本發(fā)明涉及一種下調(diào)斑馬魚lmna基因建立疾病模型的方法及通過該方法建立的早老疾病模型，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

核纖層蛋白（lamins）可維持細(xì)胞核的穩(wěn)定，連接細(xì)胞核和細(xì)胞骨架，調(diào)控核染色質(zhì)組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)。lamins突變可導(dǎo)致一系列紊亂，包括早老、肌萎縮癥和擴(kuò)張型心肌病等，統(tǒng)稱核纖層病。

核纖層蛋白（lamins）屬于V型中間纖維蛋白家族（intermediate filament, IF）成員，它是細(xì)胞骨架的重要組成部分，可維持核膜正常形態(tài)，同時(shí)影響DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)和轉(zhuǎn)錄。Lamins及其相關(guān)蛋白的突變可導(dǎo)致人核纖層蛋白病，由于LaminsA/C幾乎表達(dá)于所有的細(xì)胞和組織，高度組織特異性和在相同基因不同突變位點(diǎn)導(dǎo)致的疾病的廣泛性相對(duì)復(fù)雜。盡管國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行大量研究，核纖層蛋白病潛在的分子機(jī)制仍亟待解釋。

模式生物是目前用于研究人類疾病慣用高效的工具。目前較前沿的基因下調(diào)方法有嗎啉代寡核苷酸技術(shù)。該技術(shù)穩(wěn)定且應(yīng)用廣泛，成本較低，不會(huì)被核酸酶所降解，水溶性好，對(duì)細(xì)胞無毒副作用，并且不會(huì)和人工合成的RNA一樣，激活細(xì)胞干擾素的分泌，激發(fā)免疫應(yīng)答，特異性好，是如今廣泛應(yīng)用于斑馬魚的高效基因下調(diào)方法之一。通過建立lmna基因下調(diào)的斑馬魚模型，可以為人核纖層病的研究提供動(dòng)物模型，然而目前本領(lǐng)域中還沒有解決該技術(shù)問題的比較理想的技術(shù)方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的主要技術(shù)問題是提供一種利用morpholino技術(shù)和綠色熒光蛋白指示方法下調(diào)斑馬魚lmna基因的方法及通過該方法建立的早老疾病模型，從而建立下調(diào)lmna基因表達(dá)的斑馬魚動(dòng)物模型，為核纖層病的深入研究提供動(dòng)物模型。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明的下調(diào)斑馬魚lmna基因建立疾病模型的方法的主要技術(shù)方案是：分別設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)斑馬魚lmna基因的嗎啉代寡核苷酸lmna-MO，和特異性指示lmna基因表達(dá)量的lmna-EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒；通過顯微注射方式共注射入斑馬魚胚胎中，以綠色熒光蛋白表達(dá)量作為lmna表達(dá)下調(diào)的標(biāo)志，從而建立下調(diào)lmna基因表達(dá)的斑馬魚動(dòng)物模型。

其中，嗎啉代寡核苷酸序列設(shè)計(jì)是利用嗎啉代寡核苷酸技術(shù)抑制內(nèi)源性lmna基因的表達(dá)；嗎啉代寡核苷酸針對(duì)基因編碼起始位點(diǎn)ATG設(shè)計(jì)；設(shè)計(jì)嗎啉代寡核苷酸時(shí)避開ATG起始區(qū)，于其5’UTR區(qū)設(shè)計(jì)反義的寡核苷酸，使得外源性mRNA翻譯表達(dá)不受影響。

其中，采用的lmna-EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法是：根據(jù)pCS²⁺載體及目的基因選取限制性內(nèi)切酶，上游引物的5’端選擇加上BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物的5’端選擇加入EcoRI酶切位點(diǎn)，通過PCR法克隆兩端含有合適的酶切位點(diǎn)的lmna片段；將克隆的lmna片段與pCS²⁺載體通過T4連接酶進(jìn)行粘性末端連接，構(gòu)建lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒；構(gòu)建lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒成功之后，插入EGFP片段，與lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒相連，構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還提出了一種利用morpholino下調(diào)斑馬魚lmna基因建立的早老疾病模型，該模型是針對(duì)斑馬魚lmna基因，使用特異性嗎啉代寡核苷酸lmna-MO，下調(diào)斑馬魚lmna基因，建立的斑馬魚早老疾病模型。

本發(fā)明選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為斑馬魚，該模式生物具有體外受精，胚胎透明，與人類基因高度同源，繁殖發(fā)育迅速，成熟快，體積小，可用于高通量大規(guī)模篩選突變型，便于建立疾病模型等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明構(gòu)建有增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP標(biāo)記的斑馬魚lmna基因的質(zhì)粒，并設(shè)計(jì)靶向斑馬魚lmna基因的嗎啉反義寡核苷酸，利用嗎啉代寡核苷酸技術(shù)下調(diào)斑馬魚lmna基因的表達(dá)。以綠色熒光蛋白表達(dá)量作為lmna表達(dá)下調(diào)的標(biāo)志，從而建立下調(diào)lmna基因表達(dá)的斑馬魚動(dòng)物模型，為核纖層病的深入研究提供動(dòng)物模型。

附圖說明

圖1是嗎啉代寡核苷酸設(shè)計(jì)示意圖；

圖2是斑馬魚中l(wèi)mna、β-actin 基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)；

圖3是斑馬魚lmna基因的PCR產(chǎn)物的電泳圖；（圖3中：1 Marker Ⅲ，2 lmna PCR產(chǎn)物，3 空白對(duì)照）；

圖4是lmna-pCS2+ 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果；

圖5是雙酶切電泳圖（EcoRI和XbaI）；(圖5中：1 Marker Ⅲ，2 EGFP-pCS2+酶切產(chǎn)物，3 pCS2+酶切產(chǎn)物)；

圖6是lmna-EGFP-pCS2+重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果；

圖7是lmna-EGFP-pCS2+顯微注射后的熒光表達(dá)情況；（圖7中：A-G圖分別為不同時(shí)相胚胎的白場(chǎng)和熒光圖）；

圖8是顯微注射后的熒光表達(dá)圖；（圖8中：A-D：lmna-EGFP-pCS2+ 質(zhì)粒注射組；E-H： lmna-MO、lmna-EGFP-pCS2+質(zhì)?；旌献⑸浣M ）；

圖9是核纖層蛋白在斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：

一.材料與方法

1．嗎啉代寡核苷酸序列設(shè)計(jì)

利用嗎啉代寡核苷酸技術(shù)抑制內(nèi)源性lmna基因的表達(dá)。嗎啉代寡核苷酸針對(duì)基因編碼起始位點(diǎn)ATG設(shè)計(jì)，作用于mRNA的翻譯起始位點(diǎn)AUG附近或者AUG上游的5’非編碼區(qū)（untranslation region, UTR ）區(qū)域，它與mRNA的結(jié)合阻礙了核糖體的翻譯起始復(fù)合體向翻譯起始位點(diǎn)的移動(dòng)，從而導(dǎo)致多肽的合成過程無法起始。由于ATG對(duì)于lmna基因的起始翻譯有著至關(guān)重要的作用，所以設(shè)計(jì)嗎啉代寡核苷酸時(shí)避開ATG起始區(qū)，于其5’UTR區(qū)設(shè)計(jì)反義的寡核苷酸，使得外源性mRNA翻譯表達(dá)不受影響，如圖1。lmna-MO的靶序列位于lmna基因的5 ’UTR端，control- MO的序列是無意的25個(gè)堿基序列組合，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定卻不與任何基因的mRNA結(jié)合，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。

2. 構(gòu)建lmna-pCS²⁺質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)以不含5’UTR端序列的lmna-pCS²⁺質(zhì)粒（full-length）為模板，設(shè)計(jì)上游引物包括嗎啉代寡核苷酸序列加前后各一個(gè)堿基（共27個(gè)）后加ATG起始密碼子后的20個(gè)堿基，引入lmna-MO的靶序列；根據(jù)pCS²⁺載體及目的基因選取限制性內(nèi)切酶，上游引物的5’端選擇加上BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物的5’端選擇加入EcoRI酶切位點(diǎn)，通過PCR法克隆兩端含有合適的酶切位點(diǎn)的lmna片段，長(zhǎng)度為501bp。將lmna片段連入pCS²⁺載體中，構(gòu)建lmna-pCS²⁺質(zhì)粒。

3. 構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒

該質(zhì)粒用于嗎啉代寡核苷酸的效能測(cè)定，雙酶切EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒，獲取EGFP片段，將EGFP片段連入lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒中，構(gòu)建lmna–EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒。

二.結(jié)果

1. 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證斑馬魚中lmna基因編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)

收集野生型斑馬魚胚胎，檢測(cè)lmna基因表達(dá)的蛋白，如圖2所示，lmna基因表達(dá)的蛋白有兩個(gè)條帶，大小分別為69kDa和62kDa，β-actin為內(nèi)參基因，大小為43kDa。

2. lmna-MO及lmna-EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)lmna 5’UTR端的序列設(shè)計(jì)了一條針對(duì)lmna 5’UTR的反義寡核苷酸序列，同時(shí)用control-MO作為對(duì)照。構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒，用于lmna-MO測(cè)效，檢測(cè)是否能有效抑制lmna基因的表達(dá)。構(gòu)建重組質(zhì)粒的lmna片段主要是含有嗎啉代寡核苷酸靶向的5’UTR序列，將克隆的lmna片段與pCS²⁺載體通過T4連接酶進(jìn)行粘性末端連接，構(gòu)建lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒。將EGFP片段插入lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒中，構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒，使重組質(zhì)粒表達(dá)綠色熒光蛋白。利用PCR法克隆lmna片段，約501bp，如圖3所示。

將克隆的lmna片段與pCS²⁺載體通過T4連接酶進(jìn)行粘性末端連接，構(gòu)建lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒送測(cè)序后，測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中含有有嗎啉代寡核苷酸靶向的5’UTR序列，如圖4所示。

構(gòu)建lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒成功之后，還需插入EGFP片段。利用EcoRI和XbaI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶雙酶切EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒，得到EGFP片段大小約717bp，如圖5所示。與lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒相連，構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒。EGFP片段不含ATG，連于lmna后，使得EGFP特異性表達(dá)于lmna片段之后，可通過熒光顯微下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，即lmna基因的表達(dá)。

將酶切獲得的EGFP片段插入lmna-pCS²⁺重組質(zhì)粒中，T4連接酶進(jìn)行粘性末端連接，構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果如圖6所示。

3. lmna-MO及lmna-EGFP-pCS²⁺顯微注射野生型斑馬魚胚胎

顯微注射lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒于野生型斑馬魚單胚胎期胚胎，熒光顯微鏡下觀察胚胎表達(dá)綠色熒光蛋白，可見6hpf（hours post-fertilization，受精后小時(shí)數(shù)）開始胚胎中有lmna基因廣泛表達(dá)，直至72hpf表達(dá)量開始下降，如圖7所示。證實(shí)該質(zhì)粒中EGFP能有效示蹤lmna基因的表達(dá)，可用于lmna-MO的效能鑒定。

單獨(dú)注射lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光在不同時(shí)期胚胎中的表達(dá)，而將lmna-MO與lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒共注射入野生型斑馬魚單胚胎期胚胎后，各時(shí)相胚胎中綠色熒光均消失，即位于綠色熒光蛋白之前的lmna基因表達(dá)被下調(diào)，如圖8所示，說明lmna-MO可以有效下調(diào)lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒和斑馬魚胚胎中lmna基因的表達(dá)。

4. 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組lamin蛋白表達(dá)量下降

采用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組野生型斑馬魚胚胎表達(dá)兩種lamin蛋白（即lamins A/C）。實(shí)驗(yàn)組斑馬魚lmna基因mRNA翻譯受阻，蛋白合成出現(xiàn)障礙，與對(duì)照組相較，lamin蛋白表達(dá)水平明顯降低，如圖9所示。說明實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)lamin蛋白已被下調(diào)。

三.討論

核纖層普遍存在于高等動(dòng)物的真核細(xì)胞的細(xì)胞核中，主要成分是核纖層蛋白，其向外與內(nèi)層核膜上的蛋白結(jié)合，向內(nèi)與染色質(zhì)的特定區(qū)段結(jié)合。核纖層蛋白除了參與細(xì)胞核形狀和大小的維持，還參與DNA的復(fù)制、有絲分裂中染色體的重組、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等過程。核纖層蛋白病是由于LMNA基因突變所導(dǎo)致的疾病，目前有180多個(gè)LMNA突變型被報(bào)道，但具體的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，還需進(jìn)一步研究與探討。模式生物作為基因功能研究常用對(duì)象，其生長(zhǎng)發(fā)育過程在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中具有高度的保守性，是研究人類發(fā)育、系統(tǒng)功能、疾病發(fā)生發(fā)展等的重要工具。目前常用的模式生物有大小鼠，斑馬魚，果蠅等，本實(shí)驗(yàn)選用斑馬魚為研究對(duì)象，斑馬魚具有胚胎透明、體外發(fā)育、體積小、繁殖率高及魚種發(fā)育遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)使其成為研究脊椎動(dòng)物，特別是研究人類發(fā)育和疾病的模式物種之一。

本實(shí)驗(yàn)用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)斑馬魚中l(wèi)amin蛋白的表達(dá)，檢測(cè)出兩個(gè)蛋白條帶，即lamin A/C。成功構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒用于嗎啉代寡核苷酸測(cè)效。由于lmna-MO序列位于5’UTR端，即位于非編碼區(qū)，利用斑馬魚的cDNA，通過RT-PCR法不可直接克隆針對(duì)5’UTR的lmna片段，故將lmna-pCS²⁺（full-length）質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，直接通過PCR法，將5’UTR的非編碼區(qū)片段有效克隆出來，并與EGFP片段相連，構(gòu)建lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒，該EGFP片段不含ATG，與lmna基因片段相連，通過lmna基因片段的ATG端編碼翻譯綠色熒光蛋白，利用綠色熒光蛋白監(jiān)測(cè)lmna基因的表達(dá)，用于嗎啉代寡核苷酸測(cè)效

lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒顯微注射入斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中，于熒光顯微鏡下直接觀察綠色熒光表達(dá)情況，熒光表達(dá)從6hpf在全胚胎廣泛表達(dá)，至72hpf時(shí)逐漸減少。

利用嗎啉代寡核苷酸技術(shù)建立斑馬魚lmna基因下調(diào)的表型。顯微注射法是一種應(yīng)用于基因功能研究的技術(shù)，通過顯微注射相關(guān)基因的DNA和mRNA實(shí)現(xiàn)特定基因的過表達(dá)。利用嗎啉代寡核苷酸技術(shù)建立特定基因下調(diào)模型，嗎啉反義寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers，即PMO）屬于第三代反義寡核苷酸，是逆向遺傳學(xué)技術(shù)的一種。嗎啉代寡核苷酸技術(shù)的原理基于RNA的五元核糖骨架被含有氮和氧的六元環(huán)替代，并相連于A、T、C、G等堿基。RNA-MO進(jìn)入細(xì)胞后，可以和目的基因mRNA結(jié)合，形成RNA-RNA雙鏈，抑制細(xì)胞內(nèi)正常mRNA的剪接過程，從而達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的。嗎啡啉有抑制起始翻譯，減少傳統(tǒng)反義寡核苷酸非特異性的效應(yīng)，是一種新型反義寡核苷酸，具有良好的穩(wěn)定性、溶解度和細(xì)胞滲透性，因此這種雙鏈結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定存在于生物體內(nèi)，抵抗多種核酸酶和蛋白酶，不易降解，易溶于水，能在細(xì)胞中存留較長(zhǎng)的時(shí)間 。嗎啉代寡核苷酸可以靶向于的mRNA，編碼的蛋白質(zhì)是多樣化的，包括配體、跨膜受體、細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的嗎啉代寡核苷酸序列與目的基因mRNA 5’翻譯起始序列附近分序列互補(bǔ)，大小為25個(gè)堿基，在目的基因mRNA 5’端形成穩(wěn)定的RNA-RNA雙鏈，通過阻礙mRNA和核糖體的結(jié)合而阻斷lmna基因的起始翻譯過程。將lmna-EGFP-pCS²⁺質(zhì)粒與特異性的嗎啉代寡核苷酸共注射入斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中，各時(shí)相胚胎中綠色熒光均消失，即位于綠色熒光蛋白之前的lmna基因表達(dá)被下調(diào)，如圖8所示，說明lmna-MO可以有效下調(diào)lmna基因的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組斑馬魚lmna基因mRNA翻譯受阻，蛋白合成出現(xiàn)障礙，與對(duì)照組相較，lmna蛋白表達(dá)水平明顯降低。說明實(shí)驗(yàn)組斑馬魚體內(nèi)lmna蛋白已被下調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了嗎啉代寡核苷酸技術(shù)下調(diào)斑馬魚lmna基因表達(dá)所需的重組質(zhì)粒lmna-MO及可用于特異性指示lmna基因下調(diào)的重組質(zhì)粒lmna-EGFP-pCS²⁺。通過顯微注射的方法將兩者共注射入野生型斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中，通過綠色熒光蛋白表達(dá)量反應(yīng)lmna基因表達(dá)量。成功建立了下調(diào)lmna基因的斑馬魚模型。該模型為深入研究人核纖層病提供了良好的動(dòng)物模型。

當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。