專利名稱：：用于胞內(nèi)釋放藥理活性化合物的用作陽離子脂質(zhì)的l－肉堿或烷酰基l－肉堿的酯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類新的L-肉堿和?；鵏-肉堿的酯以及它們作為適于幫助藥理活性化合物的胞內(nèi)釋放、促進(jìn)它們的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或促進(jìn)它們與特定細(xì)胞膜位點(diǎn)(受體)的相互作用的陽離子脂質(zhì)的用途。本發(fā)明還涉及作為上述新化合物用于相同目的的L-肉堿和?；鵏-肉堿的其他已知酯。術(shù)語“胞內(nèi)釋放”在本文中的意思是指用天然來源或經(jīng)過修飾賦予了治療活性的多核苷酸或質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(基因釋放)，或者將藥物或免疫原性肽摻入到細(xì)胞中。
背景技術(shù)：
：許多藥理活性物質(zhì)，諸如象多肽和蛋白質(zhì)或藥物一般需要穿透到細(xì)胞中通過以亞細(xì)胞或分子水平影響細(xì)胞功能而發(fā)揮它們的作用。對于這些分子來說，細(xì)胞膜構(gòu)成了選擇性不透屏障。細(xì)胞膜事實(shí)上履行保護(hù)功能，阻止可能的毒性物質(zhì)進(jìn)入，但也阻止了具有治療活性的化合物通過。細(xì)胞膜的復(fù)合組成包括磷脂、糖脂和蛋白質(zhì)；其功能受到細(xì)胞漿組分如Ca++及其他離子、ATP、微絲、微管、酶和、與Ca++鍵合的蛋白質(zhì)的影響。不同的細(xì)胞類型顯示的選擇性和它們之間的選擇性是由于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞漿組分之間的相互作用和對外界信號的反應(yīng)造成的。通過將復(fù)合物中的物質(zhì)與再現(xiàn)天然來源的膜脂質(zhì)組分的脂質(zhì)制劑結(jié)合可以克服細(xì)胞膜的屏障效應(yīng)。這些脂質(zhì)可以與膜融合并釋放與其結(jié)合的物質(zhì)使之進(jìn)入細(xì)胞。這些脂質(zhì)復(fù)合物不僅能通過與膜融合的方式促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移，也能降低細(xì)胞膜與欲穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的分子之間的電荷排斥力。兩性脂質(zhì)，如膜磷脂，在水性系統(tǒng)中形成脂質(zhì)小囊或脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是一種小囊，其中水性體積被一或多層由脂質(zhì)分子-通常為磷脂-組成的膜完全包裹。磷脂有一個(gè)親水的頭和一對碳鏈(疏水性的尾)，它是生物膜的主要組分。在水溶液中，疏水性的尾自動(dòng)排斥水，而此時(shí)親水性頭與介質(zhì)相互作用，自然形成有不同直徑的小囊的群體。脂質(zhì)體一般是兩性離子，中性或陰離子。這些小囊可以作為藥物、小分子、蛋白質(zhì)、核苷酸和質(zhì)粒的載體。近年來，已廣泛使用陽離子脂質(zhì)體向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)，它是一類由合成脂質(zhì)制備的帶正電荷的小囊。DNA的陰性電荷可以與陽離子脂質(zhì)體相互作用，形成穩(wěn)定的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。此技術(shù)的簡單性和通用性使脂質(zhì)體成為一種在人的基因療法中輸送基因的重要的載體?，F(xiàn)在，用于基因療法和NIH重組顧問委員會(huì)(NIHRecombinantAdvisoryCommittee)批準(zhǔn)的多數(shù)載體包括病毒的和合成的系統(tǒng)。病毒感染包括一系列復(fù)雜的機(jī)制以能夠感染特定的細(xì)胞并攜帶DNA進(jìn)入細(xì)胞核?；虔煼ㄊ褂貌《据d體的原理基于用對療效編碼的基因替換病毒基因，而不消除病毒顆粒感染細(xì)胞的能力。病毒療法受到免疫、細(xì)胞病變和基因重組等病毒因素(viralelements)的限制。非常希望在病毒療法中使用陽離子脂質(zhì)。這些載體與生物來源的相比具有非常大的潛力，因?yàn)樗鼈兏踩?、低毒并能夠結(jié)合大體積的基因。然而，與生物載體相比，它們的細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率較低。需牢記的是，這種轉(zhuǎn)染體系的應(yīng)用是在研究的初級階段。陽離子脂質(zhì)在DNA-脂質(zhì)復(fù)合物的形成、細(xì)胞與復(fù)合物的相互作用、與細(xì)胞膜的融合、在細(xì)胞內(nèi)釋放DNA和轉(zhuǎn)錄等過程中起非常重要的作用。脂質(zhì)體的體內(nèi)(in-vivo)應(yīng)用有重要的例子。病毒療法的第一個(gè)臨床試驗(yàn)是通過引入一個(gè)含有人脂質(zhì)體復(fù)合的HLA-B7基因表達(dá)載體用于治療黑素瘤。另一個(gè)重要的應(yīng)用涉及脂質(zhì)體復(fù)合的表達(dá)載體SV40C-FTR通過經(jīng)肺途徑或鼻腔噴霧給藥治療肺泡纖維變性。其他包括在癌癥的基因療法中使用脂質(zhì)體的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)展中。在陽離子脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)中通常鑒別四個(gè)構(gòu)成因素帶正電的陽離子頭，間隔區(qū)，錨狀脂質(zhì)(theanchorlipid)和連接鍵。陽離子頭導(dǎo)致陽離子脂質(zhì)體和DNA之間、DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物和細(xì)胞膜及細(xì)胞的其他組分之間的相互作用。它含有一個(gè)或多個(gè)可以被取代的陽離子基團(tuán)(決定于電荷數(shù)目)。間隔區(qū)是分子中分隔陽離子頭和疏水性尾的部分，并且它確保陽離子頭與DNA磷脂的陰離子電荷之間的最佳的接觸。錨狀脂質(zhì)是分子的非極性烴部分，并決定雙脂質(zhì)層的物理性質(zhì)，如其剛性和與膜脂質(zhì)的交換速率?！暹B接鍵″表示烴鏈和分子的其他部分之間的鍵。此鍵決定了陽離子脂質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性和生物降解能力。近年來脂質(zhì)體在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用穩(wěn)定增長。脂質(zhì)體在此領(lǐng)域的成功是由于皮膚對這些化合物是非常耐受的。它們既作為活性成分的載體，也作為促進(jìn)活性成分吸收的化合物。在制備和使用脂質(zhì)體方面的科技和專利參考文獻(xiàn)是非常豐富的，然而僅有少量的參考文獻(xiàn)記載了肉堿衍生物在基因釋放中的應(yīng)用，對于藥物的傳遞，沒有涉及制備即使極少地相似于本發(fā)明的化合物的已知技術(shù)的文獻(xiàn)可供利用。專利申請EP0279887記載了肉堿載體的應(yīng)用，如磷脂?；鈮A，可選地與其他磷脂和脂質(zhì)(膽固醇、磷脂?；憠A、磷脂酰基絲氨酸)組成混合物，制備脂質(zhì)體。在關(guān)于制備脂質(zhì)體的例子中，與普萘洛爾結(jié)合制備了磷脂?；鈮A脂質(zhì)體，普萘洛爾是一種已知具有抗高血壓、抗心絞痛和抗心律失?；钚缘乃幬铩４颂幨褂萌鈮A衍生物是基于肉堿顯著的心肌向性。此向性使脂質(zhì)體能避免被肝代謝而不能到達(dá)所需的靶部位。磷脂?；鈮A的存在也使脂質(zhì)體能夠口服，因?yàn)樗軐鼓c內(nèi)的脂酶。在《醫(yī)藥化學(xué)雜志》1998，6月18日；41(13)2207-15記載了一些用于基因釋放的L-肉堿的酯，但并未記載或提示它們作為藥物釋放的有用藥劑。WO96/39193記載了新的靶藥物制劑，其目的在于通過肉堿-酰基肉堿移位酶系統(tǒng)進(jìn)入線粒體，但未提示它們是制備脂質(zhì)體的有用藥劑。EP559625B1記載了一些有選擇性的胃腸道肌松弛活性的L-肉堿和酰基L-肉堿的酯。近年來分子生物學(xué)家已鑒定了一些導(dǎo)致人類遺傳疾病的染色體水平的缺損。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要方面涉及用基因療法方案治療由遺傳基因?qū)е碌募膊?。如已提及的，陽離子脂質(zhì)體廣泛用于在細(xì)胞內(nèi)傳遞藥物活性化合物，促進(jìn)跨膜輸送或促進(jìn)其與特定的細(xì)胞膜位點(diǎn)(受體)的相互作用。這些載體與源于生物的載體相比具有非常大的潛力，因?yàn)樗鼈兏踩?、低毒并且也能結(jié)合大體積的基因。然而，與生物載體相比，它們的細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)率較低。此外，由常規(guī)的陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移需要質(zhì)粒DNA和陽離子脂質(zhì)保持分離，恰在基因轉(zhuǎn)移之前使其混合。使多核苷酸復(fù)合物穩(wěn)定的嘗試迄今為止是失敗的，未能產(chǎn)生令人鼓舞的結(jié)果；實(shí)際上，它們僅在短的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。在基因療法或基因釋放和藥物釋放領(lǐng)域，已認(rèn)識到非常需要穩(wěn)定、可再生的位點(diǎn)-特異性系統(tǒng)，它在一個(gè)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間周期后也具有活性。已發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的藥理學(xué)活性化合物在細(xì)胞內(nèi)傳送方面具有強(qiáng)大活性的一類陽離子脂質(zhì)含有新的L-肉堿和?；鵏-肉堿的酯。這些新化合物是穩(wěn)定和高選擇性的，因?yàn)樗鼈冊诘竭_(dá)靶器官時(shí)具有位點(diǎn)特異性。此特性使它們能特別有效地將活性物質(zhì)直接傳遞到活性物質(zhì)可以發(fā)揮其藥理學(xué)活性的部位。
發(fā)明內(nèi)容此處記載的本發(fā)明的化合物是有通式(I)的化合物其中n是1-3的整數(shù)；R是氫或直鏈或分支的、有2-6個(gè)碳原子的烷?；?；R1和R2，可以相同或不同，代表有3-20個(gè)碳原子的飽和或不飽和直鏈?；?；并且X-是藥學(xué)可接受的酸的陰離子。R的例子是乙?；⒈；⒍□；?、戊?；彤愇祯；1和R2的例子是己?；?、十一烷?；⑷舛罐Ⅴ；⒆貦磅；蛴王；１景l(fā)明優(yōu)選的化合物如-L-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST770)；-乙?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST771)；-丙?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST772)；-異丁?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3二棕櫚?；视偷孽?ST773)；-異戊?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST774)；-L-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基十六烷基甘油的酯(ST810)；-乙?；鵏-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙?；视偷孽?ST809)；-丙?；鵏-肉堿溴化物與1，3-二己酰基-2-羥基乙?；视偷孽?ST808)。藥理學(xué)上可以接受的酸的陰離子是指任何不導(dǎo)致不需要的毒性或副作用升高的酸的陰離子。這些酸是藥理學(xué)家和藥學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這些陰離子的例子不僅限于以下列出的種類氯；溴；碘；門冬氨酸根；酸式門冬氨酸根；檸檬酸根；酸式檸檬酸根；酒石酸根；酸式酒石酸根；磷酸根；酸式磷酸根；延胡索酸根；酸式延胡索酸根；甘油磷酸根；葡萄糖磷酸根；乳酸根；順丁烯二酸根；酸式順丁烯二酸根；粘酸根；乳清酸根；草酸根；酸式草酸根；硫酸根；酸式硫酸根；三氯醋酸根；三氟醋酸根；甲磺酸根；雙羥萘酸根和酸式雙羥萘酸根。以脂質(zhì)體形式存在的式(I)化合物，作為在基因療法中傳遞天然來源的或經(jīng)修飾的質(zhì)?；蚝塑账岬乃巹?，或?yàn)樽鳛橐呙绲碾幕虻鞍踪|(zhì)編碼，或用于下列藥物的基因釋放，例如，抗癌劑，抗病毒劑，抗細(xì)菌劑，抗真菌劑，抗原生動(dòng)物劑，用于治療心血管系統(tǒng)疾病的藥物，免疫原性肽和其他用于治療的藥物。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)制備含有式(I)化合物的脂質(zhì)體；見AllenT.M.Drugs56，747-56(1998)的例子。也可以用脂質(zhì)體技術(shù)實(shí)踐中熟知的其他組分制備本發(fā)明的脂質(zhì)體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，脂質(zhì)體可以含有助性脂質(zhì)，此術(shù)語在本領(lǐng)域是可以理解的。助性脂質(zhì)例如膽固醇，1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰基膽堿或二油酰磷脂?；憠A。本發(fā)明的脂質(zhì)體適于以組合物形式存在。在屬于傳遞藥理學(xué)活性化合物的實(shí)施方案中，組合物理解為藥劑學(xué)上的種類，可選地含有藥學(xué)上可接受的載體和/或賦型劑。脂質(zhì)體形式的式(I)化合物，也可以用于制備化妝品組合物，脂質(zhì)體本身可以作為化妝品活性劑，也可以用于輸送化妝品活性物質(zhì)，如水合劑、營養(yǎng)素、面部清潔劑、抗皺劑、抗蜂窩炎劑和抗拉伸紋劑(anti-stretch-markagents)。含有式(I)化合物的脂質(zhì)體可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈注射、皮下、經(jīng)皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。本發(fā)明也涉及另外具有通式(II)的陽離子脂質(zhì)，它們已知用于不同的用途(見上述EP559625)。根據(jù)本發(fā)明，式(II)化合物是L-肉堿的酯，用于制備在藥物釋放方面具有潛在活性的脂質(zhì)體，它與上述式(I)化合物相比，在到達(dá)靶器官方面表現(xiàn)出穩(wěn)定性和選擇性的特點(diǎn)。同樣有益的性質(zhì)適用于化妝品。這些化合物具有通式(II)其中R3是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的?；湥籖4是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的烷基鏈；并且X-是藥理學(xué)可接受的酸的陰離子。R3優(yōu)選的例子是壬?；⑹轷；?、肉豆蔻?；?、棕櫚?；⒂仓；蛴王；?。R4優(yōu)選的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。本發(fā)明記載的特定的式(II)化合物的例子是-棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)；-硬脂酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯(ST1055)；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1351)；-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1379)；-肉豆蔻?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1380)；-棕櫚酰L-肉堿溴化物十六烷基酯(ST1390)；-油基(oleyl)L-肉堿氯化物油基酯(ST1392)。上述《醫(yī)藥化學(xué)雜志》1998年6月18日；41(13)2207-15記載了一些式(II)化合物，即ST1380、ST1390和ST1392，作為制備用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的具有治療活性的脂質(zhì)體的有用藥劑，但未記載作為制備用于輸送藥物的脂質(zhì)體的有用藥劑。制藥領(lǐng)域具有一般經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員清楚地知道在制備脂質(zhì)體-藥物復(fù)合物方面面臨的困難；實(shí)際上，不能預(yù)測一個(gè)用于傳遞基因的脂質(zhì)體是否能用于傳遞藥物，這需要克服許多困難以得到能與藥物復(fù)合并將其優(yōu)先釋放到需要發(fā)揮治療作用的器官的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體形式的式(II)化合物，是有用的藥物釋放劑，可以輸送藥物如抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗原生動(dòng)物劑，或用于治療心血管疾病的藥物，或免疫原性肽，和其他用于治療的藥物。脂質(zhì)體形式的式(II)化合物，也可以用于制備化妝品組合物，脂質(zhì)體本身可以作為化妝品活性劑，也可以用于輸送化妝品活性物質(zhì)，如水合劑、營養(yǎng)素、面部清潔劑、抗皺劑、抗蜂窩炎劑和抗拉伸紋劑(anti-stretch-markagents)。在含有式(II)化合物的脂質(zhì)體中，所述的脂質(zhì)體可選地含有助性脂質(zhì)。含有式(II)化合物的脂質(zhì)體可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。本發(fā)明也涉及另外具有通式(III)的陽離子脂質(zhì)，它們已知用于不同的用途(見上述EP559625)。根據(jù)本發(fā)明，式(III)化合物是L-肉堿的酯，用于制備在促進(jìn)藥物釋放方面具有潛在活性的脂質(zhì)體，它與上述式(I)化合物相比，在到達(dá)靶器官方面表現(xiàn)出穩(wěn)定性和選擇性的特點(diǎn)。這些化合物具有通式(III)其中R5是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的?；?；R6是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的烷基鏈；X-是藥理學(xué)可接受的酸的陰離子，具有如下限制條件當(dāng)R5是硬脂?；鶗r(shí)，R6不是硬脂基，當(dāng)R5是油?；鶗r(shí)，R6不是硬脂基，當(dāng)R5是棕櫚?；鶗r(shí)，R6不是棕櫚基，當(dāng)R5是肉豆蔻?；鶗r(shí)，R6不是肉豆蔻基，當(dāng)R5是月桂?；鶗r(shí)，R6不是月桂基，當(dāng)R5是油?；鶗r(shí)，R6不是油基?！夺t(yī)藥化學(xué)雜志》1988，41，2207-2215公開了僅用于基因釋放的放棄保護(hù)的脂質(zhì)體形式的化合物。R5優(yōu)選的例子是壬?；?、十二烷酰基、肉豆蔻酰基、棕櫚酰基、硬脂?；蛴王；?。R6優(yōu)選的例子是壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。本發(fā)明式(III)化合物的優(yōu)選的例子是-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST1055)；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1351)；-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯(ST1379)。式(III)化合物作為在基因療法中傳遞天然來源的或經(jīng)修飾的質(zhì)?；蚝塑账岬乃巹?yàn)樽鳛橐呙绲碾幕虻鞍踪|(zhì)編碼。式(III)化合物可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。在以下反應(yīng)簡圖中表示了制備本發(fā)明式(I)化合物的過程，它表示此簡圖用于所有通式(I)化合物。由于所有必需的試劑都是市售的或已公開在文獻(xiàn)中，并且反應(yīng)條件通常適用于本發(fā)明任何變化的全部范圍，如果在常識范圍內(nèi)可以正常地滿足需求，技術(shù)人員可以容易地得到R、R1和R2代表的所有的基團(tuán)。參考以上反應(yīng)流程1，以下說明本申請的式(I)化合物的制備方法。例1丙酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST772)a)制備1，3-二羥基丙-2-酮1，3-二棕櫚酸酯(1)在0℃(外部溫度)在無水氮?dú)饬髦袑⒍u基丙酮(7g；0.078mol)溶解在300mL無水氯仿中。向得到的溶液中滴加棕櫚酰氯(44g；0.16mol)和無水吡啶(15mL)。將溫度已上升至環(huán)境溫度的所得混合物攪拌24小時(shí)。按以下順序萃取混合物用0.5％鹽酸的水溶液300mL、5％碳酸氫鈉的水溶液300mL，最后用300mL水。用無水硫酸鈉使分離出的有機(jī)相脫水，用纖維素濾器過濾并濃縮至干，得到粗產(chǎn)物(1)。從500mL乙醇中結(jié)晶得到純品。得到30.4g產(chǎn)品(1)。產(chǎn)率73％熔點(diǎn)＝80-81℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.7(4H，s，-OCCH2-).b)制備1，2，3-三羥基丙烷-1，3-二棕櫚酸酯(2)將水(7.5mL)緩慢加到產(chǎn)品(1)(5g，9mmol)中，攪拌使之溶解在四氫呋喃(125mL)和甲苯(25mL)中。將所得的白色乳狀懸浮液的溫度調(diào)至5℃(外部溫度)，分次加入硼氫化鈉(500mg；13mmol)。在5℃將懸浮液保持?jǐn)嚢?0分鐘。然后緩慢加入冰醋酸直至不再有剩余的硼氫化鈉分解產(chǎn)生泡沫，最終得到一種溶液。向溶液中加入氯仿(100mL)，形成兩相系統(tǒng)。分離底層含有CHCI3的有機(jī)相，按以下順序萃取用水(25mL)，碳酸氫鈉(10％水溶液25mL)和水(25mL)。用硫酸鈉使含有(2)的有機(jī)相脫水，過濾并濃縮至干，得到一種蠟狀產(chǎn)物。用丙酮使蠟狀產(chǎn)物結(jié)晶得到產(chǎn)品(2)。得到4.8g產(chǎn)品(2)。產(chǎn)率94％。熔點(diǎn)＝71-72℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；4.2(5H，m，-CHCH2O-).c)制備1，3-二棕櫚酰-2-溴乙?；视?3)在0℃和攪拌的條件下將產(chǎn)品(2)(2.5g；4.4mmol)溶解在無水氯仿(50mL)中(外部溫度)。向得到的溶液中緩慢加入吡啶(0.42ml)并滴加3ml含有溴代乙酰氯(0.43mL；5.2mmol)的氯仿溶液。將反應(yīng)混合物在0℃保持30分鐘(外部溫度)，并在環(huán)境溫度下保持30分鐘。然后按以下順序處理反應(yīng)混合物鹽酸的1％水溶液(約50mL)，碳酸氫鈉的5％水溶液(約50mL)和水。用丙酮結(jié)晶純化產(chǎn)物(3)，然后使反應(yīng)混合物脫水(用硫酸鈉)并濃縮至干。得到2.5g產(chǎn)品。產(chǎn)率89％。熔點(diǎn)＝46-47℃H1NMR(CDCl3)0.9(6H，t，CH3CH2-)；1.3(48H，m，(CH2)n＝24)；1.55(4H，m，-OCOCH2CH2-)；2.4(4H，t，-OCOCH2-)；3.9(2H，s，-OCH2COO-)4.2-4.4(5H，m，-CHCH2O-)；5.25(1H，m，CHCH2O-).。d)制備L-丙?；鈮A溴化物與2-羥乙酰-1，3-二棕櫚酰甘油的酯(4)將預(yù)先在40℃真空干燥的L-丙?；鈮A內(nèi)鹽(0.95g，4.4mmol)懸浮在無水二甲基甲酰胺中(約20mL)。將產(chǎn)物(3)(3g，4.7mmol)分次小部分加入懸浮液中。將懸浮液緩慢加熱到38℃并保持此條件直至得到一種溶液。10分鐘后，使溶液達(dá)到0℃，保持30分鐘。得到一種沉淀，過濾，用乙酸乙酯洗滌并溶解在氯仿(100mL)中。將所得乳狀溶液(30mL)通過硅藻土過濾并濃縮。向后一溶液中加入己烷(100mL)，將得到的產(chǎn)品(4)的沉淀物過濾并在35℃真空干燥。得到3.19g標(biāo)題化合物。產(chǎn)率80％。熔點(diǎn)＝127-128℃[α]25D＝-3.9(C＝1％氯仿)C47H88BrNO10的元素分析<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="859">C％H％N％Br％計(jì)算值62.239.781.548.81實(shí)測值62.7310.150.798.77</table></tables>H1NMR(CDCl3)0.9-0.95(6H，t，CH3CH2CH2-)；1.1-1.2(3H，t，CH3CH2CO)；1.2-1.4(24H，m，CH2n＝24)；1.5-1.6(4H，m，-OCCH2CH2-)；2.3-2.4(4H，t，-OCCH2CH2-)；2.4-2.45(4H，d.d.，-CHCH2O-)；2.95(2H，d，-CH2COOCH2COO-)；3.5(9H，s，N(CH3)3)；4.2(4H，m，-CH2OCOCH2-)；4.35(2H，m，-CH2N-)；4，65(2H，d，d，-OCH2CO-)；5.25(1H，m，-OCH2CHCH2O-)；5.75(1H，m，-CHCH2N-).例2-7按與上述實(shí)施例相同的方法制備下述化合物-L-肉堿溴化物與2-羥基乙酰基-1，3-二棕櫚酰基甘油的酯(ST770)；-乙?；鵏-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST771)；-異丁酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3二棕櫚?；视偷孽?ST773)；-異戊酰基L-肉堿溴化物與2-羥基乙?；?1，3-二棕櫚?；视偷孽?ST774)；-L-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙酰基甘油的酯(ST810)；-乙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙酰基甘油的酯(ST809)；-丙酰基L-肉堿溴化物與1，3-二己?；?2-羥基乙酰基甘油的酯(ST808)；此處記載的本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括制備有抗癌藥物的脂質(zhì)體，尤其是作為喜樹堿的載體的脂質(zhì)體，如WO97/31003記載的。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有通式(IV)的傳遞喜樹堿的脂質(zhì)體其中R7是-C(R11)＝N-O(n)R10基團(tuán)，其中R10是氫，或是直鏈或分支的C1-C5烷基或C1-C5烯基基團(tuán)，或一個(gè)C3-C10環(huán)烷基基團(tuán)，或一個(gè)直鏈或分支的(C3-C10)環(huán)烷基(C1-C5)烷基基團(tuán)，或一個(gè)C6-C14芳基，或一個(gè)直鏈或分支的(C6-C14)芳基-C1-C5)烷基基團(tuán)，或雜環(huán)或直鏈或分支的雜環(huán)-(C1-C5)烷基基團(tuán)，所述的雜環(huán)基團(tuán)含有至少一個(gè)選自氮原子和/或氧和/或硫的雜原子，氮原子可選地被(C1-C5)烷基基團(tuán)取代；所述的烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、芳基-烷基、雜環(huán)或雜環(huán)-烷基基團(tuán)可選地被其它基團(tuán)取代，這些基團(tuán)選自鹵素、羥基、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、苯基、氰基、硝基、-NR12R13，其中R12和R13可以相同或不同，它們可以是氫、直鏈或分支的(C1-C5)烷基、-COOH基團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的一種酯；或-CONR14R15基團(tuán)，其中R14和R15，可以相同或不同，是氫、直鏈或分支的(C1-C5)烷基；或R10是C6-C10芳?；?，可選地被一或多個(gè)下述基團(tuán)取代鹵素，羥基，直鏈或分支的C1-C5烷基，直鏈或分支的C1-C5烷氧基，苯基，氰基，硝基，-NR16R17，其中R16和R17，可以相同或不同，是氫，直鏈或分支的C1-C5烷基；R10是聚氨基烷基殘基；或R10是葡萄糖殘基；n是0或1；R11是氫，直鏈或分支的C1-C5烷基，直鏈或分支的C1-C5烯基，C3-C10環(huán)烷基，直鏈或分支的(C3-C10)環(huán)烷基-(C1-C5)烷基，C6-C14芳基，直鏈或分支的(C6-C14)芳基-(C1-C5)烷基；R8和R9，可以相同或不同，是氫、羥基、直鏈或分支的C1-C5烷氧基；它們的N1-氧化物，單一異構(gòu)體，特別是-C(R11)＝N-O(n)R10基團(tuán)的順反異構(gòu)體，其可能的旋光對映體，非對映異構(gòu)體和相關(guān)的混合物，它們的藥學(xué)可接受的鹽及其活性代謝物。1999年3月9日申請的歐洲專利申請99830124.6記載了式(IV)化合物。至于式(IV)化合物，其中n是1，R10的定義如上，芳酰基除外，可以從喜樹堿7-醛(式IVa，R11氫)或喜樹堿7-酮(式IVa，R11不是氫)制備這些化合物。其中R7是-C(R11)＝O基團(tuán)，R11的定義如式(IV)，R8和R9的定義如式(IV)。式(IVa)化合物與式(Va)化合物R10O-NH2反應(yīng)，其中R10如上所述，產(chǎn)生式(I)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-O-R10基團(tuán)，R10的定義如式(IV)，芳?；?。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行此反應(yīng)，此過程包括肟的正常生成。優(yōu)選地，喜樹堿7-醛或7-酮與羥胺的比例應(yīng)在1∶3-3∶1的范圍內(nèi)。也可以使用相關(guān)的羥胺鹽。在有堿存在的條件下進(jìn)行此反應(yīng)，如無機(jī)堿，例如碳酸鉀，或一種有機(jī)堿，如三乙胺或或二氮雜雙環(huán)壬烷，使用極性溶劑，優(yōu)選甲醇或乙醇，在從室溫至溶劑沸點(diǎn)溫度范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行反應(yīng)，可選地有脫水劑存在，如鈉或鎂的硫酸鹽，分子篩。如果需要，也可以在有催化劑如Lewis酸的條件下進(jìn)行此反應(yīng)。或者，可以從喜樹堿7-醛的肟(按Sawada等在《化學(xué)與藥學(xué)通報(bào)》39，2574(1991)記載的方法得到)，或喜樹堿7-酮的肟，或從相應(yīng)的7-?；矘鋲A，通過與一個(gè)R10-X鹵化物反應(yīng)制備上述化合物，其中X優(yōu)選碘，在極性溶劑如四氫呋喃或乙醇中，和在有堿如氫化鈉或碳酸鉀存在的條件下進(jìn)行此反應(yīng)。至于式(IV)化合物，其中n是1，R10是芳?；?，定義如式(IV)中所述，可以從喜樹堿7-肟制備這些化合物，在以上段落記載了其制備方法，用R10-COCl?；然铮跇O性溶劑中，在有堿存在的條件下，優(yōu)選吡啶，或直接在吡啶中進(jìn)行反應(yīng)，方法如Cho等在《有機(jī)化學(xué)雜志》62，2230(1997)所記載。至于式(IV)化合物，其中n是0，并且R10的定義如上，芳?；?，可以從喜樹堿7-醛(式IVa，R11氫)或喜樹堿7-酮(式IVa，R11不是氫)制備此化合物。其中R7是-C(R11)＝O基團(tuán)，R11如式(IV)的定義，R8和R9的定義如式(IV)中所定義。式(IVa)化合物與式(Vb)化合物R10-NH2反應(yīng)，其中R10的定義如上，產(chǎn)生式(IV)化合物，其中R7是-C(R11)＝N-R10基團(tuán)，R10的定義如式(IV)中所定義，芳?；狻？梢杂盟帉W(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行此反應(yīng)，此過程包括正常形成亞胺。優(yōu)選地，喜樹堿7-醛或7-酮與亞胺的摩爾比應(yīng)在1∶3-3∶1的范圍。也可以使用相關(guān)的胺鹽。在有堿存在的條件下進(jìn)行此反應(yīng)，如一種無機(jī)堿，例如碳酸鉀，或一種有機(jī)堿，如三乙胺或二氮雜雙環(huán)壬烷，使用極性溶劑，優(yōu)選甲醇或乙醇，在從室溫至溶劑沸點(diǎn)溫度范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行反應(yīng)，可選地有脫水劑存在，如鈉或鎂的硫酸鹽，分子篩。如果需要，也可以在有催化劑如Lewis酸的條件下進(jìn)行此反應(yīng)，如Moretti和Torre在《合成》，1970，141，或Kobayashi等在《Synlett》1977，115記載的。歐洲專利申請EP0056692和上述Sawada等在《化學(xué)與藥學(xué)通報(bào)》39，2574(1991)發(fā)表的文章記載了喜樹堿7-醛和喜樹堿7-肟。按已知的異芳香氮氧化法制備式(IV)化合物的N1氧化物，優(yōu)選用醋酸或三氟醋酸和過氧化氫進(jìn)行氧化，或通過與有機(jī)過氧化酸反應(yīng)而進(jìn)行(A.Albini和S.Pietra，《雜環(huán)N-氧化物》，CRC，1991).關(guān)于R10的不同的意義，在不同的式V試劑中有所不同，這些試劑可以由市售得到，或可以按文獻(xiàn)記載的方法制備，本領(lǐng)域的專家可以借助這些文獻(xiàn)，補(bǔ)充他們所擁有的此領(lǐng)域的知識。用文獻(xiàn)記載的常規(guī)方法可以得到藥學(xué)上可接受的鹽，這不需要進(jìn)一步的描述。例87-芐氧基亞氨甲基喜樹堿(CPT172)500mg(1.33mmol)7-甲?；矘鋲A溶解在100ml乙醇中。加入15ml吡啶和638mg(4mmol)O-芐基羥胺鹽酸鹽。將溶液回流5小時(shí)。真空蒸發(fā)溶劑，在硅膠上用快速色譜法(flashchromatography)純化得到的殘余物，洗脫劑為己烷與乙酸乙酯4∶6的混合物。產(chǎn)率65％熔點(diǎn)200-205℃。得到的產(chǎn)品含有順式和反式異構(gòu)體比例為8∶2的混合物(異構(gòu)體ARf0.32；異構(gòu)體B，Rf0.19，使用Merck60F254硅膠；洗脫劑己烷∶乙酸乙酯為3∶7)。HPLC用安裝四元泵(quaternarypump)的儀器進(jìn)行此分析(HP1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二極管陣列檢測器(HP1050)，使用HPLC-ChemStation程序進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。在200-600nm范圍內(nèi)得到光譜，并在360和400nm記錄色譜。使用有RP18預(yù)柱的C18反向色譜柱(RaininC18；25×0.4cm，Varian)。線性洗脫梯度進(jìn)行分析，從乙腈∶水＝30∶70開始在20分鐘內(nèi)達(dá)到乙腈100％，流速為1ml/分鐘。保留時(shí)間為異構(gòu)體B12.51分鐘，異構(gòu)體A為14.48分鐘。1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)δ0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.878m，(H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.21(8s，H2-PhB)，5.30(H2-PhA)，5.40(s，H2-5A)，5.45(s，H2-17A+H2-17B)，6.53(s，-OHA+-OHB)，7.3-7.6(m，ArA+ArB+H-14A+H-14B)，7.75(m，H-11A+H-11B)，7.85-7-95(m，H-10A+H-10B)，7.98(dd，H-12B)，8.18-8.27(m，H-12A+H9-B)，8.45(s，CH＝NB)，8.59(dd，H-9A)，9.38(s，CH＝NA).Massm/z481(M+100)374(30)330(70)300(30)273(20)243(20)91(34).例97-丁氧基亞氨基甲基喜樹堿(CPT184)將400mg(1.06mmol)7-甲酰基喜樹堿溶解在80ml乙醇中。加入12ml砒啶和400mg(3.18mmol)O-t-丁基羥胺鹽酸鹽。溶液回流4小時(shí)。真空蒸發(fā)溶劑，在硅膠上用快速色譜法(flashchromatography)純化得到的殘余物，洗脫劑為己烷與乙酸乙酯4∶6的混合物。得到322mg(0.72mmol)黃色固體。產(chǎn)率68％熔點(diǎn)250℃。得到的產(chǎn)品含有順式和反式異構(gòu)體比例為約8∶2的混合物(異構(gòu)體ARf0.31；異構(gòu)體B，Rf0.24，Merck60F254硅膠；洗脫劑己烷∶乙酸乙酯為3∶7)。HPLC用安裝四元泵的儀器進(jìn)行此分析(HP1050)，使用Rheodyne注射器(20μl回路)和二極管陣列檢測器(HP1050)，使用HPLC-ChemStation程序進(jìn)行驅(qū)動(dòng)。在200-600nm范圍內(nèi)得到光譜，并在360和400nm記錄色譜。使用有RP18預(yù)柱的C18反向色譜柱(RaininC18；25×0.4cm，Varian)。線性洗脫梯度進(jìn)行分析，從乙腈∶水＝30∶70開始在20分鐘內(nèi)達(dá)到乙腈100％，流速為1ml/分鐘。保留時(shí)間為異構(gòu)體B12.92分鐘，異構(gòu)體A為14.61分鐘。1H-NMR(300MHz；DMSO-d6)δ0.88(t，H3-18A+H3-18B)，1.30(s，t-but.B)，1.47(s，t-but.A)，1.87(m，H2-19A+H2-19B)，5.18(s，H2-5B)，5.37(H2-5A)，5.42(s，H2-17A+H2-17B)，6.54(s，-OHA+-OHB)，7.35(sH-14A)，7.36(s，H-14B)7.69-7.83(m，H-11A+H-11B)，7.85-7.98(m，H-10A+H-10B)，8.07(dd，H-9B)，8.16-8.27(m，H-9A+H-12B)8.40(s，CHB)，8.62(dd，H-12A)，9.31(s，CHA).Massm/z448(M+28)391(40)374(100)362(40)330(34)57(17).制備脂質(zhì)體本發(fā)明的化合物可以用來制備多層脂質(zhì)體(MLV)和單層脂質(zhì)體(SUV)，可以是干粉狀或水溶液中的懸浮物。用本發(fā)明的化合物，如例1-7所制備的，按以下方法制備脂質(zhì)體。將適宜量的化合物溶解在氯仿中；在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將溶液真空濃縮至干，直至得到一層脂質(zhì)膜。在高真空度下干燥脂質(zhì)膜直至除去最后的殘余溶劑，然后將脂質(zhì)膜溶解在叔丁醇或水中。將溶液冷凍干燥，得到一種柔軟的干燥粉末。用適宜量的水溶液將粉末水化，得到所用化合物的脂質(zhì)體，然后與多核苷酸或所需的藥物復(fù)合。另一種制備脂質(zhì)體的方法包括將一個(gè)脂質(zhì)膜吸附在一個(gè)適宜的惰性載體如山梨醇、甘露醇或其他藥學(xué)可接受的碳水化物上，此脂質(zhì)膜中包含一種溶解在溶劑中的本發(fā)明的化合物。將此混合物真空干燥，得到一種固體，在使用之前它可以方便而快速地水化。干燥粉末形式的制劑呈現(xiàn)長期穩(wěn)定性方面的改善，并且易于使用。另外，可以按以下步驟用本發(fā)明的化合物制備干粉狀的與DNA或所需藥物復(fù)合的脂質(zhì)體。將本發(fā)明的化合物溶解在叔丁醇或水中；將得到的溶液與DNA或所需藥物混合，將混合物冷凍干燥，得到一種柔軟的干燥粉末狀的復(fù)合物，我們將其定義為前脂質(zhì)體-DNA或前脂質(zhì)體-藥物?？梢杂玫玫降姆勰?前脂質(zhì)體)制備通過氣霧劑形式給藥的藥物組合物，或當(dāng)其與水或適宜的緩沖溶液重組時(shí)，可以經(jīng)胃腸外或口服給藥。也可以用上述方法通過將脂質(zhì)膜吸附在惰性載體如山梨醇、甘露醇或其他碳水化物上，得到固體形式的與DNA或藥物復(fù)合的脂質(zhì)體。測試脂質(zhì)體的形成按以下步驟，使用水溶性染料，用比色法測定脂質(zhì)體的形成。得到一種水溶性染料偶氮胂III的水溶液(m.w.＝776.37；2.3mg/mL)。用此溶液替代水以水化用上述方法得到的脂質(zhì)膜。用水將一份含有包裹染料的脂質(zhì)體的懸浮液稀釋100倍。使用2mL此脂質(zhì)體懸浮液在660nm得到第一光學(xué)密度讀數(shù)；與定義為空白的相同的樣品進(jìn)行比較得到讀數(shù)。將200μlCaCl2溶液(15mg/mL；100mM)加入第一樣品中，在660nm以空白為背景測定光密度，向其中加入200μl水。將所得的吸收值作為讀數(shù)2。向樣品中加入100μl三硝基甲苯X-100(5％v/v；0.26％終濃度)溶液，向空白中加入200μl水；在660nm得到的對應(yīng)于光密度值的讀數(shù)定義為讀數(shù)3。用以下公式計(jì)算被包裹的染料的百分?jǐn)?shù)被包裹染料的百分?jǐn)?shù)提供了一個(gè)脂質(zhì)體形成的測定尺度，其平均值為40％；用激光散射法檢測脂質(zhì)體的體積，得到陽性結(jié)果。制備脂質(zhì)體的實(shí)施例制備以下形式的棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯(ST983)a)冷凍干燥粉末在100mL燒瓶中將65mg，0.11mmol棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。蒸發(fā)溶液直至得到脂質(zhì)膜，將其真空干燥3小時(shí)。將得到的產(chǎn)物溶解在叔丁醇中，用液氮將此溶液快速冷卻至-70℃并冷凍干燥24小時(shí)。得到海綿狀柔軟白色固體。b)吸附的粉末將143mg，0.231mmol棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在10mL氯仿中。將得到的溶液以小部分分次倒入含有750mg山梨醇的100mL燒瓶中。加完各部分氯仿溶液后，快速蒸發(fā)氯仿。將得到的固體真空干燥3小時(shí)。得到893mg白色固體產(chǎn)物。使用前，用適當(dāng)體積的水將產(chǎn)物快速水化得到一等滲的溶液。c)MLV懸浮液在一100ML燒瓶中，將65mg，0.11mmol棕櫚酰基L-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。將得到的溶液蒸發(fā)直至得到脂質(zhì)膜，將其真空干燥3小時(shí)。在30℃用10mL水將脂質(zhì)膜水化3小時(shí)，得到MLV懸浮液。將MLV懸浮液適當(dāng)稀釋，與多核苷酸或藥物復(fù)合，進(jìn)行生物測定。e)SUV懸浮液在100mL燒瓶中，將65mg，0.11mmol棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯溶解在20mL氯仿中。將得到的溶液蒸發(fā)直至得到一脂質(zhì)膜，將其真空干燥3小時(shí)。在30℃，用10mL水將得到的脂質(zhì)膜水化3小時(shí)，得到MLV懸浮液。用孔徑為200nm的聚碳酸酯濾器將MLV懸浮液過濾10次。將如此得到的單層脂質(zhì)體懸浮液與多核苷酸或藥物復(fù)合并進(jìn)行生物測定。f)測定脂質(zhì)體的物理穩(wěn)定性用周期為30天的比濁法測定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性。每間隔一定時(shí)間，在600nm測定每個(gè)將被測試的懸浮液的吸收度。被測制劑在0時(shí)測得的平均吸收值保持不變。在考察期間內(nèi)被考察的分子呈現(xiàn)一致的值?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明的化合物與助性脂質(zhì)如膽固醇、1-棕櫚酰基-2-油?；字；憠A(POPC)或二油基磷脂酰基膽堿(DOPE)結(jié)合制備MLV和SUV脂質(zhì)體懸浮液?；衔锱c助性脂質(zhì)結(jié)合以得到具有更穩(wěn)定膜的脂質(zhì)體。以下在記載脂質(zhì)體制備的部分，給出了一個(gè)制備例，其中本發(fā)明的化合物與助性脂質(zhì)如膽固醇或POPC結(jié)合。制備傳遞藥物的脂質(zhì)體的實(shí)施例例10制備紫杉醇-ST983MLV脂質(zhì)體(1∶40)將20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿，將20mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液分成19份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時(shí)。每份固體含有紫杉醇(1.05mg)和ST983(29.2mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，在使用時(shí)將冷凍干燥產(chǎn)物用水(450μL)或其他鹽溶液水合，攪拌10分鐘，靜置30分鐘以完成膨脹(水合)過程。得到了MLV脂質(zhì)體。測定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測定制劑中紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測定紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱μBondapackC-18洗脫劑乙腈∶水70∶30檢測器UV-VIS227nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.5分鐘針對標(biāo)準(zhǔn)品，測得的紫杉醇的濃度為2.13mg/mL。被包裹的紫杉醇的濃度為98％。例11制備紫杉醇-ST983SUV脂質(zhì)體將20mg，0.0234mmol紫杉醇和556mg，0.9417mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿，將20mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液分成19份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時(shí)。每份固體含有紫杉醇(1.05mg)和ST983(29.2mg)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，在0℃將已用PBS溶液(1mL)水合的冷凍干燥產(chǎn)物聲處理20分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑的物理穩(wěn)定性。用比濁法測定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測定制劑中紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測定紫杉醇的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱μBondapackC-18Eluent乙腈∶水70∶30檢測器UV-VIS227nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.5分鐘對SUV脂質(zhì)體懸浮液的HPLC分析產(chǎn)生與在同樣條件下相應(yīng)的MLV脂質(zhì)體懸浮液相同的結(jié)果，被包裹的紫杉醇的百分率為98％.24小時(shí)后重復(fù)進(jìn)行HPLC分析，除紫杉醇峰外，沒有新峰出現(xiàn)，顯示了活性成分的穩(wěn)定性。例12制備紫杉醇-ST983-膽固醇脂質(zhì)體(1∶15)制備這些類型的脂質(zhì)體以得到具有穩(wěn)定膜的復(fù)合物。將6mg，0.0101mmol紫杉醇，62.2mg，0.105mmolST983和40mg膽固醇溶解在10mL氯仿中。濃縮所得溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將6.3mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液分成5份，立即用液氮將其在-70℃冷凍24小時(shí)。每份固體含有紫杉醇(1.2mg)和ST983(12.44mg)和膽固醇(8mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，在使用時(shí)將冷凍干燥產(chǎn)物用水(1000μL)或其他鹽溶液水合，攪拌10分鐘并靜置30分鐘以完成膨脹(水合)過程。得到MLV脂質(zhì)體。測定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測定脂質(zhì)體懸浮液的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為6小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。例13制備紫杉醇-ST772SUV脂質(zhì)體(1∶70)將20mg，0.0234mmol紫杉醇和1485mg，1.638mmolST772溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將20mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中。為得到澄清的溶液，必須將其加熱到60℃。立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，將已用PBS溶液(20mL)水合的冷凍干燥產(chǎn)物在0℃聲處理20分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑的物理穩(wěn)定性。用比濁法測定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為6小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。例14制備CPT83-ST983MLV脂質(zhì)體(1∶40)將6.3mg，0.0168mmolCPT83(7-腈喜樹堿，記載于WO97/31003)和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT83(0.525mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，在使用時(shí)將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000μL)或其它鹽溶液水合，并攪拌10分鐘。得到MLV脂質(zhì)體。測定制劑的物理穩(wěn)定性。用比濁法測定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在800nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測定制劑中CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測定CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.033分鐘針對標(biāo)準(zhǔn)品測得的CPT83濃度為0.502mg/mL。被包裹的CPT83百分率為99％。例15制備CPT83-ST983SUV脂質(zhì)體(1∶40)將6.3mg，0.0168mmolCPT83和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT83(0.525mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000L)水合，并在0℃聲處理40分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑中CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測定CPT83的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間4.033分鐘針對標(biāo)準(zhǔn)品測得的CPT83濃度為0.3mg/mL。被包裹的CPT83的百分率為59％。在24小時(shí)后重復(fù)進(jìn)行HPLC分析，除CPT83峰外未顯示新的峰，表明了化合物的穩(wěn)定性。測定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在600nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。例16制備CPT184-ST983MLV脂質(zhì)體(1∶40)將7.29mg，0.0168mmolCPT184和400mg，0.677mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT184(0.607mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的脂質(zhì)體懸浮液，將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000μL)或其它鹽溶液水合，并攪拌10分鐘。得到MLV脂質(zhì)體。測定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在600nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。測定制劑中CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測定CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間25.5分鐘針對標(biāo)準(zhǔn)品，測得CPT184濃度為0.600mg/mL。包裹的CPT184百分率為99％。例17制備CPT184-ST983SUV脂質(zhì)體(1∶40)將7.29mg，0.0168mmolCPT184和400mg，0.667mmolST983溶解在20mL氯仿中。濃縮溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜。用高效真空泵消除最后殘留的氯仿后，將26mL叔丁醇加入脂質(zhì)膜中，將得到的溶液細(xì)分成12份，立即用液氮將其在-70℃冷凍，并冷凍干燥24小時(shí)。每份固體含有CPT184(0.607mg)和ST983(33.33mg)。為得到最終的SUV脂質(zhì)體懸浮液，將冷凍干燥產(chǎn)品用水(1000L)水合，并在0℃聲處理40分鐘。在400nm濾器上過濾，除去聲處理儀的探針釋放的痕量的鈦。測定制劑中CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法測定CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性。色譜條件如下色譜柱SupelcosilLC-ABZ洗脫劑磷酸鹽緩沖液20mM甲醇40∶60，pH＝7.3檢測器UV-VIS360nm流速1mL/分鐘保留時(shí)間25.5分鐘針對標(biāo)準(zhǔn)品測得的CPT184濃度為0.36mg/mL。被包裹的CPT184的百分率為70％。在24小時(shí)后重復(fù)進(jìn)行HPLC分析，除CPT184峰外未顯示新的峰，表明了活性成分的穩(wěn)定性。測定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測定制劑的物理穩(wěn)定性，使用在600nm測定的TDC(TimeDriveCurve時(shí)間驅(qū)動(dòng)曲線)記錄，溫度為20℃，測定時(shí)間為20小時(shí)。記錄了用于指示制劑穩(wěn)定性的恒定濁度趨向，它未顯示沉淀現(xiàn)象。在以下實(shí)施例中，使用助性脂質(zhì)和/或低溫防護(hù)劑制備脂質(zhì)體。例18制備CPT184-ST983脂質(zhì)體在2L燒瓶中，向20mgCPT184和600mgST983中加入100ml甲基氯仿，并稍加熱直至完全溶解。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮得到的溶液直至在燒瓶表面得到一個(gè)脂質(zhì)膜，并在高效真空泵中干燥2小時(shí)。用乳糖溶液(6g/300ml水)在45℃將脂質(zhì)膜水合，在一個(gè)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中攪拌2小時(shí)。然后將懸浮液聲處理2小時(shí)，每個(gè)周期持續(xù)半小時(shí)。隨后將產(chǎn)品通過200nm濾器過濾并冷凍干燥。測定制劑中CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性用HPLC法確定CPT184的化學(xué)穩(wěn)定性。產(chǎn)品在實(shí)驗(yàn)的24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。測定制劑的物理穩(wěn)定性用比濁法測定制劑的物理穩(wěn)定性。在24小時(shí)的測定過程中，產(chǎn)品穩(wěn)定。顆粒體積也是穩(wěn)定的(平均值為100nm)。例19制備CPT184-ST983脂質(zhì)體按以下步驟制備1ml脂質(zhì)體(POPC-1-棕櫚?；?2-油?；字；憠A5mM；ST9831.25mM；CPT1840.25和海藻糖150mM)0.11mg，0.25μmolCPT184溶解在250μL乙酸乙酯中，3.79mg，4.89μmolPOPC溶解在100μL乙醇中，0.74mg，1.25μmolST983溶解在100μL乙醇中。將此三溶液混合在一起并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。在室溫及80mbar的條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將溶劑蒸發(fā)除去。在暗處將脂質(zhì)膜干燥2小時(shí)。將脂質(zhì)膜懸浮在1ml的150mMD(+)海藻糖二水合物溶液中(Fluka，HPLC99％)，通過0.22nm濾器滅菌，并旋轉(zhuǎn)2分鐘。使懸浮液通過200nm聚碳酸酯濾器21次。將過濾后的脂質(zhì)體懸浮液在液氮中冷凍，并冷凍干燥2夜。得到白色固體。例20制備CPT184-ST983脂質(zhì)體使用例19的方法，不同的是使用500mM海藻糖。ST983脂質(zhì)體-抗癌劑復(fù)合物的抗癌活性如下所述，ST983脂質(zhì)體主要蓄積在肺部。此部位特異性使其在鼠科模型肺癌發(fā)生方面的應(yīng)用具有優(yōu)勢。此例中使用的抗癌劑是紫杉醇。為誘發(fā)體內(nèi)腫瘤，未麻醉的Balb/c小鼠在右后爪的股四頭肌處接受注射0.1mlRPMI-1640(Sigma)，其中有3×105細(xì)胞的鼠肺癌M109。植入腫瘤10天后，用磷酸鹽-緩沖鹽溶液(PBS，SIGMA，P-4417)稀釋脂質(zhì)體-紫杉醇復(fù)合物并以2.5mg/mLST983和75μg/mL紫杉醇的濃度靜脈注射。紫杉醇(paclitaxelINDENA)作為空白，以20mg/mL的濃度溶解在cremophor載體EL(BASF)中并在+4℃避光儲存另外24小時(shí)。使用時(shí)，用磷酸鹽-緩沖鹽溶液(PBS，SIGMA)稀釋并用和ST983脂質(zhì)體輸送的紫杉醇相同的體積和濃度靜脈注射。按1∶1的比例用乙醇稀釋制備cremophor。從接種腫瘤后的第10天開始連續(xù)給藥7天。持續(xù)觀察動(dòng)物直至接種后第17天，并脫頸椎處死動(dòng)物，取出肺測定轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目。在5mlBouin’s溶液中將肺培養(yǎng)10天進(jìn)行染色，以測定轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目，Bouin’s溶液中含有71％苦味酸飽和溶液、4.8％冰醋酸(Merck)，和24％的10％甲醛(Fluka)。在Bouin’s溶液中培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，對轉(zhuǎn)移瘤計(jì)數(shù)。與未經(jīng)處理的對照小鼠比較，由cremophor輸送的紫杉醇未顯示降低肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目的效果，雖然后者小于未經(jīng)處理的對照鼠，然而與ST983脂質(zhì)體復(fù)合的紫杉醇顯示出降低肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目和體積的顯著效果。用針對未配對數(shù)據(jù)的Mann-Whitney無參數(shù)試驗(yàn)法對肺移植瘤數(shù)目進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得結(jié)果示于以下表1。表1在BALB/c小鼠體內(nèi)接種腫瘤M109和用紫杉醇及紫杉醇/脂質(zhì)體ST983處理后第17天的肺轉(zhuǎn)移瘤M＝平均值(1-2mm直徑)S＝小(＜1mm直徑)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)在96孔平板上測定對HeLa和M109細(xì)胞的毒性。鋪平板后，用所測定的分子對細(xì)胞再處理48小時(shí)。然后用PBS洗滌細(xì)胞，并將其置于正常的生長條件下48小時(shí)。除去生長介質(zhì)后，在冰上用16％TCA培養(yǎng)細(xì)胞，在水中洗滌3次，用硫氰酸胺(sulforhodamine)B(SRB)在1％醋酸中的溶液處理細(xì)胞30分鐘，在單純的1％醋酸中洗滌細(xì)胞3次，在pH10.5的TRIS10mM中培養(yǎng)20分鐘，最后在540nm讀取讀數(shù)。測定CPT83的細(xì)胞毒性進(jìn)行CPT83細(xì)胞毒性的體外測定以評價(jià)與脂質(zhì)體復(fù)合的抗癌劑的細(xì)胞毒性，作為對有效活性的初步預(yù)測。使用上述硫氰酸胺B試驗(yàn)評價(jià)在體外在M109細(xì)胞中脂質(zhì)體輸送CPT83的能力。另外，也評價(jià)了溶解在二甲亞砜(DMSO)中的CPT83的細(xì)胞毒性，以與和ST983脂質(zhì)體復(fù)合的相同分子的毒性進(jìn)行比較。在細(xì)胞毒性測定中使用脂質(zhì)體-CPT83復(fù)合物，其濃度示于以下表2.1，2.2和3.3，它是SUV和MLV構(gòu)型。所用的摩爾比為脂質(zhì)體∶CPT83＝40∶1。SUV和MLV構(gòu)型的ST983-CPT83復(fù)合物的細(xì)胞毒性平均值示于表2.1，2.2和2.3，它提示ST983脂質(zhì)體能以非常近似于DMSO的方式輸送CPT83，并顯示同樣數(shù)量等級的細(xì)胞毒性。表2.1ST983SUV-CPT83的細(xì)胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數(shù)。表2.2ST983MLV-CPT83的細(xì)胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數(shù)。表2.3DMSO-CPT83的細(xì)胞毒性(SRB)濃度單位為μM表中的值指在540nm的光密度讀數(shù)。ST983脂質(zhì)體-CPT184復(fù)合物的生物活性測定例18脂質(zhì)體(以下命名為脂質(zhì)體A)和例20脂質(zhì)體(以下命名為脂質(zhì)體B)的生物活性。對健康小鼠的毒性按q4d×4(每日4次，給藥4天)的方案，以1.2mg/kg的劑量口服、靜脈注射脂質(zhì)體A和B，與游離的CPT184相比較。兩種脂質(zhì)體對體重、肺、脾和腎沒有顯著影響。靜脈注射脂質(zhì)體B，口服脂質(zhì)體A，與游離的CPT184相似，對胸腺產(chǎn)生影響。靜脈注射脂質(zhì)體A僅有小的影響。24小時(shí)后兩種脂質(zhì)體未使血液學(xué)參數(shù)顯示顯著的變化。，按qd5的方案靜脈注射脂質(zhì)A顯示與游離的CPT184相似的毒性。脂質(zhì)體的肺向性脂質(zhì)體A和B顯示主要在肺水平聚集。靜脈注射1.2mg/kg劑量的脂質(zhì)體。將溶解在DMSO中的游離CPT184以1.2mg/kg的劑量口服給藥。在最后一次給藥后24小時(shí)處死動(dòng)物，即健康小鼠。從動(dòng)物體取出肺在液氮中冷凍。當(dāng)融化后，將組織匯集并在0.1％醋酸/乙腈溶液中1∶5均質(zhì)化。將勻漿分成3份，2份加入CPT184測定回收率。在16,000g將3份樣品離心5分鐘。收集上清液并用二氯甲烷提取。用speedvac將有機(jī)相干燥，殘余物再次溶解在乙腈中以在50μL中含有相當(dāng)于一只動(dòng)物的量，在HPLC上加樣。在WatersSymmetryC183.5μm(4.6×7.5mm)上進(jìn)行HPLC。使用在370nm激發(fā)和510nm發(fā)射的Merck熒光計(jì)作為檢測器。洗脫劑是水/乙腈60∶40，等度洗脫。樣品體積為50μL。CPT184的回收率約為70％。脂質(zhì)體A和B的CPT184聚集水平高于DMSO中游離的CPT184，如圖3所示。基因傳遞制備脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物將脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA分別適當(dāng)稀釋在PBS中。然后將DNA加到脂質(zhì)體中，將脂質(zhì)體DNA復(fù)合物在約4℃保持約30min以促進(jìn)形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體-DNA相互作用體。在體外試驗(yàn)中，使用1，2-二油?；?3-三甲基-銨丙烷(DOTAP)作為參考的陽離子脂質(zhì)；每2×105HeLa細(xì)胞使用2.5μg質(zhì)粒DNA，脂質(zhì)體濃度為9μM。在體內(nèi)試驗(yàn)中，使用DOTAP和[2，3(二油?；?丙基]三甲基銨(DOTMA)作為參考的陽離子脂質(zhì)。結(jié)果中的摩爾比定義為每毫克NDA中各陽離子脂質(zhì)的nmol濃度。在體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，每只動(dòng)物使用25μg質(zhì)粒DNA。在這些試驗(yàn)中使用的質(zhì)粒pCMVluc含有受巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制的蟲螢光素酶基因cDNA。螢光素酶活性的定量測定用BoehringerMannheimkit(catno.1669893)方法測定細(xì)胞和組織內(nèi)蛋白質(zhì)螢光素酶活性。在PBS中洗滌細(xì)胞3次，然后從平板中移出，在溶胞緩沖液(lysisbuffer)(100mM磷酸鉀pH7.8.1mM二硫蘇糖醇-DTT)中散布成一層，然后進(jìn)行3次連續(xù)的冷凍融化循環(huán)。在1.5mLEppendorf試管中離心后，上清液在提取蛋白質(zhì)后5小時(shí)內(nèi)進(jìn)行發(fā)光試驗(yàn)。用在562nm的發(fā)光計(jì)測定發(fā)射出的光。在液氮中首次冷凍后細(xì)細(xì)研磨得到粉末。將組織再次懸浮在溶胞緩沖液中，在冰中培養(yǎng)10-15分鐘。然后將樣品在2mlEppendorf試管中離心，測定上清液的熒光素酶活性。斑點(diǎn)印跡分析按Sanbrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis在MolecularCloning(分子克隆)1989記載的堿性溶胞過程提取細(xì)胞DNA。使用Biorad斑點(diǎn)印跡裝置將從細(xì)胞中提取得到的5μgDNA預(yù)吸附在尼龍濾器(Boehringer)上。在65℃將這些濾器與含有0.5M焦磷酸鈉(NaPi)，1mMEDTA，7％SDS的溶液預(yù)雜交4小時(shí)。用質(zhì)粒pCMVlucDNA作模板和隨機(jī)接觸過抗原的AmershamKit制備32P(α)標(biāo)記的探針。使用1×106CPM/ml在42℃將濾器在同樣的預(yù)雜交緩沖液中雜交12小時(shí)。然后在65℃，在含有40mMNaPi，1％SDS的緩沖液中將濾器洗滌3次，每次10分鐘。借助磷光劑成像進(jìn)行放射自顯影分析，使用由β射線活化的磷光屏(phosphorscreens)，借助與圖像分析程序結(jié)合的光電倍增管系統(tǒng)讀數(shù)和測量。使用IP-LabGel圖像分析程序在斑點(diǎn)印跡上進(jìn)行的光密度法。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試驗(yàn)在體內(nèi)和體外進(jìn)行了一些質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。使用DOTAP和DOTMA作為參考陽離子脂質(zhì)，Abkenet等在《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1993，90，6518充分表征和記載了其轉(zhuǎn)染效率。在體內(nèi)試驗(yàn)中，分析了陽離子脂質(zhì)與質(zhì)粒DNA各種不同的摩爾比，以測定各陽離子脂質(zhì)的活性和各自對于基因轉(zhuǎn)移最有效的濃度。用pCMVluc質(zhì)粒中含有的熒光素酶基因轉(zhuǎn)運(yùn)體評價(jià)了各種脂質(zhì)體體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)染能力，即以用于快速定量的相對發(fā)光單位(RLU)(以上已敘述)表述的其活性。如上所述，作為一種選擇，通過對從預(yù)吸收在硝酸纖維素濾器上(斑點(diǎn)印跡)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取并與32P-標(biāo)記的質(zhì)粒DNA標(biāo)記物雜交DNA樣品進(jìn)行光密度分析(磷光劑成像)，評價(jià)了一些陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率對ST983脂質(zhì)體∶DNA摩爾比的依賴性在此試驗(yàn)中，評價(jià)了肝、肺和心的轉(zhuǎn)染效率對ST983脂質(zhì)體∶質(zhì)粒DNA摩爾比的依賴性。對以下與每μgDNA對應(yīng)的納摩爾(nmol)脂質(zhì)體的比例12∶1，24∶1，36∶1和48∶1進(jìn)行了測定。小鼠每組6只，體重約為20g，用分散在200μlPBS中的上述數(shù)量的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物對其靜脈注射，在并在給予復(fù)合物24小時(shí)后處死。從肺、心和肝組織中提取的熒光素酶活性顯示了在所測定的所有摩爾比的情況下，熒光素酶主要在肺分布。實(shí)際上，從三種組織中提取得到的熒光素酶約99％分布在肺中。已證明最優(yōu)的脂質(zhì)體∶DNA摩爾比為12∶1。所得結(jié)果示于下表3。表3作為ST983∶DNA摩爾比(μgDNA)的函數(shù)的ST983體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率對SRT983脂質(zhì)體制劑之間的差異的依賴性將表示為相對發(fā)光單位(RLU)的熒光素酶活性值，報(bào)告于表4，所測試的蟲熒光素酶是從接受靜脈注射不同的ST983脂質(zhì)體制劑的Balb/c小鼠的肺提取得到的，脂質(zhì)體制劑中脂質(zhì)體∶DNA的摩爾比例為12∶1。所得數(shù)據(jù)，除證明ST983脂質(zhì)體能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)粒DNAI，其效率高于和/或類似于DOTMA外，也顯示了在不同ST983制劑之間的一定程度的變異性。這可能是由于一些物理化學(xué)特性如脂質(zhì)體囊的體積、或與不同的ST983制劑的單層(SUV)或多層結(jié)構(gòu)相關(guān)的囊的有關(guān)性質(zhì)造成的。實(shí)際上，R.I.Mahato等在《人類基因療法》9.19982083已充分說明了以上列出的物理化學(xué)參數(shù)，它們是達(dá)到最佳體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染效率的決定因素。表4ST983的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率(不同的制劑)<tablesid="table8"num="008"><tablewidth="733">脂質(zhì)體平均RLU/mg蛋白質(zhì)±s.d.肺ST983∶DNA摩爾比ST983/#72ST983/#73ST983/#4對照DOTMA3118235±1847267285835±8270671022117±604021523±983410125±18952012∶112∶112∶112∶1</table></tables>體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率對ST983-DNA脂質(zhì)體復(fù)合物預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的依賴性表5列出了從接受靜脈注射ST983脂質(zhì)體的小鼠的肝、肺、心提取得到的相對發(fā)光單位，此脂質(zhì)體在給藥前與質(zhì)粒DNA預(yù)培養(yǎng)30分鐘或3小時(shí)。用與DNA預(yù)培養(yǎng)3小時(shí)的ST983處理的動(dòng)物與用預(yù)培養(yǎng)30分鐘的相同脂質(zhì)體處理的動(dòng)物相比，在肺和心的熒光素酶活性方面顯示增長到5倍。此結(jié)果提示穩(wěn)定的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的形成具有時(shí)間依賴性，并且在測定體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率方面具有關(guān)鍵的作用。表5ST983的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率作為脂質(zhì)體/DNA預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的函數(shù)<tablesid="table9"num="009"><tablewidth="832">脂質(zhì)體時(shí)間平均RLU/mg蛋白質(zhì)±s.d.T983∶DNA摩爾比肝肺心ST983ST98330分鐘3h3526±2602497±682874882±659174225656±2117318118±26337100±185312∶112∶1</table></tables>ST772脂質(zhì)體在HeLa細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染圖1和2顯示ST772脂質(zhì)體在HeLa細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率。為此目的，從ST272轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取DNA進(jìn)行了光密度分析，用DOTAP作為對照陽離子脂質(zhì)。斑點(diǎn)分析的結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA的數(shù)量與由DOTAP得到的結(jié)果在相同數(shù)量級。權(quán)利要求1.含有式(II)化合物的脂質(zhì)體的用途，用于輸送藥物或有化妝品活性的物質(zhì)，其中R3是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的?；湥籖4是飽和或不飽和，直線或分支，有4-26個(gè)碳原子的烷基鏈；并且X-是藥理學(xué)可接受的酸的陰離子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中R3優(yōu)選壬?；?、十二烷?；⑷舛罐Ⅴ；?、棕櫚?；?、硬脂?；蛴王；?。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中R4優(yōu)選壬烷基、十一烷基、十四烷基、十六烷基或油基。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中X-選自氯、溴、碘、門冬氨酸根、酸式門冬氨酸根、檸檬酸根、酸式檸檬酸根、酒石酸根、酸式酒石酸根、磷酸根、酸式磷酸根、延胡索酸根、酸式延胡索酸根、甘油磷酸根、葡萄糖磷酸根、乳酸根、順丁烯二酸根、酸式順丁烯二酸根、粘酸根、乳清酸根、草酸根、酸式草酸根、硫酸根、酸式硫酸根、三氯醋酸根、三氟醋酸根、甲磺酸根、雙羥萘酸根和酸式雙羥萘酸根。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的用途，其中的化合物選自-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十一烷基酯；-硬脂?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯；-棕櫚?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯；-肉豆蔻?；鵏-肉堿氯化物十四烷基酯；-棕櫚酰基L-肉堿溴化物十六烷基酯；-油?；鵏-肉堿氯化物油基酯.6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物選自抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗原生動(dòng)物劑，具有心血管系統(tǒng)活性的化合物，或免疫原性肽。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述的藥物是抗癌劑或抗血管生成劑.8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的抗癌劑選自紫杉醇或喜樹堿的衍生物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述的喜樹堿的衍生物選自-7-芐氧基亞氨甲基喜樹堿或-7-丁氧基亞氨基甲基喜樹堿。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中脂質(zhì)體還含有輔助性脂質(zhì)。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中的輔助性脂質(zhì)選自膽固醇，1-棕櫚?；?2-油?；字；憠A或二油基磷脂?；憠A。12.含有根據(jù)權(quán)利要求1所述脂質(zhì)體的組合物，用于輸送藥物或具有化妝品活性的物質(zhì)。13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其中所述的藥物選自抗癌劑、抗血管生成劑、抗病毒劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗原生動(dòng)物劑，具有心血管系統(tǒng)活性的藥物，或免疫原性肽。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的組合物，可以通過口服、腸道外、肌內(nèi)、靜脈注射、皮下、透皮給藥，或以鼻或口噴霧劑的形式給藥。全文摘要公開了L－肉堿和烷酰基L－肉堿的酯，它們可以作為陽離子脂質(zhì)用于細(xì)胞內(nèi)釋放藥理學(xué)的活性化合物。也公開了具有式(II)結(jié)構(gòu)的L－肉堿和烷?；鵏－肉堿的新酯，其中R基團(tuán)的定義如說明書所述。文檔編號C07C229/00GK1823731SQ200510129598公開日2006年8月30日申請日期2000年4月11日優(yōu)先權(quán)日1999年4月13日發(fā)明者C·匹薩諾,M·O·廷提,M·圣塔尼羅,L·克里泰利,G·薩爾瓦托利申請人:希格馬托制藥工業(yè)公司