本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與水稻粒長相關(guān)的蛋白OsJGL2及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是人類賴以生存的主要糧食作物之一，全球約有一半的人口以稻米為主食。世界稻米的供求矛盾越來越突出，提高產(chǎn)量是當(dāng)今水稻育種的首要目標(biāo)。粒重是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一，增加谷粒的大小粒重，是提高水稻產(chǎn)量的有效途經(jīng)之一，而谷粒的長度又是決定稻米質(zhì)量的重要形態(tài)指標(biāo)。既增加產(chǎn)量又提高稻米質(zhì)量，是育種家追求的目標(biāo)。相對于水稻其它產(chǎn)量性狀而言，目前關(guān)于粒長基因的研究稍顯滯后，真正分離到的粒長基因還很少。在禾本科材料中克隆與粒長相關(guān)的優(yōu)良基因，對培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻新品種具有重要的理論與實際意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

OsJGL2基因(GenBank登陸號XM_015770529.1)是水稻中功能未知基因，位于水稻第1號染色體上，無內(nèi)含子，mRNA大小為1349bp，編碼序列(CDS)大小為747bp，編碼包含248個氨基酸殘基的蛋白(GenBank登陸號XP_015626015.1)，蛋白質(zhì)分子量為26.72KD，等電點為8.1。在該蛋白質(zhì)序列中，帶電荷氨基酸78個，酸性氨基酸32個，堿性氨基酸33個，極性氨基酸55個，疏水氨基酸76個。GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)，OsJGL2蛋白序列具有推定的DUF1645保守結(jié)構(gòu)域，與短花藥野生稻(XP_006644418.1)、二穗短柄草(XP_003569426.1)、高粱(XP_002456032.1)、小米(XP_004969278.1)和玉米(NP_001143665.2)蛋白序列的同源性分別達到82％、56％、61％、65％和61％。OsJGL2蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示，OsJGL2蛋白的編碼基因序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明構(gòu)建出蛋白OsJGL2的表達載體，其序列如SEQ ID NO.1所示，命名為載體pCAMBIA1300+163+OsJGL2，將其轉(zhuǎn)化到水稻中表達，發(fā)現(xiàn)過量表達水稻OsJGL2基因可引起水稻種子極顯著增長增重。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因水稻粒長增長7.0％，千粒重增重15.6％。因此，蛋白OsJGL2編碼基因可用于制備與水稻粒長相關(guān)的表達載體。蛋白OsJGL2可用于制備水稻粒長調(diào)控制劑。

附圖說明

圖1水稻OsJGL2基因的PCR擴增產(chǎn)物；M，Marker；1，PCR產(chǎn)物；

圖2 OsJGL2的pMD18-T質(zhì)粒酶切分析；M，Marker；C，未酶切質(zhì)粒作為對照；1、2分別代表不同質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；

圖3表達載體pCAMBIA1300+163的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4表達載體pCAMBIA1300+163+OsJGL2酶切鑒定；M，Marker；C，未酶切質(zhì)粒作為對照；1、2、3分別代表不同質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；

圖5農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化；左上圖為水稻愈傷組織的誘導(dǎo)；右上圖為繼代培養(yǎng)；左下圖為抗性愈傷篩選；右下圖為愈傷分化；

圖6特異潮霉素引物鑒定轉(zhuǎn)OsJGL2基因水稻；M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，無模板對照；2、3，野生型對照；4、5，陽性對照；6-24，轉(zhuǎn)基因植株；

圖7野生型與轉(zhuǎn)OsJGL2基因水稻農(nóng)藝性狀的比較；Control，水稻野生型；OE，過表達株系；*P<0.05,**P<0.01,Student’s t test。

具體實施方式

基因克隆

PCR克隆引物，PCR等反應(yīng)實驗條件，克隆載體，來源及可能用到的內(nèi)切酶，cDNA陽性克隆分析

人工合成一對引物，并在反向引物5’端加上BamHI酶切位點，正向引物所在序列附近含有NcoI酶切位點，無需添加。引物如下：

OsJGL2F：5'ACGCATCGTCACATCACAGAG 3'(21)(SEQ ID NO.4)；

OsJGL2R：5'GGATCC TAGGCTTCAAGTCAAAGGTTCG 3'(28)(BamHI)(SEQ ID NO.5)。

利用此對引物，以水稻日本晴的總DNA為模板進行PCR。PCR條件為：熱蓋溫度105℃，預(yù)變性95℃5min，95℃變性45s，61℃退火45s，72℃延伸60s，進行34個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR體系見表1：

表1

使用TAE電泳緩沖液進行瓊脂糖凝膠電泳，得到了大約900bp的片段(圖1)，命名為OsJGL2。

將上述OsJGL2擴增產(chǎn)物用TIANGEN的試劑盒進行膠回收，然后將回收片段連入PMD18-T載體(TAKARA)。連接體系如表2：

表2

連接2個小時，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α的感受態(tài)細胞，涂板，用氨芐霉素篩選。挑選單克隆，提取質(zhì)粒后用NcoI和BamHI雙酶切鑒定，結(jié)果如圖所示，均有大約1000bp的目的條帶(圖2)。送1、2號對應(yīng)的菌液測序，測序結(jié)果均與GenBank上基因序列完全一致。

基因功能驗證詳細過程

表達原載體及來源，表達原載體構(gòu)建可能用到的內(nèi)切酶

克隆得到OsJGL2基因，將其構(gòu)建到表達載體，具體步驟如下：將連接有OsJGL2基因的克隆載體pMD18-T和表達載體pCAMBIA1300+163(圖3)都用BamHI和NcoI進行雙酶切并分別回收純化，然后用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑取單菌落擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，BamHI和NcoI雙酶切鑒定，最終獲得連接有目的基因的過量表達載體pCAMBIA1300+163+OsJGL2(圖4)。利用熱激法將構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株中。

基因轉(zhuǎn)化方法，基因轉(zhuǎn)化物種

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化到水稻SR59中，獲得過量表達OsJGL2基因的水稻轉(zhuǎn)基因株系。該實驗過程如下：以SR59成熟種子誘導(dǎo)而來的愈傷組織為受體，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)、2次抗性愈傷組織潮霉素連續(xù)篩選(每次2周)、抗性愈傷組織分化、生根、煉苗等步驟獲得潮霉素抗性植株(圖5)。

轉(zhuǎn)基因植物分子分析

利用潮霉素特異引物，對潮霉素抗性再生植株進行PCR檢測(圖6)。檢測出含潮霉素基因的陽性株系13株。引物如下：

hptF：5'TTTAGCGAGAGCCTGACCTATTGC 3'(SEQ ID NO.6)；

hptR：5'CGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTG 3'(SEQ ID NO.7)；

轉(zhuǎn)基因植物功能表型(圖7)

對野生型和T1代轉(zhuǎn)OsJGL2基因水稻的農(nóng)藝性狀進行對比觀察和統(tǒng)計分析。與野生型的株高相比，三個株系無顯著性差異。與野生型的分蘗數(shù)相比，OE-1和OE-2株系均顯著高于野生型，OE-3株系與野生型無顯著性差異。與野生型的劍葉長相比，OE-1顯著短于野生型，OE-2顯著長于野生型，OE-3株系與野生型無顯著性差異。與野生型的劍葉寬相比，OE-1和OE-2顯著大于野生型，OE-3株系與野生型無顯著性差異。與野生型的穗長相比，三個株系無顯著性差異。與野生型的每穗粒數(shù)相比，OE-1和OE-2株系均顯著低于野生型，OE-3株系無顯著性差異。

與野生型的千粒重相比，三個株系均極顯著增重，OE-1株系增重6.3％，OE-2株系增重13.8％，OE-3株系增重15.6％。與野生型的粒長相比，三個株系均極顯著增長，OE-1株系增長8.4％，OE-2株系增長8.2％，OE-3株系增長7.0％。與野生型的粒寬相比，三個株系無顯著性差異。與野生型的粒厚相比，三個株系無顯著性差異。