專利名稱：一種多酚酸有效部位的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從中藥中提取有效部位的方法。具體地說，涉及從鼠尾草屬植物中提取多酚酸有效部位的方法，更具體地涉及從丹參中提取多酚酸有效部位的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，丹參是一種用于治療如心絞痛、高血壓、冠心病和中風(fēng)等心血管性疾病的常用有效中藥。但一般用的都是從丹參中提取的粗提品，或直接用丹參切片。近二十多年來，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參中的有效成分，主要是多酚酸類化合物，特別是丹酚酸B及其鹽類。體外研究結(jié)果顯示，丹酚酸B及其鹽類，除了用于治療心血管性疾病(中國專利CN02155004，01110378和98111076)外，還具有治療其它多種疾病的潛力，如慢性肝病(中國專利CN 99113644)、腫瘤(中國專利CN 02136970和94103933)、消化性潰瘍(中國專利CN 98114172)、乙型肝炎(中國專利CN 95105902)和艾滋病等(美國專利US 6043276，中國專利CN 95105902和99809677，參考文獻(xiàn)Antiviral Research 5591-96，2002)。從其它鼠尾草屬的植物，如Coleus parvifolius和Cordia spinescens中，分離出的丹酚酸B及其鹽類，體外實(shí)驗(yàn)同樣證明它們具有抗艾滋病毒的作用(參考文獻(xiàn)Phytotherapy Research 17232-239，2003和11490-495，1997)。
隨著丹參中多酚酸類化合物新用途的不斷發(fā)現(xiàn)，分離純化多酚酸類化合物制備方法的專利也在不斷增加。這些方法大致可分為兩種類型(一)先用熱水浸提丹參粉末，浸出水溶性的多酚酸后，再經(jīng)不同方法純化。如再用酸提和大孔樹脂分離(中國專利CN02160771)；用大孔樹脂層析和乙醇精制(中國專利CN 98111076)；酸提，Sephadex LH20和高壓液相層析(中國專利CN 99809677)；或再經(jīng)硅膠樹脂和高壓液相層析(中國專利CN98114172)。(二)用較低濃度的有機(jī)溶劑水溶液取代熱水浸提丹參粉末，浸出水溶性的多酚酸后，再經(jīng)不同方法純化。如用50-80％丙酮水或60-95％乙醇水對丹參粉末浸提，再用不同的樹脂、或某種樹脂加高壓液相層析(中國專利CN 02160771，02137375和95113971)進(jìn)行純化。
本發(fā)明的目的，是建立一種工藝簡單、成本低和產(chǎn)品質(zhì)量高而穩(wěn)定可控的方法，從鼠尾草屬植物特別是丹參中分離純化出一種多酚酸有效部位，滿足市場的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用一種簡單易行的二步法，從鼠尾草屬植物特別是丹參中分離純化出一種多酚酸部位。由于制備方法十分簡單，因此結(jié)果重復(fù)性好，組合物的質(zhì)量完全穩(wěn)定可控。本發(fā)明的方法包括以下兩個(gè)步驟(1)植物粉末提取植物粉末用無水甲醇或者濃度大于95％的甲醇水溶液提取，提取充分后除去甲醇，殘留物溶于水后離心過濾，除去沉淀；(2)柱層析濾液經(jīng)大孔樹脂柱層析，以適量水洗柱后，用甲醇水溶液洗脫，減壓蒸去甲醇和水，殘留物干燥后即得多酚酸有效部位。
所述用無水甲醇或濃度大于95％的甲醇水溶液提取，優(yōu)選為用無水甲醇提取。
所述提取包括浸漬法或者滲漉法。
所得多酚酸有效部位，經(jīng)高壓液相層析，高效硅膠簿板層析，比色和質(zhì)譜等分析，發(fā)現(xiàn)它的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，它們的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，占總重量的73-75％(如圖2和圖3所示)，它們的分子量分別是718，740和773(如圖4和圖6所示)。次要成分是咖啡酸三聚體和二聚體，兩者共占12-14％(如圖2和圖3所示)。根據(jù)質(zhì)譜分析，咖啡酸三聚體以分子量520和516的多酚酸為主(如圖7所示)；二聚體以分子量為296的多酚酸為主(如圖8所示)。
在相同實(shí)驗(yàn)條件下，對來自四個(gè)不同時(shí)間制備的多酚酸有效部位，比較了它們的高壓液相層析和高效硅膠簿板層析。結(jié)果顯示，四批多酚酸有效部位，無論是它們的高壓液相層析，還是高效硅膠簿板層析圖譜，彼此都十分相似(如圖9和圖10所示)。說明用本發(fā)明制備的多酚酸有效部位，結(jié)果重復(fù)性好，組合物的質(zhì)量完全穩(wěn)定可控。
本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)的制備方法不同之處在于，打破常規(guī)，第一步用無水甲醇或者濃度大于95％的甲醇水溶液取代熱水或現(xiàn)有技術(shù)所采用的濃度較低的有機(jī)溶劑水溶液，浸提植物粉末。實(shí)驗(yàn)表明，用熱水或現(xiàn)有技術(shù)所采用的濃度較低的有機(jī)溶劑水溶液浸提100克丹參粉末，浸出物可達(dá)到50-60克，而用無水甲醇或者濃度大于95％的甲醇水溶液浸提，浸出物只有20-30克左右。由于甲醇的疏水性低，這一變革既可以浸出水溶性的多酚酸，又可以大量減少丹參中其它一些易溶于水的物質(zhì)進(jìn)入浸提液而干擾后面的純化。因此，再進(jìn)行一步大孔樹脂層析，便可得到更富集的多酚酸有效部位，它的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總重量的73-75％(丹酚酸B是咖啡酸的四聚體)；次要成分是咖啡酸的三聚體和二聚體，兩者共占12-14％。


圖1是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽的分子量與結(jié)構(gòu)式，其中，丹酚酸B 718R＝HH鎂鹽 740R＝Mg銨鉀鹽 773R＝NH4K圖2是實(shí)施例1的多酚酸有效部位的高壓液相色譜圖。
圖3是實(shí)施例1的產(chǎn)物和檢測例1中的餾分7、6和5的高效硅膠簿板層析譜。
圖4是實(shí)施例1的多酚酸有效部位的質(zhì)譜(ES-MS)圖。
圖5是對照用的純丹酚酸B及其鹽類的質(zhì)譜圖。
圖6是實(shí)施例1的多酚酸有效部位高壓液相色譜分離所得餾分7的質(zhì)譜圖。
圖7是實(shí)施例1的多酚酸有效部位高壓液相色譜分離所得餾分6的質(zhì)譜圖。
圖8是實(shí)施例1的多酚酸有效部位高壓液相色譜分離所得餾分5的質(zhì)譜圖。
圖9是四批提取物的高壓液相色譜圖。
圖10是四批提取物的高效硅膠簿板層析圖。
具體實(shí)施例方式
下面提供的實(shí)施例僅為進(jìn)一步說明本發(fā)明，它們對本發(fā)明并不構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例1第一步，無水甲醇提取向10公斤丹參粉末內(nèi)，加無水甲醇浸泡三次，依次加60，50和40升，每次浸泡8小時(shí)，合并三次浸出液。減壓蒸去浸出液中甲醇，加30升水，使殘留物溶解后，離心過濾(4000轉(zhuǎn)/分)，收集濾液。
第二步，柱層析濾液經(jīng)AmberliteXAD-4柱層析。層析柱直徑為30厘米，高80厘米，內(nèi)裝20公斤樹脂。將近30升濾液慢慢加入柱內(nèi)，依次用水、20％和80％的甲醇水溶液洗柱，每次150升。所要的多酚酸有效部位洗脫在80％甲醇水溶液內(nèi)。減壓蒸去甲醇和水，進(jìn)一步干燥后即得到淺棕色多酚酸有效部位0.22公斤，按丹參計(jì)得率為2.2％。以上二步，除蒸餾外，均在室溫下操作。
檢測例1多酚酸有效部位的高壓液相色譜分析將實(shí)施例1的產(chǎn)物進(jìn)行高壓液相色譜分析，采用反相柱C18(10×250mm)，進(jìn)樣量125微克，以甲醇-水-三氟醋酸洗脫，體積比為4∶6∶0.05％，流速為1.5ml/min。結(jié)果見圖2，其中，餾分5和6以咖啡酸二聚體和三聚體為主；餾分7為丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽。并經(jīng)稱量法鑒定，餾分5和6共占總進(jìn)樣量的13.1％，餾分7占75.1％。
檢測例2多酚酸有效部位的高效硅膠簿板層析分析將實(shí)施例1的產(chǎn)物和檢測例1中的餾分7、6和5進(jìn)行高效硅膠簿板層析。點(diǎn)樣順序?yàn)?.實(shí)施例1的產(chǎn)物；2.餾分5；3.餾分6；4.餾分7；5.對照品純丹酚酸B及其鎂鹽。展開采用氯仿-丙酮-甲酸(體積比＝8∶8∶1)。層析板用含8％的磷酸，3％醋酸銅水溶液噴霧，200℃加熱碳化顯色。圖3為高效硅膠簿板層析結(jié)果。圖中，a和b分別表示以咖啡酸三聚體和二聚體為主的混合物的移動(dòng)位置。c表示丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽移動(dòng)的位置。
檢測例3多酚酸有效部位的質(zhì)譜(ES-MS)分析采用負(fù)離子反映模式。樣品為水溶液，樣品進(jìn)樣量約5微克。圖4為多酚酸有效部位的質(zhì)譜圖。圖中，丹酚酸B的結(jié)構(gòu)式如右上圖，屬咖啡酸的四聚體，分子量為718，故m/z717來自丹酚酸B；m/z739和771則分別來自丹酚酸B的鎂鹽和銨鉀鹽。離子m/z519及其附近較小的m/z559，515和493，都來自屬于是咖啡酸的三聚體，它們有的可能本來就存在于提取物內(nèi)。在進(jìn)行質(zhì)譜時(shí)，分子會(huì)發(fā)生降解和聚合，因此有的可能來自丹酚酸B及其鹽類降解物，如m/z519有可能來自丹酚酸B去掉一個(gè)水合咖啡酸。離子m/z321，339，和295，都來自屬于是咖啡酸的二聚體，像三聚體一樣，它們有的可能本來就存在于提取物內(nèi)，有的可能來自三和四聚體分子在測定時(shí)生成的碎片。在m/z1457附近的離子是咖啡酸四聚體的聚合物，如m/z1457就是來自丹酚酸B及其鎂鹽的聚合物。圖中44是CO2的分子量，16是O的原子量。
檢測例4.對照用純丹酚酸B及其鹽類的質(zhì)譜圖實(shí)驗(yàn)條件同檢測例3，結(jié)果見圖5。圖中可見丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽離子峰，同時(shí)也可見在測定時(shí)它們產(chǎn)生的分子碎片咖啡酸三聚體，二聚體和它們的聚合物的離子峰。這些離子峰與上述組合物的相應(yīng)的離子峰基本上一致。定量分析結(jié)果表明，提取物中丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽占總重量的75.1％，咖啡酸三聚體和二聚體共占13.1％，此處質(zhì)譜分析結(jié)果與其吻合。其它說明同檢測例3。
檢測例5餾分7的質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)條件同檢測例3，結(jié)果見圖6。圖中可見丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽離子峰，它們的分子碎片咖啡酸三聚體，二聚體和它們的聚合物的離子峰，都與圖5純丹酚酸B及其鹽類的質(zhì)譜圖上相應(yīng)的離子峰幾乎一致。表明溜分7是由丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽組成。其它說明同檢測例3。
檢測例6餾分6的質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)條件同檢測例3，結(jié)果見圖7。其中，離子m/z519，521和515都屬于咖啡酸三聚體。離子m/z519來自丹酚酸B去掉一個(gè)水合咖啡酸分子；m/z521可能來自離子m/z519的飽和物；m/z515可能來自丹酚酸A的鈉鹽(494+22-1)。高壓液相層析時(shí)，溜分6和7有一點(diǎn)重疊，因此圖7可見丹酚酸B鎂鹽的離子峰。離子m/z359和321屬于咖啡酸二聚體，它們可能來自在測定時(shí)咖啡酸三和四聚體產(chǎn)生的分子碎片，在本實(shí)驗(yàn)條件下高壓液相層析時(shí)它們不能和三聚體完全分開。
檢測例7餾分5的質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)條件同檢測例3，結(jié)果見圖8。其中，離子m/z379，335和295都屬于咖啡酸二聚體，離子m/z379可能來自前紫草酸的鈉鹽，m/z335是m/z321的甲酯，m/z295來自丹酚酸G去掉一個(gè)CO2。正如前述，離子m/z559，521，515和493都屬于咖啡酸三聚體，可能在本實(shí)驗(yàn)條件下高壓液相層析時(shí)，它們和不能和二聚體完全分開。
檢測例8四批提取物的高壓液相色譜分析圖9是不同時(shí)間四批提取物的高壓液相色譜圖，其中，A，B，C和D分別表示樣品來自四個(gè)不同的批號(hào)。這里，在進(jìn)行層析時(shí)，0到30分鐘，儀器靈敏度為0.02，30分鐘后，改為0.1，這表示同樣的峰高，和30分鐘后的相比，30分鐘前的被放大了5倍。其它說明如圖2。
檢測例9四批提取物的高效硅膠簿板層析圖10是上述四批提取物的高效硅膠簿板層析，其中，1到4點(diǎn)的樣品來自與圖8相同的四個(gè)不同批號(hào)；5是對照品純丹酚酸B及其鎂鹽。點(diǎn)樣量都是30微克左右。其它說明如圖3。
檢測例10多酚酸有效部位中重金屬、甲醇和氯仿殘留物含量測定按照2000年版本的中國藥典的要求，測定了實(shí)施例1中得到的多酚酸有效部位中重金屬、甲醇和氯仿殘留物的含量，發(fā)現(xiàn)它們均低于國家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的含量限值。
檢驗(yàn)結(jié)果如下

具體的測定條件和測定法如下溶劑殘留量的測定條件儀器為Agilent 6890氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器；色譜柱為DB624(6％氰丙基苯-94％甲基硅氧烷基共聚物，30m×0.53mm×3μm)色譜柱；載氣為氮?dú)?；柱流速為氮?dú)?.0ml/min(恒流)；分流進(jìn)樣(分流比1∶1)；柱溫使用程序升溫，初始溫度為50℃，保持5分鐘，然后以每分鐘50℃的升溫速率升至80℃，保持6分鐘，然后以每分鐘50℃的升溫速率升至200℃，保持4分鐘；進(jìn)樣口溫度為180℃；檢測器溫度為260℃；進(jìn)樣量為1.0μl。
溶劑殘留量的測定法為精密稱取甲醇、氯仿各適量，加二甲亞砜定量稀釋制成每1ml中分別約含甲醇150μg、氯仿3μg的溶液作為對照品；另取本品約0.5g，精密稱定，精密加入二甲亞砜10ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。精密量取上述兩種溶液各1μl，用DB624(6％氰丙基苯-94％甲基硅氧烷基共聚物，30m×0.53mm×3μm)色譜柱，依法進(jìn)行測定，記錄色譜圖，各組峰間的分離度應(yīng)符合要求，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，甲醇≤3000ppm，氯仿≤60ppm。
重金屬的測量方法是取熾灼殘?jiān)?xiàng)下遺留的殘?jiān)?，照中國藥?000年版二部附錄VIII H(第二法)項(xiàng)下方法檢查。與標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液(10mg/ml)1ml制成的對照溶液比較。供試品溶液的顏色均淺于對照液(≤10ppm)。
實(shí)施例2用98％的甲醇水溶液提取向10公斤丹參粉末內(nèi)，慢慢加入150升98％的甲醇水溶液，經(jīng)滲漉法提取。取得提取液之后，包括第二步的操作，均同實(shí)施例1。經(jīng)檢測，所得多酚酸有效部位的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總重量的74.0％，次要成分咖啡酸三聚體和咖啡酸二聚體共占總量的13.2％。按丹參計(jì)本例得率為2.3％。
實(shí)施例3用95％的甲醇水溶液提取本例除用95％的甲醇水溶液取代無水甲醇外，其它操作均同實(shí)施例1。經(jīng)檢測，所得多酚酸有效部位的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總重量的73.7％，次要成分咖啡酸三聚體和咖啡酸二聚體共占總量的12.5％。按丹參計(jì)本例得率為2.1％。
權(quán)利要求
1.從鼠尾草屬植物中提取多酚酸有效部位的方法，其特征在于包括以下兩個(gè)步驟(1)植物粉末提取植物粉末用無水甲醇或濃度大于95％的甲醇水溶液提取，提取充分后除去甲醇，殘留物溶于水后離心過濾，除去沉淀；(2)柱層析濾液經(jīng)大孔樹脂柱層析，以適量水洗柱后，用甲醇水溶液洗脫，減壓蒸去甲醇和水，殘留物干燥后即得多酚酸有效部位。
2.如權(quán)利要求1所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述鼠尾草屬植物為丹參。
3.如權(quán)利要求1所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述提取包括浸漬法或者滲漉法。
4.如權(quán)利要求1所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述用無水甲醇或濃度大于95％的甲醇水溶液提取，優(yōu)選為用無水甲醇提取。
5.如1到4任一權(quán)利要求所述的提取多酚酸有效部位的方法，其特征在于提取所得多酚酸有效部位的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總重量的73-75％；次要成分是咖啡酸的三聚體和二聚體，兩者共占12-14％。
6.如1到4任一權(quán)利要求所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述大孔樹脂包括Amberlite XAD系列，Diaion HP系列和國產(chǎn)非極性大孔樹脂。
7.如權(quán)利要求6所述的提取多酚酸有效部位的方法，其中所述國產(chǎn)非極性大孔樹脂為GDX-104。
全文摘要
本發(fā)明公開一種多酚酸有效部位的提取方法。分兩步先采用無水甲醇或濃度大于95％的甲醇水溶液提取，接下來用大孔樹脂分離。所得多酚酸有效部位的主要成分是丹酚酸B及其鎂鹽和銨鉀鹽，占總重量的73－75％；次要成分是咖啡酸三聚體和二聚體，兩者共占12－14％。本發(fā)明工藝簡單，產(chǎn)品中有效成分含量高，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07D307/00GK1813893SQ200510129368
公開日2006年8月9日 申請日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月6日
發(fā)明者邵明川, 邵明順 申請人:百愈生物醫(yī)藥有限公司