專利名稱：斑馬魚Caspy2基因在制備治療腫瘤的藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤免疫基因治療領(lǐng)域，具體涉及斑馬魚的Caspy2基因在制備抗腫瘤藥物中 的用途。
背景技術(shù)：
斑馬魚(Danio rerio，俗稱zebrafish)具有繁殖能力強、體外受精和發(fā)育、胚胎透明 、性成熟周期短、個體小易養(yǎng)殖等諸多特點，為生命科學(xué)研究中重要的模式脊椎動物之一。 但目前對斑馬魚自身基因?qū)Ω叩燃棺祫游镉绕涫侨说挠绊懷芯糠浅５纳?。Caspy2基因是一個 來自斑馬魚的caspase基因家族成員，有文獻報導(dǎo)它是一個斑馬魚細胞凋亡誘導(dǎo)基因，在斑 馬魚的發(fā)育過程中扮演重要的作用，而Caspy2基因是否對人的腫瘤有無治療效應(yīng)目前并沒有 文獻報導(dǎo)。
誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡或激發(fā)產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)是目前抗腫瘤治療的兩種重要技術(shù)手段， 目前大多數(shù)治療方案都是采用單一的抗腫瘤效應(yīng)進行，如果能夠?qū)⒄T導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和激發(fā) 產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)結(jié)合起來將能獲得更好及更持久的抗腫瘤療效，但目前未見相關(guān)報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種斑馬魚Caspy2基因及其編碼的蛋白質(zhì)的新用途。 具體地說，該用途為斑馬魚Caspy2基因或其編碼的蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用途。
其中，上述斑馬魚Caspy2基因的序列為SEQ ID NO. 3所示或為SEQ ID NO. 3所示序列的保 守性變異體。
其中，上述斑馬魚Caspy2基因所編碼的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 4所示或為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的保守性變異體。
本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供了一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物是由斑馬魚 Caspy2基因編碼的蛋白或能表達斑馬魚Caspy2基因的表達載體或宿主細胞添加藥學(xué)上可接受 的輔助性成分制備而成。其中的斑馬魚Caspy2基因編碼的蛋白或能表達斑馬魚Caspy2基因的 表達載體或宿主細胞是作為主要的活性成分。
其中，上述斑馬魚Caspy2基因的序列為SEQ ID NO. 3所示或為SEQ ID NO. 3所示序列的保 守性變異體。
其中，上述斑馬魚Caspy2基因編碼的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 4所示或為SEQ IDNO. 4所示氨基酸序列的保守性變異體。
進一步的，上述能表達斑馬魚Caspy2基因的表達載體為pcDNA3. l-Caspy2。 其中上述表達載體pcDNA3. l-Caspy2是由以下步驟制備得到
a、 利用上、下游引物對斑馬魚總RNA進行RT-PCR反應(yīng)，擴增得到1215bp的Caspy2基因編 碼區(qū)cDNA片段；
b、 將步驟a得到的編碼區(qū)cDNA片段禾口pcDNA3. 1 (+)分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I 、 EcoRV進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，通過菌落篩選、酶切鑒定、 DNA測序鑒定，得到Caspy2基因的真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3. l-Caspy2 。
本發(fā)明創(chuàng)造性地發(fā)現(xiàn)利用表達載體表達Caspy2基因編碼的蛋白質(zhì)能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡 和抗腫瘤免疫的雙重抗腫瘤效應(yīng)。對CT26細胞、LLC細胞、A549細胞中，結(jié)果對這3種腫瘤細 胞的增殖產(chǎn)生了顯著的抑制效應(yīng)；利用陽離子脂質(zhì)體包裹Caspy2基因?qū)T26和MethA荷瘤小 鼠進行治療，產(chǎn)生了很強的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生非常好的抗腫瘤作用的原因是經(jīng)過異種的 Caspy2基因治療后產(chǎn)生了誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤免疫的雙重抗腫瘤效應(yīng)，而且這種抗腫 瘤免疫效應(yīng)是特異的、長期的，優(yōu)于現(xiàn)有的普通腫瘤治療方案。
因此本發(fā)明Caspy2基因及其編碼蛋白的新用途為腫瘤的免疫基因治療提供新的選擇。本 發(fā)明抗腫瘤藥物抗腫瘤療效好，并具有特異的、長期的免疫效應(yīng)，是一種很有開發(fā)價值的抗 腫瘤藥物。


圖l、質(zhì)粒pcDNA3. 1 (+)的結(jié)構(gòu)示意圖2、 MTT實驗檢測各處理組腫瘤細胞的增值活性；
圖3、流式細胞術(shù)檢測各處理組細胞的凋亡情況；
圖4、腫瘤生長曲線和小鼠的生存期；
圖5、腫瘤組織的HE染色；
圖6、腫瘤組織的細胞凋亡染色結(jié)果
圖7、腫瘤組織的細胞凋亡指數(shù)；
圖8、 pcDNA3. l-Caspy2治療后所產(chǎn)生的長期抗腫瘤免疫反應(yīng)。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖通過對具體實施方式
的描述以詳細說明但不限制本發(fā)明。 實施例一 Caspy2基因的獲取和重組質(zhì)粒DNA的構(gòu)建
根據(jù)GenBank遞交的斑馬魚的Caspy2基因序列(NM—152884)，設(shè)計引物從斑馬魚中擴增Caspy2基因的編碼序列。為了進一步將所擴增Caspy2基因克隆到真核表達載體pcDNA3. 1 (+) 中，如圖1所示，本發(fā)明在所設(shè)計的上、下游引物中分別引入了BamHl 、 EcoRV酶切位點( 引物由上海博亞公司合成)。上游引物(SEQ ID NO. 1):
5' ^GCSSAI^A隱一GATATTACCCAGCTGCT-3'(下劃線表示B艦H i的酶切位點；為了增
強基因的表達水平，在設(shè)計引物時引入了AAG序列，它們與ATGG共同構(gòu)成了Kozak序列，如方
框所示^GATGG I);下游引物(SEQ ID NO. 2)
5' {GCe^IMeTCACAGTCCAGGAAACAGGTAGMC-3'(其中下劃線表示EcoRV的,切位點)。 取德國Tuebingen品系斑馬魚(四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室保種)，并提取其總
RNA進行RT-PCR以擴增Caspy2基因的編碼區(qū)cDNA。利用上、下游引物進行RT-PCR反應(yīng)，擴增
得到1215bp的PCR片段，與GenBank所報導(dǎo)的Caspy2基因的編碼區(qū)cDNA—致。
將上述PCR產(chǎn)物和pcDNA3. 1(+)分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamHl 、 EcoRV進行雙酶切，將
酶切產(chǎn)物進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，通過菌落篩選、酶切鑒定、DNA測序鑒定，得到
Caspy2基因的真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3. l-Caspy2。
上述Caspy2基因的編碼區(qū)cDNA序列和所編碼的蛋白質(zhì)序列如下
斑馬魚的Caspv2基因的編碼區(qū)cDNA序列(1215bp) (SEQ ID NO. 3):
^GAGGATATrACCCAGCTGCTGTCTGATGTGCTCGAGGATCTTOTGGAGGCAGAGCTCMACAGTrCACCAGGC
AGCTCTGGATCGGTCTGAAACCAGGCGTCGAACCCATrcCTCGGGGAAAGCTGGAGMTMGGACCGTCAGGATCTG
GTGGACAGCATGGTTCAGCAGTACAGCGAGGATGCCGGGACAATCACAGTACAGACACTGCGCAAAATCMGCAGAA
CGMCGTGCAAAGCGGCTCGAGTCCAATCTGCTGAAAGTrCAGTCGCAGGGGCAAGAAAATMGCAAAACTCTGMG
GCTrcTTAMGCACACGGAGACGATAnTACACGCCGAGGAGCGGGACTCAAAGGAMGGCrTOGCTCTCTrcATCA CCMCATACMTTCGCCMTACACAACACMCCGAAACGGAGCGGACAG溫CGAGGAGMCGCGGAGTGGCTGCTG AGATCTCTGGGCTrcGCTCTrATAAAATACAGAAATCTCAGTGGAAAAGACATCAGGAGAGCAGTiXAGMnTCTC TAMCGTCGTCAACATGMGACGCAGACAGCACCnTATCGTCATCATCTCTCACGGGACTAGMTTGACMTAMG ATGCCATrcTAGGTCTCAGTCACGATGTCTACnTATrcMGAAACTrrCTCCCATCTCMCTCTCTCMCTCTCCG GCTCTGATCGACMACCCMGGTTATCCTGATIiCAGGCCTGCAGAGGAGGGCMTCCAGTGGCGTGCrrGCTCAAGA TTCTCTGTIiCGCATCGGACTCGTGGGTGCACATGGAGAAAGACTniGTCTGTnTATGTCCACCATGCCTAATACTr TCGCATACAGGAATCCAATCGAGGGAAGTlT丄TlTATCAGCTACATAGTGGATGTCTrCTGniCGTCAGCCCACAGG GATGACATTATGGAGCTCnTAGGAAGGTCACCTrcCGTATGGAGAAAGATCAACGTrrCAAAGGTCAGGCGAAACT CTrGCCGTGCATrGAMGGACGTCCATrrCAAAGAGGrrCTACCTGTrrCCTGGACl
斑馬魚Caspy2基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列(404aa) (SEQ ID NO. 4): MEDITQLLSDVLEDLVEAELKQFTRQLWIGVKPGVEPI PRGKLENKDRQDVVDSMVQQYSEDAGTITVQTLRKIKQNERAKRLESNLLKVQSQGQENKQNSEEPQPIP QIISQPIQQI
ISQPINNAGSEDLQPIQADWQRPRQIIPCS QETKNTLLKA
HGDDIYTPRSGTQRKGLALLITNIQFANTQ HNRNGADRDE
ENAEWLLRSLGFAVIKYRNLSGKDIRRAVE NFSKRREHED
ADSTFIVIMSHGTRIDNKDAIVGVSDDVYF IEETFSHLNS
VNCPALIDKPKVILIQACRGGQSsGVLAQD SVFASDSWVH
MEKDFVcFMSTMPNTFAYRNPIEGSFFISY IVDVFCSSAH
RDDIMELFRKVTLRMEKDQRFKGQAKLLPC IERTSISKRF
Y L F P G L
實施例二本發(fā)明產(chǎn)品pcDNA3. l-Caspy2體外抑制腫瘤細胞增殖實驗 pcDNA3. l-Caspy2體外抑制腫瘤細胞增殖實驗使用的是MTT的方法進行檢測，結(jié)果如圖2 所示。實驗分為以下3組A.陰性對照組(圖2中的白色柱)；B. pcDNA3. l空載體轉(zhuǎn)染組( 圖2中的灰色柱)；C. pcDNA3. 1-Caspy2轉(zhuǎn)染組(圖2中的黑色柱)。分別將1X104 CT26細 胞(小鼠結(jié)腸癌細胞)、LLC細胞(小鼠肺癌細胞)、A549細胞(人的肺癌細胞)接種到96 孔板內(nèi)，第2天當細胞生長至50-60%的覆蓋率時進行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染48小時后利用MTT實驗檢 測各處理組腫瘤細胞的增值活性。
實驗結(jié)果顯示:pcDNA3. l-Caspy2轉(zhuǎn)染組的腫瘤細胞增值活性受到顯著抑制，特別是CT26 細胞實驗組的細胞增殖活性被抑制率達到了75-80%，其他2個腫瘤細胞模型實驗組的腫瘤細 胞增殖活性也被抑制了50-60%，該實驗結(jié)果表明pcDNA3. l-Caspy2具有明顯體外抑制腫瘤細 胞增殖的能力。
實施例三本發(fā)明產(chǎn)品pcDNA3. l-Caspy2體外誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡實驗 檢測pcDNA3. l-Caspy2體外誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡實驗使用的流式細胞術(shù)方法。實驗分為以 下4組A.陰性對照組(untreated ，未處理組)；B.脂質(zhì)體對照組(簡稱為Lipo) ; C. pcDNA3. l空載體轉(zhuǎn)染組(empty plasmid，簡稱為e-p組)；D. pcDNA3. 1-Caspy2轉(zhuǎn)染組( pcDNA3. 1-Caspy2，簡稱為p-c)。
以CT26細胞為模型，將2X105 CT26細胞(小鼠結(jié)腸癌細胞)接種到6孔板內(nèi)，第2天當 細胞生長至50-60%的覆蓋率時進行轉(zhuǎn)染實驗，轉(zhuǎn)染48小時后利流式細胞術(shù)檢測各處理組細胞 的凋亡情況。從流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(圖3)可以發(fā)現(xiàn)pcDNA3. l-Caspy2 (p-c)轉(zhuǎn)染后能夠 明顯誘導(dǎo)CT26細胞凋亡(細胞的凋亡率為42%)，而其它3個處理組細胞的凋亡率都在10%以 下，p-c轉(zhuǎn)染組與其它3個對照組相比具有顯著誘導(dǎo)CT26細胞凋亡的作用。該組實驗結(jié)果表明pcDNA3. l-Caspy2具有明顯體外誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力。
實施例四本發(fā)明產(chǎn)品pcDNA3. l-Caspy2體內(nèi)抗腫瘤實驗
pcDNA3. l-Caspy2的體內(nèi)抗腫瘤實驗選用的是小鼠的結(jié)腸癌(CT26)和纖維肉瘤( MethA)模型。實驗分為以下4組A.對照組(PBS處理組，saline，如O所示)；B.脂質(zhì)體 對照組(簡稱為Lipo，如A所示)；C. pcDNA3. l空載體/脂質(zhì)體復(fù)合物處理組(empty plasmid，簡稱為e-p組，如B所示)；D. pcDNA3. l-Caspy2/脂質(zhì)體復(fù)合物處理組( pcDNA3. l-Caspy2，簡稱為p-c，如A所示)。采取瘤內(nèi)注射的方式進行治療，每只小鼠每次 瘤內(nèi)注射100yg質(zhì)粒/500yg陽離子脂質(zhì)體(陽離子脂質(zhì)體由DOTAP和膽固醇組成，摩爾比為 DOTAP:Chol=l:l)。每周治療2次，連續(xù)治療3周，每3天測量1次腫瘤體積，并同時觀察了個 組小鼠的生存期，結(jié)果如圖4所示，a和c分別為CT26模型的腫瘤生長曲線和小鼠的生存期， 可以發(fā)現(xiàn)p-c治療組的小鼠腫瘤生長速度受到顯著抑制，抑瘤率達到80%，荷瘤小鼠的生存期 也明顯延長；b和d分別為MethA模型的腫瘤生長曲線和小鼠的生存期，可以發(fā)現(xiàn)p-c治療組的 小鼠腫瘤生長受到完全抑制，抑瘤率達到100%，實驗組小鼠長期生存。以上結(jié)果表明 pcDNA3. 1-Caspy2/陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物瘤內(nèi)注射治療具有顯著的抗腫瘤作用。 實施例五、本發(fā)明產(chǎn)品pcDNA3. l-Caspy2體內(nèi)抗腫瘤作用機理研究 將實施例四處理完成的各組小鼠的腫瘤組織進行HE切片(結(jié)果見圖5)，結(jié)果表明a. pcDNA3. 1-Caspy2處理組(p-c處理組)；b. pcDNA3. l空載體處理組(e-p處理組)；c.月旨 質(zhì)體對照組(Lipo) ; d.對照組(PBS處理組)。e和f是p-c處理組所顯示的淋巴細胞侵潤 情況。結(jié)果顯示p-c處理組較其他3組出現(xiàn)了明顯的腫瘤組織壞死區(qū)域，e和f組結(jié)果顯示p-c 處理組的腫瘤組織出現(xiàn)了明顯的淋巴細胞侵潤，產(chǎn)生了抗腫瘤的免疫反應(yīng)。
對實施例四處理完成的各組小鼠的各組腫瘤組織進行細胞凋亡染色(TUNEL染色)實驗 ，染色結(jié)果見圖6，細胞凋亡指數(shù)(細胞凋亡率)見圖7。結(jié)果表明p-c處理組(凋亡的細胞 為25-30%)較其他3組(凋亡的細胞〈10%)出現(xiàn)了更強的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用，說明p-c能 夠明顯誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡作用。
實施例六、本發(fā)明產(chǎn)品pcDNA3. l-Caspy2治療后產(chǎn)生了長期的抗腫瘤免疫反應(yīng) 將實施例四中經(jīng)過pcDNA3. l-Caspy2治療后的MethA腫瘤模型小鼠分成兩組，第一組用l X106MethA細胞進行接種(用A表示)，另外一組用3X105 CT26細胞進行接種(用A表示 )，結(jié)果如圖8所示，圖8-A表示腫瘤體積，圖8-B表示小鼠的存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用1X106 MethA細胞進行沖擊接種(re-challenged injection是指荷瘤小鼠治療后，再次進行腫瘤接 種的過程， 一般用于研究所產(chǎn)生的抗腫瘤長期免疫效果)，小鼠對MethA細胞產(chǎn)生了記憶性免疫反應(yīng)，接種的MethA細胞未能長出腫瘤，所接種的小鼠長期生存；而用CT26細胞再接種 的小鼠，腫瘤迅速生長，小鼠最終全部死亡。該結(jié)果表明小鼠經(jīng)過pcDNA3. 1-Caspy2治療后 產(chǎn)生了長期的記憶性抗腫瘤免疫反應(yīng)。SEQUENCE LISTING
〈110> 四川大學(xué)
〈120>斑馬魚Caspy2基因在制備治療腫瘤的藥物中的用途
〈130> A080481k
〈160> 4
〈170> Patentln version 3.4
〈210> 1
〈211> 35
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial
〈400> 1
cgcggatcca agatggagga tattacccag ctgct 35
〈210> 2
〈211> 34
〈212> DNA
〈213> artificial
〈220>
〈223> artificial
〈400> 2
cgcgatatct cacagtccag gaaacaggta gaac 34
〈210> 3
〈211> 1215
〈212> DNA
〈213> artificial〈220>
〈223> artificial 〈400> 3
ttacccagctgctgtctgatgtgctcgaggatcttgtggaggc卿gctc60
ccaggcagctgtggatcggtgtgaaaccaggcgtcgaacccattcctcgg120
gga肌gctggccgtcaggatgtggtggacagcatggttcagcagtacagc180
gaggatgccgggac肌tcacctgcgc肌肌tc肌gcag肌cgaacgtgca240
肌gcggctcgagtccaatctgctgaaagttcagtcgcaggggc肌g肌肌300
cgcagcccatcccgcagatcatctcgcagcccatccagcagatcatctcg360
cagcccatcaacaatgccgggtctgaggatctcc肌cccatccaggctgactggc卿ga420
ccacggcagatcattccctgcagtcaagagactaaaaacacgcttcttaaagcacacgga■
gacgatatttacacgccgaggagcgggactgcttggctctgttgatcacc540
tcgccaataccga肌cggagcggac卿gacgagg卿ac600
gcggagtggctgctgagatctctgggcttcgctgttataatctcagtgga660
gg卿gcagtcgagaatttctctaaacgtcgtgaacatgaagacgcagac720
agcacctttatcgtcatcatgtctcacgggtgccattgta780
ggtgtcagtgacgatgtctactttattgaagaaactttctcccatctgaactctgtgaac840
tgtccggctctgatcgac肌acccaaggttatcctgattcaggcctgcagaggagggc肌■
tccagtggcgtgcttgctcaagattctgtgttcgcatcggactcgtgggtgcacatggag960
tctgttttatgtccaccatgcctaatactttcgcatacagg肌tcc肌tc1020
gaggg肌gtttttttatcagctacatagtggatgtgttctgttcgtcagcccacagggat1080
gacattatggagctgtttaggaaggtcaccttgcgtatgg1140
ggtcaggcgaaactcttgccgtgcattgaaaggacgtccatttca肌gaggttctacctg1200
tttcctggactgtga 1215
〈210> 4
〈211> 404
〈212> PRT
〈213> artificial
〈220>〈223> artificial 〈400> 4 Met Glu Asp
lie Thr Gin Leu Leu Ser Asp Val Leu Glu Asp Leu Val
1
Glu
Ala Glu
Pro Gly
Gin
Thr
65
Lys
Asp
50
lie
Glu
lie 145 Asp
Asp 130 Pro
Gly
Phe 210
Val
35
Val
Gin Pro
lie 115 Leu
Gly Ala
Asp 195 Ala
Leu
20
Glu
Asn Lys Gin
Asn 100 Gin
Leu Leu lie
Thr 180 Arg
5
Lys
Arg Leu Glu
Ser
85
Ser
Asp lie Tyr
Thr 165 Asn
Glii Phe Thr
Pro lie Pro
Val Asp Ser
Thr Val Glii
Thr
70
Asn
Cys Ser Gin
Glu 150 Pro
Met
55
Leu
Gin Pro lie
Gin 135 Thr
Val lie Lys
Tyr 215
Arg
40
Val
Gin lie lie
Ser 120 Ala
Asp Glu Glu
Asn 200 Arg
Arg
25
Gly
Glu Glu Pro
Gin 105 Gin
lie Gin Phe
Ala 185 Ala
10 Gin
Leu Leu Lys
Val
90
Pro
Arg Ser Gly
Thr 170 Asn
Leu Trp lie
Lys Leu Glu
Gin Gin Tyr
Arg Lys lie
Lys
75
Gin
Lys Asn Thr
Leu 155 Gin
Ser
60
Gin
Asp Trp Gin
Arg 140 Leu
Asn Leu Ser
Gly 220
Asn
45
Glu
Pro lie Asn
Asn 125 Pro
Glu Trp Leu
Leu 205 Lys
Gly
30
Lys
lie Pro Gin
lie 110 Ala
Thr Gin His
Asn 190 Arg
15 Val
Ser Gin Gly
Gin
95
lie
Arg Lys Gly
Leu 175 Arg
Lys
Asp Arg
Asp Ala Gly
Asn Glu Arg
Ala
80
Glu
Ser
Gly Ser
Arg Gin lie
Lys Ala His
Gly 160 Ala
Asn
Ser Leu
Asp lie ArgArg Ala Val Glu Asn Phe Ser Lys Arg Arg Glu His Glu Asp Ala 225
Ser Thr Phe lie
Phe 230
lie Met Ser His
Val 245
Gly Val Ser Asp
Glu 235
Thr Arg lie Asp
Asp Ala lie Val 260
Phe Ser His Leu Asn Ser Val 275
lie Leu lie Gin
Gly 250
Asp Val Tyr Phe lie 265
Cys Pro Ala Leu
Asn 255 Glu
Lys
Val 290
Ala Gin Asp Ser
Asn 280
Cys Arg Gly Gly
Leu 305
Lys Asp Phe Val
Ala 295
Val Phe Ala Ser Asp 310
Phe Met Ser Thr
Cys 325
Glu Gly Ser Phe
Ser 315
Pro Asn Thr Phe
Arg Asn Pro lie 340
Phe Cys Ser Ser Ala His Arg 355
Leu Arg Met Glu
Met 330
Phe lie Ser Tyr lie 345
Asp lie Met Glu
Ala 335 Asp
Val
Thr 370
Leu Leu Pro Cys lie 385
Phe Pro Gly Leu
Asp 360
Asp Gin Arg Phe
Glu 390
Lys 375
Arg Thr Ser lie
Ser 395
Asp 240 Lys
Thr
Glu 270
Asp Lys Pro
lie 285
Gin Ser Ser Gly Val 300
Trp Val His Met
Glu 320 Tyr
Val
Val 350
Phe Arg Lys
Leu 365
Lys Gly Gin Ala Lys 380
Lys Arg Phe Tyr Leu 400
權(quán)利要求
權(quán)利要求1斑馬魚Caspy2基因或其編碼的蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用途。
2 根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于所述的斑馬魚Caspy2基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示或為SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的保守性變異體。
3 根據(jù)權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于所述的斑馬魚Caspy2基因編碼的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0.4所示或為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列的保守性變異體。
4 一種抗腫瘤藥物，其特征在于是由斑馬魚Caspy2基因編碼的蛋 白或能表達斑馬魚Caspy2基因的表達載體或宿主細胞添加藥學(xué)上可接受的輔助性成分制備而 成。
5 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述的斑馬魚 Caspy2基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示或為SEQ ID NO. 3所示序列的保守性變異體。
6 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述的斑馬魚 Caspy2基因編碼的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 4所示或為SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的 保守性變異體。
7 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述能表達斑馬 魚Caspy2基因的表達載體為pcDNA3. l-Caspy2 。
8 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述表達載體 pcDNA3. l-Caspy2是由以下步驟制備得到a、 利用上、下游引物對斑馬魚總RNA進行RT-PCR反應(yīng)，擴增得到1215bp的Caspy2基因 編碼區(qū)cDNA片段；b、 將步驟a得到的編碼區(qū)cDNA片段禾口pcDNA3. 1 (+)分別用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I 、 EcoRV進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，通過菌落篩選、酶切鑒定、 DNA測序鑒定，得到Caspy2基因的真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3. l-Caspy2 。
全文摘要
本發(fā)明屬于腫瘤免疫基因治療領(lǐng)域，具體涉及斑馬魚Caspy2基因在制備治療腫瘤的藥物中的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了斑馬魚Caspy2基因或其編碼的蛋白在制備抗腫瘤藥物中的用途。斑馬魚Caspy2基因或其編碼的蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤免疫的雙重抗腫瘤效應(yīng)，而且這種抗腫瘤免疫效應(yīng)是長期特異的，優(yōu)于普通腫瘤治療方案，為腫瘤的治療提供了新的選擇。
文檔編號A61K38/17GK101439189SQ20081030670
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者鄧洪新, 魏于全 申請人:四川大學(xué)