本發(fā)明涉及tsc22d4活性或表達的寡核苷酸抑制劑，及其在哺乳動物中用于預(yù)防、治療和/或調(diào)節(jié)胰島素抵抗、代謝綜合征和/或糖尿病和/或提高胰島素敏感性的用途。

發(fā)明背景

在人類中，過量脂質(zhì)儲存和減低移除的組合導(dǎo)致超重和相關(guān)的共存疾病，包括胰島素抵抗、心血管并發(fā)癥和血脂異常(langind.inandout:adiposetissuelipidturnoverinobesityanddyslipidemia.cellmetab.2011nov2；14(5):569-70)，現(xiàn)今在全世界影響超過15億人(finucanemm等人，national,regional,andglobaltrendsinbody-massindexsince1980:systematicanalysisofhealthexaminationsurveysandepidemiologicalstudieswith960country-yearsand91millionparticipants.lancet.2011feb12；377(9765):557-67)。確實，胰島素抵抗代表所謂的代謝綜合征的核心部分，最終導(dǎo)致代謝功能障礙的發(fā)展，如葡萄糖耐受不良、胰腺β細胞衰竭和最終的2型糖尿病。

受損的胰島素分泌(β-細胞)、增加的肝葡萄糖生成(肝臟)和降低的外周(肌肉)葡萄糖利用構(gòu)成了導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)展和進展的常規(guī)的主要缺陷?，F(xiàn)在已知，在2型糖尿病的自然史中，最終導(dǎo)致降低的胰島素分泌的β-細胞衰竭比最初認為的發(fā)生地早的多。此外，對于2型糖尿病的病理生理學(xué)的更好的了解揭示了現(xiàn)在被稱為發(fā)病八重奏(ominousoctet)的經(jīng)典三聯(lián)癥(triad)之外的其它病因?qū)W機制。除了β-細胞、肝臟和肌肉之外，其它致病機制包括脂肪細胞胰島素抵抗(增加的脂解作用)、降低的腸降血糖素分泌/敏感性(胃腸的)、增加的胰高血糖素分泌(α-細胞)、增強的葡萄糖重吸收(腎臟)以及由神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)胰島素抵抗(腦)。當(dāng)前，2型糖尿病的管理集中于經(jīng)降低血糖(空腹和餐后)和血紅蛋白a(1c)控制葡萄糖。但是，療法的目標(biāo)應(yīng)該是延緩疾病進展和最終的治療失敗。治療應(yīng)靶向疾病已知的致病性干擾(即降低β-細胞功能的退化并提高胰島素敏感性)。近年來，治療策略已集中于影響促成2型糖尿病的多種缺陷以及通過鈍化疾病進展提供持久的葡萄糖控制的新型治療選擇的發(fā)展。2型糖尿病的最佳管理應(yīng)該包括早期起始利用具有不同作用機制的多種藥物的組合療法(defronzora.(currentissuesinthetreatmentoftype2diabetes.overviewofneweragents:wheretreatmentisgoing.amjmed.2010mar；123(3suppl):s38-48)。

特別地，針對胰島素作用的主要代謝器官的不敏感性(包括肝臟、骨骼肌和脂肪組織)在很大程度上導(dǎo)致疾病進展和對于藥物介入以預(yù)防糖尿病晚期并發(fā)癥的最終需求。因此，有效且安全的胰島素敏化在抗-糖尿病療法中仍是具有吸引力的目標(biāo)和目的。

轉(zhuǎn)錄輔助因子復(fù)合物已被鑒定為不同組織(包括肝臟和白脂肪組織(wat))中代謝程序的協(xié)調(diào)中的重要檢驗點(關(guān)于綜述，參見sommerfelda,krones-herziga,herzigs.transcriptionalco-factorsandhepaticenergymetabolism.molcellendocrinol.2011jan30；332(1-2):21-31)。

kesterha等人(在transforminggrowthfactor-beta-stimulatedclone-22isamemberofafamilyofleucinezipperproteinsthatcanhomo-andheterodimerizeandhastranscriptionalrepressoractivity.jbiolchem.1999sep24；274(39):27439-47中)描述了，tgf-β-刺激的克隆-22(tsc-22)編碼在進化中高度保守的包含亮氨酸拉鏈的蛋白。

此外，jones等人(在jones,a.等人，transforminggrowthfactor-beta1stimulatedclone-22d4isamolecularoutputofhepaticwastingmetabolism.embomolmed.2013feb；5(2):294-308中)描述了，作為分子惡病質(zhì)輸出通路，轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化生長因子β1-刺激的克隆(tsc)22d4的肝臟水平在癌癥惡病質(zhì)中增加。在健康肝臟中模擬高惡病質(zhì)水平的tsc22d4導(dǎo)致肝臟vldl釋放和脂肪生成基因的抑制，并減弱了正常和高脂肪飲食條件下的全身vldl水平。因此，肝臟tsc22d4活性可以表示患有代謝消耗性疾病(包括癌癥惡病質(zhì))的對象中外圍能量缺乏的分子理論基礎(chǔ)。

kulozik,ph.等人(hepaticdeficiencyintranscriptionalco-factortblipromotesliversteatosisandhypertriglyceridemia.2011cellmetab.13:389-400)描述了，轉(zhuǎn)錄輔助因子轉(zhuǎn)導(dǎo)素β樣(tbl)1的受損的肝臟表達代表單-和多基因脂肪肝小鼠模型的共同特征。在正常和高脂肪飲食條件下，健康小鼠中tbl1基因表達的肝臟特異性切除促進了高甘油三酯血癥和肝脂肪變性。由于發(fā)現(xiàn)tbl1表達水平也與人患者中的肝臟脂肪含量負相關(guān)，因此肝臟tbl1/tblr1輔助因子活性的缺乏可以表示患有肥胖和代謝綜合征的對象中肝脂肪變性的分子理論基礎(chǔ)。

berrieldiaz,m.等人(nuclearreceptorco-factorrip140controlslipidmetabolismduringwastinginmice.2008.hepatology48:782-791)描述了，通過預(yù)防肝臟tg儲存的動員，肝臟中rip140的誘導(dǎo)提供了饑餓、敗血癥或癌癥惡病質(zhì)中肝脂肪變性的分子理論基礎(chǔ)。因此，在這些病況的治療中，肝臟rip140轉(zhuǎn)錄活性的抑制可以提供有吸引力的輔助方案。

farese等人(在theproblemofestablishingrelationshipsbetweenhepaticsteatosisandhepaticinsulinresistance.cellmetab.2012may2；15(5):570-3中)描述了，脂肪在肝臟中的過度沉積(肝脂肪變性)通常伴隨著肝臟胰島素抵抗。

抗-糖尿病和/或胰島素敏化藥物的主要類別包括磺酰脲、二甲雙胍、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制劑、腸降血糖素模擬物和二肽基-肽酶4抑制劑，其均與嚴重的限制相關(guān)(關(guān)于綜述，參見moller,metabolicdiseasedrugdiscovery-"hittingthetarget"iseasiersaidthandone.cellmetab.2012jan4；15(1):19-24)。

盡管胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)病機制中具有重要作用，但是仍然缺乏有效且安全的胰島素敏化劑。確實，當(dāng)前噻唑烷二酮家族的藥物顯示出適度的功效特征，并且伴隨著很大的副作用，包括體重增加、心臟衰竭的風(fēng)險增加、膀胱癌的風(fēng)險可能增加以及心肌梗塞的風(fēng)險增加，例如導(dǎo)致羅格列酮最近退出市場。

wo2013/076501公開了鑒定可用于治療和/或預(yù)防與胰島素抵抗和/或葡萄糖耐受不良相關(guān)的疾病的藥劑的篩選方法，其包括下述步驟：研究測試藥劑抑制vps34信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和/或rhoiota3κ-02β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的能力。類似地，wo2005/059564公開了篩選調(diào)控視黃醇結(jié)合蛋白4(rbp4)的活性的分子的方法，并描述了其在胰島素抵抗的治療中的用途。還描述了通過檢測rbp4活性的調(diào)控來診斷胰島素抵抗和相關(guān)病況的方法。

wo2012/158123涉及通過施用蛋白激酶rna-樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(perk)基因或其功能變體的抑制劑或者perk蛋白或其功能變體的抑制劑治療或預(yù)防動物體中的胰島素抵抗綜合征的方法，或者通過施用蛋白激酶rna-樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(perk)基因或其功能變體的抑制劑或者perk蛋白或其功能變體的抑制劑降低foxo家族(foxo1、3a、4和6)的轉(zhuǎn)錄因子的活性的方法。

wo2014/202602通常涉及tsc22d4活性或表達的調(diào)節(jié)劑，特別是抑制劑，及其在哺乳動物中用于預(yù)防、治療和/或調(diào)節(jié)胰島素抵抗、代謝綜合征和/或糖尿病和/或提高胰島素敏感性的用途。wo2014/202602還涉及篩選方法以鑒定這些調(diào)節(jié)劑。

盡管通過病毒遞送指向tsc22d4的shrna或mirna構(gòu)建體的實驗性敲低已證實有效改善糖尿病動物的代謝狀態(tài)，但是還未鑒定出在通過不同技術(shù)遞送時，適合在不同物種中高效且特異性敲低tsc22d4的sirna構(gòu)建體。

考慮到以上所述的

背景技術(shù)：
中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供預(yù)防、治療和/或調(diào)節(jié)胰島素抵抗、代謝綜合征和/或糖尿病和/或提高胰島素敏感性的新的治療性策略。

在本發(fā)明的第一方面，通過提供tsc22d4的表達和/或生物活性的抑制劑實現(xiàn)以上目的，所述抑制劑選自寡核苷酸、其反義序列或其功能變體，所述寡核苷酸為包含下述序列中的至少一種的干擾核糖核酸、pna(蛋白核酸)或lna(鎖核酸)：5’-ggacguguguggauguuuadtdt-3’(seqidno.1)；5’-ggauguuuacgagagagaudtdt-3’(seqidno.2)；5’-agucccaccucauguuugcdtdt-3’(seqidno.3)。

mhd4-sirna1:(nm_030935.3_sirna_1024；orf)

正義：5’-ggacguguguggauguuuadtdt-3’(seqidno.1)；

反義：5’-uaaacauccacacacguccdtdt-3’(seqidno.4)；

gc：47％(w/ott-突出)

md4-sirna2:(nm_023910.6_sirna_993；orf)

正義：ggauguuuacgagagagaudtdt-3’(seqidno.2)；

反義：aucucucucguaaacauccdtdt-3’(seqidno.5)；

gc：42.1％(w/ott-突出)

mhd4-sirna3:

正義：5’-agucccaccucauguuugcdtdt-3’(seqidno.3)；

反義：5’-gcaaacaugaggugggacudtdt-3’(seqidno.6)；

gc：52.6％(w/ott-突出)

最近，本發(fā)明的發(fā)明人表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物轉(zhuǎn)化生長因子β1刺激的克隆22d4(tsc22d4)控制肝臟和全身胰島素敏感性。在野生型小鼠中，肝臟特異性的tsc22d4損失顯著改善了葡萄糖耐受性和胰島素敏感性，并中和了高胰島素血癥。健康動物中與高通量tsc22d4目標(biāo)轉(zhuǎn)錄組研究組合的tsc22d4順反組的chlp-seq分析揭示，tsc22d4直接或間接靶向胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要節(jié)點，最顯著的是脂質(zhì)運載蛋白13。

確實，在針對急性胰島素暴露的應(yīng)答中，如分別通過akt/pkb激酶在ser473位和gsk3β在ser9位的磷酸化所確定的，原代小鼠肝細胞以及野生型小鼠中tsc22d4的下調(diào)或過表達導(dǎo)致細胞內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上調(diào)或下調(diào)。有趣地，在糖尿病db/db小鼠中，tsc22d4的肝臟失活改善了這些動物中的葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗，并使血糖正?；翈缀踅】档乃?。與糖尿病動物中代謝狀態(tài)的整體改善一致，在具有肝臟特異性的tsc22d4缺陷中的小鼠中，促炎性細胞因子和抵抗素的循環(huán)水平顯著降低。

盡管通過病毒遞送指向tsc22d4的shrna或mirna構(gòu)建體的實驗性敲低已證實有效改善糖尿病動物的代謝狀態(tài)，但是還未鑒定出通過不同技術(shù)遞送時，適合在不同物種中高效且特異性敲低tsc22d4的sirna構(gòu)建體。

肝癌細胞中tsc22d4的失活未增加細胞生長，但是降低了增殖，這表明tsc22d4的胰島素敏化功能未導(dǎo)致受影響的細胞/或器官中增加的癌癥易感性。此外，tsc22d4的肝臟失活也未引起低血糖。

“抑制劑”是可以降低催化反應(yīng)中催化劑的有效性的物質(zhì)(非生物催化劑或酶)。本文提及的抑制劑可以降低酶的活性的有效性；并且本文提及的抑制劑可以降低酶表達的有效性。在本發(fā)明的背景下，優(yōu)選的抑制劑是寡核苷酸。

術(shù)語“寡核苷酸”通常指干擾核糖核酸(irna)或蛋白核酸(pna)或鎖核酸(lna)。術(shù)語“寡核苷酸”通常指由共價連接在一起的超過19個核苷酸亞基構(gòu)成的單鏈核苷酸聚合物。同樣如下述進一步所述，優(yōu)選存在19至100個核苷酸單元，最優(yōu)選將19至50個核苷酸單元連接在一起。

核苷酸亞基的糖基可以是核糖、脫氧核糖或其修飾的衍生物，如2'-0-甲基核糖。寡核苷酸的核苷酸亞基可以通過磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、甲基磷酸酯鍵或者通過不阻止寡核苷酸的雜交的其它罕見的或非天然存在的鍵連接。此外，寡核苷酸可以含有不常見的核苷酸或非核苷酸部分。

在本說明書的背景下，術(shù)語“寡核苷酸”也可以指本領(lǐng)域已知的那些的核酸類似物(例如鎖核酸(lna))或其混合物。術(shù)語“寡核苷酸”包括由天然存在的核堿基、糖和核苷(骨架)間的鍵組成的寡核苷酸以及含有具有類似功能或具有特別改善的功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。因為完全或部分修飾或取代的寡核苷酸的一些期望特性，如例如能夠穿透細胞膜、針對細胞外和細胞內(nèi)核酶的良好抗性、針對核酸靶標(biāo)的高親和力和特異性，相對于天然形式，此類寡核苷酸通常是優(yōu)選的。以此種方式修飾寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域是已知的。

在一些寡核苷酸中(有時稱為寡核苷酸模擬物)，核苷酸單元的糖和核苷間的鍵，即骨架均被新的基團置換。保留堿基單元以與合適的核酸靶標(biāo)化合物雜交。一種此類寡聚化合物是已顯示具有極好雜交特性的寡核苷酸模擬物，其被稱為蛋白核酸(pna)。在pna化合物中，寡核苷酸的糖骨架被包含酰胺的骨架，特別是氨乙基甘氨酸骨架置換。核堿基被保留，并且其與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子直接或間接結(jié)合。

其它修飾包括鎖核酸(lna)，其中2’-羥基與糖環(huán)的3’或4’碳原子相連，從而形成雙環(huán)糖部分。鍵優(yōu)選是橋接2’氧原子和4’碳原子的亞甲基(-ch2-)n基團，其中n是1或2。術(shù)語“l(fā)na”通常指含有一個雙環(huán)核苷類似物的核苷酸(也被稱為lna單體)，或者含有一個或多個雙環(huán)核苷類似物的寡核苷酸。

優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的抑制劑，其中干擾核糖核酸是小干擾核糖核酸(sirna)或小發(fā)卡核糖核酸(shrna)或微小核糖核酸(mirna)或者它們的組合。

還優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的抑制劑，其中sirna的長度為19至30個核苷酸。

一方面，生物活性劑利用“rna干擾(rnai)”。rnai是由雙鏈rna(dsrna)或sirna引發(fā)的序列特異的、轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法。rnai見于多種有機體中，如果蠅、線蟲、真菌和植物，并且被認為參與抗病毒防御、轉(zhuǎn)座子活性的調(diào)控以及基因表達的調(diào)節(jié)。在rnai期間，dsrna或sirna引起靶標(biāo)mrna的降解，隨后伴隨著基因表達的序列特異性抑制。本文使用的“小干擾rna”(sirna)是靶向tsc22d4的基因的核苷酸的rna雙鏈體?！皉na雙鏈體”指通過rna分子的兩個區(qū)域的互補配對形成的結(jié)構(gòu)。sirna“靶向”基因，這是因為sirna雙鏈體部分的核苷酸序列與靶基因的核苷酸序列互補。在一些實施方案中，sirna雙鏈體的長度小于30個核苷酸。在一些實施方案中，雙鏈體的長度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個核苷酸。在一些實施方案中，雙鏈體的長度是19-25個核苷酸。sirna的rna雙鏈體部分可以是發(fā)卡結(jié)構(gòu)的一部分。除雙鏈體部分之外，發(fā)卡結(jié)構(gòu)可以包含位于形成雙鏈體的兩條序列之間的環(huán)部分。環(huán)的長度可以不同。在一些實施方案中，環(huán)的長度是5、6、7、8、9、10、11、12或13個核苷酸。發(fā)卡結(jié)構(gòu)也可以包含3’和/或5’突出部分。在一些實施方案中，突出是長度為0、1、2、3、4或5個核苷酸的3’和/或5’突出。sirna可由核酸序列編碼，并且該核酸序列還可以包含啟動子。核酸序列還可以包含聚腺苷酸化信號。在一些實施方案中，聚腺苷酸化信號是合成的最小聚腺苷酸化信號。

本文使用的術(shù)語“sirna”指能夠引導(dǎo)或介導(dǎo)rna干擾通路的包含約19至50個核苷酸(或核苷酸類似物)的核糖核酸(rna)或rna類似物。這些分子的長度可以不同，并且在其反義鏈中可以包含針對靶標(biāo)信使rna(mrna)的不同程度的互補性。術(shù)語“sirna”包括兩條單獨的鏈的雙鏈體(即雙鏈rna)以及可以形成由雙鏈體區(qū)域組成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈。sirna的長度可以是約19至50個核苷酸、或者約25至50個核苷酸、或者約30至50個核苷酸、或者約35至50個核苷酸、或者約40至50個核苷酸。在一個實施方案中，sirna的長度為19至30個核苷酸。

將sirna用于下調(diào)其靶標(biāo)mrna的活性在本領(lǐng)域是已知的。在一些實施方案中，當(dāng)sirna的反義鏈或引導(dǎo)鏈引導(dǎo)包含rna核酸內(nèi)切酶ago2的rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)切割含有互補序列的其靶標(biāo)mrna時，發(fā)生mrna降解。因此，sirna可與perk基因的不同長度的任何部分互補。sirna還可以與tsc22d4基因的正義鏈和/或反義鏈互補。因此，可將sirna處理用于沉默tsc22d4基因，從而消耗下游的tsc22d4蛋白。

本文使用的術(shù)語“shrna”指能夠進行rnai并含有隨從鏈、環(huán)和引導(dǎo)鏈的單分子rna。隨從鏈和引導(dǎo)鏈可以互相基本互補。術(shù)語“shrna”還可以包括含有除核糖核苷酸部分之外的部分的核酸，包括但不限于：修飾的核苷酸、修飾的核苷酸間的鍵、非核苷酸、脫氧核苷酸以及核苷酸的類似物。

mirna下調(diào)其靶標(biāo)mrna。術(shù)語“mirna”通常指單鏈分子，但是在特定實施方案中，其也可以涵蓋與同一單鏈分子的另一區(qū)域或者與另一核酸部分(鏈長10％至50％互補)、基本(鏈長大于50％但小于100％互補)或完全互補的區(qū)域或其它鏈。因此，核酸可以涵蓋這樣的分子：其包含一條或多條互補鏈或自身互補鏈，或者分子所包含的特定序列的“互補物”。例如，前體mirna可以含有高至100％互補的自身互補區(qū)域。本發(fā)明的mirna探針或核酸可以包含其靶標(biāo)，可以是其靶標(biāo)或者可以與其靶標(biāo)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互補。

最優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的抑制劑，其中sirna由如seqidno.1至3所述序列其反義序列組成。

還優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的抑制劑，其中其功能變體包含至少一個修飾的或取代的核苷酸。術(shù)語“功能變體”也包括片段、基于簡并核酸密碼的變體或化學(xué)衍生物。功能變體可以含有保守改變，其中取代的核酸與被置換的核酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性。功能變體還可以含有一個或多個核酸的缺失和/或插入。應(yīng)該理解，功能變體至少部分保留tsc22d4基因的生物活性(例如，功能)，或者甚至顯示出改善的生物活性。

修飾的寡核苷酸的實例包括但不限于：含有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸(參見上述)和含有雜原子骨架的寡核苷酸，以及特別是-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-[其中天然的磷酸二酯骨架表示為-o-p-o-ch2-]。具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸也是可用的。用作干擾核糖核酸的修飾的寡核苷酸還可以包含一個或多個取代的糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸包含位于2’位的下述之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或者o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1至c10烷基或者c2至c10烯基和炔基。具體實例包括但不限于：o[(ch2)no]mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n和m為1至約10。其它示例性寡核苷酸包含位于2’位的下述之一：c1至c10低級烷基，取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基，sh，sch3，ocn，cl，br，cn，cf3，ocf3，soch3，so2ch3，ono2，no2，n3，nh2，雜環(huán)烷基，雜環(huán)烷芳基，氨基烷基氨基，聚烷基氨基，取代的甲硅烷基，rna切割基團，報告基團，嵌入劑，用于改善寡核苷酸的藥代動力學(xué)特性的基團，或者用于改善寡核苷酸的藥效動力學(xué)特性的基團，以及具有類似特性的其它取代基。一種示例性修飾包含2’-甲氧基乙氧基(2’-o-ch2ch2och3，也被稱為2’-o-(2-甲氧乙基)或2’-moe)，即烷氧基烷氧基基團。

此外，另一方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的重組載體。一般而言，將寡核苷酸插入表達載體(如質(zhì)粒)中，用于表達。如果必要，可將寡核苷酸與期望的宿主識別的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列連接，盡管此類控制在表達載體中通常是可用的。然后通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將載體引入宿主。

在哺乳動物細胞中表達sirna的載體通常使用rna聚合酶iii啟動子來驅(qū)動模擬sirna的結(jié)構(gòu)的短的發(fā)卡rna的表達。將編碼該發(fā)卡的插入物設(shè)計為含有通過短的間隔序列分開的兩個反向重復(fù)序列。一個反向重復(fù)序列與sirna所靶向的mrna互補。添加至3’端的一連串胸苷作為poliii轉(zhuǎn)錄終止位點。一旦位于細胞內(nèi)部，則載體組成型表達誘導(dǎo)靶基因的沉默的發(fā)卡rna。

其它合適的載體包括病毒載體，如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒或者各自的表達系統(tǒng)(參見，例如catanotto,d.等人(2002)functionalsirnaexpressionfromtransfectedpcrproducts.rna8,1454-1460；barton,g.m.等人(2002)retroviraldeliveryofsmallinterferingrnaintoprimarycells.procnatlacadsciusa.99(23):14943-5.abbas-terki,t.等人(2002)lentiviral-mediatedrnainterference.hum.genether.13,2197-2201，以及xia,h.等人(2002)sirna-mediategenesilencinginvitroandinvivo.nat.biotechnol.20,1006-1010)。

一般而言，并非所有的宿主均被載體轉(zhuǎn)化。因此，選擇用于轉(zhuǎn)化的宿主細胞將是必要的。一種選擇技術(shù)涉及將編碼轉(zhuǎn)化的細胞中的選擇性特征，如抗生素抗性的dna序列以及任何必要的控制元件并入表達載體?？蛇x地，此類選擇性特征的基因可以位于用于共轉(zhuǎn)化期望的宿主細胞的另一載體上。然后參考本公開的教導(dǎo)，在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適條件下將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的寡核苷酸的宿主細胞培養(yǎng)足夠的時間，以允許多肽的表達，然后可以回收所述多肽。

其它實例可見于參考文獻，例如yangj.等人(design,preparationandapplicationofnucleicaciddeliverycarriers.”biotechnoladv.2014jul-aug；32(4):804-17)中。

通過多種方法可將本文所述的各類核酸(例如，寡核苷酸和/或載體)引入細胞。在脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中，細胞通過內(nèi)吞作用吸收核酸與脂質(zhì)或聚合物試劑之間的非共價復(fù)合物。電穿孔利用短暫的電脈沖來引起細胞質(zhì)膜的破壞或穿孔，核酸通過這進入。這些方法均成功遞送除病毒載體之外的任何rnai核酸。病毒載體遞送僅通過用相應(yīng)的病毒感染細胞而發(fā)生，通常使用輔助病毒。用病毒感染期望的細胞系引入了sirna或shrna，并敲低了基因表達。

此外，本發(fā)明另一方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或根據(jù)本發(fā)明的重組載體的重組細胞，優(yōu)選重組肝細胞。根據(jù)本發(fā)明的“細胞”可以是原核細胞或真核細胞。根據(jù)本發(fā)明的“細胞”優(yōu)選但不限于選自肝細胞。哺乳動物細胞可以優(yōu)選選自人、兔、小鼠或大鼠。優(yōu)選地，細胞是人細胞，例如肝細胞。術(shù)語“細胞”還包括動物模型的細胞。此外，細胞可以是組織培養(yǎng)物的一部分。

還通過生產(chǎn)藥物組合物的方法來實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述方法包括用至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑配制所述至少一種根據(jù)本發(fā)明的抑制劑的步驟。藥物組合物的載體和/或賦形劑必須是從與制劑的其它成分兼容且對于其接受者無害的意義而言“可接受的”。

此外，本發(fā)明另一方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的抑制劑、根據(jù)本發(fā)明的重組載體和根據(jù)本發(fā)明的重組細胞中的至少一種以及藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其中所述藥物組合物用于口服施用、直腸施用、經(jīng)粘膜施用、經(jīng)皮施用、腸部施用、腸胃外施用、肌內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用、直接心室內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、腹腔內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用、眼內(nèi)施用或者皮下施用。

此外，本發(fā)明另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的抑制劑、根據(jù)本發(fā)明的表達載體、根據(jù)本發(fā)明的重組細胞或者根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其用于預(yù)防、調(diào)節(jié)和/或治療疾病的用途。

胰島素抵抗綜合征組成了廣泛的臨床表現(xiàn)，并且其被定義為與胰島素抵抗相關(guān)的任何異常。諸如針對胰島素的抗性、糖尿病、高血壓、血脂異常和心血管疾病的異常構(gòu)成了胰島素抵抗綜合征。

胰島素抵抗綜合征可以是飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和/或肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗。飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗意為，針對胰島素的抗性是由含有高飽和脂肪和碳水化合物含量的飲食誘導(dǎo)的。肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗意為，針對胰島素的抗性是由肥胖的遺傳素質(zhì)或者由飲食習(xí)慣導(dǎo)致的肥胖誘導(dǎo)的。

因此本發(fā)明另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的抑制劑，根據(jù)本發(fā)明的表達載體、根據(jù)本發(fā)明的重組細胞或者根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其用于預(yù)防、調(diào)節(jié)和/或治療選自下述的疾病的用途和/或用于提高胰島素敏感性(如例如在腫瘤疾病背景下的胰島素敏感性)：胰島素抵抗、高血壓、血脂異常、冠狀動脈疾病、代謝綜合征和/或1型或2型糖尿病。優(yōu)選地，胰島素抵抗綜合征是飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和/或肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

還通過治療和/或預(yù)防有需要的對象中的選自胰島素抵抗、代謝綜合征和/或糖尿病的疾病的方法來實現(xiàn)目的，所述方法包括向是有需要的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抑制劑或者根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的步驟。

可將公開的方法用于治療由胰島素抵抗綜合征引起的下述病況中的任何一種：胰島素抵抗、高血壓、血脂異常、2型糖尿病或冠狀動脈疾病。

本發(fā)明背景下的術(shù)語“預(yù)防”應(yīng)被理解為，旨在避免最可能導(dǎo)致患有疾病的患者的病況惡化或者導(dǎo)致健康和/或患病對象的損傷或死亡的不良事件的發(fā)生的醫(yī)療干預(yù)?！坝行枰幕颊摺笨梢允堑幌抻?，罹患胰島素抵抗綜合征相關(guān)的疾病，特別是胰島素抵抗、高血壓、血脂異常、2型糖尿病或冠狀動脈疾病的任何動物或人。優(yōu)選地，有需要的對象是人。

還通過治療性試劑盒實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的抑制劑、根據(jù)本發(fā)明的重組載體、根據(jù)本發(fā)明的重組細胞或者根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其任選地還包含合適的緩沖劑和賦形劑以及使用說明書。

還通過用于預(yù)防、調(diào)節(jié)和/或治療疾病的用途和/或用于提高胰島素敏感性(如例如在腫瘤疾病背景下的胰島素敏感性)的根據(jù)本發(fā)明的治療性試劑盒實現(xiàn)目的，其中所述疾病選自胰島素抵抗、高血壓、血脂異常、冠狀動脈疾病、代謝綜合征和/或1型或2型糖尿病。

最近，本發(fā)明的發(fā)明人表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物轉(zhuǎn)化生長因子β1刺激的克隆22d4(tsc22d4)控制肝臟和全身胰島素敏感性。在野生型小鼠中，肝臟特異性的tsc22d4損失顯著改善了葡萄糖耐受性和胰島素敏感性，并中和了高胰島素血癥。健康動物中與高通量tsc22d4目標(biāo)轉(zhuǎn)錄組研究組合的tsc22d4順反組的chlp-seq分析揭示，tsc22d4直接或間接靶向胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要節(jié)點，最顯著的是脂質(zhì)運載蛋白13。確實，在針對急性胰島素暴露的應(yīng)答中，如分別通過akt/pkb激酶在ser473位和gsk3β在ser9位的磷酸化所確定的，原代小鼠肝細胞以及野生型小鼠中tsc22d4的下調(diào)或過表達導(dǎo)致細胞內(nèi)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上調(diào)或下調(diào)。

有趣地，在糖尿病db/db小鼠中，tsc22d4的肝臟失活改善了這些動物中的葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗，并使血糖正?；翈缀踅】档乃?。與糖尿病動物中代謝狀態(tài)的整體改善一致，在具有肝臟特異性的tsc22d4缺陷中的小鼠中，促炎性細胞因子和抵抗素的循環(huán)水平顯著降低。

肝癌細胞中tsc22d4的失活未增加細胞生長，但是降低了增殖，這表明tsc22d4的胰島素敏化功能未導(dǎo)致受影響的細胞/或器官中增加的癌癥易感性。此外，tsc22d4的肝臟失活也未引起低血糖。

盡管通過病毒遞送指向tsc22d4的shrna或mirna構(gòu)建體的實驗性敲低已證實有效改善糖尿病動物的代謝狀態(tài)，但是還未鑒定出通過不同技術(shù)遞送時，適合在不同物種中高效且特異性敲低tsc22d4的sirna構(gòu)建體。為了解決該問題，本發(fā)明的發(fā)明人已利用如本文所公開的鼠hepa1.6以及人huh7肝癌細胞，在體外敲低研究中對針對tsc22d4mrna序列的多種sirna進行了鑒定、功能測試和驗證。

下述圖、序列和實施例僅用于闡明本發(fā)明，并且不應(yīng)被解釋為將本發(fā)明的范圍限于實施例中描述的本發(fā)明的具體實施方案。出于本發(fā)明的目的，在此將文本中引用的所有參考文獻整體并入。

圖1顯示了鼠肝癌細胞中顏色編碼的所選指向tsc22d4的sirna的敲低效率。顯示了相對mrna水平。在這些實驗中，所有其它測試的sirna序列均未顯示任何顯著的tsc22d4敲低(未顯示)。

圖2顯示了轉(zhuǎn)染進鼠hepa1-6肝癌細胞時，mhd4-sirna1對鼠tsc22d4的敲低效率。顯示了相對mrna水平。

圖3顯示了轉(zhuǎn)染進人huh7肝癌細胞時，mhd4-sirna1對人tsc22d4的敲低效率。顯示了相對mrna水平。

序列idno.1至6顯示了根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸序列。

實施例

重組病毒

利用block-it腺病毒rnai表達系統(tǒng)(invitrogen,karlsruhe,germany)克隆受u6啟動子控制的表達tsc22d4或非特異性shrna的腺病毒或者受cmv啟動子控制的表達tsc22d4cdna的腺病毒。如前所述，通過氯化銫方法純化病毒，并在向動物注射之前，將純化的病毒在含有10％甘油的磷酸鹽緩沖鹽水緩沖液進行透析(herzigs,hedricks,moranttei,koosh,galimif,montminym.crebcontrolshepaticlipidmetabolismthroughnuclearhormonereceptorppar-gamma.nature.2003；426:190–193.herzigs,longf,jhalaus,hedricks,quinnr,bauera,rudolphd,yoonc,puigserverp,spiegelmanb,等人，crebregulateshepaticgluconeogenesisthroughthecoactivatorpgc-1.nature.2001；413:179–183)。如前所述建立受肝細胞特異性啟動子控制的編碼對照或者tsc22d4特異性mirna的aav(roseaj,frosigc,kiensb,wojtaszewskijf,richterea.effectofenduranceexercisetrainingonca2+calmodulin-dependentproteinkinaseiiexpressionandsignalinginskeletalmuscleofhumans.jphysiol.2007；583:785–795)。

動物實驗

從查爾斯河實驗室(brussels,belgium)獲得雄性8–12周齡的c57bl/6以及10周齡的db/db小鼠，并用常規(guī)無限制飲食在12h晝夜循環(huán)下對其進行飼喂。在胰島素和葡萄糖耐受性測試之前，使動物禁食4h。除此以外，隨意飼喂動物并使其自由獲得水。對于腺病毒注射，經(jīng)尾靜脈注射施用1-2×10⁹個噬斑形成單位(pfu)/重組病毒。對于aav實驗，經(jīng)尾靜脈注射5×10¹¹個病毒。在各實驗中，6–12只動物接受相同的處理，并在如所指示的禁食(18hr禁食)、隨意飼喂或者飼喂(18hr禁食，隨后6hr重新飼喂)條件下進行分析。在特定時間段之后收集器官，包括肝臟、附睪和腹部脂肪墊以及腓腸肌，將其稱重、速凍并用于進一步分析。通過echomri身體成分分析儀(echomedicalsystems,houston,usa)測定總的身體脂肪含量。根據(jù)nih的指南并經(jīng)地方當(dāng)局批準(zhǔn)進行動物處理和實驗。

對于胰島素耐受性測試，利用0.9％氯化鈉制備1u胰島素/ml的儲備液。在實驗前使小鼠禁食4小時。測定所有動物的體重，并通過用刀片割尾測量血糖水平。將血滴置于血糖儀條上并進行測量。向c57bl/6腹腔內(nèi)注射1u胰島素/kg體重，并向db/db小鼠腹腔內(nèi)注射1.5u胰島素/kg體重。在20、40、60、80和120min之后監(jiān)測血糖水平。

對于葡萄糖耐受性測試，利用0.9％氯化鈉制備20％葡萄糖的儲備液。在實驗前使小鼠禁食4小時。測定所有動物的體重，并通過用刀片割尾測量血糖水平。將血滴置于血糖儀條上并進行測量。向c57bl/6和db/db小鼠腹腔內(nèi)注射5μl/g20％葡萄糖溶液。在20、40、60、80和120min之后監(jiān)測血糖水平。

定量taqmanrt-pcr

利用qiazol試劑(qiagen,hilden,germany)，從勻漿的小鼠肝臟或細胞裂解物中提取總rna。利用m-mulv酶和oligodt引物(fermentas,st.leon-rot,germany)，通過反轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)備cdna。利用assay-on-demand試劑盒和abiprism7700序列檢測儀(appliedbiosystems,darmstadt,germany)擴增cdna。將rna表達數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為tata-框結(jié)合蛋白(tbp)rna的水平。

利用taqman分析，在熒光溫度循環(huán)儀中通過定量實時rt-pcr測量人tsc22d4mrna的表達，并在abiprism7000序列檢測儀(appliedbiosystems,darmstadt,germany)上檢測熒光。利用trizol(lifetechnologies,grandisland,ny)分離總rna，并用標(biāo)準(zhǔn)試劑(lifetechnologies,grandisland,ny)反轉(zhuǎn)錄1μgrna。對于每次rt-pcr，根據(jù)制造商的說明書，利用來自stratagene(lajolla,ca)的brilliantsybrgreenqpcrcore試劑盒在26μlpcr反應(yīng)中擴增2μl。將樣品在abiprism7000序列檢測儀中孵育以在95℃下起始變性持續(xù)10min，隨后進行40個pcr循環(huán)，每個循環(huán)由下述組成：95℃，持續(xù)15s；60℃，持續(xù)1min；以及72℃，持續(xù)1min。計算相對于次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)mrna表達的人tsc22d4和obp2a(lcn13)(分別由hs00229526_m1和hs01062934_g1確定)(appliedbiosystems,darmstadt,germany)的mrna表達，所述次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(hprt1)mrna表達通過對hprt1(hs01003267_m1)的預(yù)混合的assay-on-demand(appliedbiosystems,darmstadt,germany)確定的。在各pcr結(jié)束時，通過熔解曲線特征(將樣品冷卻至68℃，并緩慢加熱至95℃，同時測量熒光)確認特定轉(zhuǎn)錄本的擴增。通過將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證pcr的特異性。

蛋白分析

從細胞裂解緩沖液中的冷凍器官樣品或培養(yǎng)的肝細胞提取蛋白(roseaj,frosigc,kiensb,wojtaszewskijf,richterea.effectofenduranceexercisetrainingonca2+calmodulin-dependentproteinkinaseiiexpressionandsignalinginskeletalmuscleofhumans.jphysiol.2007；583:785–795)，將20μg蛋白上樣至4–12％sds-聚丙烯酰胺凝膠中，并印跡至硝酸纖維素膜上。利用tsc22d4(abcam,cambridge,ukorsigma,munich,germany)、akt、p-akt、gsk、p-gsk(cellsignaling,danvers,usa)或vcp(abcam)的特異性抗體，如(herzig等人，2001)所述進行蛋白質(zhì)印跡分析。

質(zhì)粒和rna干擾

對于shrna實驗，將靶向小鼠和tsc22d4(seqidno.1至3)的寡核苷酸克隆進pentr/u6shrna載體(invitrogen)中。

細胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染分析

如(klingmulleru,bauera,bohls,nickelpj,breitkopfk,dooleys,zellmers,kernc,merforti,sparnat等人，primarymousehepatocytesforsystemsbiologyapproaches:astandardizedinvitrosystemformodellingofsignaltransductionpathways.ieeprocsystbiol.2006；153:433–447)所述分離并培養(yǎng)原代小鼠肝細胞。簡言之，通過腹腔注射100mg/kg體重的鹽酸氯胺酮和5mg/kg體重的鹽酸塞拉嗪麻醉8–12周齡的雄性c57bl/6小鼠。打開腹腔之后，在37℃下，經(jīng)門靜脈用hanksi(含8gnacl、0.4gkcl、3.57ghepes、0.06gna2hpo4×2h2o、0.06gkh2po4的1l蒸餾h2o，2.5mmegta，0.1％葡萄糖，調(diào)節(jié)至ph7.4)灌注肝臟，持續(xù)5min，隨后用hanksii(含8gnacl、0.4gkcl、3.57ghepes、0.06gna2hpo4×2h2o、0.06gkh2po4的1l蒸餾水，0.1％葡萄糖，3mg/ml膠原酶clsii，5mmcacl2，調(diào)節(jié)至ph7.4)灌注，持續(xù)5–7min，直至觀察到肝臟結(jié)構(gòu)瓦解。移除肝包膜，并經(jīng)100μm的網(wǎng)過濾細胞懸液。洗滌細胞，并隨后通過臺盼藍染色測定細胞活力。將1000000個活細胞/孔接種至膠原i-包被的六孔板上。24h之后，以100的感染復(fù)數(shù)用重組腺病毒感染細胞。對于刺激實驗，用pbs(對照介質(zhì))或100nm/6-孔的濃度的胰島素處理原代肝細胞，持續(xù)10分鐘。在感染之后48h收獲細胞。

肝臟tsc22d4的順反組分析

通過顯著性對芯片測序結(jié)果的kegg-通路分析進行分選。發(fā)現(xiàn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路明顯被調(diào)節(jié)(p＝0.00005)。在來自注射后7天的flag-tsc22d4cdna腺病毒注射的雄性c57bl/6小鼠的肝臟提取物中進行芯片測序。

結(jié)果

如在4次獨立實驗中所示，序列對于小鼠和人tsc作用十分有效(參見附圖)。存在與各序列連接的非特異性dtdt突出。序列與小鼠和人tsc序列均100％匹配。

基于這些結(jié)果，由于根據(jù)本發(fā)明的序列(seqidno.1至3)顯示出針對tsc22d4的優(yōu)良的敲低效率，并靶向多個物種(包括小鼠、非人的靈長類和人)，選擇其作為用于治療目的的主要候選物。利用鼠hepa1.6以及人huh7肝癌細胞在體外敲低研究中對針對tsc22d4mrna序列的多種sirna的序列進行鑒定、功能測試和驗證。具體地，mhd4-sirna1顯示出針對tsc22d4的優(yōu)良的敲低效率，并靶向多個物種，包括小鼠、非人的靈長類和人。

mhd4-sirna1:(nm_030935.3_sirna_1024；orf)

正義：5’-ggacguguguggauguuuadtdt-3’(seqidno.1)；

反義：5’-uaaacauccacacacguccdtdt-3’(seqidno.4)；

gc：47％(w/ott-突出)

md4-sirna2:(nm_023910.6_sirna_993；orf)

正義：ggauguuuacgagagagaudtdt-3’(seqidno.2)；

反義：aucucucucguaaacauccdtdt-3’(seqidno.5)；

gc：42.1％(w/ott-突出)

mhd4-sirna3:

正義：5’-agucccaccucauguuugcdtdt-3’(seqidno.3)；

反義：5’-gcaaacaugaggugggacudtdt-3’(seqidno.6)；

gc：52.6％(w/ott-突出)。

序列表

<110>德國癌癥研究公共權(quán)益基金會(deutscheskrebsforschungszentrumstiftungdes鰂fentlichenrechts)

<120>用于治療胰島素抵抗的靶向轉(zhuǎn)錄因子tsc22d4的寡核苷酸序列

<130>d31385wo

<150>15160259.6

<151>2015-03-23

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>rna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>1

ggacguguguggauguuua19

<210>2

<211>19

<212>rna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>2

uaaacauccacacacgucc19

<210>3

<211>19

<212>rna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>3

ggauguuuacgagagagau19

<210>4

<211>19

<212>rna

<213>小家鼠(musmusculus)

<400>4

aucucucucguaaacaucc19

<210>5

<211>19

<212>rna

<213>智人(homosapiens)

<400>5

agucccaccucauguuugc19

<210>6

<211>19

<212>rna

<213>智人(homosapiens)

<400>6

gcaaacaugaggugggacu19