含施用通過包含編碼嵌合抗原受體的表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體或同種異型(allogeneic)人t細(xì)胞(例如，包含tcm細(xì)胞的自體或同種異型t細(xì)胞，例如，至少20％、30％、40％、50％60％、70％、80％的細(xì)胞是tcm細(xì)胞；至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm細(xì)胞是cd4+并且至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm細(xì)胞是cd8+細(xì)胞)，其中嵌合抗原受體包含選自seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列。在多個實施方案中：人t細(xì)胞群包含中央記憶型t細(xì)胞；所述癌癥是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；并且轉(zhuǎn)導(dǎo)的人t細(xì)胞通過下述方法制備，所述方法包含從患者獲得t細(xì)胞，處理t細(xì)胞以分離中央記憶型t細(xì)胞，并利用包含編碼嵌合抗原受體的表達(dá)盒的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)中央記憶型細(xì)胞的至少部分，其中嵌合抗原受體包含選自seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列。

還描述的是：核酸分子，其編碼包含與選自seqidno:10和seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列具有至少95％同一性(atleast95％identical)的氨基酸序列的多肽；核酸分子，其編碼包含與選自seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽，除了存在不超過5個氨基酸取代、缺失或插入；核酸分子，其編碼包含與選自seqidno:10和seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽，除了存在不超過5個氨基酸取代；和核酸分子，其編碼包含與選自seqidno:10和seqidno:10、31-48和52的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽，除了存在不超過2個氨基酸取代。

本文所述的某一car，例如il13(eq)bbζcar和il13(eq)cd28-bbζcar相比于某一其他il13-靶向性car具有某些有益的特征。例如，它們具有對il13rα的提高選擇性，引發(fā)較低的th2細(xì)胞因子產(chǎn)生，特別是較低的il13產(chǎn)生。

表達(dá)靶向il13rα2的car的t細(xì)胞可以用于治療癌癥，如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，以及表達(dá)il13rα2的其他癌癥，其包含但不限于成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、乳腺癌、頭與頸癌、腎癌、卵巢癌和卡波西(kaposi)肉瘤。因此，該公開內(nèi)容包含使用表達(dá)本文所述的car的t細(xì)胞治療癌癥的方法。

該公開內(nèi)容還包含編碼本文所述的任何car的核酸分子(例如，包含編碼cars之一的核酸序列的載體)和表達(dá)本文所述的任何car的分離的t淋巴細(xì)胞。

本文所述的car可以包含定位在il13域和跨膜域之間的間隔物區(qū)?？梢允褂枚喾N不同的間隔物。它們中的一些包含人fc區(qū)的至少部分，例如人fc區(qū)的鉸鏈部分或ch3域或其變體。下文表1提供了可以用于本文所述的car的多個間隔物。

表1：間隔物的實例

一些間隔物區(qū)包含整個或部分的免疫球蛋白(例如，igg1、igg2、igg3、igg4)鉸鏈區(qū)，即落在免疫球蛋白的ch1和ch2域之間的序列，例如，igg4fc鉸鏈或cd8鉸鏈。一些間隔物區(qū)包含免疫球蛋白ch3域或ch3域和ch2域兩者。免疫球蛋白來源的序列可以包含一個或多個氨基酸修飾，例如，1、2、3、4或5個取代，例如，減少脫靶結(jié)合的取代。

“氨基酸修飾”指蛋白質(zhì)或肽序列中的氨基酸取代、插入，和/或缺失?！鞍被崛〈被颉叭〈敝赣H本肽或蛋白質(zhì)序列中特定位置上的氨基酸被另一氨基酸替換?？梢赃M(jìn)行取代用于以非保守方式(即，通過將密碼子從屬于具有特定大小或特征的氨基酸分組的氨基酸改變成屬于另一分組的氨基酸)或以保守方式(即，通過將密碼子從屬于具有特定大小或特征的氨基酸分組的氨基酸改變成屬于相同分組的氨基酸)來改變所得蛋白質(zhì)中的氨基酸。該保守改變一般導(dǎo)致所得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的較少改變。以下是氨基酸多個分組的實例：1)具有非極性r基團(tuán)的氨基酸：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；2)具有不帶電的極性r基團(tuán)的氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；3)具有帶電的極性r基團(tuán)的氨基酸(在ph6.0時帶負(fù)電)：天冬氨酸、谷氨酸；4)堿性氨基酸(在ph6.0時帶正電)：賴氨酸、精氨酸、組氨酸(在ph6.0)。另一分組可能是具有苯基的那些氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸，和酪氨酸。

在某些實施方案中，間隔物來源于igg1、igg2、igg3或igg4，其包含用與未修飾間隔物中存在的氨基酸殘基不同的氨基酸殘基取代的一個或多個氨基酸殘基。所述一個或多個取代的氨基酸殘基選自，但不限于位置220、226、228、229、230、233、234、235、234、237、238、239、243、247、267、268、280、290、292、297、298、299、300、305、309、218、326、330、331、332、333、334、336、339上的一個或多個氨基酸殘基，或其組合。在該編號體系中，在下文更詳細(xì)地描述，表1中igg4(l235e、n297q)間隔物中的第一個氨基酸是219，并且表1中igg4(hl-ch3)間隔物中的第一個氨基酸是219，其是表1中igg鉸鏈序列和igg4鉸鏈接頭(hl)序列中的第一個氨基酸。

在一些實施方案中，修飾的間隔物來源于igg1、igg2、igg3或igg4，其包含，但不限于一個或多個以下氨基酸殘基取代：c220s、c226s、s228p、c229s、p230s、e233p、v234a、l234v、l234f、l234a、l235a、l235e、g236a、g237a、p238s、s239d、f243l、p247i、s267e、h268q、s280h、k290s、k290e、k290n、r292p、n297a、n297q、s298a、s298g、s298d、s298v、t299a、y300l、v305i、v309l、e318a、k326a、k326w、k326e、l328f、a330l、a330s、a331s、p331s、i332e、e333a、e333s、e333s、k334a、a339d、a339q、p396l，或其組合。

在某些實施方案中，修飾的間隔物來源于igg4區(qū)，其包含利用與未修飾區(qū)域中存在的氨基酸殘基不同的氨基酸殘基取代的一個或多個氨基酸殘基。一個或多個取代的氨基酸殘基選自，但不限于位置220、226、228、229、230、233、234、235、234、237、238、239、243、247、267、268、280、290、292、297、298、299、300、305、309、218、326、330、331、332、333、334、336、339上的一個或多個氨基酸殘基或其組合。

在一些實施方案中，修飾的間隔物來源于igg4區(qū)，其包含，但不限于以下氨基酸殘基取代的一個或多個：220s、226s、228p、229s、230s、233p、234a、234v、234f、234a、235a、235e、236a、237a、238s、239d、243l、247i、267e、268q、280h、290s、290e、290n、292p、297a、297q、298a、298g、298d、298v、299a、300l、305i、309l、318a、326a、326w、326e、328f、330l、330s、331s、331s、332e、333a、333s、333s、334a、339d、339q、396l或其組合，其中未修飾間隔物中的氨基酸被所指示位置上的上文鑒定的氨基酸取代。

對于本文討論的免疫球蛋白中的氨基酸位置，根據(jù)eu索引或eu編號體系(kabat等1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,unitedstatespublichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,由此以其整體作為參考并入)進(jìn)行編號。eu索引或kabat或eu編號體系中的eu索引指eu抗體的編號(edelman等1969procnatlacadsciusa63:78-85)。

多種跨膜域可以用于針對il13ra2的car。表2包含合適跨膜域的實例。當(dāng)存在間隔物域時，跨膜域定位在間隔物域的羧基末端。

表2：跨膜域的實例

本文所述的許多car包含一個或多個(例如兩個)共刺激域。共刺激域定位在跨膜域和cd3ζ信號傳導(dǎo)域之間。表3包含與cd3ζ信號傳導(dǎo)域的序列一起的合適的共刺激域的實例。

表3：共刺激域的實例

附圖簡述

圖1是il13(e13y)-zetakinecar(左)的示意性描述，所述il13(e13y)-zetakinecar由所指示的il13rα2-特異性人il-13變體(huil-13(e13y))、人igg4fc間隔物(huγ4fc)、人cd4跨膜(hucd4tm)，和人cd3ζ鏈胞質(zhì)(hucd3ζcyt)部分組成。還描述的是il13(eq)bbζcar，其與il13(e13y)-zetakine相同，除了定位在igg4間隔物的ch2域中紅色指示的兩個點突變l235e和n297q，并添加了共刺激4-1bb胞質(zhì)域(4-1bbcyt)。

圖2a-c描述了某些載體可讀框。a是2670個核苷酸il13(eq)bbz-t2acd19t構(gòu)建體的cdna可讀框的圖表，其中指示了il13(eq)bbzcar的il13rα2-特異性配體il13(e13y)、igg4(eq)fc鉸鏈、cd4跨膜、4-1bb胞質(zhì)信號傳導(dǎo)、三甘氨酸接頭，和cd3ζ胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域，以及t2a核糖體跳躍(skip)和截短的cd19序列。還指示了人gm-csf受體α和驅(qū)動il13(eq)bbζcar和cd19t表面表達(dá)的cd19信號序列。b是側(cè)翼為將整合至宿主基因組中的長末端重復(fù)(由‘r’指示)的序列的圖表。c是il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7質(zhì)粒圖。

圖3描述了phiv7的構(gòu)建。

圖4描述了phiv7的元件。

圖5描述了il13(eq)bbζ/cd19t+tcm的產(chǎn)生圖解。

圖6a-c描述了表面轉(zhuǎn)基因和t細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的流式細(xì)胞檢測分析的結(jié)果。il13(eq)bbζ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1被抗il13-pe和抗cd8-fitc共染色以檢測cd8+car+和cd4+(即，cd8陰性)car+細(xì)胞(a)，或被抗cd19-pe和抗cd4-fitc共染色以檢測cd4+cd19t+和cd8+(即，cd4陰性)car+細(xì)胞(b)。il13(eq)bbζ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1被熒光色素綴合的抗cd3、tcr、cd4、cd8、cd62l和cd28(灰色柱狀圖)或同種型對照(黑色柱狀圖)染色(c)。在所有情況中，百分比基于高于同種型染色的有活力的淋巴細(xì)胞(dapi陰性)。

圖7a-b描述了il13(eq)bbz+tcm的il13rα2-特異性效應(yīng)器功能的體外功能表征。il13(eq)bbz/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1在使用10:1e:t比例基于cd19t表達(dá)的6-小時⁵¹cr釋放測定中用作效應(yīng)器。將il13rα2陽性腫瘤靶標(biāo)是k562工程化改造的，以表達(dá)il13rα2(k562-il13rα2)和原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤系pbt030-2，并且il13rα2陰性腫瘤靶標(biāo)對照是k562親本系(a)。在與il13rα2陽性和陰性靶標(biāo)以10:1e:t比例過夜共培養(yǎng)后評估il13(eq)bbz/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1的抗原依賴性細(xì)胞因子產(chǎn)生。使用bio-plexpro人細(xì)胞因子th1/th2測定試劑盒測定細(xì)胞因子水平并報道了inf-γ(b)。

圖8a-c描述了研究結(jié)果，其證明在il13(eq)bbζ/cd19t+tcm過繼性轉(zhuǎn)移后建立的神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤異種移植物的消退。將egfp-ffluc+pbt030-2腫瘤細(xì)胞(1×10⁵)立體定向植入nsg小鼠的右前腦中。在第5天，小鼠接受2x10⁶個il13(eq)bbζ/cd19t+tcm(1.1x10⁶car+；n＝6)、2x10⁶個模擬tcm(無car；n＝6)或pbs(n＝6)。來自各組的代表性小鼠，其顯示使用xenogenlivingimage的相對腫瘤負(fù)荷(a)。ffluc流量(光子/秒)的定量顯示il13(eq)bbζ/cd19t+tcm與模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的tcm和pbs相比誘導(dǎo)腫瘤消退(#p<0.02,*p<0.001,重復(fù)測量anova)(b)。kaplanmeier存活曲線(n＝6/組)，證明利用il13(eq)bbζ/cd19t+tcm處理的小鼠的存活顯著提高(p＝0.0008；時序檢驗)(c)。

圖9a-c描述了比較il13(eq)bbztcm和il13-zetakinectl克隆的抗腫瘤效果的研究結(jié)果。將egfp-ffluc+pbt030-2tss(1×105)立體定向植入nsg小鼠的右前腦中。在第8天，小鼠接受1.6x10⁶個模擬tcm(無car)、1.0×10⁶car+il13(eq)bbζtcm(1.6×10⁶全部t細(xì)胞；63％car)、1.0x10⁶il13-zetakinecd8+ctlcl.2d7(克隆car+)，或沒有處理(n＝6/組)。來自各組的代表性小鼠使用xenogenlivingimage顯示相對腫瘤負(fù)荷(a)。ffluc流量(光子/秒)的自然對數(shù)隨時間的線性回歸線，p-值通過時間相互的比較用于組(p-valuesareforgroupbytimeinteractioncomparisons)(b)。kaplanmeier存活分析(n＝6/組)證明與il13-zetakinecd8+ctlcl.2d7相比，利用il13(eq)bbζtcm處理的小鼠的存活顯著提高(p＝0.02；時序檢驗)(c)。

圖10a-c描述了比較il13(eq)bbζtcm和il13-zetakinectl克隆的抗腫瘤效果的研究結(jié)果。將egfp-ffluc+pbt030-2tss(1×10⁵)立體定向植入nsg小鼠的右前腦中。在第8天，小鼠接受1.3x10⁶模擬tcm(無car；n＝6)、1.0、0.3或0.1x10⁶car+il13(eq)bbζtcm(78％car+；n＝6-7)、1.0、0.3或0.1x10⁶個il13-zetakinecd8+ctlcl.2d7(克隆car+；n＝6-7)，或無處理(n＝5)。來自各組的代表性小鼠的xenogen成像顯示相對腫瘤負(fù)荷(a)。ffluc流量(光子/秒)的自然對數(shù)的線性回歸線顯示與第一代il13-zetakinectlcl.2d7、模擬tcm和僅腫瘤相比，il13(eq)bbζtcm實現(xiàn)卓越的腫瘤消退。腫瘤注射后第27天的平均流量/組證明0.1x10⁶個il13(eq)bbζtcm劑量勝過高10倍劑量的1.0x10⁶個il13-zetakinecd8+ctlcl.2d7(p＝0.043；welch兩樣品t-檢驗)(c)。

圖11描述了研究結(jié)果，其證明與il13-zetakinectl克隆相比il13(eq)bbζtcm展示提高的持續(xù)性。cd3免疫組織化學(xué)在t細(xì)胞輸注后7天在腫瘤位點上評估t細(xì)胞持續(xù)性。檢測il13(eq)bbζtcm的顯著數(shù)量的t細(xì)胞(上圖)。相反，檢測到極少的有活力的cd3+il13-zetakinet細(xì)胞(下圖)。

圖12a-d描述了比較用于大的建立腫瘤的car+t細(xì)胞遞送途徑(i.c.相對于i.v.)的實驗結(jié)果。將egfp-ffluc+pbt030-2tss(1×10⁵)植入nsg小鼠的右前腦中。在第19天和第26天，利用5x10⁶個car+il13(eq)bbζ+tcm(11.8x10⁶總細(xì)胞；n＝4)，或模擬tcm(11.8x10⁶細(xì)胞；n＝4)通過尾靜脈i.v.注射小鼠?；蛘撸诘?9、22、26和29天，利用1x10⁶個car+il13(eq)bbζ+tcm(2.4x10⁶個總細(xì)胞；n＝4)，或模擬tcm(2.4x10⁶個細(xì)胞；n＝5)i.c.注射小鼠。隨時間的平均ffluc流量(光子/秒)顯示i.c.遞送的il13(eq)bbζtcm介導(dǎo)第19天腫瘤的腫瘤消退。通過比較，i.v.遞送的t細(xì)胞與未處理的或模擬tcm對照相比不顯示腫瘤負(fù)荷的減少(a)。kaplanmeier存活曲線證明與利用i.v.施用的car+tcm處理的小鼠相比利用il13(eq)bbztcmi.c.處理的小鼠的存活提高(p＝0.0003時序檢驗)(b)。利用il13(eq)bbz+tcmi.v.(c)相對于i.c.(d)處理的小鼠的代表性h&e和cd3ihc。僅在i.c.處理組中檢測到cd3+t細(xì)胞，對于i.v.處理的小鼠，在腫瘤或周圍腦實質(zhì)中沒有檢測到cd3+細(xì)胞。

圖13a-b描述了研究結(jié)果，其顯示顱內(nèi)、瘤內(nèi)(i.c.t.)或心室內(nèi)(i.c.v.)注射的car+t細(xì)胞可以運輸?shù)綄γ姘肭蛏系哪[瘤中。將egfp-ffluc+pbt030-2tss(1×105)立體定向植入nsg小鼠的右前腦和左前腦中。在第6天，利用1.0x106il13(eq)bbζ+tcm(1.6x106總細(xì)胞；63％car；n＝4)在右邊腫瘤位點i.c.注射小鼠。多病灶神經(jīng)膠質(zhì)瘤實驗?zāi)Ｐ偷氖疽鈭D(a)。cd3ihc顯示t細(xì)胞浸潤右邊和左邊腫瘤位點二者(b)。

圖14a-c描述了評估il13rα2-特異性car的共刺激域的一系列研究的結(jié)果。il13ra2-特異性car構(gòu)建體的示意圖，其比較多個胞內(nèi)內(nèi)(endo)/信號傳導(dǎo)域，包含缺少共刺激的第一代cd3zcar，相對于摻入4-1bb或cd28的第二代car，相對于含有cd28和41bb的第三代car。所有car盒也含有t2a核糖體跳躍和截短的cd19(cd19t)序列作為用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的標(biāo)志物(a)。通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cd4和cd8tcm并且通過抗cd19免疫磁性富集表達(dá)car的t細(xì)胞。如通過流式細(xì)胞術(shù)所測定的cd19和il13(即，car)表達(dá)水平(b)。通過用car(il13)平均熒光強度(mfi)除以轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)志物(cd19t)的平均熒光強度測定各car構(gòu)建體的穩(wěn)定性(c)。含有4-1bb的car證明與cd19t轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)志物相比最低的表達(dá)水平。

圖15a-b描述了研究結(jié)果，其證明含有4-1bb共刺激域的il13rα2-特異性car產(chǎn)生較少的th1和th2細(xì)胞因子。在指示的效應(yīng)器：靶標(biāo)比例的4小時51cr釋放測定中測定所指示的模擬-轉(zhuǎn)導(dǎo)的或表達(dá)car的t細(xì)胞殺死表達(dá)il13rα2的pbt030-2腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)的能力。描述了一式三份孔的均值％鉻釋放+s.d.(a)。如預(yù)期，模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞不有效裂解靶標(biāo)。相反，所有表達(dá)car的t細(xì)胞以相似的方式裂解腫瘤細(xì)胞。所指示的模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的或表達(dá)car的t細(xì)胞與表達(dá)il13rα2的pbt030-2腫瘤細(xì)胞以10：1比例共培養(yǎng)過夜并且通過細(xì)胞測定珠陣列分析上清液中il-13和ifn-γ水平(b)。描述了一式三份孔的均值+s.d.。有趣的是，表達(dá)ζ、41bb-ζ或cd28-41bb-ζcar的t細(xì)胞比表達(dá)cd28-ζcar的t細(xì)胞展示更低的抗原刺激的細(xì)胞因子產(chǎn)生。

圖16a-c描述了il13rα2-特異性car的體內(nèi)效果的一系列研究結(jié)果。nsg小鼠在第0天接受ffluc+pbt030-2腫瘤細(xì)胞的顱內(nèi)注射，并在第8天隨機(jī)化到6個組中(n＝9-10小鼠/組)用于pbs(僅腫瘤)、模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞或表達(dá)指示的il13rα2-特異性car的t細(xì)胞的i.c.處理。然后進(jìn)行定量生物發(fā)光成像以監(jiān)測腫瘤隨時間的生長。各組中代表性小鼠的生物發(fā)光圖像(a)。各組中螢光素酶活性隨時間的總體流量水平的均值+s.e.(b)。在第27天各小鼠的流量水平。除了利用表達(dá)cd28-car的t細(xì)胞處理的那些組，利用il13rα2-特異性cart細(xì)胞處理的所有組與利用模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞處理的小鼠相比在腫瘤體積上顯示統(tǒng)計學(xué)上顯著的減少(c)

圖17描述了il13(eq)bbζ/cd19t+的氨基酸序列(seqidno:10)。

圖18描述了il13(eq)41bbζ[il13{eq}41bbζt2a-cd19t_ephiv7；pf02630](seqidno:12)與cd19rop_ephiv7(pj01683)(seqidno:13)的序列比較。

圖19描述了il13(emy)-cd8h3-cd8tm2-41bbζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:31；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:39)。

圖20描述了il13(emy)-cd8h3-cd28tm-cd28gg-41bb-ζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:32；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:40)。

圖21描述了il13(emy)-igg4(hl-ch3)-cd4tm-41bb-ζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:33；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:41)。

圖22描述了il13(emy)-igg4(l235e,n297q)-cd8tm-41bb-ζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:34；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:42)。

圖23描述了il13(emy)-linker-cd28tm-cd28gg-41bb-ζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:35；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:43)。

圖24描述了il13(emy)-hl-cd28m-cd28gg-41bb-ζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:36；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:44)。

圖25描述了il13(emy)-igg4(hl-ch3)-cd28tm-cd28gg-41bb-ζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:37；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:45)。

圖26描述了il13(emy)igg4(l235e,n297q)-cd28tm-cd28gg-41bb-ζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:38；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:46)。

圖27描述了il13(emy)-cd8h3-cd8tm-41bbζ的氨基酸序列(具有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:47；沒有g(shù)mscfra信號肽的seqidno:48)。

發(fā)明詳述

下文描述的是多個il13rα2-特異性嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建和表征。嵌合抗原(car)是這樣的重組生物分子，其最少含有胞外識別域、跨膜區(qū)，和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。因此，術(shù)語“抗原”不限于結(jié)合抗體的分子，還指可以特異性結(jié)合靶標(biāo)的任何分子。例如，car可以包含特異性結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體。胞外識別域(還稱作胞外域或簡單地由其含有的識別元件所指)包含特異性結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)胞表面上存在的分子的識別元件?？缒^(qū)錨定膜中的car。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域包含來自人cd3復(fù)合體的ζ鏈的信號傳導(dǎo)域并任選地包含一個或多個共刺激信號傳導(dǎo)域。car可以既結(jié)合抗原又轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞激活，其不依賴于mhc限制。因此，car是“通用”免疫受體，其可以治療具有抗原陽性腫瘤的患者群體，不論其hla基因型如何。使用表達(dá)腫瘤特異性car的t淋巴細(xì)胞的過繼性免疫療法可以是用于治療癌癥的強大治療策略。

本文所述的一個il13rα2-特異性car稱作il13(eq)bbζ。該car包含多個重要特征，包含：具有氨基酸改變的il13α2配體，所述氨基酸改變提高與il13α2結(jié)合的特異性；cd137(4-1bb)的域與cd3ζ串聯(lián)以提供有益的共刺激；和igg4fc區(qū)，其在ch2區(qū)內(nèi)的兩個位點上以減少被fc受體(fcr)結(jié)合的方式被突變(l235e；n297q)。本文所述的其他car含有第二個共刺激域。

在一些情況中，可以使用載體產(chǎn)生本文所述的car，包含il13(eq)bbζcar，在所述載體中car可讀框后接t2a核糖體跳躍序列和截短的cd19(cd19t)，其缺少胞質(zhì)信號傳導(dǎo)尾部(在第323位氨基酸上被截短)。在該排列中，cd19t的共表達(dá)提供惰性的非免疫原性表面標(biāo)志物，其允許精確測定基因修飾的細(xì)胞，并使得能夠陽性選擇基因修飾的細(xì)胞，以及有效的細(xì)胞運輸和/或在過繼性轉(zhuǎn)移后體內(nèi)治療性t細(xì)胞成像。cd19t的共表達(dá)提供用于使用臨床可得的抗體和/或免疫毒素試劑在體內(nèi)免疫靶向轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以選擇性刪除治療細(xì)胞，并由此作為自殺開關(guān)起作用的標(biāo)志物。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤表達(dá)il13受體，特別是高親和力il13受體。然而，不像il13受體，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞過表達(dá)獨特的il13rα2鏈，其能夠不依賴對il4rβ或γc44的需要而結(jié)合il13。與其同系物il4相似，il13在cns外具有多效(pleotropic)的免疫調(diào)節(jié)活性。il13和il4均刺激b淋巴細(xì)胞產(chǎn)生ige并抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子。

使用利用放射標(biāo)記的il13的放射自顯影技術(shù)的詳細(xì)研究已經(jīng)證明在所研究的幾乎所有惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織上大量的il13結(jié)合。該結(jié)合在腫瘤切片和單細(xì)胞分析中是高度同質(zhì)的。然而，對il13rα2mrna特異的分子探針分析不檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性受體通過正常腦元件的表達(dá)，并且利用放射標(biāo)記的il13的放射自顯影技術(shù)也不能檢測正常cns中的特異性il13結(jié)合。這些研究提示共有的il13rα1/il4β/γc受體在正常的cns中不可被檢測地表達(dá)。因而，il13rα2是神經(jīng)膠質(zhì)瘤非常特異的細(xì)胞表面靶標(biāo)并且是被設(shè)計用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的car的合適靶標(biāo)。

然而，基于il13的治療分子與廣泛表達(dá)的il13rα1/il4β/γc受體復(fù)合體結(jié)合具有向cns外的正常組織介導(dǎo)不想要的毒性的潛力，并因此限制這些試劑的全身施用。il13α螺旋a第13位氨基酸上酪氨酸對天然谷氨酸的氨基酸取代選擇性地降低了il13對il13rα1/il4β/γc受體的親和力。然而，該突變體(稱為il13(e13y))與il13rα2的結(jié)合相對于野生型il13是增加的。因此，該最低限度改變的il13類似物同時增加了il13對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性和親和力。因而，本文所述的car包含在第13位氨基酸(根據(jù)debinski等1999clincancerres5:3143s的編號)上含有突變(e變成y或e變成一些其他氨基酸如k或r或l或v)的il13。然而，也可以使用具有天然序列的il13，并且可以特別可用于下述情況，其中有待如通過直接注射到腫瘤塊中局部施用所述修飾的t細(xì)胞。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段產(chǎn)生本文所述的car，盡管優(yōu)選使用重組dna技術(shù)產(chǎn)生它?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的便利分子克隆的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(基因組文庫篩選、pcr、引物-輔助的連接、定點誘變等)制備編碼嵌合受體的幾個區(qū)域的核酸并將其裝配成完整的編碼序列。將所得的編碼區(qū)優(yōu)選插入表達(dá)載體中并用于轉(zhuǎn)化合適的表達(dá)宿主細(xì)胞系，優(yōu)選t淋巴細(xì)胞細(xì)胞系，并最優(yōu)選自體t淋巴細(xì)胞細(xì)胞系。

可以利用用于car表達(dá)的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)從患者分離的多個t細(xì)胞亞群，包含未選擇的pbmc或富集的cd3t細(xì)胞或富集的cd3或記憶型t細(xì)胞亞群。中央記憶型t細(xì)胞是一種有用的t細(xì)胞亞群。可以通過選擇cd45ro+/cd62l+細(xì)胞，使用例如設(shè)備從外周血單核細(xì)胞(pbmc)分離中央記憶型t細(xì)胞，以免疫磁性選擇表達(dá)想要的受體的細(xì)胞?？梢岳每筩d3/cd28激活針對中央記憶型t細(xì)胞富集的細(xì)胞，利用例如指導(dǎo)il13rα2-特異性car(例如，il13(eq)bbζ)以及截短的人cd19(cd19t)表達(dá)的sin慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述截短的人cd19(cd19t)是用于體內(nèi)檢測和可能的離體選擇兩者的非免疫原性表面標(biāo)志物?？梢岳胕l-2/il-15在體外擴(kuò)增激活的/遺傳修飾的中央記憶型t細(xì)胞，然后冷藏保存。

實施例

實施例1：il13rα2-特異性car的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)

在下文描述了有用的il13rα2-特異性car的結(jié)構(gòu)。密碼子優(yōu)化的car序列含有在單個位點上突變(e13y)以減少與il13rα1的可能結(jié)合的膜栓系il-13配體、含有極大減少fc受體介導(dǎo)的識別模型的兩個突變(l235e；n297q)的igg4fc間隔物、cd4跨膜域、共刺激4-1bb胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域，和cd3ζ胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域。t2a核糖體跳躍序列將該il13(eq)bbζcar序列與cd19t分隔開，所述cd19t是惰性的非免疫原性細(xì)胞表面檢測/選擇標(biāo)志物。該t2a連接導(dǎo)致il13(eq)bbζ和cd19t從單個轉(zhuǎn)錄本協(xié)同表達(dá)。圖1a是編碼il13(eq)bbz-t2acd19t構(gòu)建體的2670個核苷酸的可讀框的示意圖。在該圖中，il13(eq)bbzcar的il13rα2-特異性配體il13(e13y)、igg4(eq)fc、cd4跨膜、4-1bb胞質(zhì)信號傳導(dǎo)、三甘氨酸接頭，和cd3ζ胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域，以及t2a核糖體跳躍和截短的cd19序列均被指出。也指出了驅(qū)動il13(eq)bbzcar和cd19t表面表達(dá)的人gm-csf受體α和cd19信號序列。因此，il13(eq)bbz-t2acd19t構(gòu)建體包含il13rα2特異性的鉸鏈優(yōu)化的共刺激嵌合免疫受體序列(命名為il13(eq)bbz)、核糖體跳躍t2a序列，和cd19t序列。

通過融合人gm-csf受體α前導(dǎo)肽與il13(e13y)配體5l235e/n297q-修飾的igg4fc鉸鏈(其中雙突變干擾fcr識別)、cd4跨膜、4-1bb胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域，和cd3ζ胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域序列來產(chǎn)生il13(eq)bbz序列。在密碼子優(yōu)化后從頭合成該序列。從消化含t2a的質(zhì)粒獲得t2a序列。從橫跨含cd19的質(zhì)粒的前導(dǎo)肽序列與跨膜組分(即，堿基對1-972)獲得cd19t序列。將所有三個片段，1)il13(eq)bbz,2)t2a，和3)cd19t克隆到ephiv7慢病毒載體的多克隆位點中。當(dāng)轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)募?xì)胞中時，載體整合圖1b中示意描述的序列到宿主細(xì)胞基因組中。圖1c提供9515個堿基對的il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7質(zhì)粒自身的示意圖。

如圖2中示意所示，il13(eq)bbzcar與先前描述的il13rα2-特異性car(稱作il13(e13y)-zetakine)在幾個重要方面不同(brown等2012clinicalcancerresearch18:2199)。il13(e13y)-zetakine由所示的il13rα2-特異性人il-13突變蛋白(huil-13(e13y))、人igg4fc間隔物(huγ4fc)、人cd4跨膜(hucd4tm)，和人cd3ζ鏈胞質(zhì)(hucd3ζcyt)部分組成。相反，il13(eq)bbζ)具有兩個點突變l235e和n297q，其定位在igg4間隔物的ch2域中，和共刺激4-1bb胞質(zhì)域(4-1bbcyt)。

實施例2：用于表達(dá)il13rα2-特異性car的ephiv7的構(gòu)建和結(jié)構(gòu)

phiv7質(zhì)粒是這樣的親代質(zhì)粒，在cityofhope(coh)的tcelltherapeuticsresearchlaboratory(tctrl)中從所述親代質(zhì)粒衍生臨床載體il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7。從phiv7載體產(chǎn)生用于表達(dá)car的ephiv7載體。重要的是，該載體使用人ef1啟動子以驅(qū)動car的表達(dá)。載體的5'和3'序列都來源于如先前來源于hxbc2前病毒的pv653rsn。聚嘌呤區(qū)dna瓣(flap)序列(cppt)來源于來自nihaidsreagentrepository的hiv-1菌株pnl4-3。先前描述了土撥鼠(woodchuck)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(wpre)序列。

在圖3中示意描述了phiv7的構(gòu)建。簡言之，如下將pv653rsn亞克隆至pbluescript中，所述pv653rsn含有來自gag-pol的653bp加上5’和3’長末端重復(fù)(ltrs)與居間sl3-新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)：在步驟1中，從5’ltr到rev-響應(yīng)元件(rre)的序列構(gòu)成了p5’hiv-151，然后通過去除tata盒上游的序列修飾5'ltr，并首先連接cmv增強子，然后連接sv40復(fù)制起始區(qū)(p5'hiv-2)。在步驟2中，將3'ltr克隆到pbluescript中以制備p3’hiv-1，在3'ltr增強子/啟動子中進(jìn)行400-bp缺失以去除hivu3中的順式調(diào)節(jié)元件并形成p3'hiv-2。在步驟3中，連接從p5'hiv-3和p3'hiv-2分離的片段以制備phiv-3。在步驟4中，通過去除額外的上游hiv序列進(jìn)一步修飾p3'hiv-2來產(chǎn)生p3’hiv-3，并將含有wpre的600-bpbamhi-sali片段添加到p3’hiv-3來制備p3'hiv-4。在步驟5中，通過pcr在大小上減少phiv-3rre并將其連接到來自phiv-3的5’片段(未顯示)和p3’hiv-4中，以制備phiv-6。在步驟6中，從pnl4-3擴(kuò)增含有來自hiv-1pnl4-3(55)的cpptdna瓣序列的190-bpbglii-bamhi片段并置于phiv6中的rre與wpre序列之間來制備phiv-7。該親代質(zhì)粒phiv7-gfp(gfp，綠色熒光蛋白)用于使用四質(zhì)粒系統(tǒng)包裝親代載體。

將病毒基因組有效包裝到載體中需要包裝信號psiψ。rre和wpre增強rna轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。已經(jīng)證明瓣序列與wpre組合增強哺乳動物細(xì)胞中慢病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

將產(chǎn)生病毒載體所需的輔助功能分到三個獨立質(zhì)粒中以減少通過重組產(chǎn)生能夠復(fù)制的慢病毒的可能性：1)pcgp編碼病毒載體裝配所需的gag/pol蛋白；2)pcmv-rev2編碼rev蛋白，其作用于rre序列上以輔助病毒基因組轉(zhuǎn)運用于有效的包裝；和3)pcmv-g編碼水皰-口炎病毒(vesiculo-stomatitisvirus,vsv)的糖蛋白，其為病毒載體的傳染性所需。

在phiv7編碼的載體基因組與輔助質(zhì)粒之間存在最小的dna序列同源性。同源區(qū)域包含大概600個核苷酸的包裝信號區(qū)，其定位在pcgp輔助質(zhì)粒的gag/pol序列中；所有三個輔助質(zhì)粒中的cmv啟動子序列；和輔助質(zhì)粒pcgp中的rre序列。非常可能的是由于這些區(qū)域中的同源性可產(chǎn)生能夠復(fù)制的重組病毒，因為其需要多個重組事件。此外，任何所得的重組子均可能會丟失功能性ltr和tat序列，其為慢病毒復(fù)制所需。

cmv啟動子被ef1α-htlv啟動子(ef1p)替換，并將新的質(zhì)粒命名為ephiv7(圖4)。ef1p具有563bp并使用nrui和nhei將其引入到ephiv7中，在切掉cmv啟動子后。

已經(jīng)從該系統(tǒng)去除了慢病毒基因組，不包含gag/pol和rev，其為野生型病毒的病原性所必需并且為靶細(xì)胞的有效感染所需。此外，il13(eq)bbz-t2acd19t_ephiv7載體構(gòu)建體不含有完整的3’ltr啟動子，所以靶定細(xì)胞中所得的表達(dá)的和反向轉(zhuǎn)錄的dna前病毒基因組將具有無活性的ltr。由于該設(shè)計，沒有hiv-i來源的序列從前病毒轉(zhuǎn)錄并且僅治療序列將從其各自啟動子表達(dá)。預(yù)期sin載體中l(wèi)tr啟動子活性的去除顯著減少了宿主基因無意激活的可能性(56)。表4概述了il13(eq)bbz-t2acd19t_ephiv7中存在的多個調(diào)節(jié)元件。

實施例3：產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)導(dǎo)患者t細(xì)胞的載體

對于每個質(zhì)粒(il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7；pcgp；pcmv-g；和pcmv-rev2)，產(chǎn)生種子庫，其用于接種發(fā)酵罐以產(chǎn)生足夠量的質(zhì)粒dna。測試質(zhì)粒dna的身份(identity)、無菌性(sterility)和內(nèi)毒素，之后在生成慢病毒載體中使用它。

簡言之，從293t工作細(xì)胞(wcb)擴(kuò)增細(xì)胞，所述293t工作細(xì)胞已經(jīng)被測試以驗證無菌性和病毒污染的缺乏。融化來自293twcb的293t細(xì)胞的小瓶。培養(yǎng)細(xì)胞并擴(kuò)增直至存在足夠數(shù)量的細(xì)胞以平鋪適當(dāng)數(shù)量的10層細(xì)胞工廠(cellfactories,cf)用于載體產(chǎn)生和細(xì)胞培養(yǎng)(celltrain)維持。可以使用細(xì)胞的單培養(yǎng)(singletrain)用于生產(chǎn)。

在高達(dá)10個cf的分批中產(chǎn)生慢病毒載體?？梢栽谕恢墚a(chǎn)生兩個分批，導(dǎo)致產(chǎn)生大概20l的慢病毒上清液/周。在下游加工期間集中從所有分批產(chǎn)生的材料，以產(chǎn)生一批產(chǎn)物。將293t細(xì)胞平鋪在293t培養(yǎng)基(具有10％fbs的dmem)中的cf中。將工廠放置在37℃溫育箱中并水平放平以在cf的所有層上獲得平均細(xì)胞分布。兩天后，利用上述四個慢病毒質(zhì)粒，使用capo4方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其包含tris:edta、2mcacl2、2xhbs和四個dna質(zhì)粒的混合物。轉(zhuǎn)染后第3天，收集、純化并濃縮含有分泌的慢病毒載體的上清液。從cf去除上清液后，從各cf收集生產(chǎn)終末期細(xì)胞。從各工廠胰蛋白酶處理(trypsinize)細(xì)胞并通過離心收集。將細(xì)胞重懸浮在冰凍的培養(yǎng)基中并冷藏保存。這些細(xì)胞稍后用于能夠復(fù)制的慢病毒(rcl)測試。

為了純化并配制載體，通過膜過濾澄清粗上清液以去除細(xì)胞碎片。通過內(nèi)切核酸酶消化降解宿主細(xì)胞dna和殘留的質(zhì)粒dna。使用0.45μm過濾器澄清病毒上清液的細(xì)胞碎片。將澄清的上清液收集到預(yù)先稱重的容器中，向所述容器中加入(終濃度50u/ml)。殘留的質(zhì)粒dna和宿主基因組dna的內(nèi)切核酸酶消化在37℃進(jìn)行6小時。內(nèi)切核酸酶處理的上清液的初始切向流超濾(tff)濃縮用于從粗上清液中去除殘留的低分子量組分，同時將病毒濃縮約20倍。澄清的內(nèi)切核酸酶處理的病毒上清液通過具有500kd的nmwco的中空纖維藥筒以這樣的流速循環(huán)，設(shè)計所述流速以維持約4,000/秒或更低的剪切速率，同時使流通率最大。在濃縮過程中開始透析過濾核酸酶處理的上清液以維持藥筒性能。在pbs中使用4％的乳糖作為透析過濾緩沖液建立80％的滲透置換率。使病毒上清液達(dá)到靶體積，代表20倍濃度的粗上清液，并且透析過濾以100％的滲透置換率持續(xù)4份額外的交換體積。

通過使用高速離心技術(shù)完成病毒產(chǎn)物的進(jìn)一步濃縮。使用sorvallrc-26plus離心機(jī)在6oc下以6000rpm(6,088rcf)沉淀慢病毒的各分批16-20小時。然后利用pbs中4％的乳糖在50ml體積中重構(gòu)來自各分批的病毒沉淀。在該緩沖液中重構(gòu)的沉淀代表用于病毒制備的最終制劑。完整的載體濃縮過程導(dǎo)致大概200倍體積減少。完成所有分批后，接著將材料放置在-80oc中，同時測試來自各分批的樣品的無菌性。驗證樣品無菌性后，將分批在37oc頻繁攪拌快速溶解。然后收集材料并手工平分到病毒載體組(suite)中的ii類a/b3型生物安全箱中。使用無菌usp六級，外部螺紋的o-環(huán)冷凍管中1ml濃縮慢病毒的填充構(gòu)造。coh的應(yīng)用技術(shù)開發(fā)中心(centerforappliedtechnologydevelopment)(catd)的質(zhì)量系統(tǒng)(qualitysystems)(qs)根據(jù)關(guān)于cbg的政策和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(policiesandstandardoperatingproceduresforthecbg)并順應(yīng)目前的良好制造實踐(goodmanufacturingpractices)(cgmps)釋放所有材料。

為了保證慢病毒載體制劑的純度，對它測試殘留宿主dna污染物，以及殘留的宿主和質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)移。在其他測試中，通過rt-pcr評估載體身份以保證存在正確的載體。對于旨在用于該研究的載體，滿足所有的釋放標(biāo)準(zhǔn)。

實施例4：制備適合用于act中的t細(xì)胞

通過白細(xì)胞分離法從患者獲得t淋巴細(xì)胞，并將適當(dāng)?shù)耐N異型或自體t細(xì)胞亞群，例如中央記憶型t細(xì)胞(tcm)遺傳改變以表達(dá)car，然后通過任何臨床可接受的手段向患者回向施用，以實現(xiàn)抗癌癥治療。

在圖8中描述了用于tcm的制造策略的概要(用于il13(eq)bbζ/cd19t+tcm的制造方案)。尤其是，將從知情的研究參與者獲得的血漿分離置換(apheresis)產(chǎn)物聚蔗糖化(ficoll)、洗滌并溫育過夜。然后使用gmp級別的抗cd14、抗cd25和抗cd45ra試劑(miltenyibiotec)和clinimacs^tm分離設(shè)備消減細(xì)胞的單核細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞和幼稚t細(xì)胞群。消減后，在clinimacstm分離設(shè)備上使用dreg56-生物素(coh臨床級別)和抗生物素微珠(miltenyibiotec)為cd62l+tcm細(xì)胞富集陰性級分細(xì)胞。

富集后，在完整的x-vivo15加50iu/mlil-2和0.5ng/mlil-15中配制tcm細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移到teflon細(xì)胞培養(yǎng)袋中，其中利用dynalclinex^tmvivocd3/cd28珠刺激它們。刺激后高達(dá)5天，利用il13(eq)bbz-t2a-cd19t_ephiv7慢病毒載體以1.0-0.3的多重性感染(moi)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在添加如細(xì)胞擴(kuò)增所需的完整x-vivo15和il-2以及il-15細(xì)胞因子的情況下將培養(yǎng)物維持高達(dá)42天(保持細(xì)胞密度在3x10⁵-2x10⁶個活細(xì)胞/ml之間，并且在培養(yǎng)的每周一、周三和周五維持細(xì)胞因子補給)。細(xì)胞通常在這些條件下在21天內(nèi)擴(kuò)增至大概10⁹個細(xì)胞。在培養(yǎng)期結(jié)束時，收集細(xì)胞，洗滌兩次并配制在臨床級別的冷藏保存培養(yǎng)基(cryostorecs5,biolifesolutions)中。

在t細(xì)胞輸注當(dāng)天里，將冷藏保存的和釋放的產(chǎn)物融化、洗滌并配制用于再次輸注。從液氮存儲取出含有釋放的細(xì)胞產(chǎn)物的冷藏保存管、融化、冷卻并利用pbs/2％人血清白蛋白(hsa)洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌。離心后，去除上清液并將細(xì)胞重懸于無防腐劑的生理鹽水(pfns)/2％hsa輸注稀釋液中。取出樣品用于質(zhì)量控制測試。

使用上述制造平臺在從健康供體獲得的細(xì)胞上進(jìn)行兩次量化運行。為各臨床前量化運行產(chǎn)物分配人供體(hd)編號-hd006.5和hd187.1。重要的是，如表5中所示，這些量化運行在28天內(nèi)擴(kuò)大>80倍并且擴(kuò)增的細(xì)胞表達(dá)il13(eq)bbγ/cd19t轉(zhuǎn)基因。

表5：來自臨床前量化運行產(chǎn)物的表達(dá)數(shù)據(jù)的概括

實施例5：il13(eq)bbγ/cd19t+tcm中表面轉(zhuǎn)基因和t細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析

在實施例4中描述的兩份臨床前量化運行產(chǎn)物用于如下所述的臨床前研究。圖6a-c描述了表面轉(zhuǎn)基因和t細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。il13(eq)bbγ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1與抗il13-pe和抗cd8-fitc共染色以檢測cd8+car+和cd4+(即，cd8陰性)car+細(xì)胞(圖6a)，或與抗cd19-pe和抗cd4-fitc共染色以檢測cd4+cd19t+和cd8+(即，cd4陰性)car+細(xì)胞(圖6b)。利用熒光色素綴合的抗cd3、tcr、cd4、cd8、cd62l和cd28(灰色柱狀圖)或同種型對照(黑色柱狀圖)染色il13(eq)bbγ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1。(圖6c)。在圖6a-c的各圖中，所指示的百分比基于活的淋巴細(xì)胞(dapi陰性)染色的上述同種型。

實施例6：il13(eq)bbγ/cd19t+tcm的效應(yīng)器活性

評估il13(eq)bbζ/cd19t+tcm的效應(yīng)器活性并在圖7a-b中描述該分析結(jié)果。簡言之，il13(eq)bbγ/cd19t+tcmhd006.5和hd187.1在基于cd19t表達(dá)的使用10e:1t比例的6小時51cr-釋放測定中用作效應(yīng)器。將il13rα2陽性腫瘤靶標(biāo)是k562工程化改造的，以表達(dá)il13rα2(k562-il13rα2)和原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤系pbt030-2，并且il13rα2-陰性腫瘤靶標(biāo)對照是k562親本系(圖7a)。如上所述與相同的il13rα2-陽性和陰性靶標(biāo)以10e:1t比例過夜共培養(yǎng)后評估il13(eq)bbγ/cd19t+hd006.5和hd187.1的抗原依賴性細(xì)胞因子產(chǎn)生。使用bio-plexprohumancytokineth1/th2測定試劑盒測定細(xì)胞因子水平并描述inf-γ水平(圖7b)。

實施例7：il13(eq)bbγ/cd19t+tcm的體內(nèi)抗腫瘤活性

下述研究證明在體內(nèi)小鼠模型中il13(eq)bbγ/cd19t+tcm展示抗腫瘤效果。尤其是，我們已經(jīng)評估了il13(eq)bbγ/cd19t+tcm針對il13rα2+原代低傳代成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤球系pbt030-2的抗腫瘤潛能，已經(jīng)改造了所述原代低傳代成膠質(zhì)細(xì)胞瘤腫瘤球系pbt030-2以表達(dá)egfp和螢火蟲螢光素酶(ffluc)報告基因二者(pbt030-2egfp:ffluc)(6)。來自患者成膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的一組原代系(pbt)在無血清培養(yǎng)基中生長為腫瘤球(ts)。這些擴(kuò)增的ts系展示干細(xì)胞樣特征，包含干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)、多譜系分化和在免疫受損的小鼠(nsg)中以低細(xì)胞數(shù)目起始原位腫瘤的能力。pbt030-2egfp:fflucts起始的異種移植模型(0.1x10⁶細(xì)胞；5天移植物移入)先前已經(jīng)用于評估nsg小鼠中表達(dá)il13rα2-特異性car的t細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性，由此顯示2周期間三次注射2x10⁶細(xì)胞溶解性t淋巴細(xì)胞(ctl)降低腫瘤生長。然而，在那些實驗中，大多數(shù)pbt030-2腫瘤最終復(fù)發(fā)。通過比較，單次注射il13(eq)bbγ/cd19t+tcm(1.1x10⁶car+tcm；2x10⁶總tcm)展示針對pbt030-2egfp:fflucts-起始的腫瘤(0.1x10⁶細(xì)胞；5天移植物移入)的強的抗腫瘤活性，如圖8a-c中所示。與利用pbs或模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的tcm(無car)處理的nsg小鼠相比，il13(eq)bbγ/cd19t+tcm顯著減少ffluc流量(>18天，p<0.001)并顯著提高存活(p＝0.0008)。

簡言之，將egfp-ffluc+pbt030-2腫瘤細(xì)胞(1×10⁵)立體定向植入nsg小鼠的右前腦中。在第5天，小鼠接受2x10⁶個il13(eq)bbγ/cd19t+tcm(1.1x106car+；n＝6)、2x10⁶個模擬tcm(無car；n＝6)或pbs(n＝6)。圖8a描述了來自各組的代表性小鼠，使用xenogenlivingimage顯示相對腫瘤負(fù)荷。ffluc流量(光子/秒)的定量顯示與模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的tcm和pbs相比，il13(eq)bbζ/cd19t+tcm誘導(dǎo)腫瘤消退(#p<0.02，*p<0.001，重復(fù)測量anova)(圖8b)。如圖8c中所示，kaplanmeier存活曲線(n＝6/組)證明利用il13(eq)bbγ/cd19t+tcm處理的小鼠存活顯著提高(p＝0.0008；時序檢驗)。

實施例8：il13(eq)bbζ+tcm和非tcmil13-zetakinecd8+ctl克隆在抗腫瘤效果和t細(xì)胞持續(xù)性中的比較

下述研究比較了il13(eq)bbζ+tcm與先前產(chǎn)生的il13rα2-特異性人cd8+ctl(il13-zetakinecd8+ctl(描述于brown等2012clincancerres18:2199和kahlon等2004cancerres64:9160)。il13-zetakine使用cd3ζ刺激域，缺少共刺激域并使用與il13(eq)bbζ+相同的il13變體。

產(chǎn)生了來自患者成膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本的一組原代系(pbt)，其在無血清培養(yǎng)基中生長為腫瘤球(ts)(brown等2012clincancerres18:2199；brown等2009cancerres69:8886)。這些擴(kuò)增的ts系展示干細(xì)胞樣特征，包含干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)、多譜系分化和在免疫受損的小鼠(nsg)中以低細(xì)胞數(shù)目起始原位腫瘤的能力。il13rα2+原代低傳代成膠質(zhì)細(xì)胞瘤ts系pbt030-2用于下文概括的實驗，已經(jīng)改造所述il13rα2+原代低傳代成膠質(zhì)細(xì)胞瘤ts系pbt030-2以表達(dá)egfp和螢火蟲螢光素酶(ffluc)報告基因二者(pbt030-2egfp:ffluc)(brown等2012clincancerres18:2199)。

首先，單劑量(1x10⁶cart細(xì)胞)的il13(eq)bbζ+tcm產(chǎn)物與針對第8天pbt030-2egfp:ffucts-起始的異種移植物(0.1x10⁶細(xì)胞)評估的il13-zetakinecd8+ctl克隆進(jìn)行比較。盡管兩個il13rα2-特異性cart細(xì)胞(il13-zetakinectl和il13(eq)bbζtcm)與未處理的和模擬tcm(car-陰性)對照相比，證明針對建立的pbt030-2腫瘤的抗腫瘤活性(圖9a和9b)，il13(eq)bbz+tcm與我們的第一代il13-zetakinecd8+ctl克隆相比介導(dǎo)顯著提高的存活和持久的腫瘤消退，小鼠存活大于150天(圖9c)。

為了進(jìn)一步比較這兩個il13rα2-cart細(xì)胞產(chǎn)物的治療效果，進(jìn)行針對第8天pbt030-2egfp:ffucts-起始的腫瘤的1.0、0.3和0.1x10⁶cart細(xì)胞的劑量滴定(圖10a-c)。如在6只動物中的3只中通過xenogenflux所測定，最高劑量(1x10⁶)的il13-zetakinecd8+ctlcl.2d7介導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答(圖10c)，但是在較低cart細(xì)胞劑量沒有觀察到明顯的抗腫瘤應(yīng)答。通過比較，在大多數(shù)小鼠中在所有劑量水平上，包含利用盡可能少的0.1x10⁶cart細(xì)胞的處理，注射il13(eq)bbζ+tcm產(chǎn)物介導(dǎo)完整的腫瘤消退。這些數(shù)據(jù)證明il13(eq)bbζ+tcm比il13-zetakinecd8+ctl克隆在抗腫瘤效果上至少更有效10倍。提高的抗腫瘤效果是由于腫瘤微環(huán)境中提高的t細(xì)胞持續(xù)性。i.c.注射后7天評估cd3+t細(xì)胞揭示了腫瘤微環(huán)境中顯著數(shù)量的il13(eq)bbζ+tcm，然而存在非常少的第一代il13-ζctl(圖11)。

實施例9：用于處理大的ts起始pbt腫瘤的cart細(xì)胞遞送途徑的比較

下文描述的是這樣的研究，其比較在針對侵入性原代pbt系的抗腫瘤活性上靜脈內(nèi)(i.v.)或顱內(nèi)(i.c.)的遞送途徑。在初步研究中(數(shù)據(jù)未顯示)，出乎預(yù)料到觀察到與用于處理小的(第5天)pbt030-2egfp:ffluc腫瘤的pbs相比，i.v.施用的il13(eq)bbζ+tcm沒有提供治療益處。這與利用i.c.施用的car+t細(xì)胞觀察到的強治療效果相反。推理第5天的pbt030-2腫瘤可能已經(jīng)太小了以致于不能從外周募集治療性t細(xì)胞，對在針對較大的第19天的pbt030-2egfp:ffluc腫瘤的i.v.相對于i.c.遞送進(jìn)行比較。對于這些研究，利用兩次i.v.輸注(5x10⁶car+tcm；第19天和第26天)或四次i.c.輸注(1x10⁶car+tcm；第19、22、26和29天)il13(eq)bbz+tcm，或模擬tcm(無car)處理pbt030-2移入的小鼠。此處沒有如通過對i.v.施用的car+t細(xì)胞xenogen成像或kaplan-meier存活分析所監(jiān)測到的治療益處(圖12a和12b)。相反，對i.c.施用的il13(eq)bbζ+tcm觀察到有效的抗腫瘤活性(圖12a-b)。然后，收集來自t細(xì)胞注射后7天的一組小鼠的腦并通過ihc評估cd3+人t細(xì)胞。令人驚訝的是，對于利用模擬tcm或il13(eq)bbζtcmi.v.處理的小鼠，在腫瘤或其中人t細(xì)胞通常存在的其他小鼠腦區(qū)域(即，柔腦膜)中沒有可檢測的cd3+人t細(xì)胞(圖12c)，提示腫瘤向性的缺乏。這與在i.c.處理的小鼠中檢測到顯著數(shù)量的t細(xì)胞相反(圖12d)。

腫瘤來源的細(xì)胞因子，特別是mcp-1/ccl2在將t細(xì)胞募集到腫瘤中是重要的。因此，評估pbt030-2腫瘤細(xì)胞并發(fā)現(xiàn)該系產(chǎn)生與u251t細(xì)胞相當(dāng)?shù)母咚降膍cp-1/ccl2(數(shù)據(jù)未顯示)，所述u251t細(xì)胞是先前顯示吸引靜脈內(nèi)施用的效應(yīng)器cd8+t細(xì)胞到顱內(nèi)移入的腫瘤的神經(jīng)膠質(zhì)瘤系。惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是高度侵入性腫瘤并且在表現(xiàn)上經(jīng)常是多病灶的。上述研究確定il13bbztcm可以消除浸潤的腫瘤如pbt030-2，并且介導(dǎo)長期持久的抗腫瘤活性。也檢查了顱內(nèi)遞送的cart細(xì)胞運輸?shù)蕉嗖≡罴膊〉哪芰?。對于該研究，將pbt030-2egfp:fflucts植入左半球和右半球(圖13a)并僅在右邊腫瘤位點上注射car+t細(xì)胞。令人鼓舞的是，對于所評估的所有小鼠(n＝3)，我們通過在注射位點(即，右邊腫瘤)，以及左半球的腫瘤內(nèi)在t細(xì)胞輸注后7天通過cd3ihc檢測t細(xì)胞(圖13b)。這些發(fā)現(xiàn)提供了這樣的證據(jù)，即car+t細(xì)胞能夠運輸?shù)讲⒔欉h(yuǎn)位點上的腫瘤灶。在使用u251t神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的第二個腫瘤模型中也觀察到類似的發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例10：共刺激域的比較

進(jìn)行一系列研究以評估多個共刺激域。在圖14a中示意性描述了所評估的多個car并且其包含缺少共刺激域的第一代cd3ζcar，摻入了4-1bb共刺激域或cd28共刺激域的第二代cars，和含有cd28共刺激域和41bb共刺激域的第三代car。所有car構(gòu)建體還含有t2a核糖體跳躍序列和截短的cd19(cd19t)序列作為標(biāo)志物用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。

經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)cd4和cd8tcm并通過抗cd19免疫磁性富集表達(dá)car的t細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)測定cd19和il13(即，car)表達(dá)水平。在圖14b中顯示了結(jié)果。通過將car(il13)平均熒光強度(mfi)除以轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)志物(cd19t)的平均熒光強度測定各car構(gòu)建體的穩(wěn)定性(圖14c)。包含4-1bb共刺激域的兩個car與cd19t轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)志物相比展示最低表達(dá)水平。

在指示的效應(yīng)器：靶標(biāo)比例的4小時⁵¹cr-釋放測定中測定指示的模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的或表達(dá)car的t細(xì)胞殺死表達(dá)il13rα2的pbt030-2腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)的能力。在圖15a中顯示了該研究的結(jié)果(描述了一式三份孔的均值％鉻釋放±s.d.)。如預(yù)期，模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞未有效裂解靶標(biāo)。相反，所有表達(dá)car的t細(xì)胞以相似的方式裂解腫瘤細(xì)胞。圖15b描述了這樣的研究結(jié)果，其中指示模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的或表達(dá)car的t細(xì)胞與表達(dá)il13rα2的pbt030-2腫瘤細(xì)胞以10：1的比例共培養(yǎng)過夜并且通過細(xì)胞測定珠陣列分析上清液的il-13和ifn-γ水平。有趣的是，表達(dá)ζ、41bb-ζ或cd28-41bb-ζcar的t細(xì)胞比表達(dá)cd28-ζcar的t細(xì)胞展示更低的抗原刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生。

如下檢查多種car的體內(nèi)效率。簡言之，nsg小鼠在第0天接受顱內(nèi)注射ffluc+pbt030-2腫瘤細(xì)胞，并被隨機(jī)化到6個組中(n＝9-10小鼠/組)用于在第8天利用pbs(僅腫瘤)、模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞或表達(dá)指示的il13rα2-特異性car的t細(xì)胞進(jìn)行顱內(nèi)處理。然后進(jìn)行定量生物發(fā)光成像以監(jiān)測腫瘤隨時間的生長。各組中代表性小鼠的生物發(fā)光圖像(圖16a)。第27天各小鼠的流量水平(圖16b)。除了利用表達(dá)cd28-car的t細(xì)胞處理的那些組，利用il13rα2-特異性cart細(xì)胞處理的所有組相比于利用模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞處理的小鼠在腫瘤體積上顯示統(tǒng)計學(xué)上顯著的減小(圖16c)。

實施例11：il13(eq)bbζ/cd19t的氨基酸序列

在圖17中描述了il13(eq)bbζ/cd19t的完整氨基酸序列。整條序列(seqidno:1)包含：22個氨基酸的gmcsf信號肽(seqidno:2)、112個氨基酸的il-13序列(seqidno:3；粗體顯示的氨基酸取代e13y)；229個氨基酸的igg4序列(seqidno:4；具有粗體顯示的氨基酸取代l235e和n297q)；22個氨基酸的cd4跨膜序列(seqidno:5)；42個氨基酸的4-1bb序列(seqidno:6)；3個氨基酸的gly接頭；112個氨基酸的cd3ζ序列(seqidno:7)；24個氨基酸的t2a序列(seqidno:8)；和323個氨基酸的cd19t序列(seqidno:9)。

成熟的嵌合抗原受體序列(seqidno:10)包含：112個氨基酸的il-13序列(seqidno:3；粗體顯示的氨基酸取代e13y)；229個氨基酸的igg4序列(seqidno:4；具有粗體顯示的氨基酸取代l235e和n297q)；22個氨基酸的cd4序列(seqidno:5)；42個氨基酸的4-1bb序列(seqidno:6)；3個氨基酸的gly接頭；和112個氨基酸的cd3ζ序列(seqidno:7)。在該car序列(seqidno:10)中是il-13/igg4/cd4t/41-bb序列(seqidno:11)，其包含112個氨基酸的il-13序列(seqidno:3；粗體顯示的氨基酸取代e13y)；229個氨基酸的igg4序列(seqidno:4；具有粗體顯示的氨基酸取代l235e和n297q)；22個氨基酸的cd4序列(seqidno:5)；和42個氨基酸的4-1bb序列(seqidno:6)。il13/igg4/cd4t/4-1bb序列(seqidno:11)可以通過接頭如glyglygly接頭連接到112個氨基酸的cd3ζ序列(seqidno:7)中。car序列(seqidno:10)前面可以是22個氨基酸的gmcsf信號肽(seqidno:2)。

圖18描述了il13(eq)41bbζ[il13{eq}41bbζt2a-cd19t_ephiv7；pf02630](seqidno:12)與cd19rop_ephiv7(pj01683)(seqidno:13)的序列比較。

實施例12：il13(eq)bbζ/cd19t的氨基酸序列

圖19-26描述了除了定位在某些胞內(nèi)域之間的glyglygly間隔物外在多個域被標(biāo)記的各種情況中針對il13rα2的額外car的氨基酸序列。每一個包含glu變成tyr的人il13(seqidno:3；強調(diào)突出顯示的氨基酸取代e13y)。在用于表達(dá)這些car的表達(dá)載體中，所表達(dá)的氨基酸序列可以包含24個氨基酸的t2a序列(seqidno:8)；和323個氨基酸的cd19t序列(seqidno:9)以允許在表達(dá)car的細(xì)胞表面上協(xié)同表達(dá)截短的cd19序列。

如在72小時共培養(yǎng)測定中評估，測試一組car的介導(dǎo)il13ra2-特異性殺死的能力，所述car包含人il13(e13y)域、cd28tm域、cd28gg共刺激域、4-1bb共刺激域，和cd3ζ域car骨架并包含hl(22個氨基酸)間隔物、cd8鉸鏈(48個氨基酸)間隔物、igg4-hl-ch3(129個氨基酸)間隔物或igg4(eq)(229個氨基酸)間隔物。除了在該系統(tǒng)中看起來具有弱car表達(dá)的hl(22個氨基酸)外，其他均為活性的。