本發(fā)明涉及生物材料領(lǐng)域，具體地涉及一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多肽分子作為介于有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)之間的一類特殊的生物大分子，具有較好的生物相容性，同時又可以模擬體內(nèi)一些蛋白質(zhì)的生物功能，因此常被用于設(shè)計(jì)成分子探針研究細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，或者被設(shè)計(jì)成藥物分子，參與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到疾病的診斷和治療的目的。然而，進(jìn)細(xì)胞效率低成為限制其應(yīng)用的主要瓶頸。

早在20世紀(jì)就有研究人員發(fā)現(xiàn)許多病毒(如hiv-1、hcv等等)在進(jìn)入細(xì)胞的過程中會與細(xì)胞膜發(fā)生巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，并且這一交換反應(yīng)對介導(dǎo)其進(jìn)細(xì)胞發(fā)揮著十分重要的作用。受此啟發(fā)，一種利用細(xì)胞膜巰基-二硫鍵交換反應(yīng)來提高外源性材料的進(jìn)細(xì)胞效率的方法應(yīng)運(yùn)而生。例如：torres,a.g.等在2011年報道了利用細(xì)胞膜二硫鍵交換反應(yīng)提高寡聚核苷酸類似物的進(jìn)細(xì)胞效率方法。stefanmatile等則合成了有高進(jìn)細(xì)胞效率的聚二硫鍵高分子化合物(cpds)，其依據(jù)的原理也是細(xì)胞膜二硫鍵交換反應(yīng)。sandrinesagan等則將細(xì)胞膜巰基-二硫鍵交換反應(yīng)介導(dǎo)的跨膜遞送應(yīng)用到多肽分子體系，通過在細(xì)胞穿透肽(cpps)上引入巰基或者二硫鍵進(jìn)一步提高了細(xì)胞穿透肽的進(jìn)細(xì)胞效率。

然而，目前發(fā)展的利用細(xì)胞膜巰基-二硫鍵交換反應(yīng)即僅依靠多肽分子與細(xì)胞膜間形成單二硫鍵的方式對多肽分子進(jìn)細(xì)胞效率的提高程度是十分有限的。這主要是因?yàn)榧?xì)胞膜及其外圍因存在著不少含巰基化合物，如谷胱甘肽(gsh)、半胱氨酸(cys)等，會使得在細(xì)胞膜表面及其外圍發(fā)生的巰基-二硫鍵交換反應(yīng)更加的復(fù)雜。很多多肽分子在到達(dá)細(xì)胞膜之前可能就已經(jīng)發(fā)生了二硫鍵交換反應(yīng)，甚至一些多肽分子即使與細(xì)胞膜間形成了二硫鍵，也同樣會因再次發(fā)生交換反應(yīng)而從細(xì)胞膜脫離。這些因素都使得細(xì)胞膜巰基-二硫鍵交換反應(yīng)對進(jìn)細(xì)胞效率的介導(dǎo)效應(yīng)大打折扣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法及應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法，其包括如下步驟：

在化合物或材料上修飾含有cxc的氨基酸序列，其中，c代表半胱氨酸，x代表除半胱氨酸外的任意天然氨基酸或非天然氨基酸。

以及，本發(fā)明提供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法在藥物或藥物制備中的應(yīng)用。

本發(fā)明提還供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法在藥物載體或藥物載體制備中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法在生物探針或生物探針制備中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法，利用特殊氨基酸序列cxc，在細(xì)胞膜表面形成穩(wěn)定性更高的雙二硫鍵，從而有效地抵抗了細(xì)胞外圍谷胱甘肽等巰基分子的進(jìn)攻，避免了多肽分子再次發(fā)生交換反應(yīng)而從細(xì)胞膜脫離的過程，使得基于細(xì)胞膜二硫鍵交換反應(yīng)介導(dǎo)的進(jìn)細(xì)胞效率有了很大程度的提高，從而克服傳統(tǒng)的通過在細(xì)胞膜表面形成單二硫鍵來提高多肽分子的進(jìn)細(xì)胞效率所存在的缺陷。當(dāng)多肽片段為c(x)n時，也就是只含有一個半胱氨酸，就是傳統(tǒng)的依靠與細(xì)胞膜間形成單二硫鍵的方式來提高進(jìn)細(xì)胞效率，這種單二硫鍵不夠穩(wěn)定，形成后還會可能再次被細(xì)胞外圍的谷胱甘肽含巰基分子進(jìn)攻，從而脫離細(xì)胞膜，所以其介導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞的效率較低；當(dāng)n＝0，即為cc結(jié)構(gòu)時，兩個巰基因?yàn)榫嚯x比較近，而非常容易在分子內(nèi)形成二硫鍵，從而自身形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)；當(dāng)n≥2時，此時，兩個巰基間因間隔較多的氨基酸而變得柔性，也非常容易在分子內(nèi)形成二硫鍵，從而自身形成內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，這種內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)一旦形成，就使得多肽分子從細(xì)胞膜脫落，巰基-二硫鍵交換反應(yīng)就失去了介導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞的效應(yīng)。而當(dāng)n＝1，即為cxc結(jié)構(gòu)時，兩個巰基間間隔一個氨基酸，此時空間位阻恰好比較大，導(dǎo)致較難在分子內(nèi)形成二硫鍵，在細(xì)胞外排的谷胱甘肽的介導(dǎo)下，cxc結(jié)構(gòu)單元會與含雙巰基(或二硫鍵)的膜蛋白以及谷胱甘肽分子形成較穩(wěn)定的混合型二硫鍵，并最終能以雙二硫鍵的方式連接到膜蛋白上，并且其巰基還原態(tài)也具有同樣的效果。該多肽可以大大提高其修飾物(如化合物和材料)進(jìn)細(xì)胞的效率，操作上非常簡單、易于實(shí)現(xiàn)，而且對進(jìn)細(xì)胞效率的提高效果十分顯著，在藥物和探針等諸多領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是cxc具有較高介導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞效率的機(jī)理圖。

圖2是不同氨基酸序列進(jìn)入細(xì)胞的效率。

圖3是不同氨基酸序列多肽或蛋白質(zhì)分子的進(jìn)細(xì)胞效率評價。

圖4是不同種屬和種類的細(xì)胞“cxc”基序的進(jìn)細(xì)胞效率進(jìn)行的考察情況。

圖5是基于cgc和crc序列的多肽分子探針fam-gcgcgrkkrrqrrr和fam-gcrcgrkkrrqrrr進(jìn)細(xì)胞效率的考察。

圖6是fam-gcggge和fam-gcgcge多肽進(jìn)hela細(xì)胞的效率。

圖7是fam-gsgggltfrrywarlrs和fam-gcgggltfrrywarlrs多肽進(jìn)mcf-7細(xì)胞的效率。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法，其包括如下步驟：

在化合物或材料上修飾含有cxc的氨基酸序列，其中，c代表半胱氨酸，x為除半胱氨酸外的任意天然氨基酸或非天然氨基酸。

具體地，x可以為甘氨酸gly、丙氨酸ala、纈氨酸val、亮氨酸leu、異亮氨酸ile、脯氨酸pro、苯丙氨酸phe、酪氨酸t(yī)yr、色氨酸t(yī)rp、絲氨酸ser、蘇氨酸t(yī)hr、蛋氨酸met、天冬酰胺asn、谷氨酰胺gln、天冬氨酸asp、谷氨酸glu、賴氨酸lys、精氨酸arg、組氨酸his等中的任意一種，或者是非天然氨基酸，即具有不同于上述天然氨基酸側(cè)鏈的其它類型氨基酸，如d型氨基酸、丁氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸等?；趲€基形成二硫鍵的動力學(xué)過程會受到位阻效應(yīng)的影響，通過調(diào)節(jié)多肽片段c(x)nc(n＝0,1,2…)中兩個半胱氨酸的位置和數(shù)目的方式，改變兩個巰基間的空間位阻，可以操縱巰基形成二硫鍵的方向。采用“遍歷”的方法進(jìn)行篩選，最終得到可以與細(xì)胞膜上的某些雙巰基蛋白形成雙二硫鍵的特殊結(jié)構(gòu)單元。在cxc結(jié)構(gòu)中，兩個巰基間間隔一個氨基酸，此時空間位阻恰好比較大，導(dǎo)致較難在分子內(nèi)形成二硫鍵，在細(xì)胞外排的谷胱甘肽的介導(dǎo)下，cxc結(jié)構(gòu)單元會與含雙巰基(或二硫鍵)的膜蛋白以及谷胱甘肽分子形成較穩(wěn)定的混合型二硫鍵，并最終能以雙二硫鍵的方式連接到膜蛋白上。如圖1所示，cxc因其特殊的空間位阻性質(zhì)，在與谷胱甘肽等巰基化合物反應(yīng)時可以以四種形式存在，分別是還原態(tài)的雙巰基，氧化態(tài)的內(nèi)環(huán)形式，單谷胱甘肽結(jié)合物和雙谷胱甘肽結(jié)合物。而cc或cxxc則僅能以還原態(tài)雙巰基和氧化態(tài)內(nèi)環(huán)這兩種形式存在。所以在細(xì)胞膜外排的谷胱甘肽的參與下，與細(xì)胞膜發(fā)生巰基-二硫鍵交換反應(yīng)時，cxc與含巰基膜蛋白能形成如上圖所示的三種較穩(wěn)定中間體，并最終形成穩(wěn)定的雙二硫鍵，從而大幅度提高進(jìn)細(xì)胞效率。

優(yōu)選地，所述x為甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、丙氨酸、絲氨酸等。

具體地，所述cxc多肽的固相合成方法為：

(1)按照事先計(jì)算好的比例配制氨基酸溶液和合成用樹脂；

(2)將配好的氨基酸溶液裝入多肽合成儀；

(3)運(yùn)行多肽合成程序，進(jìn)行多肽合成；

(4)切割樹脂和多肽，色譜純化，質(zhì)譜表征，獲得cxc多肽。

對于多肽固相合成技術(shù)以及化學(xué)修飾技術(shù)，目前都已經(jīng)比較成熟，在此不再詳述。要是想得到較穩(wěn)定的氧化態(tài)內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)形式，后續(xù)再通過在體積比為10：1的dmso與10mmpb的混合溶劑中進(jìn)行低濃度氧化24h，再經(jīng)過色譜純化，即可以得到有較高進(jìn)細(xì)胞效率的含“cxc”cyclic的多肽分子。

所述在化合物或材料上修飾含有cxc氨基酸序列，對于多肽分子，可以在多肽固相合成的過程中直接將“cxc”作為多肽序列的一部分一起合成，從而直接得到含“cxc”基序的多肽分子，對于其他化合物或者材料，可以通過共價鍵、靜電作用、氫鍵等方式修飾。優(yōu)選地，通過共價鍵修飾，例如：運(yùn)用多肽固相合成技術(shù)合成gcxcg的多肽序列，就可以獲得c端酰胺化，n端有活性氨基的cxc基序；再通過縮合反應(yīng)，將cxc基序連到含有活性羧基的化合物或材料上，以此提高化合物或材料的進(jìn)細(xì)胞效率。當(dāng)然也可以根據(jù)化合物或材料的性質(zhì)，選擇合適的中間連接鍵進(jìn)行轉(zhuǎn)換，實(shí)現(xiàn)將cxc基序連到化合物或材料上的目的。具體地，所述化合物或材料可以為多肽化合物、蛋白、聚合物、微納米材料中的任意一種。對于多肽化合物，可以在多肽合成的過程中，直接將cxc作為多肽序列的一部分與原有的多肽序列一起合成。

更優(yōu)選地，所述在化合物或材料上修飾含有cxc的氨基酸序列，還包括通過修飾將化合物或材料帶正電的步驟。正電荷能夠介導(dǎo)cxc靠近細(xì)胞膜，使之與細(xì)胞膜發(fā)生巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞的效率。

通過設(shè)計(jì)五個不同氨基酸序列含正電荷的多肽分子來驗(yàn)證基于cxc序列的有效性。s-tat(fam-gsgggrkkrrqrrr-nh2)、c-tat(fam-gcgggrkkrrqrrr-nh2)、cc-tat(fam-gccggrkkrrqrrr-nh2)、cgc-tat(fam-gcgcgrkkrrqrrr-nh2)和cggc-tat(fam-gcggcgrkkrrqrrr-nh2)。s-tat是不含任何巰基或二硫鍵的多肽分子用來作為對照，c-tat是用dtdp活化的二硫鍵，即為傳統(tǒng)的單二硫鍵；cc-tat、cgc-tat和cggc-tat分別是含cc、cgc、cggc基序的多肽。多肽分子的濃度均為1μm，孵育hela細(xì)胞時間均為4h，通過流式細(xì)胞儀考查的其分別進(jìn)細(xì)胞效率，包括了其氧化態(tài)的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)形式和還原態(tài)的巰基形式，從圖2中可以看出，上述五個多肽中進(jìn)入細(xì)胞最多的是cgc-tat，證明了該序列對于提高多肽進(jìn)入細(xì)胞效率的具有重要的意義。

通過設(shè)計(jì)如下六個不同氨基酸序列多肽或蛋白質(zhì)分子fam-gsgggrrr、fam-gcgggrrr、fam-gcgcgrrr、fam-gsgggpsqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry、fam-gcgggpsqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry、fam-gcgcgpsqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry來驗(yàn)證cxc對提高不同的多肽以及蛋白質(zhì)分子進(jìn)細(xì)胞效率的普適性。從圖3中可以看出，無論是對于多肽還是蛋白質(zhì)，cxc都可以提高其進(jìn)入細(xì)胞的效率。

利用不同種屬和種類的細(xì)胞系驗(yàn)證該提高多肽進(jìn)細(xì)胞效率的方法在不同細(xì)胞系中具有普適性，其中細(xì)胞系包括人源、鼠源和正常組織細(xì)胞。多肽序列為fam-gcgcgrkkrrqrrr。從圖4可以看出，本發(fā)明提高進(jìn)細(xì)胞效率的多肽對細(xì)胞沒有選擇性，可以提高多肽進(jìn)入任何細(xì)胞的效率。

采用激光共聚焦顯微鏡對其進(jìn)細(xì)胞途徑和過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)cxc基序介導(dǎo)的進(jìn)細(xì)胞效率的提高是通過一種新的內(nèi)吞途徑實(shí)現(xiàn)。含cgc的多肽fam-gcgcgrkkrrqrrr在1h時多肽分子基本上連在了細(xì)胞膜的表面，即是fam-gcgcgrkkrrqrrr中的“cgc”結(jié)構(gòu)單元與細(xì)胞膜形成雙二硫鍵的過程。孵育4h后進(jìn)行的拍攝，可以看到多肽分子多數(shù)已經(jīng)進(jìn)入到了細(xì)胞內(nèi)。

進(jìn)一步，在相同情況下，我們另外設(shè)計(jì)了兩條分別含有cgc和crc序列的多肽分子探針fam-gcgcgrkkrrqrrr和fam-gcrcgrkkrrqrrr進(jìn)行進(jìn)入細(xì)胞效率的驗(yàn)證。如圖5所示，同樣在hela細(xì)胞上，1μm的fam-gcgcgrkkrrqrrr和fam-gcrcgrkkrrqrrr孵育4h后具有相同的進(jìn)細(xì)胞效率，這說明改變x的種類，對多肽進(jìn)入細(xì)胞的效率沒有明顯影響。對于x為甘氨酸gly、丙氨酸ala、纈氨酸val、亮氨酸leu、異亮氨酸ile、脯氨酸pro、苯丙氨酸phe、酪氨酸t(yī)yr、色氨酸t(yī)rp、絲氨酸ser、蘇氨酸t(yī)hr、蛋氨酸met、天冬酰胺asn、谷氨酰胺gln、天冬氨酸asp、谷氨酸glu、賴氨酸lys、精氨酸arg、組氨酸his均可以提高多肽進(jìn)細(xì)胞的效率。

而通過改變多肽分子所帶的電荷，設(shè)計(jì)了fam-gcggge和fam-gcgcge兩種多肽分子探針來探索cxc發(fā)揮作用的過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如圖6所示，cgc在效果上有少許提高。這表明了帶正電荷的多肽分子僅僅起到的介導(dǎo)cxc靠近細(xì)胞膜，使之能與細(xì)胞膜發(fā)生巰基-二硫鍵交換反應(yīng)的作用，也再次說明了cxc序列可以提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞的效率。

以及，本發(fā)明提供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法在藥物中的應(yīng)用。

p53蛋白是細(xì)胞的基因組衛(wèi)士，起著修復(fù)dna，阻止細(xì)胞癌變的作用。但當(dāng)細(xì)胞過量表達(dá)mdm2或mdmx蛋白時，就會大量結(jié)合p53蛋白，使dna的復(fù)制失去控制，細(xì)胞癌變。ltfrrywarlrs是一條與mdm2或mdmx有較強(qiáng)親和能力的活性多肽，其通過可以結(jié)合mdm2或mdmx蛋白，釋放出p53，達(dá)到抑癌作用，但進(jìn)細(xì)胞效率低成為限制其應(yīng)用的主要瓶頸。以該活性多肽為例，將cgc序列插入到活性多肽ltfrrywarlrs的一端，設(shè)計(jì)出fam-gcgcgltfrrywarlrs的多肽分子。另外作為對照，設(shè)計(jì)了fam-gsgggltfrrywarlrs和fam-gcgggltfrrywarlrs這兩條多肽，分別考查了它們的進(jìn)mcf-7細(xì)胞(一種p53野生型，mdm2過表達(dá)的癌細(xì)胞)效率?；钚远嚯姆肿拥男蛄袨閘tfrrywarlrs的n端修飾fam熒光染料，用流式細(xì)胞儀分析它們的進(jìn)細(xì)胞效率。如圖7所示，縱坐標(biāo)是以sgg在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值作為單位“1”做的歸一化處理，可以看到，連有cgc多肽序列活性肽的進(jìn)細(xì)胞效率較連上sgg的提高了60多倍，較連上cgg的提高了十幾倍。

本發(fā)明提還供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法在藥物載體中的應(yīng)用。

所述藥物載體包括多肽、蛋白質(zhì)、聚合物、納米二氧化硅、量子點(diǎn)、磁性納米顆粒中的至少一種。例如利用gcgcg的氨基修飾魚精蛋白，作為基因載體，提高載體和基因進(jìn)入細(xì)胞的效率，提升治療效果。

本發(fā)明還提供一種提高化合物或材料進(jìn)細(xì)胞效率的方法在生物探針領(lǐng)域中的應(yīng)用。

利用gcgcg的氨基與帶有谷胱甘肽修飾的納米金簇反應(yīng)，制備得到gcgcg-納米金簇?zé)晒馓结?，與hela細(xì)胞共同孵育，通過激光共聚焦和流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)的熒光進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)修飾gcgcg的納米金簇納米金簇與谷胱甘肽修飾的納米金簇相比，進(jìn)入細(xì)胞的效率大大提高。

進(jìn)一步，具體的所述生物探針領(lǐng)域中的應(yīng)用包括納米熒光探針、磁成像探針、光聲成像探針等。

實(shí)施例1：

hela細(xì)胞與1μm的多肽分子探針在含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中與細(xì)胞孵育4h后，用流式細(xì)胞儀分析各探針分子的進(jìn)細(xì)胞效率。其中，多肽分子探針的序列如圖2中所示，即在細(xì)胞穿透肽tat：rkkrrqrrr的一端引入不同的含巰基多肽單元，并在n端修飾fam熒光染料。圖中黑色柱表示多肽以分子內(nèi)形成二硫鍵的氧化態(tài)內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)形式存在(其中cgg是通過硫吡啶活化的二硫鍵)，白色柱表示多肽以自由的雙巰基(或巰基)形式存在。圖中縱坐標(biāo)是以sgg在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值作為單位“1”做的歸一化處理。可以看到，無論是連上cgc氧化態(tài)的內(nèi)環(huán)形式，還是還原態(tài)的雙巰基形式，均能明顯提高多肽分子的進(jìn)細(xì)胞效率。

實(shí)施例2：

hela細(xì)胞與1μm帶有正電荷的多肽分子rrr和蛋白質(zhì)分子psqptypgddapvrdlirfyrdlrrylnvvtrhry的一端引入不同的含巰基多肽單元，并在n端修飾fam熒光染料。用流式細(xì)胞儀分析各多肽(圖中黑色柱)或蛋白質(zhì)(圖中白色柱)分子的進(jìn)細(xì)胞效率，圖3中縱坐標(biāo)是以sgg在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值作為單位“1”做的歸一化處理?？梢钥吹剑鄬τ趕gg，連上cgg后，多肽或蛋白質(zhì)分子的進(jìn)細(xì)胞效率有所提高，連上cgc后，多肽或蛋白質(zhì)分子的進(jìn)細(xì)胞效率均明顯提高。說明cgc多肽單元能夠提高任意一種多肽或蛋白質(zhì)等生物材料分子的進(jìn)細(xì)胞效率。

實(shí)施例3：

將不同種類的細(xì)胞與1μm的多肽在含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中與細(xì)胞孵育4h后，用流式細(xì)胞儀分析各探針分子的進(jìn)細(xì)胞效率。包括：hela細(xì)胞(人源的，宮頸癌細(xì)胞，圖中橫線填充柱)，mcf7細(xì)胞(人源的，乳腺癌細(xì)胞，圖中白色填充柱)，cho細(xì)胞(鼠源的，中國倉鼠卵巢細(xì)胞，圖中斜線填充柱)，raw264.7細(xì)胞(鼠源的，大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，圖中網(wǎng)格線填充柱)，其中，多肽分子探針的序列如圖4中所示，即在細(xì)胞穿透肽tat：rkkrrqrrr的一端引入不同的含巰基多肽單元，并在n端修飾fam熒光染料。圖4中縱坐標(biāo)是以sgg在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值作為單位“1”做的歸一化處理?？梢钥吹皆诓煌N類的細(xì)胞系中連有cgc多肽單元的探針分子均具有更高的進(jìn)細(xì)胞效率，驗(yàn)證了cgc多肽單元介導(dǎo)的進(jìn)細(xì)胞效率的提高對不同種類細(xì)胞系的普遍適用性。

實(shí)施例4：

hela細(xì)胞與1μm的多肽在含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中與細(xì)胞孵育4h后，用流式細(xì)胞儀分析各探針分子的進(jìn)細(xì)胞效率。其中，多肽分子探針的序列如圖5中所示，即在細(xì)胞穿透肽tat：rkkrrqrrr的一端引入cgc(電中性)或crc(帶正電荷)多肽單元，并在n端修飾fam熒光染料。圖中黑色柱表示cgc多肽單元介導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞的能力，白色柱表示crc多肽單元介導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞的能力。圖中縱坐標(biāo)是以sgg在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度值作為單位“1”做的歸一化處理?？梢钥吹絚xc多肽單元所帶的電荷并不會影響其介導(dǎo)跨膜遞送的能力。

實(shí)施例5：

hela細(xì)胞與1μm的多肽分子探針在含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中與細(xì)胞分別孵育4h、24h、48h后，用流式細(xì)胞儀分析各探針分子的進(jìn)細(xì)胞效率。其中，多肽分子探針的序列如圖中所示，即在帶負(fù)電荷的氨基酸e的一端引入不同的含巰基多肽單元，并在n端修飾fam熒光染料。可以看到，對于帶有負(fù)電荷的多肽或氨基酸，連上cgc多肽單元相對于cgg的進(jìn)細(xì)胞效率略微有些提高，這是由于cgc是通過在正電荷的介導(dǎo)作用下靠近了細(xì)胞膜并與細(xì)胞膜發(fā)生了巰基-二硫鍵交換反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)提高進(jìn)細(xì)胞效率的機(jī)制。