相關申請的交叉引用
本申請要求于2014年11月7日提交的美國臨時申請第62/076,795號的權益，該申請通過引用被整體并入本文。
背景
對人血液標本中的核酸(na；rna和dna)的檢測是用于檢測各種急性和慢性醫(yī)療狀況(例如病原體感染等)的測定的重要組成部分。為了評估na的水平，必須首先從人體液純化na，以去除蛋白質和抑制下游na擴增程序的分子。從人標本中高效純化na是設計下一代基于硅微芯片的病毒na診斷測定的重要要素。目前的金標準na純化方案是由boom等人(boom，1990)描述的方案，其充當大部分商業(yè)na純化試劑盒的基礎并且需要在離液鹽的存在下將na結合至二氧化硅、使用70％乙醇將na沉淀到二氧化硅上并將其重新懸浮于弱堿性緩沖液或水中。
對于boom方案在下一代基于硅微芯片測定的適用性方面，boom方案在至少兩個方面受限。第一，離液鹽諸如硫氰酸胍是有毒的并且需要特殊的處理和處置。此限制排除了非技術人員在實驗室以外的情境中使用該方案。第二，當在下一代基于硅微芯片的na診斷測定上使用此方案時，70％乙醇沉淀步驟的使用展現了許多挑戰(zhàn)。例如，乙醇沉淀步驟可能是na擴增測定的有效抑制因素，導致形成阻塞微流體通道的氣泡,并且是蒸發(fā)不可行的。在下一代na診斷測定中基于boom的方案的禁用需要開發(fā)不含離液鹽和揮發(fā)性有機化學品的na純化方法。
已經描述了嘗試克服基于boom的方案的限制的一些替代方案。例如，hourfar等人(hourfar,2005)描述了使用硅質(silica)包被的磁珠固相從人血漿純化病毒na和由以下組成的方案：在ph4的親液(kosmotropic)鹽(硫酸銨)中結合、在ph6.8的洗滌步驟和在80℃用ph8.5的緩沖液洗脫。通過在該方案的結合和洗滌步驟中使用蛋白酶k抑制由于降解rna而干擾na擴增測定的rna酶。在此方法中使用的硅質包被的磁珠固相與基于微芯片的測定不相容。
屬于merck的美國專利6,355,792公開了使用硅質磁珠從溶液純化na和由以下組成的方案：在不含任何其他鹽的ph4的緩沖液中結合、用ph6.5緩沖液洗滌并在ph9緩沖液中洗脫。此方案不適用于從血漿純化na，因為rna酶未被抑制或去除。
屬于agencourttechnologies的美國專利5,705,6283描述了在被稱為固相反向固定化(solidphasereverseimmobilization)的方法中使用用-cooh基團官能化的聚苯乙烯磁珠和群集試劑(crowdingreagent)來從生物流體純化na。在該程序中，na在高濃度nacl(0.5m-5m)和聚乙二醇(7％-13％)的存在下與柱結合。使用高鹽緩沖液將污染物從柱上洗去，并在低離子強度緩沖液或水中洗脫。
用于從血漿純化na的現有方法涉及使用基于硅質的固相和有毒的和/或揮發(fā)性緩沖液體系，這妨礙在多種資源環(huán)境中在護理即時(point-of-care)診斷測試中使用這些方法。
概述
在一些方面中，本公開的主題提供了用于純化核酸的無離液劑和無揮發(fā)物的方法，所述方法包括：(a)將包含至少一種核酸的樣品加入到包含硅質或聚合物骨架的官能化固相；(b)允許所述樣品中的核酸在包含高濃度的親液分子的結合緩沖液的存在下與官能化固相結合；(c)去除所述結合緩沖液；(d)任選地用洗滌緩沖液洗滌與所述官能化固相結合的核酸；和(e)用洗脫緩沖液從所述官能化固相洗脫所述核酸。
在一些方面中，本公開的主題提供了用于純化核酸的無離液劑和無揮發(fā)物的方法，所述方法包括：(a)提供包含至少一種核酸的樣品；(b)將所述至少一種核酸加入到包含硅質或聚合物骨架的官能化固相；(c)允許所述至少一種核酸在包含高濃度的親液分子的結合緩沖液的存在下與包含硅質或聚合物骨架的官能化固相結合；(d)去除所述包含高濃度的親液分子的結合緩沖液；(e)用低離子強度洗滌緩沖液洗滌與所述包含硅質或聚合物骨架的官能化固相結合的所述至少一種核酸；和(f)用低離子強度洗脫緩沖液從所述包含硅質或聚合物骨架的官能化固相洗脫所述至少一種核酸。
在其他方面中，本公開的主題提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括包含硅質或聚合物骨架的至少一種官能化固相和用于使用至少一種官能化固相純化核酸的一組說明書。
上文已列舉了本公開的主題的某些方面，其全部或部分由本公開的主題所呈送，當結合下文作為最佳描述的所附實施例和附圖考慮時，其他方面隨著描述進行將變得明顯。
附圖簡述
已如此以常規(guī)術語描述了本公開的主題，現將參考附圖，其不一定按比例繪制，且其中：
圖1示出了以1pg/ml和10pg/mlhcvrna的初始濃度使用本公開的方法后丙型肝炎病毒(hcv)rna的回收率。
詳述
現將在下文中參照附圖更全面地描述本公開的主題，在附圖中示出了本發(fā)明的某些而不是全部實施方案。相似的數字始終指的是相似的要素。本公開的主題可以以許多不同的形式來體現并且不應該被解釋為局限于本文列出的實施方案；相反，這些實施方案被提供以使得本公開內容將滿足適用的法律要求。事實上，有了前面的描述和相關的附圖中呈現的教導的益處，本公開的主題所屬領域的技術人員將想到本文提出的本公開的主題的許多修改和其他實施方案。因此，應該理解，本公開的主題不限于所公開的具體實施方案并且修改形式和其他實施方案意圖被包括在所附權利要求書的范圍內。
本公開的主題提供了非官能化固相和包含硅質和聚合物骨架的官能化固相與非離液鹽和無乙醇的緩沖方案的新的組合，用于純化核酸。這些方法可以使用包括非離液鹽的多種不同緩沖液方案在許多不同的固相上進行。在一些實施方案中，該方法利用包含高濃度的親液分子的緩沖液，并且污染物被低離子強度緩沖液去除并在低離子強度緩沖液中洗脫。本公開的主題克服了使用有毒離液鹽和揮發(fā)性有機化學品的必要性。本公開的主題適用于當前診斷測定和下一代基于硅微芯片的診斷測定。此外，本公開的主題適用于在護理即時診斷微流體或磁性系統(tǒng)中使用，從而允許遍布所有資源環(huán)境在全世界使用護理即時診斷。在具體實施方案中，本公開的主題提供了從血漿中純化核酸的方法。
i.用于從血漿純化核酸的方法
相應地，在一些實施方案中，本公開的主題提供了用于純化核酸的無離液劑和無揮發(fā)物的方法，所述方法包括：(a)將包含至少一種核酸的樣品加入到包含硅質或聚合物骨架的官能化固相；(b)允許所述樣品中的核酸在包含高濃度的親液分子的結合緩沖液的存在下與所述官能化固相結合；(c)去除所述結合緩沖液；(d)任選地用洗滌緩沖液洗滌與所述官能化固相結合的核酸；和(e)用洗脫緩沖液從所述官能化固相洗脫所述核酸。
在一些實施方案中，本公開的主題提供了用于純化核酸的無離液劑和無揮發(fā)物的方法，所述方法包括：(a)提供包含至少一種核酸的樣品；(b)將所述至少一種核酸加入到包含硅質或聚合物骨架的官能化固相；(c)允許所述至少一種核酸在包含高濃度的親液分子的結合緩沖液的存在下與所述包含硅質或聚合物骨架的官能化固相結合；(d)去除所述包含高濃度親液分子的結合緩沖液；(e)用低離子強度洗滌緩沖液洗滌與所述包含硅質或聚合物骨架的官能化固相結合的至少一種核酸；和(f)用低離子強度洗脫緩沖液從所述包含硅質或聚合物骨架的官能化固相中洗脫所述至少一種核酸。
如本文使用的，“聚合物骨架”指共價結合的原子的系列，其一起創(chuàng)建大分子或包含許多重復子單元的高分子中的連續(xù)的鏈。如本文使用的，“硅質骨架”指一系列共價結合的硅原子。
如本文使用的，“離液劑(chaotrope)"或“離液劑(chaotropicagent)”是破壞水結構、增加非極性溶劑顆粒的溶解度并使溶質聚集體不穩(wěn)定的劑?！盁o離液劑”方法是不使用離液劑的方法。如本文使用的，離子型或非離子型“親液”分子使水分子有利地相互作用并穩(wěn)定高分子諸如蛋白質中的分子內相互作用。離子型親液劑往往是小的，諸如co32-、so42-、hpo42-、鎂(2+)、鋰(1+)、鋅(2+)和鋁(+3)。如本文使用的，“無揮發(fā)物”方法是不使用揮發(fā)性分子諸如醇，并且更具體地，乙醇的方法。
如本文使用的，術語“樣品”指包含至少一種核酸的任何分子混合物，諸如所有種類的組織、培養(yǎng)的細胞、體液、全血、血清、血漿、尿液、糞便、微生物、病毒、寄生蟲、植物以及在酶反應之后包含核酸的混合物。組織的實例包括來自無脊椎動物諸如昆蟲和軟體動物的組織、來自脊椎動物諸如魚、兩棲動物、爬行動物、鳥類和哺乳動物諸如人、大鼠、狗、貓和小鼠的組織。培養(yǎng)的細胞可以來自原核生物諸如細菌、藍綠藻、放線菌和支原體，以及來自真核生物諸如植物、動物、真菌和原生動物。血液樣品包括直接從生物體采集的血液，或已經以一些方式被過濾以去除一些元素諸如紅細胞的血液、和/或血清或血漿。在一些實施方案中，樣品是血漿。在其他實施方案中，血漿來自人。
在一些實施方案中，本公開的方法檢測從約0.5pg/ml至約10pg/ml的生物學上相關的血液病毒rna濃度，其對應于例如1×105至1×106hcvrna拷貝/ml。在其它實施方案中，樣品中至少一種核酸的濃度為從約0.05pg/ml至約1000pg/ml。又在其它實施方案中，樣品中至少一種核酸的濃度為從約0.5pg/ml至約10pg/ml。
如本文所用的，“核酸”或“多核苷酸”指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“rna分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、或脫氧胞苷；“dna分子”)的呈單鏈形式或雙鏈螺旋的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯和硫酯。雙鏈dna-dna、dna-rna和rna-rna螺旋是可能的。術語核酸分子，并且特別是dna或rna分子，僅指該分子的一級結構和二級結構，并且不將其限于任何特定的三級形式。因此，此術語包括特別是以線性dna分子或環(huán)狀dna分子存在的雙鏈dna(例如，限制性片段)、質粒和染色體。在討論特定的雙鏈dna分子的結構時，序列可根據僅給出沿著dna的非轉錄鏈(即，具有與mrna同源的序列的鏈)的5'至3'方向的序列的一般慣例在本文被描述?！爸亟Mdna分子”是已經歷分子生物學操作的dna分子。rna分子的非限制性實例包括mrna、trna、rrna、tmrna、mirna、sirna、snrna和dsrna。在一些實施方案中，至少一種核酸選自由rna和dna組成的組。在其它實施方案中，至少一種核酸選自由病毒的、細菌的和寄生蟲的核酸組成的組。病毒核酸的非限制性實例包括人免疫缺陷病毒(hiv)rna、人乳頭瘤病毒(hpv)dna和丙型肝炎病毒(hcv)rna。寄生蟲核酸的非限制性實例是瘧疾dna。在特定實施方案中，至少一種核酸選自由病毒核酸、細菌核酸和寄生蟲核酸組成的組。在特定實施方案中，至少一種核酸選自由rna和dna組成的組。
又在其它實施方案中，核酸是rna并且該rna是丙型肝炎病毒(hcv)rna。
如本文使用的，術語“純化的”、“分離的”和“提取的”可互換使用。本文中使用“純化的核酸”來描述已經與包括但不限于蛋白質、脂質和碳水化合物的其它化合物分離的核酸。當樣品的至少約50％，優(yōu)選地60％至75％展現出單一的多核苷酸序列和構象(線性的相對于共價閉合的)時，多核苷酸是基本上純的。基本上純的多核苷酸通常占核酸樣品的約50％，優(yōu)選地60％至90％重量/重量，更通常約95％，并且優(yōu)選地是超過約99％純。多核苷酸純度或同質性通過本領域熟知的許多方法來指示，所述方法諸如樣品的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后在染色凝膠之后看到單一的多核苷酸條帶。為了某些目的，可以通過使用高效液相色譜(hplc)或本領域公知的其他手段提供更高的分辨率。
在一些實施方案中，在其中期望檢測少量核酸的方法中，核酸的百分比純度可能不如百分比回收率重要。如本文使用的，術語“百分比回收率”指與樣品中發(fā)現的初始量相比，在從固體支持物洗脫核酸后在洗脫緩沖液中發(fā)現的核酸的量。本公開的方法允許至少約50％，優(yōu)選地大于約60％的百分比回收率。在一些實施方案中，百分比回收率大于約70％。在一些實施方案中，百分比回收率大于約80％。在一些實施方案中，百分比回收率大于約85％。在一些實施方案中，百分比回收率大于約90％。在其它實施方案中，在執(zhí)行本公開的方法后，至少一種核酸的百分比回收率為約60％或更高。
在一些實施方案中，本公開的方法提供了包含硅質或聚合物骨架的官能化固相，用于在核酸的純化中使用。如本文使用的，術語“固相”包括剛性固體和柔性固體。固體基材的非限制性實例包括凝膠、纖維、微球、球體、立方體、其他形狀的顆粒、通道、微通道、毛細管、容器壁、膜和過濾器、珠、柱、樹脂、漿液、膜或盤或適用于本公開的方法的任何通常為固體的支持物材料。使用固相的優(yōu)點在于它允許充分洗滌以去除不需要的分子。使用固相的另一個優(yōu)點是它能夠具有磁性以吸引核酸。使用固相的又另一個優(yōu)點是它可以用部分或分子進行官能化以形成“官能化固相”。在特定實施方案中，這些官能化部分可以被用于結合核酸分子。
在一些實施方案中，包含硅質或聚合物骨架的官能化固相具有磁性性質。在其它實施方案中，官能化固相包含硅質。硅質的非限制性實例包括sio2、無定形氧化硅、玻璃、多孔硅質、微機械化的硅(micromachinedsilicon)、烷基硅質(alkylsilica)、硅酸鋁、硅烷化材料和氧化硅烷化材料。又在其它實施方案中，包含硅質或聚合物骨架的官能化固相包括硅質珠和/或柱。在另外的實施方案中，官能化固相包含選自由-cooh、-nh3、-oh和咪唑組成的組的至少一種官能團。在實施方案中，官能化固相包含用-cooh基團官能化的磁珠。
在一些實施方案中，本公開的方法包括提供包含核酸的樣品、將核酸加入到包含硅質或聚合物骨架的官能化固相、和允許核酸在結合緩沖液的存在下與包含硅質或聚合物骨架的官能化固相結合。本公開的緩沖體系不使用離液鹽和揮發(fā)性化學品，而是使用高濃度的親液分子來驅動核酸結合。如本文使用的，術語“結合”指兩種或更多種化合物，諸如核酸和固相，以非共價關系彼此締合。在其它實施方案中，親液分子選自由硫酸銨((nh4)2so4)、氯化鈉(nacl)、co3-2、hpo4-2、葡萄糖、海藻糖、多元醇和脯氨酸組成的組。又在其它實施方案中，在結合緩沖液的存在下，核酸與包含硅質或聚合物骨架的官能化固相的結合在室溫下進行約5至約10分鐘。如本文使用的，術語“室溫”是指人們通常習慣的典型或優(yōu)選的室內(氣候控制的)溫度，諸如20℃和24℃(68℉和75℉)之間的范圍。
如本文使用的，“高濃度的親液分子”指結合緩沖液中的親液分子的濃度等于或大于約0.3m。例如，所述濃度可以等于或大于0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m或1.9m。在一些實施方案中，結合緩沖液包含約0.3m至約2.0m親液分子。在其它實施方案中，結合緩沖液包含約0.3m至約2.0m硫酸銨。在一些實施方案中，結合緩沖液包含多于一種類型的親液分子的混合物，諸如例如硫酸銨和氯化鈉的組合。
在一些實施方案中，允許核酸在結合緩沖液的存在下與官能化固相結合后，去除結合緩沖液。從樣品去除緩沖液的方法是本領域熟知的，諸如離心樣品或向樣品施加正空氣壓力和/或真空，并因此在本文中將不再詳細描述。
在一些實施方案中，在去除結合緩沖液后，用低離子強度洗滌緩沖液洗滌與包含硅質或聚合物骨架的官能化固相結合的核酸至少一次。在其他實施方案中，低離子強度洗滌緩沖液包含10mmtris、10mmmes等。又在其他實施方案中，低離子強度洗滌緩沖液包含非離子除垢劑諸如np-40、吐溫-20、吐溫-80、brijtm(thermofisherscientific,rockford,il)、igepal等。
因此，在一些實施方案中，洗滌緩沖液是低離子強度緩沖液。在其他實施發(fā)難中，洗滌緩沖液包含非離子除垢劑。又在其他實施方案中，具有升高ph的洗滌緩沖液被用于去除污染物。在另外的實施方案中，洗滌在室溫下進行約1至約10分鐘。洗滌方法是本領域熟知的并且可以使用任何合適的洗滌方案。又在另外的實施方案中，結合緩沖液和/或洗滌緩沖液還包含蛋白酶k以去除樣品中的蛋白，特別是如果樣品包含血漿的話。
洗滌步驟后，用低離子強度洗脫緩沖液從包含硅質或聚合物骨架的官能化固相洗脫核酸。低離子強度洗脫緩沖液的非限制性實例包括10mmtris、10mmgly-gly、10mmn-二甘氨酸和10mmbis-tris丙烷。在一些實施方案中，洗脫緩沖液的ph為約8或更高。在其它實施方案中，洗脫緩沖液包含ph從約8至約9的10mmtris。又在其它實施方案中，洗脫在約80℃進行約5至約10分鐘。在另外的實施方案中，純化的核酸可以被用于擴增測定而不受來自污染物質的干擾。
如本文使用的，在一些實施方案中，術語“低離子強度緩沖液”指具有約10mm或低于10mm的離子強度的緩沖液。在其它實施方案中，低離子強度緩沖液具有從約5mm至約10mm的離子強度。又在其它實施方案中，低離子強度緩沖液具有從約1mm至約10mm的離子強度。低離子強度緩沖液是本領域熟知的，因此，在本文中將不再更詳細地描述可以在本公開的主題中用于洗滌或洗脫的其他低離子強度緩沖液。
本公開的主題特別適用于護理即時測試。本公開的方法易于使用、便攜并且不使用有毒的或揮發(fā)性緩沖體系。因此，在一些實施方案中，本方法用于護理即時測試。
ii.用于純化核酸的試劑盒
本公開的主題還提供了用于執(zhí)行本公開的方法的試劑盒。在一些實施方案中，本公開的主題提供了試劑盒，所述試劑盒包括包含硅質或聚合物骨架的至少一種官能化固相和用于使用包含硅質或聚合物骨架的至少一種官能化固相來純化核酸的一組說明書。本公開的試劑盒的可選要素包括合適的緩沖液、試劑、包裝材料等。緩沖液或試劑的實例包括無菌水、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液。試劑盒的試劑可以在容器中，在所述容器中呈凍干形式或作為穩(wěn)定的液體的試劑是穩(wěn)定的。試劑盒可以以預先測量的量供應試劑，以簡化本公開的方法。
iii.定義
盡管本文中采用了特定術語，但它們僅用于一般的和描述性的意義，而非用于限制的目的。除非另有定義，本文使用的所有技術術語和科學術語具有與由本發(fā)明描述的主題所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。
遵循長期存在的專利法公約，術語“a(一)”、“an(一)”、和“the(該)”當用于本申請(包括權利要求書)時指的是“一個或更多個”。因此，例如，提及“受試者(asubject)”包括多個受試者，除非上下文清楚地是意思相反的(例如，多個受試者)等等。
貫穿該說明書和權利要求書，術語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”被用于在非排他性含義，除非當上下文另有要求時。同樣地，術語“包括(include)”和其語法變體旨在非限制，使得列表中項目的列舉不排除可被取代或添加至所列項目的其他類似的項目。
為了該說明書以及所附的權利要求書的目的，除非另有說明，在說明書和權利要求書中使用的表示量、尺寸、維度、比例、形狀、配方、參數、百分比、數量、特征、及其他數值的所有數字在所有情況下要理解為由術語“約”修飾，即使術語“約”可能未明確地與該值、量或范圍一起出現。因此，除非相反地指示，在以下說明書和所附的權利要求書中列出的數值參數不是且不需要是精確的，但是如所期望的可以是接近的和/或更大或更小，反映了公差、轉換因子、四舍五入、測量誤差等，以及本領域技術人員已知的其他因素，取決于本公開的主題尋求獲得的期望特性。例如，當術語“約”指值時能夠用意在于包括與特定的量在一些實施方案中±100％、在一些實施方案中±50％、在一些實施方案中±20％、在一些實施方案中±10％、在一些實施方案中±5％、在一些實施方案中±1％、在一些實施方案中±0.5％、以及在一些實施方案中±0.1％的差異，因為此類差異對于進行所公開的方法或采用所公開的組合物是適當的。
此外，當與一個或更多個數值或數值范圍關聯(lián)使用時，術語“約”應理解為指所有此類數值，包括范圍內的所有數值以及通過將邊界延伸至高于和低于所列出的數值修改該范圍。通過端點引述的數值范圍包括歸入該范圍內的所有數值例如全部的整數，包括其分數(例如，1至5的引述包括1、2、3、4和5，以及其分數，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及在該范圍內的任何范圍。
實施例
以下實施例已被包括以提供本領域普通技術人員用于實踐本公開的主題的代表性實施方案的指導。根據本公開內容和本領域技術人員的一般水平，本領域技術人員可以理解，以下實施例預期僅是示例性的，且可采用許多變化、修改和改變而不偏離本公開的主題的范圍。以下合成的描述和具體實施例僅預期用于說明的目的，并且不被解釋為以任何方式限制通過其他方法制備本公開內容的化合物。
實施例1
方法
將380μl結合緩沖液(含有從約0.3m至約2.0m硫酸銨和0.5％-1％np-40的100-200mm乙酸鈉，ph4)加入到100μlrna溶液中，得到終濃度1pg/ml或10pg/ml的rna。在室溫下，將此溶液與用-cooh基團官能化的磁珠溫育5至10分鐘。然后去除結合緩沖液，并在室溫下將固相與洗滌緩沖液(10mmtrisph6.5-7，0-1％np-40)溫育1至10分鐘。去除洗滌緩沖液，并通過在80℃、在50μl至100μl的洗脫緩沖液(10mmtrisph8-9)中溫育5-10分鐘從固相中洗脫rna。
實施例2
結果
圖1表明來自緩沖液的hcvrna純化效率(％回收率)。1pg/ml和10pg/mlrna濃度的平均％回收率(±標準偏差)分別為60％(±20)和62％(±15)。1pghcvrna/ml＝1×102cphcvrna/l且10pghcvrna/ml＝1×103cphcvrna/l。這些回收率與使用其他方法報告的回收率相似，并允許在廣譜生物體液中檢測na。
參考文獻
在說明書中提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻表示本公開的主題所屬領域的技術人員的水平。所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻在此通過引用并入，其程度如同每個單獨出版物、專利申請、專利和其他參考文獻被具體和單獨指明通過引用并入的相同程度。將理解，盡管一些專利申請、專利和其他參考文獻在本文中被提及，此類參考文獻并不構成對任何這些文件形成本領域公知常識的部分的承認。
boomr,solcj,salimansmm,jansencl,wertheim-vandillenpm,vandernoordaaj.rapidandsimplemethodforpurificationofnucleicacids.jclinmicrobiol1990,28(3):495-503.
hourfarmk,michelsenu,schmidtm,etal.high-throughputpurificationofviralrnabasedonnovelaqueouschemistryfornucleicacidisolation.clinchem2005,51:1217-1222.
雖然為了清楚理解的目的通過說明和實例相當詳細地描述了前述主題，但是本領域技術人員將理解，在所附權利要求的范圍內可以進行某些改變和修改。