本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法。

背景技術(shù)：

MSTN是肌肉生長抑制素蛋白(myostatin,MSTN)，屬轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β)超家族成員。自1997年發(fā)現(xiàn)其以來，大量的研究結(jié)果表明它是一個(gè)骨骼肌生長抑制基因。MSTN-/-小鼠體重較之野生型小鼠，體重增重約30％，骨骼肌增重約1-2倍，骨骼肌肌纖維的數(shù)目增加約86％。自然情況下，黃牛MSTN基因的突變個(gè)體肌肉顯著生長，出現(xiàn)“雙肌臀”現(xiàn)象，這種雙肌現(xiàn)象在自然界中多種動(dòng)物體上，甚至有些相關(guān)記錄表明部分人由于某些原因也會(huì)在體征上出現(xiàn)雙肌的表型。

改變基因構(gòu)造通常是進(jìn)行基因突變，即將DNA分子中發(fā)生堿基對的增添、缺失或改變而引起的基因結(jié)構(gòu)改變，而基因突變往往是不定向的，隨機(jī)的，未知的。為提高改變基因結(jié)構(gòu)的效率，在現(xiàn)今的分子生物學(xué)領(lǐng)域中，通常是從特定生物體中提取MSTN基因，再根據(jù)基因組的編碼順序來編碼進(jìn)行同源性替代靶基因使上述的MSTN基因被取代或破壞而失活，達(dá)到靶向敲除基因的目的，靶向敲除精確度高、容易進(jìn)行形狀分析篩選，大大提高了工作效率。然而該方法僅能對單一物種的某一基因進(jìn)行基因敲除，不能適用于多物種。

目前，MSTN基因的資料已比較齊全，在國內(nèi)外經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)后，也獲得了一些MSTN基因敲除細(xì)胞系。我國的家畜、家禽的產(chǎn)肉性能偏低，缺少高產(chǎn)的肉用家畜、家禽，有研究用ZFNs技術(shù)、TALEN技術(shù)等在家畜、家禽MSTN基因的特定位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯使其發(fā)生突變，篩選獲得有效的基因突變細(xì)胞系，并進(jìn)行這兩種不同基因編輯技術(shù)的突變效率的檢測，為我國家禽、家畜的加速篩選和肉品質(zhì)的改良及生產(chǎn)提供材料。

基因編輯用的ZFNs和TALEN技術(shù)，然而這兩種技術(shù)如果要實(shí)現(xiàn)定向編輯，則必須合成DNA序列特異性結(jié)合蛋白模塊，即DNA剪切的實(shí)現(xiàn)有賴于FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域。這一要求大大限制了這兩種技術(shù)的發(fā)展，而CRISPR/cas9技術(shù)則通過gRNA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶實(shí)現(xiàn)DNA特異位點(diǎn)的編輯，突破了ZFNs和TALEN技術(shù)的發(fā)展限制，是更為高效的基因特異位點(diǎn)的編輯技術(shù)。

目前，有些研究開始使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除具有效率更高，操作更簡便的優(yōu)點(diǎn)，但是還未開發(fā)一種可同時(shí)運(yùn)用于敲除多物種MSTN基因的重組載體，找出一種可快速、精確的找到靶序列的檢測方法。例如PCT專利CN 105142669 A公開了基于CRISPR的基因組修飾和調(diào)控，說明了CRISPR系統(tǒng)可用于基因組的修飾和調(diào)控，用CRISPR系統(tǒng)比ZFN和TALEN更簡單、高效的優(yōu)點(diǎn)，但該專利未公布針對MSTN基因敲除的特定酶切位點(diǎn)和堿基序列，未公布針對MSTN基因的優(yōu)選片段進(jìn)行檢測、選擇的方法，而且也未公布本發(fā)明針對MSTN基因敲除所用的重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建；中國專利CN 104232669 A公開了一種采用基因敲除法構(gòu)建基于魚類CRISPR/Cas9系統(tǒng)的載體及其構(gòu)建方法，但本技術(shù)方案僅能針對魚類的MSTN基因敲除，不能針對其它物種，普適率低，同時(shí)本技術(shù)方案也沒有公開一種能快速、精確的找到靶序列的檢測方法。因此，本發(fā)明需要解決以下幾個(gè)問題：(1)構(gòu)建能靶向敲除多物種的MSTN基因編輯方法；(2)現(xiàn)有技術(shù)在基因編輯過程特別是人和水?；蚪M編輯的技術(shù)平臺(tái)存在效率低，適用性低的特點(diǎn),整個(gè)平臺(tái)仍需進(jìn)行優(yōu)化和條件摸索；(3)現(xiàn)有技術(shù)沒有一種能快速、精確的找到靶序列的檢測方法，從而進(jìn)一步提高基因編輯的成功率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述內(nèi)容，有必要提供一種簡單、高效、準(zhǔn)確、適用于多物種特別是針對人和水牛的MSTN基因敲除方法，并進(jìn)一步提高對靶序列的檢測效率，能快速、精確的找到靶序列，提高基因編輯的成功率。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)構(gòu)建pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2載體，構(gòu)建方法如下：

A、從基因數(shù)據(jù)庫中下載多物種MSTN基因的核苷酸序列，并進(jìn)行同源比對選取兩對靶序列，分別為MSTN靶序列1：5’-AGGCACTGGTATTTGGCAGAG-3’和MSTN靶序列2：5’-AAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3’；

B.根據(jù)同源對比結(jié)果和gRNA的PAM設(shè)計(jì)原則，合成兩對與靶序列不同，表達(dá)的蛋白相同，帶有相同BsmBI粘性末端的DNA雙鏈，分別命名為：MSTN-1和MSTN-2；

C.用BsmBI酶切pPDNA330質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再進(jìn)行切膠回收；

D.用連接酶將MSTN-1和MSTN-2分別與BsmBI酶切后的pPDNA330質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒載體，分別命名為：pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2；

(2)對重組質(zhì)粒載體pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2進(jìn)行敲除效率的篩選驗(yàn)證、對比，選擇MSTN基因敲除效率更高的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞；

(3)轉(zhuǎn)染不同物種的受體細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染之后的受體細(xì)胞，并提取細(xì)胞基因組進(jìn)行測序，根據(jù)基因組測序結(jié)果合成檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接入pEASY-T1載體，挑取單克隆細(xì)菌，進(jìn)行測序，對MSTN基因敲除表達(dá)結(jié)果進(jìn)行檢測。

進(jìn)一步的，所述MSTN-1的上游序列為，5’-ACCGCTCTGCCAAATACCAGTGCCT-3’，下游序列為，5’-AAACAGGCACTGGTATTTGGCAGAG-3’；MSTN-2的上游序列5’-ACCGAAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3’，下游序列為，5’-AAACGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTT-3’。。

進(jìn)一步的，所述BsmBI酶切體系反應(yīng)溫度為50-60℃，時(shí)間為2.5-3.5h，酶切體系為：2.5-3.5μg的pPDNA330質(zhì)粒，1.5-2.5μL的10×NEB Buffer3，0.2-0.8μL的BsmBI，加水至溶液為15-25μL。

進(jìn)一步的，所述重組質(zhì)粒載體pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2敲除效率的篩選驗(yàn)證選用熒光蛋白表達(dá)法進(jìn)行驗(yàn)證，具體方法如下：

(1)利用RGS-CR做為驗(yàn)證報(bào)告載體：使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ對驗(yàn)證報(bào)告載體RGS-CR進(jìn)行線性化；

(2)合成與MSTN靶序列1和MSTN靶序列2對應(yīng)的兩條帶有EcoRⅠ和BamHⅠ粘性末端的DNA雙鏈，分別命名為：#MSTN-1和#MSTN-2；

其中，#MSTN-1引物的上游序列為：5’-AATTCCTCTGCCAAATACCAGTGCCTGGGG-3’，

下游序列為：5’-GATCCCCCAGGCACTGGTATTTGGCAGAGG-3’；

#MSTN-2引物的上游序列為：5’-AATTCAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTCTGGG-3’，

下游序列為：5’-GATCCCCAGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTTTG-3’；

(3)采用T4連接酶將步驟(1)的RGS-CR線性化產(chǎn)物和步驟(2)帶有EcoRⅠ和BamHⅠ粘性末端的#MSTN-1和#MSTN-2兩對DNA雙鏈進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒載體，分別命名為：RGS-#MSTN-1和RGS-#MSTN-2；

(4)取傳代的HEK-293T細(xì)胞于4個(gè)培養(yǎng)皿中；

(5)取4個(gè)離心管編號為1、2、3、4，每個(gè)管分別加入含F(xiàn)BS的DMEM；

(6)然后在1號管加pPDNA330-MSTN-1和RGS-#MSTN-1，2號管加pPDNA330和RGS-#MSTN-1，3號管加pPDNA330-MSTN-2和RGS-#MSTN-2，4號管加pPDNA330和RGS-#MSTN-2；最后在每個(gè)管中加入羅氏轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜置后，將混合液分別加入培養(yǎng)皿，并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后在熒光顯微鏡下觀察目的基因的熒光表達(dá)情況。

進(jìn)一步的，所述限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切體系反應(yīng)溫度為35-40℃，時(shí)間為2.5-3.5h，酶切體系為：1.5-2.5μg的RGS質(zhì)粒，1.5-2.5μL的10×NEB Buffer3，0.2-0.8μL的EcoRI，0.2-0.8μL BamHI加水至溶液為15-25μL。

進(jìn)一步的，所述受體細(xì)胞選用人的Hela細(xì)胞或水牛的成纖維細(xì)胞。

進(jìn)一步的，所述的人Hela細(xì)胞和水牛的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)條件為：用含F(xiàn)BS的DMEM的培養(yǎng)基在電轉(zhuǎn)前24小時(shí)對人的Hela細(xì)胞和水牛的成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為35-40℃，4％-6％的CO₂。

進(jìn)一步的，所述檢測引物選用人或水牛的MSTN-2基因的上、下游序列做為檢測引物，人MSTN-2基因檢測引物命名為：hMSTN，hMSTN上游序列為5’-AATCTGGTACTCAAACTTGGA-3’，下游序列為5’-ATATTATTTGTTCTTTGCCATT-3’；水牛的MSTN-2基因檢測引物命名為：bufMSTN，bufMSTN上游序列為5’-CATAAAGGAAGAATCAAGCCTA-3’，下游序列為5’-TTCGCCATTAAAATATAGCATA-3’。

進(jìn)一步的，所述PCR體系為：10μLHS(Premix)(Takara)，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，水補(bǔ)至20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，35循環(huán)(95℃變性30sec，55℃退火30sec,72℃延伸30sec)，72℃再延伸7min，4℃終止反應(yīng)。取上述PCR反應(yīng)的5μL PCR產(chǎn)物，直接進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，時(shí)間約30min。

上述的利用CRISPR-Cas9靶向敲除MSTN基因的方法可用于人或水牛的MSTN基因敲除。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本技術(shù)方案發(fā)明人通過對多物種的MSTN基因進(jìn)行分析，進(jìn)行同源比對，選擇同源性最高的兩對基因序列做為靶序列，進(jìn)行對MSTN基因的敲除，有效的提高了靶序列的普適性，使利用該靶序列進(jìn)行編輯的重組質(zhì)粒載體能適用于多物種。雖然本發(fā)明對多物種的MSTN基因進(jìn)行同源對比選擇同源性高的靶序列，然而并不是每一個(gè)選擇的靶序列都能正確表達(dá)，還需要進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，而且，不同物種的基因組序列是不一樣的，如果僅僅利用同源對比選擇靶序列而選用其它編輯技術(shù)，例如：ZFNs和TALEN編輯技術(shù)，由于這兩種技術(shù)必須合成DNA序列特異性結(jié)合蛋白模塊，在進(jìn)行DNA剪切的時(shí)候?qū)?huì)受到FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域的限制，編輯效率大大降低，如果找出的同源比對的MSTN基因上下游沒有FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域則不能完成基因的剪切，不能進(jìn)行基因編輯，同樣的，要精確找到有表達(dá)效果的靶序列，其檢測手段是必不可少的，檢測手段必須要簡單、高效、準(zhǔn)確，才能提高靶序列的準(zhǔn)確性。

2、本技術(shù)方案選用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，CRISPR-Cas9里面需要兩個(gè)組件，一個(gè)是gRNA，另外一個(gè)是內(nèi)切酶也就是Cas9.gRNA包括crRNA和tracrRNA，gRNA結(jié)合crRNA的靶標(biāo)特異性及tracrRNA的腳手架特性(如何翻譯scffold)成單一轉(zhuǎn)錄子。當(dāng)gRNA和cas9在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，基因組的靶標(biāo)會(huì)被修飾或永久性的干擾。使用Cas9核酸內(nèi)切酶只需要提供一個(gè)包含特異的20bp的小片段sgRNA(single guide RNA)來決定靶向特異性。sgRNA是由crRNA(CRISPRRNA)與tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)嵌合構(gòu)成的一個(gè)約100個(gè)核苷酸大小的RNA。crRNA能夠與靶向的DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，這段靶向DNA序列叫做前間隔序列。crRNA與trancrRNA一起構(gòu)成的sgRNA與Cas9相互作用形成核糖核蛋白。sgRNA的5’端的約20bp(對應(yīng)的是crRNA)通過RNA-DNA互補(bǔ)配對指引Cas9與靶序列結(jié)合進(jìn)而對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)。在細(xì)胞中，核酸酶造成的DSB在沒有修復(fù)模板的情況下，以非同源末端連接(nonhomologous end-joining，NHEJ)的方式進(jìn)行修復(fù)。NHEJ能夠引起隨機(jī)長度的堿基插入或缺失，可以破壞編碼基因的翻譯閱讀框架，因此，本發(fā)明使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯不受限制性內(nèi)切酶的限制，能更簡單、高效、多位點(diǎn)的對基因進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)了僅構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體就能對多物種的同一靶序列進(jìn)行基因編輯的效果，同時(shí)方法簡單、高效。

3、本技術(shù)方案用驗(yàn)證報(bào)告載體RGS-CR對兩對靶基因的敲除效率進(jìn)行檢驗(yàn)，采用熒光蛋白和目的基因連接，當(dāng)目的基因被同源替代靶向敲除時(shí)，能啟動(dòng)熒光蛋白表達(dá)，在綠光下成像，利用該方法能將基因編輯效果進(jìn)行體外表達(dá)，克服了體內(nèi)表達(dá)周期長的問題，能快速的對基因的轉(zhuǎn)染效率做出迅速和可靠的評估，有效的提高了對靶序列的定向分析、檢測作用，提高了靶序列選擇的準(zhǔn)確度。

【附圖說明】

圖1為MSTN多物種同源比對及靶標(biāo)1的設(shè)計(jì)位點(diǎn)圖；

圖2為MSTN多物種同源比對及靶標(biāo)2的設(shè)計(jì)位點(diǎn)圖；

圖3為MSTN打靶效率熒光表達(dá)檢測圖；

圖4為HELA細(xì)胞MSTN基因突變測序結(jié)果圖；

圖5為水牛成纖維細(xì)胞MSTN基因突變檢測結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。

本說明書(包括任何附加權(quán)利要求、摘要)中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子而已。

實(shí)施例：

一、靶向敲除基因克隆載體的構(gòu)建：

靶向多物種MSTN的gRNA寡核苷酸的設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載多物種MSTN基因的核苷酸序列，并進(jìn)行同源比對。同源比對結(jié)果見說明書附圖1和說明書附圖2。根據(jù)gRNA的PAM設(shè)計(jì)原則及同源比對的結(jié)果，合成了MSTN-1和MSTN-2共2對引物，引物序列分別為，載體構(gòu)建具體步驟如下：

1、合成MSTN靶序列1：5’-AGGCACTGGTATTTGGCAGAG-3’，其中上游序列5’-ACCGCTCTGCCAAATACCAGTGCCT-3’，其下游序列5’-AAACAGGCACTGGTATTTGGCAGAG-3’，靶序列2：5’-AAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3’，其中上游序列5’-ACCGAAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3’，其下游序列5’-AAACGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTTt-3’，溶解后，各取4.5μL，再加入1μL 10×LA PCR Buffer，混勻，95℃加熱10min，然后置于室溫3h，形成帶有BsmBI粘性末端的DNA雙鏈；

2、酶切pPDNA330質(zhì)粒，酶切體系為pPDNA330質(zhì)粒3μg，10×NEB Buffer3 2μL，0.5μL BsmBI，加水至20μL，55℃孵育3h；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，測定濃度，存于-20℃，備用；

3、連接上述a、b兩步獲得的產(chǎn)物，連接體系：1μL T4ligase，2μL 10×T4ligase Buffer，BsmBI酶切的pPDNA330載體30ng，靶序列及其互補(bǔ)序列形成的雙鏈DNA 5μL，加水至20μL，16℃過夜連接。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行序列測定，得到pPDNA330-MSTN-1和pPDNA330-MSTN-2載體。

二、基因敲除效率的驗(yàn)證

1、靶序列敲除效率驗(yàn)證報(bào)告載體RGS-CR，使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ對RGS載體進(jìn)行線性化,酶切體系為：RGS質(zhì)粒2μg，10×BufferK 2μL，0.5μL EcoRI，0.5μLBamHI，加水至20μL，37℃孵育3h；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段切膠回收，測定濃度，存于-20℃，備用；

2、合成MSTN的2條靶序列對應(yīng)的RGS-CR報(bào)告載體序列#MSTN-1和#MSTN-2共2對引物，其中#MSTN-1的上游引物序列為5’-AATTCCTCTGCCAAATACCAGTGCCTGGGG-3’，下游引物序列為5’-GATCCCCCAGGCACTGGTATTTGGCAGAGG-3’,#MSTN-2的上游引物序列為5’-AATTCAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTCTGGG-3’，下游引物序列為5’-GATCCCCAGAGCAGTAATTGGCCTTATATCTTTG-3’,引物溶解成100μM濃度后，經(jīng)95℃處理15min，而后自然降溫過夜退火，分別得到2條帶有EcoRⅠ和BamHⅠ粘性末端的DNA雙鏈退火產(chǎn)物。

3、T4連接RGS線性化產(chǎn)物和DNA雙鏈退火產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)，去內(nèi)毒提取重組質(zhì)粒，并通過測序驗(yàn)證質(zhì)粒，獲得RGS-#MSTN-1和RGS-#MSTN-2重組質(zhì)粒。

4、轉(zhuǎn)染前一天，傳代HEK-293T細(xì)胞于4個(gè)35mm的培養(yǎng)皿中。

5、轉(zhuǎn)染當(dāng)天，準(zhǔn)備4個(gè)1.5mL的離心管，每個(gè)管中分別加入100μL的含10％FBS的DMEM，再添加質(zhì)粒；其中，1號管中加1000ng的pPDNA330-MSTN-1，100ng的RGS-#MSTN-1；2號管中加1000ng的pPDNA330，200ng的RGS-#MSTN-1；3號管中加1000ng的pPDNA330-MSTN-2，200ng的RGS-#MSTN-2；4號管中加1000ng的pPDNA330，200ng的RGS-#MSTN-2；最后每個(gè)管中加入2μL的羅氏轉(zhuǎn)染試劑，混勻，室溫靜止15min后，將混合液分別加入4個(gè)35mm的培養(yǎng)皿，并于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h觀察熒光表達(dá)情況(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見說明書附圖3)。熒光顯示，pPDNA330-MSTN-2的綠色熒光的表達(dá)明顯多于陰性對照pPDNA330，表明pPDNA330-MSTN-2能有效地引起DSBs，造成MSTN基因突變。

三、篩選出作用效果更好的表達(dá)載體，對人和牛的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，敲除MSTN基因。

1、轉(zhuǎn)染前一天，人Hela細(xì)胞培養(yǎng)于35mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10％進(jìn)口胎牛血清(FBS)的DMEM，培養(yǎng)條件為37℃，5％的CO2，轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照Life 3000試劑盒說明書導(dǎo)入2μg的pPDNA330-MSTN-2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48h，胰酶消化收集細(xì)胞，并提取細(xì)胞基因組。

2、合成人MSTN基因敲除檢測引物hMSTN，其中上游引物5’-AATCTGGTACTCAAACTTGGA-3’，下游引物5’-ATATTATTTGTTCTTTGCCATT-3’，以pPDNA330-MSTN-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為：10μLHS(Premix)(Takara)，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，水補(bǔ)至20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，35循環(huán)(95℃變性30sec，55℃退火30sec,72℃延伸30sec)，72℃再延伸7min，4℃終止反應(yīng)。取上述PCR反應(yīng)的5μL PCR產(chǎn)物，直接進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，時(shí)間約30min。將PCR產(chǎn)物切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，進(jìn)行測序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接入pEASY-T1載體中，并通過挑取單克隆細(xì)菌，測序，對MSTN基因突變進(jìn)行檢測，結(jié)果表明pPDNA330-MSTN-2能有效地對人Hela細(xì)胞MSTN基因進(jìn)行編輯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見說明書附圖4。

3、水牛成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于60mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為含10％進(jìn)口胎牛血清(FBS)的DMEM，培養(yǎng)條件為37℃，5％的CO2，電轉(zhuǎn)當(dāng)天，胰酶消化收集細(xì)胞，通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入2μg的pPDNA330-MSTN-2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后48h，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞基因組。

4、合成水牛MSTN基因敲除檢測引物bufMSTN，其中上游引物5’-CATAAAGGAAGAATCAAGCCTA-3’，下游引物5’-TTCGCCATTAAAATATAGCATA-3’,以pPDNA330-MSTN-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為：10μLHS(Premix)(Takara)，DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，水補(bǔ)至20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，35循環(huán)(95℃變性30sec，55℃退火30sec,72℃延伸30sec)，72℃再延伸7min，4℃終止反應(yīng)。取上述PCR反應(yīng)的5μL PCR產(chǎn)物，直接進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120V，時(shí)間約30min。將PCR產(chǎn)物切膠，回收，連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，進(jìn)行測序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接入pEASY-T1載體中，并通過挑取單克隆細(xì)菌，測序，對MSTN基因突變進(jìn)行檢測，結(jié)果表明pPDNA330-MSTN-2能有效地對人Hela細(xì)胞MSTN基因進(jìn)行編輯，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見說明書附圖5。

綜上所述，本發(fā)明通過同源對比選擇不同物種控制MSTN基因的兩對同源性最高的靶序列，利用CRISPR-Cas9編輯系統(tǒng)構(gòu)建帶有靶序列基因的重組質(zhì)粒，通過熒光蛋白表達(dá)法檢測能對敲除試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行精確分析，構(gòu)建了并選擇了能靶向敲除MSTN基因的重組載體，通過轉(zhuǎn)染人的Hela細(xì)胞和水牛的成纖維細(xì)胞，驗(yàn)證了該方法能適用于不同物種，甚至多物種MSTN基因的敲除。本發(fā)明的方法具有打靶率高、準(zhǔn)確、簡單、高效、具有普適性的特點(diǎn)，有效的提高了基因敲除效率和準(zhǔn)確性。

上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實(shí)施例的詳細(xì)說明，但實(shí)施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。