相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求在35u.s.c.§119下于2014年12月19日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/094,751的優(yōu)先權(quán),其整體通過引用并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明總體上涉及具有導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增加的遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞,以及制造和使用此類細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方面包括具有遺傳改變的革蘭氏陽性微生物,如芽孢桿菌屬的成員,該遺傳改變延遲、降低、或阻斷用于孢子形成的基因的表達(dá)或激活,從而導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)。遺傳改變的實(shí)例包括降低kina、phra、和/或phre的表達(dá)或活性的那些。
序列表的引用
命名為nb40522-wo-pct_sequencelisting.txt的文本文件序列表的電子提交的內(nèi)容創(chuàng)建于2015年11月30日,并且大小為18kb,通過引用并入本文。
本發(fā)明的背景
遺傳工程已經(jīng)允許改進(jìn)在食品發(fā)酵中用作工業(yè)生物反應(yīng)器和細(xì)胞工廠的微生物。包括多個(gè)芽孢桿菌物種的革蘭氏陽性生物體被用于產(chǎn)生大量有用的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物(參見,例如,zukowski,“productionofcommerciallyvaluableproducts,”in:doiandmcglouglin(eds.)biologyofbacilli:applicationstoindustry,butterworth-heinemann,stoneham.masspages311-337,1992[zukowski,“有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)品的生產(chǎn)”,在:doi和mcglouglin(編輯)桿菌生物學(xué):工業(yè)應(yīng)用,巴特沃思-海涅曼出版公司(butterworth-heinemann),斯通哈姆,馬薩諸塞州,第311-337頁,1992中])。工業(yè)中使用的常見芽孢桿菌屬物種包括地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。由于其gras(通常被認(rèn)為是安全的)狀態(tài),這些芽孢桿菌屬物種的菌株是用于生產(chǎn)用于食品和制藥工業(yè)的蛋白質(zhì)的天然候選物。在革蘭氏陽性生物體中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括酶,例如α-淀粉酶、中性蛋白酶、和堿性(或絲氨酸)蛋白酶。
盡管對(duì)細(xì)菌宿主細(xì)胞中蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的理解有所進(jìn)展,但是仍然需要開發(fā)新的表達(dá)增加水平的感興趣的蛋白質(zhì)的重組菌株。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供表達(dá)增加水平的感興趣的蛋白質(zhì)的重組革蘭氏陽性細(xì)胞及其制備和使用方法。特別地,本發(fā)明涉及具有遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞,與不具有遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞相比,所述遺傳改變導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增加。因此,本發(fā)明的方面包括革蘭氏陽性微生物,如芽孢桿菌屬的成員,這些革蘭氏陽性微生物包含降低用于激活磷酸化途徑的基因的表達(dá)的遺傳改變(例如,參見圖5中磷酸化途徑原理圖)并且從而導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)(下文稱為“poi”)的表達(dá)增強(qiáng)。還提供了制備和使用這些重組細(xì)菌細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的方面包括用于從革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞增加poi的表達(dá)的方法,這些方法包括:(a)獲得產(chǎn)生poi的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞,其中該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的至少一個(gè)遺傳改變,并且(b)在表達(dá)poi的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞,其中在基本上相同的培養(yǎng)條件下,該poi的增加的表達(dá)是相對(duì)于未經(jīng)改變的(親本)革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中相同poi的表達(dá)而言的。在某些實(shí)施例中,降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的遺傳改變是kina基因、phra基因和/或phre基因的遺傳改變。
在某些其他實(shí)施例中,該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)胞源自具有一個(gè)或多個(gè)有缺陷或無活性的孢子形成基因(例如,其表達(dá)受spo0a控制或在spo0a下游的基因)的親本細(xì)胞,并且因此已防止形成孢子。例如,申請(qǐng)人已經(jīng)觀察到,即使在這種非孢子形成的遺傳背景下,降低激活磷酸化途徑(即,控制孢子形成起始基因表達(dá)的基因)的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的另外的遺傳改變?cè)黾恿藀oi從細(xì)胞中的表達(dá)。因此,本披露的遺傳改變的(子代)細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)/產(chǎn)生的改進(jìn)不僅僅是因?yàn)榉乐垢锾m氏陽性細(xì)胞的孢子形成。例如,本披露的經(jīng)改變的革蘭氏陽性(子代)細(xì)胞源自于其的親本革蘭氏陽性細(xì)胞可以具有非功能性孢子形成基因、突變孢子形成基因、缺失孢子形成基因等(例如,參見實(shí)例部分,其中使用孢子形成缺陷型芽孢桿菌屬細(xì)胞)。
在某些實(shí)施例中,該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬的成員(例如,芽孢桿菌屬細(xì)胞選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(b.lentus)、短芽孢桿菌(b.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(b.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(b.clausii)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(b.sonorensis)、耐鹽芽孢桿菌(b.halodurans)、短小芽孢桿菌(b.pumilus)、燦爛芽孢桿菌(b.lautus)、飼料芽孢桿菌(b.pabuli)、蠟樣芽孢桿菌(b.cereus)、黏瓊脂芽孢桿菌(b.agaradhaerens)、秋葉氏芽孢桿菌(bakibai)、庫拉奇芽孢桿菌(b.clarkii)、假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(b.pseudofirmus)、列城芽孢桿菌(b.lehensis)、巨大芽孢桿菌(b.megaterium)、凝結(jié)芽孢桿菌(b.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(b.circulans)、吉氏芽孢桿菌(b.gibsonii)、和蘇云金芽孢桿菌(b.thuringiensis))。在某些實(shí)施例中,該芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在某些實(shí)施例中,該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)一步包含選自下組基因中的突變,該組由以下各項(xiàng)組成:degu、degq、degs、scoc4等。在某些實(shí)施例中,突變?yōu)閐egu(hy)32。
在某些實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性(親本)細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性(子代)細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre基因中任一個(gè);kina、phra、和phre基因中任兩個(gè);或kina、phra、和phre基因中所有三個(gè)的表達(dá)水平的降低。在其他實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre蛋白中任一種;kina、phra、和phre蛋白中任兩種;或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。
在某些實(shí)施例中,野生型kina基因的序列與seqidno:1具有至少60%同一性,野生型phra基因的序列與seqidno:6具有至少60%同一性,并且野生型phre基因的序列與seqidno:8具有至少60%同一性。在某些實(shí)施例中,野生型kina蛋白的序列與seqidno:2具有至少80%同一性,野生型phra蛋白的序列與seqidno:7具有至少80%同一性,并且野生型phre蛋白的序列與seqidno:9具有至少80%同一性。在某些實(shí)施例中,該遺傳改變是kina、phra、和phre基因中的一個(gè)或多個(gè)的全部或部分的缺失。
在某些實(shí)施例中,該poi是同源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中,該poi是異源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中,該poi是酶。在某些實(shí)施例中,該酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶、和磷酸酶。在某些其他實(shí)施例中,該酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構(gòu)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。
在某些其他實(shí)施例中,該poi是蛋白酶。在某些實(shí)施例中,該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在某些其他實(shí)施例中,枯草桿菌蛋白酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn'、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147,枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。
在某些實(shí)施例中,該方法進(jìn)一步包括分離并回收該poi。在又其他實(shí)施例中,將該分離并回收的poi進(jìn)一步純化。
本發(fā)明的方面包括經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞,其中與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的至少一個(gè)遺傳改變,該磷酸化途徑誘導(dǎo)孢子形成起始基因的表達(dá)。在某些實(shí)施例中,該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬的成員。在某些實(shí)施例中,該芽孢桿菌屬細(xì)胞選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、飼料芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、黏瓊脂芽孢桿菌、秋葉氏芽孢桿菌、庫拉奇芽孢桿菌、假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、列城芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、吉氏芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。在某些其他實(shí)施例中,該芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在某些實(shí)施例中,該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)一步包含選自下組基因中的突變,該組由以下各項(xiàng)組成:degu、degq、degs、scoc4等。在某些實(shí)施例中,突變?yōu)閐egu(hy)32。
在某些實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre基因中任一個(gè);kina、phra、和phre基因中任兩個(gè);或kina、phra、和phre基因中所有三個(gè)的表達(dá)水平的降低。在其他實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre蛋白中任一種;kina、phra、和phre蛋白中任兩種;或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。
在某些實(shí)施例中,野生型kina基因的序列與seqidno:1具有至少60%同一性,野生型phra基因的序列與seqidno:6具有至少60%同一性,并且野生型phre基因的序列與seqidno:8具有至少60%同一性。在某些實(shí)施例中,野生型kina蛋白的序列與seqidno:2具有至少80%同一性,野生型phra蛋白的序列與seqidno:7具有至少80%同一性,并且野生型phre蛋白的序列與seqidno:9具有至少80%同一性。在某些實(shí)施例中,該遺傳改變是kina、phra、和phre基因中的一個(gè)或多個(gè)的全部或部分的缺失。
在某些實(shí)施例中,該經(jīng)改變的細(xì)胞表達(dá)poi。在某些實(shí)施例中,該poi是同源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中,該poi是異源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中,該poi是酶。
在某些實(shí)施例中,該酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶、和磷酸酶。在某些其他實(shí)施例中,該酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構(gòu)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。在其他實(shí)施例中,該poi是蛋白酶。在某些實(shí)施例中,該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在某些實(shí)施例中,該枯草桿菌蛋白酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn'、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。
在某些實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre基因中任一個(gè);kina、phra、和phre基因中任兩個(gè);或kina、phra、和phre基因中所有三個(gè)的表達(dá)水平的降低。在其他實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre蛋白中任一種;kina、phra、和phre蛋白中任兩種;或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。
在某些實(shí)施例中,野生型kina基因的序列與seqidno:1具有至少60%同一性,野生型phra基因的序列與seqidno:6具有至少60%同一性,并且野生型phre基因的序列與seqidno:8具有至少60%同一性。在某些實(shí)施例中,野生型kina蛋白的序列與seqidno:2具有至少80%同一性,野生型phra蛋白的序列與seqidno:7具有至少80%同一性,并且野生型phre蛋白的序列與seqidno:9具有至少80%同一性。在某些實(shí)施例中,該遺傳改變是kina、phra、和phre基因中的一個(gè)或多個(gè)的全部或部分的缺失。
在某些實(shí)施例中,所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中,該方法進(jìn)一步包括將編碼所述感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)盒引入所述親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中。在某些實(shí)施例中,該方法進(jìn)一步包括將編碼所述感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)盒引入所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中。在某些實(shí)施例中,該感興趣的蛋白質(zhì)是同源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中,該感興趣的蛋白質(zhì)是異源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中,該感興趣的蛋白質(zhì)是酶。在某些實(shí)施例中,該酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶、和磷酸酶。在某些實(shí)施例中,該感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶。在某些實(shí)施例中,該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在某些實(shí)施例中,該枯草桿菌蛋白酶選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn'、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。
在某些實(shí)施例中,該方法進(jìn)一步包括在由所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)所述感興趣的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。在某些實(shí)施例中,該方法進(jìn)一步包括回收所述感興趣的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的方面包括通過上述方法生產(chǎn)的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)要說明
圖1顯示了kina(δkina)缺失的遺傳圖譜。
圖2a顯示了表達(dá)amye的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞密度的圖。
圖2b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的amye表達(dá)的圖。
圖3a顯示了表達(dá)fna的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞密度的圖。
圖3b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的fna表達(dá)的圖。
圖4a顯示了表達(dá)綠色熒光蛋白(gfp)的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞密度的圖。
圖4b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的gfp表達(dá)的圖。
圖5顯示了調(diào)節(jié)芽孢桿菌屬細(xì)胞中孢子形成起始的磷酸化途徑的圖示。一種或多種激酶的自身磷酸化被特異性饑餓信號(hào)觸發(fā),隨后是spo0f、spo0b和spo0a蛋白質(zhì)的順序磷酸化。spo0a-p控制孢子形成級(jí)聯(lián)的激活。激酶(例如,kina、kinb、kinc、kind、kine)和磷酸酶(例如,rapa、rapb、rape)由基因名稱指示。箭頭表示陽性效應(yīng),如磷酸化或?qū)Π谢虮磉_(dá)的控制,而端部截?cái)嗟木€(blunt-facelin)表示負(fù)效應(yīng),如去磷酸化或抑制基因表達(dá)。例如,激酶kina磷酸化spo0f磷酸酶,其將磷?;鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到spo0b,并且然后轉(zhuǎn)移到spo0a,而轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑abrb抑制spo0h(sigh)表達(dá)并因此抑制spo0a表達(dá)。
圖6顯示了phra缺失的遺傳構(gòu)建體。
圖7顯示了phre缺失的遺傳構(gòu)建體。
圖8a顯示了表達(dá)gfp的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞(即,包含phra和phre基因的缺失(本文為δphra/δphre)的經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞)的細(xì)胞密度的圖。
圖8b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的gfp表達(dá)的圖。
圖9a顯示了表達(dá)fna的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞密度的圖。
圖9b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的fna表達(dá)的圖。
圖10a顯示了表達(dá)amye的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞密度的圖。
圖10b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的amye表達(dá)的圖。
發(fā)明詳細(xì)說明
本發(fā)明總體上涉及具有遺傳改變的細(xì)菌細(xì)胞,以及制造和使用此類細(xì)胞的方法,所述遺傳改變導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)(下文稱為“poi”)的增加的表達(dá)/生產(chǎn)。本發(fā)明的某些方面包括革蘭氏陽性微生物,如芽孢桿菌屬的成員,這些革蘭氏陽性微生物包含降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性的遺傳改變,該遺傳改變導(dǎo)致poi的表達(dá)增加。
在更詳細(xì)地描述本發(fā)明組合物和方法之前,應(yīng)當(dāng)理解,本發(fā)明組合物和方法不限于所描述的具體實(shí)施例,因此當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解,在此使用的術(shù)語僅是出于描述具體實(shí)施例的目的,并且不旨在進(jìn)行限制,因?yàn)楸景l(fā)明組合物和方法的范圍將僅由所附權(quán)利要求書限制。
在提供了一系列值的情況下,應(yīng)理解每個(gè)中間值為到下限的十分之一單位(除非上下文清晰地另外指示),該范圍的上限與下限之間以及在該陳述范圍內(nèi)的任何其他陳述的或中間值均被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以被獨(dú)立地包括在所述較小的范圍內(nèi),并且也被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內(nèi),服從所陳述范圍中任何特別排除的限值。在所陳述的范圍包括一個(gè)或者全部?jī)蓚€(gè)限值的情況下,排除那些包括的限值的任一個(gè)或者全部?jī)蓚€(gè)的范圍也包括在本發(fā)明的組合物和方法中。
本文提供了某些范圍,其中數(shù)值前面是術(shù)語“約”。術(shù)語“約”在本文中用于為其后面的確切數(shù)字以及與該術(shù)語后面的數(shù)字接近或近似的數(shù)字提供文字支持。在確定數(shù)字是否接近或近似于具體敘述的數(shù)字時(shí),接近或近似的未列舉的數(shù)字可以是在呈現(xiàn)其的上下文中提供具體敘述的數(shù)字的實(shí)質(zhì)性等值的數(shù)字。例如,關(guān)于數(shù)值,術(shù)語“約”是指數(shù)值的-10%至+10%的范圍,除非術(shù)語在上下文中另有具體定義。在另一個(gè)實(shí)例中,短語“約6的ph值”是指ph值為從5.4至6.6,除非ph值另有具體定義。
本文提供的標(biāo)題并非對(duì)本發(fā)明的組合物和方法的各個(gè)方面或?qū)嵤├M(jìn)行限制,這些方面或?qū)嵤├赏ㄟ^將說明書作為一個(gè)整體來參考而得到。因此,將說明書作為一個(gè)整體參考時(shí),下面即將定義的術(shù)語被定義得更全面。
將本文件分為若干部分以便于閱讀;然而,讀者將領(lǐng)會(huì)的是,在一個(gè)部分中進(jìn)行的陳述可能適用于其他部分。以這種方式,用于本披露的不同部分的標(biāo)題不應(yīng)被解釋為限制。
除非另有定義,本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明組合物和方法所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然類似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明組合物和方法的實(shí)踐或測(cè)試中,但現(xiàn)在將對(duì)代表性示例方法和材料進(jìn)行描述。
在本說明書中引用的所有公開物以及專利都通過引用并入本文。任何公開物的引用內(nèi)容是針對(duì)其在申請(qǐng)日之前的披露,并且不能理解為承認(rèn)因?yàn)橄惹鞍l(fā)明而本發(fā)明組合物和方法不能獲得比這些公開物更早的申請(qǐng)日。
根據(jù)此詳細(xì)描述,適用下列簡(jiǎn)稱和定義。應(yīng)當(dāng)注意單數(shù)形式“一個(gè)/一種(a/an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物,除非上下文中清楚地另外指出。因此,例如提及“酶”包括多個(gè)這樣的酶,并且提及“劑量”包括提及一個(gè)或多個(gè)劑量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等效物,等等。
進(jìn)一步注意的是,權(quán)利要求書可以撰寫以排除任何可選擇的要素(例如像附帶條件)。因此,該陳述旨在作為使用與權(quán)利要求要素的敘述有關(guān)的排他性術(shù)語如“單獨(dú)”、“僅”、“排除”等或利用“否定型”限定的前提基礎(chǔ)。
進(jìn)一步注意到,如本文使用的術(shù)語“基本上由……組成”是指一種組合物,其中該術(shù)語之后的一種或多種組分在存在其他已知的一種或多種組分的情況下為總體組合物的以重量計(jì)小于30%的總量,并且不會(huì)有助于或干擾一種或多種組分的作用或活性。
進(jìn)一步注意到,如本文所使用的術(shù)語“包含”意指包含但不限于在術(shù)語“包含”之后的一種或多種組分。在術(shù)語“包含”之后的組分是必需的或強(qiáng)制性的,但是包含一種或多種組分的組合物可以進(jìn)一步包括其他非強(qiáng)制性或可選擇的一種或多種組分。
還要注意的是,如本文所使用的術(shù)語“由……組成”意指包括且限于術(shù)語“由……組成”之后的一種或多種組分。因此,術(shù)語“由……組成”之后的一種或多種組分是必需的或強(qiáng)制性的,且組合物中不存在一種或多種其他組分。
如將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是,在閱讀本披露時(shí),本文描述和展示的單獨(dú)實(shí)施例中的每一個(gè)具有離散的組分和特征,這些組分和特征可以在不偏離本文所述的本發(fā)明組合物和方法的范圍或精神的情況下容易地與任何其他幾個(gè)實(shí)施例的任何一個(gè)的特征分離或組合??梢园凑账鶖⑹龅氖录捻樞蚧虬凑者壿嬌峡尚械娜魏纹渌樞騺磉M(jìn)行任何敘述的方法。
定義
本發(fā)明總體上涉及革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(及其制備和使用方法),其被改變或修飾以具有增加一種或多種poi的表達(dá)和/或產(chǎn)生的能力。
因此,某些實(shí)施例涉及經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞,所述革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含降低種用于激活磷酸化途徑(例如,編碼kina、phra、phre的基因)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的至少一個(gè)遺傳改變。例如,枯草芽孢桿菌中的磷酸化途徑(即,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng))通常被認(rèn)為圍繞轉(zhuǎn)錄因子spo0a循環(huán)(參見,“bacillussubtilisandothergram-positivebacteria:biochemistry,physiologyandmoleculargenetics”;eds.a.l.sonenshein,j.a.hoch,r.losick,am.societyofmicorbiology,1993[“枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性細(xì)菌:生物化學(xué)、生理學(xué)和分子遺傳學(xué)”;編輯,a.l.sonenshein、j.a.hoch、r.losick,美國微生物學(xué)會(huì),1993])。
更具體地說,據(jù)信磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的作用是最終將(無活性)spo0a轉(zhuǎn)錄因子磷酸化成spo0a~p,其中該活性spo0a~p轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)參與孢子形成初始階段的基因的轉(zhuǎn)錄。不希望受到本發(fā)明的任何特定理論或操作模式的約束,圖5總體上顯示了調(diào)節(jié)芽孢桿菌屬細(xì)胞中孢子形成起始的磷酸化途徑的圖示。例如,某些激酶(例如,kina、kinb等)被認(rèn)為參與解釋環(huán)境信號(hào)并將該信息轉(zhuǎn)導(dǎo)到自身磷酸化的激酶蛋白質(zhì)中(例如,kina至kina~p)。磷酸化激酶然后將磷酸鹽轉(zhuǎn)移到spo0f蛋白質(zhì)以產(chǎn)生spo0f~p,該spo0f~p被認(rèn)為在磷酸化中用作次級(jí)信使,其中spo0f~p將其磷酸轉(zhuǎn)移到spo0b以產(chǎn)生spo0b~p,然后該spo0b~p轉(zhuǎn)移該磷酸基團(tuán)spo0a以產(chǎn)生spo0a~p。
不希望受到任何特定理論約束或束縛,以下闡述的實(shí)例部分證明阻斷或降低kina活性(其阻斷或降低spo0a轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化和激活),導(dǎo)致芽孢桿菌屬細(xì)胞中一種或多種poi的表達(dá)增加。此外,不希望受到任何特定理論約束或束縛,五肽phra和五肽phre(參見,圖5)分別用來阻斷rapa和rape磷酸酶的功能,其脫抑制由kina激活的磷酸化途徑。如實(shí)例部分所證實(shí)的,阻斷phra和/或phre對(duì)rap磷酸酶的抑制活性導(dǎo)致在芽孢桿菌屬細(xì)胞中poi的表達(dá)增加。
如本文所定義的,“經(jīng)改變的細(xì)胞”、“修飾的細(xì)胞”、“經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”、“修飾的細(xì)菌細(xì)胞”、“經(jīng)改變的宿主細(xì)胞”或“修飾的宿主細(xì)胞”可互換使用并且是指重組革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞,這些重組革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含降低用于激活磷酸化途徑的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的至少一個(gè)遺傳改變。例如,本披露的“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞可以被進(jìn)一步定義為源自親本細(xì)菌細(xì)胞的“經(jīng)改變的細(xì)胞”,其中該經(jīng)改變的(子代)細(xì)胞包含降低用于激活磷酸化途徑的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的至少一個(gè)遺傳改變。
如本文所定義的,“未經(jīng)改變的細(xì)胞”、“未修飾的細(xì)胞”、“未經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”、“未修飾的細(xì)菌細(xì)胞”、“未經(jīng)改變的宿主細(xì)胞”或“未修飾的宿主細(xì)胞”可互換使用并且是指“未經(jīng)改變的”‘親本’革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞,這些革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞不包含降低用于激活磷酸化途徑的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的至少一個(gè)遺傳改變。在某些實(shí)施例中,未經(jīng)改變的(親本)革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞稱為“對(duì)照細(xì)胞”或未經(jīng)改變的(親本)革蘭氏陽性細(xì)菌“對(duì)照”細(xì)胞。
例如,本披露的某些實(shí)施例涉及表達(dá)增加量的poi的“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞,其中該poi的增加的量是相對(duì)于在“未經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細(xì)菌(親本)細(xì)胞(即,未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌“對(duì)照”細(xì)胞)中相同poi的表達(dá)而言的。因此,如本文定義的,當(dāng)術(shù)語或短語“一個(gè)或多個(gè)未經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”、“一個(gè)或多個(gè)未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞”、“一個(gè)或多個(gè)未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌‘對(duì)照’細(xì)胞”等用于與本披露的一個(gè)或多個(gè)“經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞”進(jìn)行比較的上下文中時(shí),應(yīng)理解經(jīng)改變的(子代)細(xì)胞和未經(jīng)改變的親本(對(duì)照)細(xì)胞均在基本上相同的條件和培養(yǎng)基下生長(zhǎng)/培養(yǎng)。
如本文所使用的,“宿主”細(xì)胞是指具有作為新引入的dna序列的宿主或表達(dá)載體的能力的“革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞”。
在本發(fā)明的某些實(shí)施例中,宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬的成員胞。.
如本文所使用的,“芽孢桿菌屬”或“芽孢桿菌屬物種”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的“芽孢桿菌屬”內(nèi)的所有物種,這些所有物種包括但不限于:枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、飼料芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、黏瓊脂芽孢桿菌、秋葉氏芽孢桿菌、庫拉奇芽孢桿菌、假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、列城芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、吉氏芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌。
我們意識(shí)到芽孢桿菌屬在不斷進(jìn)行分類學(xué)重組。因此,該屬旨在包括已重新分類的物種,這些物種包括但不限于:如嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)(現(xiàn)在稱為“嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)”)的此類生物體。在氧氣存在下的抗性內(nèi)生孢子的產(chǎn)生被認(rèn)為是芽孢桿菌屬的定義性特性,盡管這個(gè)特征也適用于最近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬(amphibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(anoxybacillus)、短芽孢桿菌屬、線性桿菌屬(filobacillus)、薄壁芽孢桿菌屬(gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌屬(halobacillus)、類芽孢桿菌屬、需鹽芽孢桿菌屬(salibacillus)、耐熱芽孢桿菌屬(thermobacillus)、脲芽孢桿菌屬(ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬(virgibacillus)。
如本文所使用的,“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或部分,以及可能是雙鏈或單鏈的基因組或合成來源的dna、cdna、和rna,無論其代表正義或反義鏈。應(yīng)當(dāng)理解,由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性,許多核苷酸序列可以編碼給定的蛋白質(zhì)。
如本文所使用的,術(shù)語“載體”是指可以在細(xì)胞中復(fù)制并且可以攜帶新基因或dna(多核苷酸)片段到細(xì)胞中的任何核酸。因此,該術(shù)語是指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?!氨磉_(dá)載體”是指具有在外來細(xì)胞中表達(dá)異源dna片段的能力的載體。許多原核和真核表達(dá)載體是可商購的?!鞍邢蜉d體”是包含與其轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的染色體中的區(qū)域同源的多核苷酸序列并且可以驅(qū)動(dòng)該區(qū)域的同源重組的載體。靶向載體可用于通過同源重組將突變引入細(xì)胞染色體中。在一些實(shí)施例中,靶向載體包括其他非同源序列,例如添加到末端的非同源序列(即,填充序列或側(cè)翼序列)。末端可以閉合,這樣使得靶向載體形成閉環(huán),例如像,插入載體中。合適的一種或多種載體的選擇和/或構(gòu)建在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
如本文所使用的,術(shù)語“質(zhì)粒”是指用作克隆載體的環(huán)狀雙鏈(ds)dna構(gòu)建體,并且其在許多細(xì)菌和一些真核生物中形成額外的染色體自復(fù)制遺傳元件。在一些實(shí)施例中,質(zhì)粒被合并入宿主細(xì)胞的基因組中。
“純化的”或“分離的”或“富集的”意指生物分子(例如,多肽或多核苷酸)通過將其與它在自然界中相關(guān)聯(lián)的天然存在的成分中的一些或所有分離而被從其天然狀態(tài)改變。這種分離或純化可以通過本領(lǐng)域公認(rèn)的分離技術(shù)如離子交換層析、親和層析、疏水分離、透析、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀或其他蛋白質(zhì)鹽沉淀、離心、尺寸排阻層析、過濾、微量過濾、凝膠電泳或梯度分離進(jìn)行,以去除最終組合物中所不希望的全細(xì)胞、細(xì)胞碎片、雜質(zhì)、外來蛋白質(zhì)或酶。隨后可以進(jìn)一步向純化或分離的生物分子組合物中添加成分,該成分提供了額外的益處,例如是活化劑、抗抑制劑、期望的離子、控制ph的化合物或其他酶或化學(xué)品。
如本文所使用的,當(dāng)提及感興趣的生物分子(例如,感興趣的蛋白質(zhì))的表達(dá)時(shí),術(shù)語“增加”、“增強(qiáng)”和“改進(jìn)”在本文中可互換使用,以指示生物分子的表達(dá)(即,在經(jīng)改變的細(xì)胞中)高于在基本上相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未改變(親本)細(xì)胞中的表達(dá)水平。
如本文定義的,關(guān)于基因序列、orf序列或多核苷酸序列的術(shù)語“表達(dá)”或“表達(dá)的”是指基因、orf或多核苷酸的轉(zhuǎn)錄,并且在適當(dāng)情況下將所得mrna轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)。因此,如將從上下文清楚看出的,蛋白質(zhì)的表達(dá)是由開放閱讀框序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生的。所希望產(chǎn)物在宿主微生物中的表達(dá)水平可以基于存在于宿主中的相應(yīng)mrna的量或所選序列編碼的所需產(chǎn)物的量來確定。例如,可以通過pcr或通過rna雜交來定量從所選序列轉(zhuǎn)錄的mrna(參見sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,1989[sambrook等人,分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè),冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,1989])。由所選序列編碼的蛋白質(zhì)可以通過各種方法進(jìn)行定量(例如,通過elisa,通過測(cè)定蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性,或通過采用使用識(shí)別并結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體的、獨(dú)立于此類活性的測(cè)定,如蛋白質(zhì)印跡或放射免疫測(cè)定)?;?或其多核苷酸)的上下文中的術(shù)語“表達(dá)”是基于該基因(或其多核苷酸)的核酸序列產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法,并且因此包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者。
如本文定義的,術(shù)語“引入”,如短語中所使用的,如“向細(xì)菌細(xì)胞中引入”至少一種多核苷酸開放閱讀框(orf)、或其基因、或其載體,包括本領(lǐng)域已知用于將多核苷酸引入細(xì)胞的方法,這些方法包括但不限于原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化(例如,氯化鈣、電穿孔)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、綴合等(參見,例如,ferrarietal.,“genetics,”inhardwoodetal,(eds.),bacillus,plenumpublishingcorp.,pages57-72,1989[ferrari等人,在hardwood等人(編輯)的“遺傳學(xué)”中,芽孢桿菌屬,普萊南出版公司,第57-72頁,1989])。
如本文所使用的,術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”和“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”是指通過人為干預(yù)被引入多核苷酸序列的細(xì)胞。多核苷酸可以整合到細(xì)胞的基因組中,或作為保持至少兩代的附加型質(zhì)粒存在。
如本文所使用的,術(shù)語“可選擇的標(biāo)志物”或“選擇性標(biāo)志物”是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸(例如,基因),其允許容易地選擇包含該核酸的那些宿主。這些可選擇的標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于抗微生物劑。因此,術(shù)語“可選擇的標(biāo)志物”是指提供宿主細(xì)胞已經(jīng)攝取了感興趣的輸入dna,或者已經(jīng)發(fā)生了一些其他反應(yīng)的指示。通常,可選擇的標(biāo)志物是賦予宿主細(xì)胞抗微生物抗性或代謝優(yōu)勢(shì)的基因,以允許在轉(zhuǎn)化期間將包含外源dna的細(xì)胞與未接受任何外源序列的細(xì)胞區(qū)分開來。根據(jù)本發(fā)明有用的其他標(biāo)志物包括但不限于營養(yǎng)缺陷型標(biāo)志物,如色氨酸;和檢測(cè)標(biāo)志物,如β-半乳糖苷酶。
如本文所使用的,術(shù)語“啟動(dòng)子”是指用于引導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。在實(shí)施例中,啟動(dòng)子適用于正在表達(dá)靶基因的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子與其他轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列(也稱為“控制序列”)一起是表達(dá)給定的基因所必須的。通常,轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強(qiáng)子或激活子序列。
如本文所使用的,“功能附接”或“可操作地連接”意指具有已知或所期望活性的調(diào)節(jié)區(qū)域或功能結(jié)構(gòu)域(如啟動(dòng)子、終止子、信號(hào)序列或增強(qiáng)子區(qū)域)按這樣一種方式附接于或連接于靶標(biāo)(例如,基因或多肽),以允許調(diào)節(jié)區(qū)域或功能結(jié)構(gòu)域根據(jù)其已知或期望的活性來控制該靶標(biāo)的表達(dá)、分泌或功能。
當(dāng)用于描述重組細(xì)胞(例如,“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞)時(shí),術(shù)語“遺傳改變”意指與親本細(xì)胞相比,該細(xì)胞具有至少一個(gè)遺傳差異。一個(gè)或多個(gè)遺傳改變可以是染色體突變(例如,插入、缺失、取代、倒位、用一個(gè)染色體區(qū)域替代另一個(gè)染色體區(qū)域(例如用異源啟動(dòng)子替代染色體啟動(dòng)子)等)和/或引入染色體外多核苷酸(例如,質(zhì)粒)。在一些實(shí)施例中,可以將染色體外多核苷酸整合到宿主細(xì)胞染色體中,以產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子/轉(zhuǎn)化子。本披露的實(shí)施例包括降低kina、phra、和/或phre蛋白的表達(dá)或活性的遺傳改變(經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯或通過降低蛋白質(zhì)本身的活性,例如通過氨基酸序列的突變)。如本文詳細(xì)描述的,這種改變改進(jìn)感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
基因的“失活”意味著基因的表達(dá)或其編碼的蛋白質(zhì)的活性被阻斷,或不能發(fā)揮其已知的功能?;虻氖Щ羁梢酝ㄟ^任何合適的手段進(jìn)行,例如通過如上所述的遺傳改變。在某些實(shí)施例中,滅活基因的表達(dá)產(chǎn)物是具有蛋白質(zhì)生物活性相應(yīng)變化的截短蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中,經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞包含導(dǎo)致穩(wěn)定和不可恢復(fù)性失活的一個(gè)或多個(gè)基因的失活。
在一些實(shí)施例中,通過缺失實(shí)現(xiàn)基因失活。在一些實(shí)施例中,通過同源重組缺失靶向缺失的區(qū)域(例如,基因)。例如,使用包括具有選擇性標(biāo)志物的輸入序列的dna構(gòu)建體,該選擇性標(biāo)志物在每側(cè)側(cè)翼有與靶向缺失的區(qū)域同源的序列(其中該序列在本文中稱為“同源盒”)。dna構(gòu)建體與宿主染色體的同源序列對(duì)齊,并且在雙重交叉事件中,將靶向缺失的區(qū)域從宿主細(xì)胞染色體上切除。
“插入”或“添加”是與天然存在的或親本的序列相比分別導(dǎo)致添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的核苷酸或氨基酸序列的改變。
如本文所使用的,“取代”由一或多個(gè)多核苷酸或氨基酸分別被不同的多核苷酸或氨基酸替代產(chǎn)生。
使基因突變的方法是本領(lǐng)域熟知的,并且包括但不限于位點(diǎn)定向突變、隨機(jī)突變的產(chǎn)生、和缺口雙鏈體方法(參見,例如,美國專利4,760,025;moringetal.,biotech.2:646[1984][moring等人,生物技術(shù)2:646[1984]];和krameretal.,nucleicacidsres.,12:9441[1984][kramer等人,核酸研究,12:9441])。
如本文所使用的,“同源基因”是指來自不同的、但通常相關(guān)的物種的基因?qū)?,這些基因彼此對(duì)應(yīng)并且彼此相同或非常相似。該術(shù)語涵蓋通過物種形成(即,新物種的發(fā)育)(例如,直系同源基因)分離的基因、以及通過遺傳重復(fù)分離的基因(例如,旁系同源基因)。
如本文所使用的,“直向同源物”和“直向同源基因”是指通過物種形成從共同祖先基因(即,同源基因)演化的不同物種中的基因。通常,直系同源物在進(jìn)化過程中保持相同的功能。直系同源物的鑒定可用于新測(cè)序基因組中基因功能的可靠預(yù)測(cè)。
如本文所使用的,“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指與基因組內(nèi)重復(fù)相關(guān)的基因。雖然直系同源物在進(jìn)化過程中保持相同的功能,但旁系同源物發(fā)展新功能,即使一些功能通常與原始功能相關(guān)。旁系同源基因的實(shí)例包括但不限于編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、和凝血酶的基因,上述酶都是絲氨酸蛋白酶并且在同一物種內(nèi)一起發(fā)生。
如本文所使用的,“同源性”是指序列相似性或同一性,同一性優(yōu)先。該同源性是使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來確定的(參見,例如,smithandwaterman,adv.appl.math.,2:482[1981];needlemanandwunsch,j.mol.biol.,48:443[1970];pearsonandlipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444[1988];programssuchasgap,bestfit,fasta,andtfastainthewisconsingeneticssoftwarepackage(geneticscomputergroup,madison,wi);anddevereuxetal.,nucl.acidres.,12:387-395[1984][smith和waterman,應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展,2:482[1981];needleman和wunsch,分子生物學(xué)雜志,48:443[1970];pearson和lipman,美國科學(xué)院院刊85:2444[1988];程序,如威斯康星遺傳軟件包中的gap、bestfit、fasta、和tfasta(遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組,麥迪遜,威斯康星州);和devereux等人,核酸研究,12:387-395[1984]])。
如本文所使用的,“類似的序列”是其中基因的功能基本上與指定來自枯草芽孢桿菌菌株168的基因相同的序列。另外,類似的基因與枯草芽孢桿菌菌株168基因的序列包括至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性??商娲?,類似的序列具有在枯草芽孢桿菌168區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的在70%至100%之間的基因的對(duì)齊和/或在與枯草芽孢桿菌168染色體中的基因?qū)R的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的至少在5-10個(gè)之間的基因。在另外的實(shí)施例中,多于一個(gè)上述性質(zhì)適用于該序列。類似的序列由已知的序列比對(duì)方法確定。通常使用的比對(duì)方法是blast,盡管如上下文所示,存在也可用于比對(duì)序列的其他方法。
有用的算法的一個(gè)實(shí)例是pileup。pileup使用漸進(jìn)的、兩兩比對(duì)創(chuàng)建了來自一組相關(guān)序列的多個(gè)序列比對(duì)。它還可以標(biāo)繪顯示用于創(chuàng)建該比對(duì)的聚類關(guān)系的一個(gè)樹。pileup使用feng和doolittle的漸進(jìn)比對(duì)方法的簡(jiǎn)化(fenganddoolittle,j.mol.evol.,35:351-360[1987][feng和doolittle,分子進(jìn)化雜志,35:351-360[1987]])。該方法類似于higgins和sharp所述的方法(higgins和sharp,cabios5:151-153[1989])。有用的pileup參數(shù)包括為3.00的默認(rèn)空位權(quán)重,為0.10的默認(rèn)空位長(zhǎng)度權(quán)重,以及加權(quán)的末端空位。
有用的算法的另一個(gè)實(shí)例是由altschul等人描述的blast算法(altschuletal.,j.mol.biol.,215:403-410,[1990];andkarlinetal.,proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787[1993][altschul等人,分子生物學(xué)雜志,215:403-410,[1990];和karlin等人,美國科學(xué)院院刊90:5873-5787[1993]])。一個(gè)特別有用的blast程序是wu-blast-2程序(參見,altschuletal.,meth.enzymol.,266:460-480[1996][altschul等人,酶學(xué)方法,266:460-480[1996]])。
如本文所使用的,相對(duì)于本文鑒定的氨基酸或核苷酸序列,“序列同一性百分比(%)”被定義為在比對(duì)序列并引入空位(必要的話)以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性之后,并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守取代,候選序列中與感興趣的序列中的氨基酸殘基或核苷酸相同的氨基酸殘基或核苷酸的百分比。
“同系物”(或“同源物”)是指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有特定程度的同一性的實(shí)體。使用常規(guī)序列比對(duì)工具(例如,clustal、blast等等),同源序列可以包括與主題序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序列。通常,除非另有說明,同系物將包括與主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)殘基。
進(jìn)行序列比對(duì)并且確定序列同一性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,可以在不進(jìn)行過多實(shí)驗(yàn)的情況下實(shí)施,并且可以明確地獲得同一性值的計(jì)算。參見,例如,ausubeletal.,eds.(1995)currentprotocolsinmolecularbiology,chapter19(greenepublishingandwiley-interscience,newyork);andthealignprogram(dayhoff(1978)inatlasofproteinsequenceandstructure5:suppl.3(nationalbiomedicalresearchfoundation,washington,d.c.)[ausubel等人編輯(1995)分子生物學(xué)現(xiàn)代方法,第19章(格林出版與威利交叉科學(xué)出版社,紐約);和align程序(dayhoff(1978),在蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集5:增刊3中(國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì),華盛頓)]。許多算法可用于比對(duì)序列并確定序列同一性,并且包括,例如,needlemanetal.(1970)j.mol.biol.48:443[needleman等人(1970)分子生物學(xué)雜志48:443]的同源性比對(duì)算法;smithetal.(1981)adv.appl.math.2:482[smith等人(1981)應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展2:482]的局部同源性算法;pearsonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.85:2444[pearson等人(1988)美國科學(xué)院院刊85:2444]的相似性捜索方法;smith-waterman算法(meth.mol.biol.70:173-187(1997)[分子生物學(xué)方法70:173-187(1997)]);和blastp、blastn、和blastx算法(參見altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-410[altschul等人(1990)分子生物學(xué)雜志215:403-410])。
使用這些算法的計(jì)算機(jī)化程序也是可用的,并且包括但不限于:align或megalign(dnastar)軟件,或wu-blast-2(altschuletal.,meth.enzym.,266:460-480(1996)[altschul等人,酶學(xué)方法,266:460-480(1996)]);或可在遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(gcg)包,版本8,麥迪遜,威斯康星州,美國中獲得的gap、bestfit、blast、fasta、和tfasta;以及智能遺傳學(xué)(intelligenetics),山景城,加利福尼亞州的pc/基因程序中的clustal。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù),包括在進(jìn)行比較的序列的整個(gè)長(zhǎng)度上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的算法。
如本文所使用的,術(shù)語“雜交”是指通過堿基配對(duì)將核酸鏈與互補(bǔ)鏈連接的過程,如本領(lǐng)域已知的。
如果兩個(gè)序列在中至高嚴(yán)格雜交和洗滌條件下彼此特異性雜交,則認(rèn)為核酸序列可與參考核酸序列“選擇性雜交”。雜交條件是基于結(jié)合復(fù)合物或探針的核酸的解鏈溫度(tm)。例如,“最大嚴(yán)格”通常發(fā)生在約tm-5℃(低于探針的tm5°);“高嚴(yán)格”發(fā)生在低于tm約5℃-10℃;“中等嚴(yán)格”發(fā)生在低于探針的tm約10℃-20℃;并且“高嚴(yán)格”發(fā)生在低于tm約20℃-25℃。在功能上,最大嚴(yán)格條件可以用于鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格同一性或近乎嚴(yán)格同一性的序列;而中等或低嚴(yán)格雜交可用于鑒定或檢測(cè)多核苷酸序列同系物。
中和高嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域熟知的。高嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在約42℃下在50%甲酰胺,5xssc,5x登哈特溶液,0.5%sds和100μg/ml變性載體dna中進(jìn)行的雜交,隨后在室溫下在2xssc和0.5%sds中洗滌兩次,并在42℃下在0.1xssc和0.5%sds中再洗滌兩次。中嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例包括在37℃下在包括20%甲酰胺,5×ssc(150mmnacl,15mm檸檬酸三鈉),50mm磷酸鈉(ph7.6),5×登哈特溶液,10%葡聚糖硫酸鹽和20mg/ml變性剪切的鮭魚精子dna的溶液中過夜孵育,然后在約37℃-50℃下以1xssc洗滌濾器來進(jìn)行。如果需要,本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)因素如探針長(zhǎng)度等等。
當(dāng)用于提及生物組分或組合物(例如,細(xì)胞、核酸、多肽/酶、載體等)時(shí),術(shù)語“重組體”表示該生物組分或組成物處于自然界中未發(fā)現(xiàn)的狀態(tài)。換句話說,生物組分或組合物已經(jīng)通過人類干預(yù)從其天然狀態(tài)進(jìn)行了修飾。例如,重組細(xì)胞涵蓋表達(dá)在其天然親本(即,非重組)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)基因的細(xì)胞,表達(dá)與其天然親本細(xì)胞不同的量的一個(gè)或多個(gè)天然基因的細(xì)胞,和/或在不同于其天然親本細(xì)胞的條件下表達(dá)一個(gè)或多個(gè)天然基因的細(xì)胞。重組核酸可以與天然序列相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸,可操作地連接到異源序列(例如,異源啟動(dòng)子,編碼非天然或變體信號(hào)序列的序列等),沒有內(nèi)含子序列,和/或處于分離形式。重組多肽/酶可以與天然序列相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸,可以與異源序列融合,可能被截短或具有氨基酸的內(nèi)部缺失,能以在天然細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的方式表達(dá)(例如,來自由于細(xì)胞中存在編碼多肽的表達(dá)載體而過表達(dá)該多肽的重組細(xì)胞),和/或處于分離形式。需要強(qiáng)調(diào)的是,在一些實(shí)施例中,重組多核苷酸或多肽/酶具有與其野生型對(duì)應(yīng)物相同但處于非天然形式(例如,分離或富集形式)的序列。
如本文所使用的,術(shù)語“靶序列”是指宿主細(xì)胞中編碼如下序列的dna序列:其中希望將輸入序列插入宿主細(xì)胞基因組中。在一些實(shí)施例中,靶序列編碼功能性野生型基因或操縱子,而在其他實(shí)施例中,靶序列編碼功能性突變基因或操縱子、或非功能基因或操縱子。
如本文所使用的,“側(cè)翼序列”是指正在討論的序列的上游或下游的任何序列(例如,針對(duì)基因a-b-c,基因b以a和c基因序列為側(cè)翼)。在一個(gè)實(shí)施例中,輸入序列每側(cè)側(cè)翼有同源盒。在另一個(gè)實(shí)施例中,輸入序列和同源盒包括在每側(cè)側(cè)翼有填充序列的單元。在一些實(shí)施例中,側(cè)翼序列僅存在于單側(cè)(3’或5’),但在實(shí)施例中,序列的每側(cè)均有側(cè)翼序列。每個(gè)同源盒的序列與芽孢桿菌屬染色體中的序列同源。這些序列指導(dǎo)在芽孢桿菌屬染色體中,新構(gòu)建體被整合,并且部分芽孢桿菌屬染色體將被輸入序列替代。在一個(gè)實(shí)施例中,選擇性標(biāo)志物的5’和3’端側(cè)翼有包含失活染色體區(qū)段的部分的多核苷酸序列。在一些實(shí)施例中,側(cè)翼序列僅存在于單側(cè)(3’或5’),而在實(shí)施例中,其存在于所側(cè)翼序列的每側(cè)。
如本文所使用的,術(shù)語“可擴(kuò)增標(biāo)志物”、“可擴(kuò)增基因”、和“擴(kuò)增載體”是指基因或編碼基因的載體,其允許在適當(dāng)生長(zhǎng)條件下擴(kuò)增該基因。
在大多數(shù)擴(kuò)增技術(shù)中通過酶的選擇實(shí)現(xiàn)“模板特異性”。擴(kuò)增酶是在使用它們的條件下僅在核酸的不均勻混合物中處理核酸的特定序列的酶。例如,在qβ復(fù)制酶的情況下,mdv-1rna是復(fù)制酶的特異性模板(參見,例如,kacianetal.,proc.natl.acad.sci.usa69:3038[1972][kacian等人,美國科學(xué)院院刊69:3038[1972]])。其他核酸不被該擴(kuò)增酶復(fù)制。類似地,在t7rna聚合酶的情況下,該擴(kuò)增酶對(duì)其本身的啟動(dòng)子具有嚴(yán)格的特異性(參見,chamberlinetal.,nature228:227[1970][chamberlin等人,自然,228:227[1970]])。在t4dna連接酶的情況下,該酶將不連接兩個(gè)寡核苷酸或多核苷酸,其中寡核苷酸或多核苷酸底物與連接接合處的模板之間存在錯(cuò)配(參見,wuandwallace,genomics4:560[1989][wu和wallace,基因組學(xué),4:560[1989]])。最后,發(fā)現(xiàn)taq和pfu聚合酶由于其在高溫下起作用的能力而對(duì)引物限制并由此限定的序列顯示出高特異性;高溫導(dǎo)致有利于與靶序列引物雜交而不與非靶序列雜交的熱力學(xué)條件。
如本文所使用的,術(shù)語“可擴(kuò)增核酸”是指可以通過任何擴(kuò)增方法擴(kuò)增的核酸。預(yù)期“可擴(kuò)增核酸”通常將包含“樣本模板”。
如本文所使用的,術(shù)語“樣品模板”是指源自樣品的核酸,將該樣品對(duì)“靶標(biāo)”的存在進(jìn)行分析(下文所定義)。相比之下,“背景模板”用于提及除樣品模板之外的核酸,其可以存在或不存在于樣品中。背景模板通常是無意的。它可能是遺留(carryover)的結(jié)果,或者它可能是因?yàn)樵噲D從樣品中純化掉的核酸污染物的存在導(dǎo)致的。例如,來自生物體的而非待檢測(cè)那些的核酸可作為背景存在于測(cè)試樣品中。
如本文所使用的,術(shù)語“引物”是指當(dāng)置于以下條件下能作為合成起始點(diǎn)的寡核苷酸,無論是純化的限制性消化物中天然存在的還是經(jīng)合成而產(chǎn)生的:其中誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成(即,在核苷酸和誘導(dǎo)劑例如dna聚合酶存在下并在合適的溫度和ph下)。引物優(yōu)選是單鏈,用于最大效率的擴(kuò)增,但是可替代地可以是雙鏈。如果是雙鏈,引物首先經(jīng)過處理以分離其雙鏈,然后再用于制備延伸產(chǎn)物。優(yōu)選地,引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長(zhǎng),以在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的準(zhǔn)確長(zhǎng)度將取決于多個(gè)因素,包括溫度、引物來源和方法的使用。
如本文所使用的,術(shù)語“探針”是指能與另一感興趣的寡核苷酸雜交的寡核苷酸(即核苷酸序列),無論是在純化的限制性消化中天然存在還是以合成,重組或通過pcr擴(kuò)增產(chǎn)生的。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針可用于檢測(cè)、鑒定和分離特定基因序列。預(yù)期的是,本發(fā)明所用的任何探針都將用任何“報(bào)道分子”標(biāo)記,這樣使得在任何檢測(cè)系統(tǒng)中都可檢測(cè),所述檢測(cè)系統(tǒng)包括但不限于酶(例如elisa、以及基于酶的組織化學(xué)測(cè)定)系統(tǒng)、熒光系統(tǒng)、放射性系統(tǒng)、和發(fā)光系統(tǒng)。本發(fā)明并不旨在限于任何具體的檢測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)記。
如本文所使用的,術(shù)語“靶”當(dāng)用于提及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí),是指由用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物所界定的核酸區(qū)域。因此,試圖從其他核酸序列分選“靶標(biāo)”?!皡^(qū)段”被定義為靶序列內(nèi)的核酸區(qū)域。
如本文所使用的,術(shù)語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“pcr”)是指通過引用并入本文的美國專利號(hào)4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法,其包括用于在不進(jìn)行克隆或純化的情況下增加基因組dna混合物中靶序列的區(qū)段濃度的方法。
如本文所使用的,術(shù)語“擴(kuò)增試劑”是指除引物、核酸模板和擴(kuò)增酶之外的擴(kuò)增所需的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩沖液等)。通常,將擴(kuò)增試劑以及其他反應(yīng)組分放置并包含在反應(yīng)容器中(試管,微孔等)中。
使用pcr,可以將基因組dna中特異性靶序列的單拷貝擴(kuò)增至通過若干種不同方法可檢測(cè)的水平(例如,與標(biāo)記的探針雜交;摻入生物素化引物,再經(jīng)抗生物素蛋白-酶綴合物檢測(cè);將32p標(biāo)記的脫氧核苷酸三磷酸(如dctp或datp)摻入擴(kuò)增區(qū)段)。除基因組dna外,任何寡核苷酸或多核苷酸序列可以用適當(dāng)?shù)囊锓肿咏M來擴(kuò)增。具體地講,經(jīng)pcr方法本身所產(chǎn)生的擴(kuò)增區(qū)段自身就是用于隨后的pcr擴(kuò)增的有效模板。
如本文所使用的,術(shù)語“pcr產(chǎn)物”、“pcr片段”、及“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指在變性、退火及延伸的pcr步驟的兩個(gè)或更多個(gè)循環(huán)完成之后所得到的化合物的混合物。這些術(shù)語涵蓋一個(gè)或多個(gè)靶序列的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段已經(jīng)擴(kuò)增的情況。
如本文所使用的,術(shù)語“rt-pcr”是指rna序列的復(fù)制和擴(kuò)增。在該方法中,將逆轉(zhuǎn)錄與pcr偶聯(lián),最常使用其中采用熱穩(wěn)定聚合酶的一種酶程序,如美國專利5,322,770中所述,其通過引用并入本文。在rt-pcr中,由于聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性,將rna模板轉(zhuǎn)化為cdna,并且然后使用聚合酶的聚合活性擴(kuò)增(即,如在其他pcr方法中)。
如本文所使用的,術(shù)語“染色體整合”是指將輸入序列引入宿主細(xì)胞(例如,芽孢桿菌屬)的染色體的過程。轉(zhuǎn)化dna的同源區(qū)域與染色體的同源區(qū)域?qū)R。隨后,在雙交換(即同源重組)中,同源盒之間的序列被輸入序列替代。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中,dna構(gòu)建體的滅活染色體區(qū)段的同源段與芽孢桿菌屬染色體的固有染色體區(qū)域的側(cè)翼同源區(qū)域?qū)R。隨后,在雙交換(即同源重組)中,通過dna構(gòu)建體缺失固有染色體區(qū)域。
“同源重組”意指在相同或幾乎相同核苷酸序列位點(diǎn)處的兩個(gè)dna分子或配對(duì)染色體之間的dna片段的交換。在一個(gè)實(shí)施例中,染色體整合是同源重組。
如本文所使用的“同源序列”意指,當(dāng)最佳比對(duì)用于比較時(shí),與另一個(gè)核酸或多肽序列具有100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、88%、85%、80%、75%、或70%序列同一性的核酸或多肽序列。在一些實(shí)施例中,同源序列具有85%至100%之間的序列同一性,而在其他實(shí)施例中,存在在90%至100%之間的序列同一性,并且在更多實(shí)施例中,存在95%和100%的序列同一性。
如本文所使用的,“氨基酸”是指肽或蛋白質(zhì)序列或其部分。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”可互換使用。
如本文所使用的,“感興趣的蛋白質(zhì)”(poi)是指所期望的和/或進(jìn)行評(píng)估的蛋白質(zhì)/多肽。在一些實(shí)施例中,感興趣的蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的,而在其他實(shí)施例中,其是分泌的多肽。多肽包括酶,這些酶包括但不限于選自以下各項(xiàng)的那些:淀粉分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶和植物細(xì)胞壁降解酶。更具體地說,這些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、過水解酶,多元醇氧化酶、果膠酸裂解酶、葡糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶和幾丁質(zhì)酶。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中,感興趣的多肽是蛋白酶。在一些實(shí)施例中,感興趣的蛋白質(zhì)是與信號(hào)肽融合的分泌多肽(即,待分泌的蛋白質(zhì)上的氨基末端延伸)。幾乎所有分泌的蛋白質(zhì)都使用氨基末端蛋白質(zhì)延伸,其在前體蛋白質(zhì)穿過膜的靶向和易位中起關(guān)鍵作用。在膜轉(zhuǎn)移期間或之后立即通過信號(hào)肽酶水解去除該延伸。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中,感興趣的多肽選自激素、抗體、生長(zhǎng)因子、受體等。涵蓋本發(fā)明的激素包括但不限于:卵泡刺激素、黃體生成激素、促皮質(zhì)素釋放因子、生長(zhǎng)激素抑制素、促性腺激素、加壓素、催產(chǎn)素、促紅細(xì)胞生成素、胰島素等。生長(zhǎng)因子包括但不限于:血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子如白介素(例如,il-1至il-13)、干擾素、集落刺激因子等??贵w包括但不限于:直接從需要產(chǎn)生抗體的任何物種獲得的免疫球蛋白。此外,本發(fā)明涵蓋修飾的抗體。多克隆和單克隆抗體也由本發(fā)明所涵蓋。在具體實(shí)施例中,抗體是人抗體。
如本文所使用的,多肽的“衍生物”或“變體”意指一種多肽,該多肽通過以下方式來自前體多肽(例如,天然多肽):向c-和n-末端之一或二者添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸,在氨基酸序列的不同位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)處取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸,在多肽的一端或兩端處或在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸,在氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸,以及其任何組合。多肽的衍生物或變體的制備能以任何方便的方式實(shí)現(xiàn),例如通過修飾編碼天然多肽的dna序列,將該dna序列轉(zhuǎn)化到合適的宿主中,以及修飾的dna序列的表達(dá)以形成衍生物/變體多肽。衍生物或變體進(jìn)一步包括經(jīng)化學(xué)修飾的多肽。
如本文所使用的,術(shù)語“異源蛋白質(zhì)”是指在天然存在于宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽。異源蛋白質(zhì)的實(shí)例包括酶如水解酶,包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶、和脂肪酶;異構(gòu)酶如消旋酶、差向異構(gòu)酶、互變異構(gòu)酶、或變位酶;轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在一些實(shí)施例中,蛋白質(zhì)是治療上重要的蛋白質(zhì)或肽,包括但不限于:生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、配體、受體和抑制劑,連同疫苗和抗體。在另外的實(shí)施例中,蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)/肽(例如,蛋白酶、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂肪酶)。在一些實(shí)施例中,編碼蛋白質(zhì)的基因是天然存在的基因,而在其他實(shí)施例中,使用突變的和/或合成的基因。
如本文所使用的,“同源蛋白質(zhì)”是指天然的或天然存在于細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽。在某些實(shí)施例中,細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)胞,而在某些其他實(shí)施例中,革蘭氏陽性細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。在替代性實(shí)施例中,同源蛋白質(zhì)是由其他生物體產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì),包括但不限于大腸桿菌。本發(fā)明涵蓋通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生同源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。
如本文所使用的,“操縱子”包含可以從共同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄成單個(gè)轉(zhuǎn)錄單元的一組連續(xù)基因,并且從而進(jìn)行共調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施例中,操縱子可以包括驅(qū)動(dòng)多個(gè)不同mrna的轉(zhuǎn)錄的多個(gè)啟動(dòng)子。
如上所述,本披露的某些實(shí)施例涉及經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞,以及制備和使用這些細(xì)胞的方法,這些經(jīng)改變的細(xì)菌細(xì)胞包含導(dǎo)致poi表達(dá)增加的遺傳改變。因此,本發(fā)明的某些方面包括經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)胞,如芽孢桿菌屬成員的細(xì)胞,其中該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞包含導(dǎo)致選自kina基因、phra基因和/或phre基因的至少一個(gè)基因的表達(dá)水平降低的遺傳改變。如本文所述,并且在實(shí)例部分中進(jìn)一步描述的,本發(fā)明的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(即,包含導(dǎo)致選自kina基因、phra基因和/或phre基因的至少一個(gè)基因的表達(dá)水平降低的遺傳改變)當(dāng)與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(親本)細(xì)胞相比時(shí),證明一種或多種poi的表達(dá)增加。因此,本披露的遺傳改變是降低kina、phra、和phre基因中任一個(gè);kina、phra、和phre基因中任兩個(gè);或kina、phra、和phre基因中所有三個(gè)的表達(dá)水平的任何改變。在其他實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(親本)細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此,在某些實(shí)施例中,遺傳改變是降低kina、phra、和phre蛋白中任一種;kina、phra、和phre蛋白中任兩種;或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的任何改變。
如上所述,本發(fā)明的方面包括用于從革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞增加poi的表達(dá)的方法,并且是基于以下觀察:在已被遺傳改變以具有降低的激活磷酸化途徑的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的革蘭氏陽性(子代)細(xì)胞中poi的產(chǎn)生增加,這是相對(duì)于對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性(親本)細(xì)胞中相同poi的產(chǎn)生而言的。如上所述,遺傳改變被定義為宿主細(xì)胞中改變宿主細(xì)胞的遺傳構(gòu)成的任何改變,例如通過附加體添加和/或染色體插入、缺失、倒位、堿基變換等。在這方面不意圖進(jìn)行限制。
在某些實(shí)施例中,親本革蘭氏陽性細(xì)胞具有一個(gè)或多個(gè)有缺陷或無活性的孢子形成起始基因(即,其表達(dá)受spo0a或spo0a下游控制的基因),并且從而防止親本細(xì)胞形成孢子。令人驚奇的是,本發(fā)明的申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)即使在這種遺傳背景(即,包括一個(gè)或多個(gè)有缺陷或無活性的孢子形成起始基因的親本革蘭氏陽性細(xì)胞)中,另外的遺傳改變(例如,導(dǎo)致選自kina基因、phra基因和/或phre基因的至少一個(gè)基因的表達(dá)水平降低的遺傳改變)增加了此類經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞中poi的表達(dá)。因此,本披露的遺傳改變的(子代)細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)/產(chǎn)生的改進(jìn)不僅僅是因?yàn)榉乐垢锾m氏陽性細(xì)胞的孢子形成。例如,本披露的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)胞源自于其的親本革蘭氏陽性細(xì)胞可以具有通過spo0a或通過σ因子sigf、sigg、sige和sigk調(diào)節(jié)的非功能性/突變的/缺失的孢子形成基因(例如,參見實(shí)例部分,其中使用孢子形成缺陷型芽孢桿菌屬細(xì)胞)。
在某些實(shí)施例中,本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生或獲得經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞的方法(及其組合物),該細(xì)胞包含降低激活磷酸化途徑的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的至少一個(gè)遺傳改變。在其他實(shí)施例中,當(dāng)在由經(jīng)改變的革蘭氏陽性(子代)細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)時(shí),該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞(其包含降低激活磷酸化途徑的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的至少一個(gè)遺傳改變)表達(dá)和/或產(chǎn)生增加的量的一種或多種poi。因此,當(dāng)與在基本上相同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(親本)細(xì)胞中poi的表達(dá)和/或產(chǎn)生相比(即,相對(duì)于其)時(shí),經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞中相同的poi的表達(dá)和/或產(chǎn)生增加。
根據(jù)某些實(shí)施例,遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞(或產(chǎn)生遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的親本細(xì)胞)是芽孢桿菌屬成員的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中,芽孢桿菌屬細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌屬細(xì)胞。許多嗜堿芽孢桿菌屬細(xì)胞是本領(lǐng)域已知的(參見例如,美國專利5,217,878;和aunstrupetal.,procivifs:ferment.technol.today,299-305[1972][aunstrup等人,procivifs:當(dāng)今發(fā)酵技術(shù),299-305[1972]])。在一些實(shí)施例中,該芽孢桿菌屬細(xì)胞是工業(yè)相關(guān)的芽孢桿菌屬細(xì)胞。工業(yè)芽孢桿菌屬細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和解淀粉芽孢桿菌。在另外的實(shí)施例中,芽孢桿菌屬細(xì)胞選自下組,該組由以下各項(xiàng)組成:地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌、以及芽孢桿菌屬內(nèi)的其他生物體,如以上所討論的。在具體實(shí)施例中,使用枯草芽孢桿菌細(xì)胞。例如,美國專利5,264,366和4,760,025(re34,606)描述了可用于本發(fā)明的各種芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞,盡管其他合適的細(xì)胞也被考慮用于本發(fā)明。
如本文所述的遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞的親代細(xì)胞(例如,親本芽孢桿菌屬細(xì)胞)是重組革蘭氏陽性細(xì)胞,其中編碼poi的異源多核苷酸已被引入細(xì)胞。雖然引入編碼poi的多核苷酸可以在親本細(xì)胞中進(jìn)行,但是該步驟也可以在已經(jīng)被遺傳改變的細(xì)胞中進(jìn)行以增加多肽產(chǎn)生,如本文所詳述的。在一些實(shí)施例中,宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌宿主菌株,例如重組枯草芽孢桿菌宿主菌株。
已知許多枯草芽孢桿菌菌株可用于本發(fā)明的方面,包括但不限于例如1a6(atcc39085)、168(1a01)、sb19、w23、ts85、b637、pb1753至pb1758、pb3360、jh642、1a243(atcc39,087)、atcc21332、atcc6051、mi113、de100(atcc39,094)、gx4931、pbt110、和pep211菌株(參見例如,hochetal.,genetics,73:215-228[1973][hoch等人,遺傳學(xué),73:215-228[1973]];美國專利號(hào)4,450,235;美國專利號(hào)4,302,544;和ep0134048)。palva等人以及其他人進(jìn)一步描述了使用枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主(參見,palvaetal.,gene19:81-87[1982][palva等人,基因,19:81-87[1982]];還參見fahnestockandfischer,j.bacteriol.,165:796-804[1986][fahnestock和fischer,細(xì)菌學(xué)雜志,165:796-804[1986]];以及wangetal.,gene69:39-47[1988][wang等人,基因,69:39-47[1988]])。
在某些實(shí)施例中,產(chǎn)生工業(yè)蛋白酶的芽孢桿菌屬菌株可用作親本表達(dá)宿主。在一些實(shí)施例中,本發(fā)明中這些菌株的使用進(jìn)一步提高了效率和蛋白酶生產(chǎn)。兩種一般類型的蛋白酶通常由芽孢桿菌屬物種分泌,即中性(或“金屬蛋白酶”)和堿性(或“絲氨酸”)蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵的水解的酶,其中在活性位點(diǎn)存在必需的絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶具有在25,000至30,000范圍內(nèi)的分子量(參見,priest,bacteriol.rev.,41:711-753[1977][priest,細(xì)菌學(xué)評(píng)論,41:711-753[1977]])??莶輻U菌蛋白酶是用于本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。已經(jīng)鑒定并測(cè)序了多種枯草芽孢桿菌蛋白酶,例如枯草桿菌蛋白酶168,枯草桿菌蛋白酶bpn’,枯草桿菌蛋白酶carlsberg,枯草桿菌蛋白酶dy,枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶309(參見,例如,ep414279b;wo89/06279;和stahletal.,j.bacteriol.,159:811-818[1984][stahl等人,細(xì)菌學(xué)雜志,159:811-818[1984]])。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中,芽孢桿菌宿主菌株產(chǎn)生突變體(例如,變體)蛋白酶。許多參考文獻(xiàn)提供了變體蛋白酶的實(shí)例(參見例如,wo99/20770;wo99/20726;wo99/20769;wo89/06279;re34,606;美國專利號(hào)4,914,031;美國專利號(hào)4,980,288;美國專利號(hào)5,208,158;美國專利號(hào)5,310,675;美國專利號(hào)5,336,611;美國專利號(hào)5,399,283;美國專利號(hào)5,441,882;美國專利號(hào)5,482,849;美國專利號(hào)5,631,217;美國專利號(hào)5,665,587;美國專利號(hào)5,700,676;美國專利號(hào)5,741,694;美國專利號(hào)5,858,757;美國專利號(hào)5,880,080;美國專利號(hào)6,197,567;和美國專利號(hào)6,218,165)。
這里注意到,本發(fā)明不限于作為感興趣的蛋白質(zhì)的蛋白酶。實(shí)際上,本披露涵蓋了多種感興趣的蛋白質(zhì),針對(duì)它們而言在革蘭氏陽性細(xì)胞中的增加的表達(dá)是所希望的(詳述如下)。
在其他實(shí)施例中,用于本發(fā)明方面的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞可能在提供有益表型的其他基因中具有額外的遺傳改變。例如,可以使用包括以下基因中的至少一個(gè)的突變或缺失的芽孢桿菌屬細(xì)胞:degu、degs、degr和degq。在一些實(shí)施例中,突變?yōu)閐egu基因,例如degu(hy)32突變。(參見,msadeketal.,j.bacteriol.,172:824-834[1990][msadek等人,細(xì)菌學(xué)雜志,172:824-834[1990]];和olmosetal.,mol.gen.genet.,253:562-567[1997][olmos等人,分子遺傳和基因組學(xué),253:562-567[1997]])。因此,可用于本發(fā)明的方面的親本/遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞的一個(gè)實(shí)例是攜帶degu32(hy)突變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中,芽孢桿菌屬宿主可以包括在以下各項(xiàng)中的突變或缺失:scoc4(參見,caldwelletal.,j.bacteriol.,183:7329-7340[2001][caldwell等人,細(xì)菌學(xué)雜志,183:7329-7340[2001]]);spoiie(參見,arigonietal.,mol.microbiol.,31:1407-1415[1999][arigoni等人,分子微生物學(xué),31:1407-1415[1999]]);oppa或opp操縱子的其他基因(參見,peregoetal.,mol.microbiol.,5:173-185[1991][perego等人,分子微生物學(xué),5:173-185[1991]])。實(shí)際上,預(yù)期引起與oppa基因突變相同的表型的opp操縱子中的任何突變將可用于本發(fā)明的經(jīng)改變的芽孢桿菌屬細(xì)胞的一些實(shí)施例中。在一些實(shí)施例中,這些突變單獨(dú)發(fā)生,而在其他實(shí)施例中,存在突變的組合。在一些實(shí)施例中,本發(fā)明的改變的芽孢桿菌獲得自已經(jīng)包括對(duì)一種或多種上述基因的突變的親本芽孢桿菌宿主菌株。在替代實(shí)施例中,將本發(fā)明的前述經(jīng)遺傳改變的芽孢桿菌進(jìn)一步工程化以包括上述基因中的一個(gè)或多個(gè)的突變。
如上所述,與親本細(xì)胞(在基本相同的條件下生長(zhǎng)的)相比,在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中降低了激活磷酸化途徑的至少一個(gè)基因的表達(dá)。表達(dá)的這種降低能以任何方便的方式實(shí)現(xiàn),并且可以是在轉(zhuǎn)錄、mrna穩(wěn)定性、翻譯的水平上,或者可能是由于從此類基因產(chǎn)生的一種或多種多肽中存在降低其活性的變異導(dǎo)致的(即,它是基于多肽的活性的、表達(dá)的“功能性”降低)。因此,不意圖限制遺傳改變的類型或誘導(dǎo)孢子形成起始基因表達(dá)的至少一個(gè)基因表達(dá)的方式。例如,在一些實(shí)施例中,革蘭氏陽性細(xì)胞中的遺傳改變是改變感興趣的基因的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的遺傳改變,這導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性降低。
在某些實(shí)施例中,與對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)水平的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre基因中任一個(gè);kina、phra、和phre基因中任兩個(gè);或kina、phra、和phre基因中所有三個(gè)的表達(dá)水平的降低。在其他實(shí)施例中,與對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞相比,遺傳改變導(dǎo)致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此,該遺傳改變可導(dǎo)致kina、phra、和phre蛋白中任一種;kina、phra、和phre蛋白中任兩種;或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。
在某些實(shí)施例中,在磷酸化途徑中用于激活孢子形成起始基因表達(dá)的基因的表達(dá)在遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞中降低至在基本相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的野生型和/或親本細(xì)胞中表達(dá)水平的約3%,包括約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、約20%、約21%、約22%、約23%、約24%、約25%、約26%、約27%、約28%、約29%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、或約80%。因此,誘導(dǎo)孢子形成起始基因表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的降低范圍可以從約3%至約80%、從約4%至約75%、從約5%至約70%、從約6%至約65%、從約7%至約60%、從約8%至約50%、從約9%至約45%、從約10%至約40%、從約11%至約35%、從約12%至約30%、從約13%至約25%、從約14%至約20%等。預(yù)期了在上述范圍內(nèi)的表達(dá)的任何子范圍。
在某些實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中這些基因的表達(dá)相比,該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞降低了kina、phra和phre基因中任何一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)的表達(dá)。
在某些實(shí)施例中,遺傳改變(或突變)是降低kina基因表達(dá)的遺傳改變。親本革蘭氏陽性細(xì)胞中的kina基因(即,在如本文所述進(jìn)行遺傳改變之前)是與seqidno:1具有至少60%同一性的基因,包括與seqidno:1具有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性。在某些實(shí)施例中,遺傳改變是kina基因全部或部分的缺失。
在某些實(shí)施例中,遺傳改變(或突變)是降低phra基因表達(dá)的遺傳改變(或突變)。親本革蘭氏陽性細(xì)胞中的phra基因(即,在如本文所述進(jìn)行遺傳改變之前)是與seqidno:6具有至少60%同一性的基因,包括與seqidno:6具有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性。在某些實(shí)施例中,遺傳改變是phra基因全部或部分的缺失。
在某些實(shí)施例中,遺傳改變(或突變)是降低phre基因表達(dá)的遺傳改變(或突變)。親本革蘭氏陽性細(xì)胞中的phre基因(即,在如本文所述進(jìn)行遺傳改變之前)是與seqidno:8具有至少60%同一性的基因,包括與seqidno:8具有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或100%同一性。在某些實(shí)施例中,遺傳改變是phre基因全部或部分的缺失。
在某些實(shí)施例中,與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中這些基因的表達(dá)相比,該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞降低了kina、phra和phre基因中任何一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)的表達(dá)。
在某些實(shí)施例中,遺傳改變(或突變)是降低kina蛋白的活性的遺傳改變(或突變),例如,變體kina蛋白(例如,與野生型序列相比,具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或取代)。變體kina蛋白可以包含與seqidno:2具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%同一性的氨基酸序列。
在某些實(shí)施例中,遺傳改變(或突變)是降低phra蛋白的活性的遺傳改變(或突變),例如,變體phra蛋白(例如,與野生型序列相比,具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或取代)。變體phra蛋白可以包含與seqidno:7具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%同一性的氨基酸序列。
在某些實(shí)施例中,遺傳改變(或突變)是降低phre蛋白的活性的遺傳改變(或突變),例如,變體phre蛋白(例如,與野生型序列相比,具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、插入或取代)。變體phre蛋白可以包含與seqidno:9具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%同一性的氨基酸序列。
如上所述,許多不同的蛋白質(zhì)可用作革蘭氏陽性細(xì)胞中的poi(即,其表達(dá)在遺傳改變的細(xì)胞中增加的蛋白質(zhì))。poi可以是同源蛋白質(zhì)或異源蛋白質(zhì),并且可以是野生型蛋白質(zhì)、天然變體或重組變體。在某些實(shí)施例中,該poi是酶,其中在某些實(shí)施例中,該酶選自乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、凝乳酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構(gòu)酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。
在某些其他實(shí)施例中,該poi是蛋白酶,其中該蛋白酶可以是枯草桿菌蛋白酶,例如選自以下各項(xiàng)的枯草桿菌蛋白酶:枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。在某些實(shí)施例中,該poi是熒光蛋白,例如,綠色熒光蛋白(gfp)。
在某些實(shí)施例中,其方法和組合物進(jìn)一步包括回收感興趣的蛋白質(zhì)。因?yàn)樵谶z傳改變的革蘭氏陽性(子代)細(xì)胞中,感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)/產(chǎn)生水平增加(與未經(jīng)改變的親本細(xì)胞相比),當(dāng)在基本相同的培養(yǎng)條件(和相同的規(guī)模)下培養(yǎng)時(shí),回收的poi量相對(duì)于對(duì)應(yīng)的革蘭氏陽性(親代)細(xì)胞是增加的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知有用于檢測(cè)和測(cè)量細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外所表達(dá)的多肽的表達(dá)水平/產(chǎn)生的各種測(cè)定。這些測(cè)定由本發(fā)明的用戶確定,并且可以取決于poi的同一性和/或活性(例如酶活性)而變化。例如,為了測(cè)定蛋白酶,存在基于從酪蛋白或血紅蛋白的酸溶性肽的釋放的測(cè)定,該釋放以280nm的吸光度或使用folin方法經(jīng)比色法進(jìn)行測(cè)量(參見例如,bergmeyeretal.,“methodsofenzymaticanalysis”vol.5,peptidases,proteinasesandtheirinhibitors,verlagchemie,weinheim[1984][bergmeyer等人,“酶分析方法”,第5卷,肽酶,蛋白酶及其抑制劑,化學(xué)出版社,魏因海姆[1984]])。其他測(cè)定涉及顯色底物的溶解(參見例如,ward,“proteinases,”infogarty(ed.).,microbialenzymesandbiotechnology,appliedscience,london,[1983],pp251-317[ward,“蛋白酶”,在:福格蒂(編輯),微生物酶與生物技術(shù),應(yīng)用科學(xué)出版社,倫敦[1983],第251-317頁])。測(cè)定的其他實(shí)例包括但不限于琥珀酰-ala-ala-pro-phe-對(duì)硝基苯胺測(cè)定(saapfpna)和2,4,6-三硝基苯磺酸鈉鹽測(cè)定(tnbs測(cè)定)。許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的附加參考文獻(xiàn)提供了合適的方法(參見,例如,wellsetal.,nucleicacidsres.11:7911-7925[1983];christiansonetal.,anal.biochem.,223:119-129[1994];andhsiaetal.,analbiochem.,242:221-227[1999][wells等人,核酸研究,11:7911-7925[1983];christianson等人,分析生物化學(xué),223:119-129[1994];以及hsia等人,分析生物化學(xué),242:221-227[1999]])。
同樣如上所述,用于確定poi在宿主細(xì)胞中的分泌水平并檢測(cè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的手段包括對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)具有特異性的多克隆或單克隆抗體的免疫測(cè)定的使用。實(shí)例包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、放射免疫測(cè)定(ria)、熒光免疫測(cè)定(fia)以及熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(facs)。然而,其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且可用于評(píng)估感興趣的蛋白質(zhì)(參見例如,hamptonetal.,serologicalmethods,alaboratorymanual,apspress,st.paul,mn[1990];andmaddoxetal.,j.exp.med.,158:1211[1983][hampton等人,血清學(xué)方法,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),aps出版社,圣保羅,明尼蘇達(dá)州[1990];和maddox等人,實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,158:1211[1983]])。如本領(lǐng)域已知的,將使用本發(fā)明產(chǎn)生的經(jīng)改變的芽孢桿菌屬細(xì)胞在適于從細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和回收poi的條件下維持和生長(zhǎng)(參見例如,hardwoodandcutting(eds.)molecularbiologicalmethodsforbacillus,johnwiley&sons[1990][hardwood和cutting(編輯)芽孢桿菌屬的分子生物學(xué)方法,約翰威利父子公司[1990]])。進(jìn)一步注意到,如本文所述的遺傳改變的細(xì)胞可以表達(dá)多于一種poi,包括兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種等。在一些實(shí)施例中,需要在細(xì)菌分泌物中增加蛋白質(zhì)的表達(dá),其包括從細(xì)胞分泌的許多不同的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的方面包括用于獲得具有改進(jìn)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的方法。通常,這些方法包括遺傳改變親本革蘭氏陽性細(xì)胞以產(chǎn)生遺傳改變的子代革蘭氏陽性細(xì)胞,其中激活磷酸化系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)(如上所述)。
在某些實(shí)施例中,該方法包括將多核苷酸序列引入親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中,當(dāng)整合到染色體中或作為附加體遺傳元件維持時(shí),該方法產(chǎn)生遺傳改變的革蘭氏陽性細(xì)胞,在該細(xì)胞中激活磷酸化系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)水平降低。
已知使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多核苷酸載體(例如,質(zhì)粒構(gòu)建體)來轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬物種,以改變?nèi)旧w或維持芽孢桿菌屬細(xì)胞中的附加型遺傳元件的各種方法。用于將多核苷酸序列引入芽孢桿菌屬細(xì)胞的合適方法見于例如ferrarietal.,“genetics,”inharwoodetal.(ed.),bacillus,plenumpublishingcorp.[1989],pages57-72[ferrari等人,“遺傳學(xué),”在:harwood等人(編輯),芽孢桿菌屬,plenum出版公司,[1989],第57-72頁]中;還參見,saundersetal.,j.bacteriol.,157:718-726[1984];hochetal.,j.bacteriol.,93:1925-1937[1967];mannetal.,currentmicrobiol.,13:131-135[1986];andholubova,foliamicrobiol.,30:97[1985][saunders等人,細(xì)菌學(xué)雜志,157:718-726[1984];hoch等人,細(xì)菌學(xué)雜志,93:1925-1937[1967];mann等人,當(dāng)代微生物學(xué),13:131-135[1986];和holubova,微生物學(xué)大觀,30:97[1985]];針對(duì)解淀粉芽孢桿菌,changetal.,mol.gen.genet.,168:11-115[1979][chang等人,分子遺傳學(xué)與基因組學(xué),168:11-115[1979]];針對(duì)巨大芽孢桿菌,vorobjevaetal.,femsmicrobiol.lett.,7:261-263[1980][vorobjeva等人,fems微生物學(xué)快報(bào),7:261-263[1980]];針對(duì)解淀粉芽孢桿菌,smithetal.,appl.env.microbiol.,51:634(1986)[smith等人,應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué),51:634(1986)];針對(duì)蘇云金芽孢桿菌,fisheretal.,arch.microbiol.,139:213-217[1981][fisher等人,微生物學(xué)文獻(xiàn)集,139:213-217[1981]];以及針對(duì)球形芽孢桿菌,mcdonald,j.gen.microbiol.,130:203[1984][mcdonald,普通微生物學(xué)雜志,130:203[1984]]。實(shí)際上,包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和中板集合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、和原生質(zhì)體融合在內(nèi)的轉(zhuǎn)化方法是已知的并且適合用于本發(fā)明。轉(zhuǎn)化方法具體是將本發(fā)明提供的dna構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞。
此外,將dna構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞包含本領(lǐng)域已知的將dna插入宿主細(xì)胞而不將靶向dna構(gòu)建體插入質(zhì)?;蜉d體中的物理和化學(xué)方法。此類方法包括但不限于氯化鈣沉淀、電穿孔、裸dna、脂質(zhì)體等。在另外的實(shí)施例中,dna構(gòu)建體可以與質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化而不插入該質(zhì)粒中。
在可選擇的標(biāo)志物基因用于選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的實(shí)施例中,可能需要使用任何方便的方法從遺傳改變的革蘭氏陽性菌株中刪除可選擇的標(biāo)志物,其中許多方法是本領(lǐng)域已知的(參見,stahletal.,j.bacteriol.,158:411-418[1984];andpalmerosetal.,gene247:255-264[2000][stahl等人,細(xì)菌學(xué)期刊,158:411-418[1984];和palmeros等人,基因,247:255-264[2000]])。
在一些實(shí)施例中,將兩個(gè)或更多個(gè)dna構(gòu)建體(即,各自被設(shè)計(jì)用于遺傳改變宿主細(xì)胞的dna構(gòu)建體)引入親本革蘭氏陽性細(xì)胞中,導(dǎo)致在細(xì)胞中引入兩個(gè)或更多個(gè)遺傳改變,例如,在兩個(gè)或更多個(gè)染色體區(qū)域的改變。在一些實(shí)施例中,這些區(qū)域是連續(xù)的(例如,在單個(gè)操縱子內(nèi)的兩個(gè)區(qū)域),而在其他實(shí)施例中,這些區(qū)域是分開的。在一些實(shí)施例中,一種或多種遺傳改變是通過添加附加型遺傳元件實(shí)現(xiàn)的。
在一些實(shí)施例中,用根據(jù)本發(fā)明的一種或多種dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生改變的芽孢桿菌菌株,其中兩個(gè)或更多個(gè)基因已經(jīng)在宿主細(xì)胞中失活。在一些實(shí)施例中,從宿主細(xì)胞染色體中缺失兩個(gè)或更多個(gè)基因。在替代實(shí)施例中,通過插入dna構(gòu)建體使兩個(gè)或更多個(gè)基因失活。在一些實(shí)施例中,滅活的基因是連續(xù)的(無論通過缺失和/或插入失活),而在其他實(shí)施例中,它們不是連續(xù)的基因。
一旦產(chǎn)生遺傳改變的宿主細(xì)胞,就可以將其在表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng),其中在某些實(shí)施例中回收該poi。
在一些實(shí)施例中,本發(fā)明包括dna構(gòu)建體,該dna構(gòu)建體包含進(jìn)入序列,當(dāng)穩(wěn)定并入宿主細(xì)胞時(shí),該進(jìn)入序列遺傳改變?cè)摷?xì)胞,這樣使得降低了激活誘導(dǎo)孢子形成起始基因表達(dá)的磷酸化系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)降低(如上文詳細(xì)描述的)。在一些實(shí)施例中,將dna構(gòu)建體在體外組裝,然后將構(gòu)建體直接克隆到感受態(tài)革蘭氏陽性(例如芽孢桿菌屬)宿主中,這樣使得dna構(gòu)建體整合入宿主細(xì)胞染色體中。例如,可以采用pcr融合和/或連接以在體外組裝dna構(gòu)建體。在一些實(shí)施例中,dna構(gòu)建體是非質(zhì)粒構(gòu)建體,而在其他實(shí)施例中,其被并入載體(例如,質(zhì)粒)中。在一些實(shí)施例中,使用環(huán)狀質(zhì)粒。在實(shí)施例中,環(huán)狀質(zhì)粒被設(shè)計(jì)為使用適當(dāng)?shù)南拗泼?即,不破壞dna構(gòu)建體的限制酶)。因此,線性質(zhì)粒可用于本發(fā)明。然而,如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,其他方法適用于本發(fā)明(參見,例如,perego,“integrationalvectorsforgeneticmanipulationinbacillussubtilis,”in(sonensheinetal.(eds.),bacillussubtilisandothergram-positivebacteria,americansocietyformicrobiology,washington,dc[1993][perego,“枯草芽孢桿菌遺傳操作的整合載體”,在:(sonenshein等人(編輯),枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性菌,美國微生物學(xué)會(huì),華盛頓,哥倫比亞特區(qū)[1993]中])。
在某些實(shí)施例中,設(shè)計(jì)dna靶向載體以使全部或部分kina基因、phra基因、或phre基因缺失(或允許其缺失)。在某些實(shí)施例中,同時(shí)或依次使用多個(gè)dna構(gòu)建體來使kina基因、phra基因、和phre基因中的任何兩個(gè)或三個(gè)缺失。在某些實(shí)施例中,dna靶向載體包括選擇性標(biāo)志物。在一些實(shí)施例中,選擇性標(biāo)志物位于兩個(gè)loxp位點(diǎn)之間(參見,kuhnandtorres,meth.mol.biol.,180:175-204[2002][kuhn和torres,分子生物學(xué)方法,180:175-204[2002]]),并且然后通過cre蛋白的作用來使抗微生物基因缺失。
本發(fā)明的方面包括用于增強(qiáng)poi在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)的方法,該方法包括用上述dna構(gòu)建體或載體(即,包括進(jìn)入序列的dna構(gòu)建體或載體,當(dāng)穩(wěn)定并入宿主細(xì)胞時(shí),遺傳上改變?cè)摷?xì)胞,這樣使得磷酸化途徑的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)降低),允許載體和親本革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞的感興趣基因中的相應(yīng)區(qū)域的同源重組以產(chǎn)生經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞;并在適于表達(dá)poi的條件下生長(zhǎng)經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞,其中與革蘭氏陽性細(xì)菌(親本)細(xì)胞相比,經(jīng)改變的革蘭氏陽性細(xì)菌(子代)細(xì)胞中poi的產(chǎn)生增加。上文詳細(xì)描述了可用于本發(fā)明的這個(gè)方面的革蘭氏陽性細(xì)胞、突變和其他特征的實(shí)例。
無論dna構(gòu)建體是否并入到載體中或者在質(zhì)粒dna的不存在下使用,將其用于轉(zhuǎn)化微生物。預(yù)期,任何合適的轉(zhuǎn)化方法將用于本發(fā)明。在某些實(shí)施例中,將dna構(gòu)建體的至少一個(gè)拷貝整合到宿主芽孢桿菌染色體中。在一些實(shí)施例中,使用本發(fā)明的一種或多種dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
通過參考以下實(shí)例,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更充分地理解實(shí)施本發(fā)明的方式和方法,這些實(shí)例不旨在以任何方式限制本發(fā)明或涉及其的權(quán)利要求的范圍。
實(shí)例
提供以下實(shí)例以便證實(shí)和進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些實(shí)施例和方面,而不應(yīng)被解釋為限制其范圍。
在下面的實(shí)驗(yàn)披露中,應(yīng)用以下縮寫中的某些:℃(攝氏度);rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù));μg(微克);mg(毫克);μl(微升);ml(毫升);mm(毫摩爾);μm(微摩爾);sec(秒);min(s)(分鐘);hr(s)(小時(shí));od280(在280nm下的光密度);od600(在600nm下的光密度);pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng));rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄pcr);sds(十二烷基硫酸鈉)。
實(shí)例1
在kina基因中通過缺失增加芽孢桿菌屬中的蛋白質(zhì)表達(dá)
a.在枯草芽孢桿菌中kina基因座的缺失
通過使用kina缺失盒的同源重組將kina中的缺失引入親本枯草芽孢桿菌細(xì)胞中(圖1)。通過pcr和kina基因座的測(cè)序證實(shí)缺失。所得到的子代細(xì)胞由δkina和未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞(本文稱為親本細(xì)胞)表示。seqidno:1顯示了kina基因的野生型序列,并且seqidno:2顯示了kina蛋白序列。
b.kina缺失菌株中的淀粉酶表達(dá)
將淀粉酶表達(dá)構(gòu)建體引入δkina(子代細(xì)胞)和未經(jīng)改變的親本細(xì)胞的apre基因座,該淀粉酶表達(dá)構(gòu)建體驅(qū)動(dòng)來自apre啟動(dòng)子的amye的表達(dá),并且包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性(catr)標(biāo)記基因(本文中為“papre-amyecatr”)。成熟的amye蛋白序列如seqidno:3所示。
在包含25μg/ml氯霉素的luria瓊脂平板上擴(kuò)增細(xì)胞。將δkina(子代)細(xì)胞和親本細(xì)胞在5ml的luria肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜。使用一(1)ml預(yù)培養(yǎng)物接種在37℃,250rpm下的搖瓶中的25mlluria肉湯培養(yǎng)基以測(cè)試amye淀粉酶蛋白的表達(dá)。使用spectramax分光光度計(jì)在600nm下以每小時(shí)間隔測(cè)量細(xì)胞密度(分子器件公司,唐寧鎮(zhèn),賓夕法尼亞州,美國)。將600nm下的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)作圖,并且將結(jié)果示于圖2a中。例如,圖2a顯示親本細(xì)胞和δkina(子代)細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)是等效的,表明(子代)細(xì)胞中kina基因的缺失不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
使用ceralpha試劑(梅格澤姆公司(megazyme),威克洛,愛爾蘭)測(cè)量全發(fā)酵液的amye淀粉酶活性。首先將來自ceralphahr試劑盒的ceralpha試劑混合物溶解在10ml的milliq水中,隨后添加30ml的50mm蘋果酸鹽緩沖液(ph5.6)。將培養(yǎng)物上清液在milliq水中稀釋40倍,并將5μl的稀釋的樣品添加到55μl稀釋的工作底物溶液中。在震蕩后,將mtp板于室溫下孵育4分鐘。通過添加70μl的200mm硼酸鹽緩沖液(ph10.2)(終止溶液)來淬滅反應(yīng)。使用spectramax分光光度計(jì)(分子器件公司,唐寧鎮(zhèn),賓夕法尼亞州,美國)在400nm下測(cè)量溶液的吸光度。將400nm下的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)作圖,并且將結(jié)果示于圖2b中。圖2b中的圖顯示出在經(jīng)改變的(δkina;子代)細(xì)胞中在生長(zhǎng)6小時(shí)處開始的增加的amye生產(chǎn)。鑒于經(jīng)改變的(δkina;子代)細(xì)胞中細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響(如圖2a所示),相對(duì)于未經(jīng)改變的(親本)芽孢桿菌細(xì)屬胞(在相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的),經(jīng)改變的(δkina;子代)芽孢桿菌屬細(xì)胞中amye產(chǎn)生的增加不是由于培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量的增加,而是由于細(xì)胞本身的表達(dá)水平增加導(dǎo)致的(即,在逐個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上)。
c.kina缺失菌株中的蛋白酶(fna)表達(dá)
在包含fna表達(dá)盒(本文中稱為“papre-fna-catr”)的枯草芽孢桿菌細(xì)胞中測(cè)試kina缺失(δkina)對(duì)fna蛋白酶(包含y217l取代的枯草桿菌蛋白酶bpn’;seqidno:4)表達(dá)的影響。通過用圖1所示的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化菌株來使經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌(子代)細(xì)胞中的kina基因缺失。在包含25μg/ml氯霉素的la平板上擴(kuò)增攜帶缺失kina的壯觀霉素霉素抗性菌落。將親本枯草芽孢桿菌細(xì)胞和δkina敲除子代細(xì)胞在5ml的luria肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜。使用一(1)ml預(yù)培養(yǎng)物接種在250rpm下的thompson燒瓶中的25ml2xnb(描述于pct國際公開號(hào)wo2010/14483中的2x營養(yǎng)肉湯,1xsnb鹽)以測(cè)試蛋白酶表達(dá)。將全發(fā)酵液的細(xì)胞密度稀釋20倍,并使用spectramax分光光度計(jì)(分子器件公司,唐寧頓,賓夕法尼亞州,美國)在600nm下以每小時(shí)間隔進(jìn)行測(cè)量。將600nm下的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)作圖,并且將結(jié)果示于圖3a中,該圖3a顯示了表達(dá)fna的枯草芽孢桿菌親本細(xì)胞和表達(dá)fna的枯草芽孢桿菌子代細(xì)胞(即,δkina)的細(xì)胞生長(zhǎng)是相等的,表明子代細(xì)胞中的kina缺失不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
使用如pct國際公開號(hào)wo2010/144283中所述的n-suc-aapf-pna底物(來自西格瑪化學(xué)公司(sigmachemicalco.))監(jiān)測(cè)fna蛋白酶表達(dá)。簡(jiǎn)言之,在測(cè)定緩沖液(100mmtris,0.005%tween80,ph8.6)中將全發(fā)酵液稀釋40倍,并且將10μl稀釋的樣品排列在微量滴定板中。將aapf原液在測(cè)定緩沖液(100mg/mlaapf儲(chǔ)備液,在dmso中,稀釋100倍)中稀釋,并將190μl該溶液添加到微量滴定板中,并使用spectramax分光光度計(jì)(分子器件公司,唐寧頓,賓夕法尼亞州,美國)在405nm下測(cè)量溶液的吸光度。將405nm下的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)作圖,并且將結(jié)果示于圖3b中,該圖3b顯示了與在相同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的親本芽孢桿菌屬細(xì)胞的培養(yǎng)物相比,包含δkina缺失的子代芽孢桿菌屬細(xì)胞培養(yǎng)物中的fna產(chǎn)量增加。鑒于經(jīng)改變的(δkina)芽孢桿菌屬子代細(xì)胞中細(xì)胞生長(zhǎng)不受影響(如圖3a所示),相對(duì)于未經(jīng)改變的親本芽孢桿菌屬細(xì)胞(在相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的),芽孢桿菌屬(δkina)子代細(xì)胞中fna產(chǎn)生的增加不是由于培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量的增加,而是由于經(jīng)改變的細(xì)胞本身的表達(dá)水平的增加(即,在逐個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上)。
d.在kina缺失菌株中的綠色熒光蛋白(gfp)表達(dá)
為了測(cè)試kina缺失對(duì)其他蛋白質(zhì)表達(dá)的影響,將在apre啟動(dòng)子控制下的并且進(jìn)一步包含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶抗性標(biāo)志物(seqidno:5顯示了gfp的氨基酸序列)的gfp表達(dá)盒(本文中稱為“papre-gfpcatr”)引入未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌親本細(xì)胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌子代細(xì)胞的apre基因座。在包含5μg/ml氯霉素的luria瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。表達(dá)gfp的經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌(δkina)子代細(xì)胞和表達(dá)gfp的未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌親本細(xì)胞在5ml的luria肉湯中生長(zhǎng)過夜。使用一(1)ml預(yù)培養(yǎng)物接種在37℃,250rpm下的搖瓶中的25ml的2xnb培養(yǎng)基(2x營養(yǎng)肉湯,1xsnb鹽)中以測(cè)試綠色熒光蛋白(gfp)的表達(dá)。使用spectramax分光光度計(jì)在600nm下以每小時(shí)間隔測(cè)量稀釋20倍的全肉湯的細(xì)胞密度(分子器件公司(moleculardevices),唐寧鎮(zhèn),賓夕法尼亞州,美國)。將600nm下的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)作圖,并且將結(jié)果示于圖4a中,該圖4a顯示了與表達(dá)gfp的枯草芽孢桿菌(δkina)子代細(xì)胞相比,表達(dá)gfp的枯草芽孢桿菌親本細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)降低了,表明這些表達(dá)gfp的細(xì)胞中的kina缺失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有積極的影響。
為了測(cè)量gfp表達(dá),將100μl培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板中,并在熒光板讀數(shù)器中使用485nm的激發(fā)波長(zhǎng),508nm的發(fā)射波長(zhǎng)用495nm發(fā)射截止濾光片測(cè)量gfp表達(dá)。將485/508nm下的相對(duì)熒光單位(rfu)作為時(shí)間的函數(shù)作圖,并且將結(jié)果示于圖4b中。該圖顯示由于kina缺失導(dǎo)致的6小時(shí)生長(zhǎng)的gfp生成的增加。與未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌親本細(xì)胞相比,經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌(δkina)子代細(xì)胞中增加的gfp表達(dá)水平超過了僅從圖4a中所見的細(xì)胞活力的改進(jìn)的預(yù)期。
實(shí)例2
通過phra和phre基因的缺失增加芽孢桿菌屬中的蛋白質(zhì)表達(dá)
a.在枯草芽孢桿菌中phra基因座的缺失
將phra基因中的缺失通過圖6中示意性示出的缺失盒的同源重組引入親本枯草芽孢桿菌細(xì)胞中。通過pcr和phra基因座測(cè)序證實(shí)phra缺失(δphra)。使用編碼cre重組酶的質(zhì)粒除去壯觀霉素標(biāo)志物(specr)。
b.在經(jīng)改變的(δphra)芽孢桿菌屬細(xì)胞中phre基因座的缺失
在實(shí)例2中,還缺失了phre基因。通過圖7中示意性示出的缺失盒的同源重組所描述的經(jīng)改變的(δphra)枯草芽孢桿菌子代細(xì)胞。通過pcr和phre基因座測(cè)序證實(shí)phre缺失。
c.經(jīng)改變的(δphra/δphre)芽孢桿菌屬細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)
將前文在實(shí)施例1中描述的表達(dá)盒(即,“papre-fnacatr”盒、“papre-gfpcatr”盒或“papre-amyecatr”盒)引入到未經(jīng)改變的(親代)枯草芽孢桿菌細(xì)胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的染色體中。如實(shí)例1所述進(jìn)行菌株選擇、細(xì)胞生長(zhǎng)、和酶測(cè)定。在氯霉素25ppm平板上選擇包含“paper-fancar”盒的枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在氯霉素5ppm平板上選擇包含“paper-gfpcar”盒或“paper-amyecar”盒的枯草芽孢桿菌細(xì)胞。如實(shí)例1所述測(cè)量細(xì)胞密度和蛋白質(zhì)表達(dá)。
圖8a顯示了表達(dá)gfp的親本枯草芽孢桿菌細(xì)胞和表達(dá)gfp的子代(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)是相等的,表明枯草芽孢桿菌(子代)細(xì)胞中的phra-phre缺失不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。圖8b顯示了由于phra-phre缺失導(dǎo)致的4小時(shí)生長(zhǎng)的gfp產(chǎn)生的增加。
圖9a顯示了表達(dá)fna的親本枯草芽孢桿菌細(xì)胞和表達(dá)fna的子代(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)是相等的,表明枯草芽孢桿菌(子代)細(xì)胞中的phra-phre缺失不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。圖9b顯示了由于phra-phre缺失導(dǎo)致的4小時(shí)生長(zhǎng)的fna產(chǎn)生的增加。
圖10a顯示了表達(dá)amye的親本枯草芽孢桿菌細(xì)胞和表達(dá)amye的子代(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)是相等的,表明枯草芽孢桿菌(子代)細(xì)胞中的phra-phre缺失不影響細(xì)胞生長(zhǎng)。圖10b顯示了由于phra-phre缺失導(dǎo)致的amye產(chǎn)生的增加。
雖然前述組合物和方法已經(jīng)通過說明和實(shí)例的方式出于清楚理解的目的在一些細(xì)節(jié)方面進(jìn)行了描述,但是對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言根據(jù)本文的傳授內(nèi)容顯而易見的是可以對(duì)其進(jìn)行某些改變和修改而不偏離所附權(quán)利要求的精神或范圍。
因此,前面僅僅舉例說明了本發(fā)明組合物和方法的原理。將了解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計(jì)不同的安排,這些不同的安排雖然沒有在此明確地描述或顯示,但體現(xiàn)本發(fā)明組合物和方法的原理并且被包括在其精神和范圍之內(nèi)。此外,本文敘述的所有實(shí)例和條件性語言主要旨在幫助讀者理解諸位發(fā)明人所貢獻(xiàn)的本發(fā)明的組合物和方法的原理和概念以推動(dòng)本領(lǐng)域發(fā)展,并且將被視為而不限于這些具體敘述的實(shí)例和條件。此外,本文中敘述本發(fā)明組合物和方法的原理、方面、以及實(shí)施例的所有陳述連同其具體實(shí)例旨在涵蓋其結(jié)構(gòu)和功能等效物兩者。另外,預(yù)期此類等效物包括當(dāng)前已知的等效物以及將來開發(fā)的等效物兩者,即不論結(jié)構(gòu)如何而執(zhí)行相同功能的任何開發(fā)的要素。因此,本發(fā)明的組合物和方法的范圍不是旨在受限于本文顯示和描述的示例性實(shí)施例。
序列
seqidno:1-kina野生型編碼序列
gtggaacaggatacgcagcatgttaaaccacttcaaacaaaaaccgatattcatgcagtcttggcctctaatggacgcatcatttatatatctgccaactccaaactgcatttgggctatctccaaggagagatgatcggatcattcctcaaaacgtttctgcatgaggaagaccaatttttggttgaaagctatttttataatgaacatcatctgatgccgtgcacctttcgttttattaaaaaagatcatacgattgtgtgggtggaggctgcggtagaaattgttacgacaagagctgagcggacagaacgggaaatcattttgaaaatgaaggttcttgaagaagaaacaggccatcaatccctaaactgcgaaaaacatgaaatcgaacctgcaagcccggaatcgactacatatataacggatgattatgaacggttggttgaaaatctcccgagtccgctatgcatcagtgtcaaaggcaagatcgtctatgtaaacagcgcgatgctttcaatgctgggagccaaaagcaaggatgctattattggtaaatcgtcctatgaatttattgaagaagaatatcatgatatcgtgaaaaacaggattatacgaatgcaaaaaggaatggaagtcggaatgattgaacagacgtggaaaaggcttgatggcacacctgttcatttagaagtgaaagcatccccgaccgtctacaaaaaccagcaggctgagctgctgctgctgatcgatatctcttcaaggaaaaaattccaaaccatcctgcaaaaaagccgtgaacgatatcagctgctgattcaaaattccattgataccattgcggtgattcacaatggaaaatgggtatttatgaatgaatcgggaatttccctgtttgaagcggctacatatgaggatttaattggcaaaaacatatacgatcagctgcatccttgcgatcacgaggatgtaaaagagagaatccaaaacattgccgagcaaaaaacagaatctgaaattgtcaagcaatcctggttcacctttcagaacagggtcatctatacggagatggtctgcattccgacgaccttttttggtgaagcggccgtccaggtcattcttcgggacatctcagagagaaaacaaacagaagaattgatgctgaaatcggaaaaattatcaatcgcagggcagctcgcggcgggaatcgcccatgagatccgcaaccctcttacagcgatcaaaggatttttacagctgatgaaaccgacaatggaaggcaacgaacattactttgatattgtgttttctgaactcagccgtatcgaattaatactcagtgaactgctcatgctggcgaaacctcagcaaaatgctgtcaaagaatatttgaacttgaaaaaattaattggtgaggtttcagccctgttagaaacgcaggcgaatttaaatggcatttttatcagaacaagttatgaaaaagacagcatttatataaacggggatcaaaaccaattaaagcaggtattcattaatttaatcaaaaatgcagttgaatcaatgcctgatgggggaacagtagacattatcataaccgaagatgagcattctgttcatgttactgtcaaagacgaaggggaaggtatacctgaaaaggtactaaaccggattggagagccatttttaacaacaaaagaaaaaggtacggggcttggattaatggtgacatttaatatcattgaaaaccatcagggagttatacatgtggacagccatcctgaaaaaggcacagcgtttaaaatttcatttccaaaaaaataa
seqidno:2-kina蛋白序列
meqdtqhvkplqtktdihavlasngriiyisansklhlgylqgemigsflktflheedqflvesyfynehhlmpctfrfikkdhtivwveaaveivttraertereiilkmkvleeetghqslncekheiepaspesttyitddyerlvenlpsplcisvkgkivyvnsamlsmlgakskdaiigkssyefieeeyhdivknriirmqkgmevgmieqtwkrldgtpvhlevkasptvyknqqaellllidissrkkfqtilqksreryqlliqnsidtiavihngkwvfmnesgislfeaatyedligkniydqlhpcdhedvkeriqniaeqkteseivkqswftfqnrviytemvcipttffgeaavqvilrdiserkqteelmlkseklsiagqlaagiaheirnpltaikgflqlmkptmegnehyfdivfselsrielilsellmlakpqqnavkeylnlkkligevsalletqanlngifirtsyekdsiyingdqnqlkqvfinliknavesmpdggtvdiiitedehsvhvtvkdegegipekvlnrigepflttkekgtglglmvtfniienhqgvihvdshpekgtafkisfpkk
seqidno:3-amye蛋白序列
ltapsiksgtilhawnwsfntlkhnmkdihdagytaiqtspinqvkegnqgdksmsnwywlyqptsyqignrylgteqefkemcaaaeeygikvivdavinhttsdyaaisnevksipnwthgntqiknwsdrwdvtqnsllglydwntqntqvqsylkrfldralndgadgfrfdaakhielpddgsygsqfwpnitntsaefqygeilqdsasrdaayanymdvtasnyghsirsalknrnlgvsnishyasdvsadklvtwveshdtyanddeestwmsdddirlgwaviasrsgstplffsrpegggngvrfpgksqigdrgsalfedqaitavnrfhnvmagqpeelsnpngnnqifmnqrgshgvvlanagsssvsintatklpdgrydnkagagsfqvndgkltgtinarsvavlypd
seqidno:4-fna蛋白序列
agksngekkyivgfkqtmstmsaakkkdvisekggkvqkqfkyvdaasatlnekavkelkkdpsvayveedhvahayaqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavidsgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnnshgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvlgadgsgqyswiingiewaiannmdvinmslggpsgsaalkaavdkavasgvvvvaaagnegtsgssstvgypgkypsviavgavdssnqrasfssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngtsmasphvagaaalilskhpnwtntqvrsslentttklgdsfyygkglinvqaaaq
seqidno:5-gfp蛋白序列
vnrnvlkntglkeimsakasvegivnnhvfsmegfgkgnvlfgnqlmqirvtkggplpfafdivsiafqygnrtftkypddiadyfvqsfpagffyernlrfedgaivdirsdisleddkfhykveyrgngfpsngpvmqkailgmepsfevvymnsgvlvgevdlvyklesgnyyschmktfyrskggvkefpeyhfihhrlektyveegsfveqhetaiaqlttigkplgslhewv
seqidno:6-phra野生型編碼序列
atgaaatctaaatggatgtcaggtttgttgctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaagggaaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaacatga
seqidno:7-phra蛋白序列
mkskwmsglllvavgfsftqvmvhagetantegktfhiaarnqt
seqidno:8-phre野生型編碼序列
atgaaatctaaattgtttatcagtttatccgccgttttaattggacttgcctttttcggatctatgtataatggcgaaatgaaggaagcatcccggaatgtaactctcgcacctactcatgaattccttgtttaa
seqidno:9-phre蛋白序列
mksklfislsavliglaffgsmyngemkeasrnvtlaptheflv