專利名稱：癌癥的檢測和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的檢測和/或治療。更詳細(xì)地說，本發(fā)明利用存在的AFP受體為基礎(chǔ)，測定病人的癌癥或者包含或消除癌癥。
背景技術(shù)：
二十年以前，Abelev et al.報(bào)道了存在第一個(gè)癌胚抗原，α-胎蛋白(AFP)的存在[Abelev，G.I.，Perova，S.D.，Khramkova，N.I.，Postnikova，Z.A.和Irlin，I.S，.《移植》1，174(1963)]，雖然其是胎兒期的主要循環(huán)蛋白，但它在出生后差不多消失了，它的正常成人血清濃度低于50ng/ml[Ruoslahti，E.和Seppals.M.，《國際癌癥雜志》8，374(1971)]。然而，在某些惡性疾病如肝癌或畸胎瘤中，其血漿水平可以高達(dá)一千倍以上[Kuoslahti，E.和Seppals，M.《高級(jí)癌癥研究》29，275(1979)]。這一發(fā)現(xiàn)不僅引起了臨床醫(yī)師的注意，他們?cè)O(shè)想了一個(gè)檢測惡性腫瘤和監(jiān)測癌癥病人的新方法，而且引起了研究者研究這個(gè)蛋白在胎兒生長過程中的生理作用的興趣。
首先要研究的參數(shù)之一是胎兒中AFP的分布。利用免疫過氧化物酶方法，Benno和Williams描述了在發(fā)育的大鼠腦中AFP的分布[Benno.R.H.和Williams，T.H.，《腦研究》142，1982(1978)]。不久，一系列論文報(bào)告了在幾個(gè)種類包括鳥和人的發(fā)育的神經(jīng)細(xì)胞中血漿蛋白的分布[Trojan，J.和Uriel.J.，《癌發(fā)育生物醫(yī)學(xué)研究雜志》1，107(1980)；Uriel.J.，Trojan，J.，Dubouch，P和Pieiro，A.，《病理生物學(xué)》30，79(1982)；Moro，R和Uriel，J.，《癌發(fā)育生物醫(yī)學(xué)研究雜志》2，391(1981)；Dzigielewska，K.M.，Evans.C.A.N.，Lorscheides E.L.，Malinowska，D.H.，Mollgard，K.，Reynolds，M.L.，和Saunders，N.R.，《生理學(xué)雜志》318，239(1981)；Mollgard，K.，Jacobsen，M.，Krag-Jacobsen，G.，Praetorius-Claussen，P.和Saunders，N.R.，《神經(jīng)科學(xué)通信》14，85(1979)]。對(duì)于一個(gè)給定的組織或器官，不同的種類間AFP和SA染色的動(dòng)力學(xué)是一個(gè)相當(dāng)穩(wěn)定的圖案[Uriel.J.，Trojan，J.，Moro.R.和Pieiro，A.，《紐約科學(xué)學(xué)術(shù)年鑒》417，321(1983)]。當(dāng)一個(gè)神經(jīng)結(jié)構(gòu)發(fā)育非常不成熟時(shí)，檢測不到細(xì)胞內(nèi)的AFP或SA。然后，突然，并在不同種類的生長時(shí)間上的某一時(shí)期，同時(shí)觀察到這兩種蛋白質(zhì)，甚至于它們?cè)谕患?xì)胞中[Torand-Allerand，C.D.，《自然》286，733(1980)]。隨后，首先是AFP后來是SA，染色強(qiáng)度減退，陽性細(xì)胞變少，在成熟結(jié)構(gòu)中兩種蛋白是陰性的，其它血清成份，如IgG，或雞胚中的卵清蛋白，盡管存在于腦脊液中，但在胎兒期從沒在神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，[Fielitz，W.，Esteves，A.和Moro.R.，《發(fā)育腦研究》13.111(1984)]。
通過胚胎細(xì)胞摻入AFP從最初的觀察中提出的一個(gè)問題是AFP和SA是從胞外源摻入還是原位合成。由于仍不清楚是否神經(jīng)細(xì)胞能夠合成血漿蛋白，[Ali，M.，Raul，H.和Sahib，M.，《發(fā)育腦研究》1，618(1981)；Ali，M.，Mujoo，K.和Sahib，M.，《發(fā)育腦研究》6，47(1983)；Schachter，B.S.和Toran-Allerand，C.D.，《發(fā)育腦研究》5，95(1982)；Pieiro，A.，Calvo，M.，Iguaz，F(xiàn).，Lampreave，F(xiàn)和Neval，J..《國際生化雜志》14，817(1982)]，在體外[Uriel，J.，F(xiàn)aivre-Bauman，A.，Trojan，J.和Foiret，D.《神經(jīng)科學(xué)通信》27，171(1981)；Hajeri-Germond，M.，Trajan，Uriel，J.和Hauw，J.《發(fā)育神經(jīng)科學(xué)雜志》6，111(1984)]和在體內(nèi)[Villacampa，M.J.，Lampreave，F(xiàn).，Calvo，M.，Pieiro，A和Uriel，J.《發(fā)育腦研究》12，77(1984)，Moro，R.，F(xiàn)ielitz，W.，Grunberg，J.和Uriel，J.，《國際發(fā)育神經(jīng)科學(xué)雜志》2，143(1984)]已經(jīng)證明，成神經(jīng)細(xì)胞能容易地從胞外源摻入AFP和血清清蛋白。利用同源和異源的蛋白進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在第一種情況中[Villacampa，M.J.，Lampreave，F(xiàn).，Calvo，M.，Pieiro，A.和Uriel，J.《發(fā)育腦研究》12，77(1984)]，顯示出在對(duì)懷孕的大鼠注射后，125I-AFP定位于胎腦，同時(shí)也在其它胎兒器官如腸，皮膚，和舌，以前已報(bào)道在這些器官中有天然細(xì)胞內(nèi)AFP[Trojan，J.和Uriel，J.，《癌發(fā)育生物醫(yī)學(xué)》3，13(1982)]。第二套實(shí)驗(yàn)[Moro，R.，F(xiàn)ielitz，W.，Grunberg，J.和Uriel，J.，《國際發(fā)育神經(jīng)科學(xué)雜志》2，143(1984)]顯示，當(dāng)在雞胚的中腦腔注射新生大鼠血清時(shí)，在它們的天生等同物的同一位置檢測到大鼠AFP和大鼠SA。這也表明來自于一個(gè)種類的AFP和SA被另一種類的細(xì)胞吸收，從而指出了進(jìn)化過程中保守的結(jié)構(gòu)和機(jī)制。這又提示其中涉及一個(gè)基本生物學(xué)原理。
盡管注射了高濃度的大鼠IgG，但這個(gè)蛋白質(zhì)的染色是陰性的，由于也檢測不到卵清蛋白(MW＝43,000)，甚至于當(dāng)注射兩倍于胚胎的腦脊液中AFP的正常分子濃度時(shí)也檢測不到，因此這不是它的能妨礙被動(dòng)擴(kuò)散的高分子量(150,000)的結(jié)果，[Fielitz，，W.，Esteves，A.和Moro，R.，《發(fā)育腦研究》13，111(1984)]。這一選擇性支持了內(nèi)吞作用的特異受體傳遞機(jī)制的假說[Moro，R.和Uriel，J.，《癌發(fā)育生物醫(yī)學(xué)雜志》2，391(1981)；Moro，R.，F(xiàn)ielitz，W.，Grunberg，J.和Uriel，J.，《國際發(fā)育神經(jīng)科學(xué)雜志》2，143(1984)]。
AFP的摻入依賴于細(xì)胞分化然而，目前仍未清楚是否AFP和SA的吸收是一個(gè)依賴細(xì)胞的現(xiàn)象，或者是否由于在胎兒期結(jié)束時(shí)腦血屏障的關(guān)閉或低濃度的循環(huán)AFP而導(dǎo)致的胞外蛋白質(zhì)的可獲得性較低而引起染色消失。首先在雞中[Moro，R.，《神經(jīng)科學(xué)通信》41，253(1983)]，然后在人胎兒中[Jacobsen，M.，Lassen，L.C.和Mollgard，K.，《腫瘤生物學(xué)》5，55(1984)]已經(jīng)證明，在獲得血清中AFP的最高峰之前，脊柱神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞完成了完整的陰性-陽性-陰性染色循環(huán)。此外，當(dāng)AFP變得不可測時(shí)，SA仍繼續(xù)存在一段時(shí)間，從而表明這些血清蛋白已經(jīng)到達(dá)神經(jīng)節(jié)成神經(jīng)細(xì)胞。
未成熟細(xì)胞內(nèi)的AFP受體AFP的細(xì)胞吸收表明存在一個(gè)根據(jù)細(xì)胞分化程度調(diào)節(jié)其表達(dá)的特異受體[Uriel，J.，Trojan，J.，Moro，R.和Pieiro，A.，《紐約學(xué)術(shù)科學(xué)年鑒》417，321(1983)；Moro，R.，《神經(jīng)科學(xué)通信》41，253(1983)]，先前的報(bào)道[Uriel.J.，Bonillon，D.，Russel，C和Dupiers，M.，《美國國家科學(xué)進(jìn)展》73，1452(1976)]表明在未成熟大鼠的子宮細(xì)胞溶質(zhì)中存在兩種含有AFP的超速離心部分；一個(gè)完全對(duì)應(yīng)于AFP的4S部分，另一個(gè)只能在用0.4MKCL處理后進(jìn)行AFP的免疫學(xué)檢測的8S部分，這一處理把8S部分轉(zhuǎn)化成4S。即使在AFP受體的概念還沒有產(chǎn)生的時(shí)候，8S部分很可能對(duì)應(yīng)于一個(gè)在高KCl濃度時(shí)解離的受體-AFP復(fù)合物。Smalley和Sarcione也觀察到了利用KCl解離AFP-受體復(fù)合物[Smalley，J.R.和Sarcione，E.J.《生物化學(xué)生物物理研究通訊》94，1429(1980)]，他們也提供了AFP分子能被未成熟的大鼠的子宮細(xì)胞合成的證據(jù)。
AFP受體在癌細(xì)胞中的表達(dá)由于癌細(xì)胞具有許多與胎兒細(xì)胞相同的生化的和抗原特征[Uriel，J.，《高級(jí)癌癥研究》29，127(1979)]，來源于在胎兒期摻入AFP的組織的惡性細(xì)胞有可能再表達(dá)相應(yīng)的受體從而再吸收AFP。為了支持這一假說，Sarcione等人[Sarcione，E.J.，Zloty，M.，Delluomo，D.S，Mizejewski，G.和Jacobson.H.，《癌癥研究》43，3739(1983)]在源于人乳腺癌的8S復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)AFP，該復(fù)合物可以用相同于利用未成熟大鼠細(xì)胞溶質(zhì)的實(shí)驗(yàn)的KCl處理方法來解離。最近，這些作者已經(jīng)證明MCF-7人乳房癌細(xì)胞系以復(fù)合物形式合成AFP，為了使AFP變成免疫學(xué)可測，該復(fù)合物需要分解[Sarcione，E.J.和Hart，D.，《國際癌癥雜志》35，315(1985)]。在另一方面，已證明這一細(xì)胞系[Uriel，J.，F(xiàn)ailly-Crepin，C.，Villacampa，M.J.，Pieiro，A.，和Gueskens，M.，《腫瘤生物學(xué)》5，41(1984)]，和一個(gè)鎳誘導(dǎo)的大鼠橫紋肌肉瘤[Uriel，J.，Poupon，M.F.和Geuskens，M.，《英國癌癥雜志》48，263(1983)]在體外吸收AFP。作為這些間接結(jié)果的一個(gè)證據(jù)，在MCF-7細(xì)胞系檢測到AFP的表面受體[Villacampa，M.J.，Moro，R.，Naval，J.，F(xiàn)ailly-Crpin，Ch.，Lampreave，F(xiàn).和Uriel，J.，《生物化學(xué)生物物理研究通訊》122，1322(1984)]。結(jié)合參數(shù)指出了一個(gè)展示陽性協(xié)同作用的兩位點(diǎn)受體模型。高親和位點(diǎn)有一個(gè)顯示陽性協(xié)同作用的1.5×10-9M的Kd。該高親和位點(diǎn)有一個(gè)具有n-2000/細(xì)胞的1.5×10-9M的Kd。以320,000/細(xì)胞存在的低親和位點(diǎn)有一個(gè)2.2×10-7M的Kd。后來的研究表明小鼠YACT淋巴瘤細(xì)胞的表面存在一個(gè)相似的受體體系，該體系在正常成年小鼠T細(xì)胞中缺乏[Naval，J.，Villacampa，M.J.，Goguel，A.F.和Uriel，J.《美國國家科學(xué)進(jìn)展》82，3301(1985)]。
平行于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也做了這些研究，其中用放射性碘標(biāo)記的AFP注射攜帶自發(fā)乳腺腫瘤的小鼠。放射性的組織分布顯示了腫瘤組織/正常組織(肝)的比例為3.6[Uriel，J.，Villacampa，M.J.，Moro，R.，Naval，J.和Failly-Crpin，CH.C.R.學(xué)術(shù)科學(xué)(巴黎)297，589(1983)；Uriel.J.，Villacampa.M.J.，Moro，R.，Naval，J.和Failly-Crpin，C.，《癌癥研究》44，5314(1984)]。來自這些動(dòng)物的腫瘤切片的放射自顯影顯示了環(huán)繞惡性細(xì)胞而不是正常細(xì)胞的核膜的明顯的銀顆粒的積累[Uriel，J.，Villacampa，M.J.，Moro，R.，Naval，J.和Failly-Crpin，C.，《癌癥研究》44，5314(1984)]。
利用131I-AFP的小鼠腫瘤的閃爍照像成象利用131I-AFP，已經(jīng)獲得小至3-4mm的鼠乳腺腫瘤的陽性閃爍圖像[Uriel，J.，Villacampa，M.J.，Moro，R.，Naval，J.和Fuilly-Crpin，C.《癌癥研究》44，5314(1984)；Moro，R，Heuguerot，C.，Vercelli-Retta，J.，F(xiàn)ielitz，W.，Lpez，J.J.和Roca，R.，《核醫(yī)學(xué)通訊》5，5(1984)]，事實(shí)上，利用連接于計(jì)算機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)γ-攝像機(jī)，可檢測12個(gè)這樣的腫瘤中的11個(gè)。用類似的方法，也可以掃描另一種小鼠腫瘤，即成神經(jīng)細(xì)胞瘤[Hajeri-Germond，M.，Naval.J.，Trojan，J.和Uriel，J.，《英國癌癥雜志》51，791(1985)]。
已經(jīng)在幾種不同類型的腫瘤中證明AFP吸收的表達(dá)或AFP受體的直接證據(jù)，這些腫瘤中的一些是大鼠橫紋肌肉瘤[Uriel，J.，Poupon，M.F.和Geuskens，M.，《英國癌癥雜志》48，263(1983)]，小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤[Hajeri-Germond，M.Naval，J.，Trojan，J.和Uriel，J.，《英國癌癥雜志》51，791(1985)]，小鼠和人乳腺癌[Villacampa，M.J.，Moro，R.，Naval.J.，F(xiàn)ailly-Crpin，Ch，Lampreave，F(xiàn)和Uriel，J.，《生物化學(xué)生物物理研究通訊》122，1322(1984)；Naval，J.，Villacampa，M.J.，Goguel，A.F.和Uriel，J.《美國國家科學(xué)進(jìn)展》82，3301(1985)；Uriel，J.，Villacampa，M.J.，Moro，R.，Naval，J.和Failly-Crpin，CH.C.R.學(xué)術(shù)科學(xué)(巴黎)297，589(1983)；Uriel，J.，Villacampa，M.J.，Moro，R.，Naval，J.和Failly-Crpin，C.，《癌癥研究》44，5314(1984)；Moro，R.，Heuguerot，C.，Vercelli-Retta，J.，F(xiàn)ielitz，W.，Lpez，J.J.和Roca，R，《核醫(yī)學(xué)通訊》5，5(1984)；Biddle，W.和Sarcione.E.J.，Breast《癌癥研究》Treat.10.281(1987)]，小鼠T淋巴瘤[Naval，J，Villacampa，M.J.，Goguel，A.F.和Uriel，J.《美國國家科學(xué)進(jìn)展》82，3301(1985)].人T和B細(xì)胞淋巴瘤[Laborda，J.，Naval，J.，Allouche，M.，Calvo，M.，Georgoulias，V.，Mishal，Z.和Uriel，J.《國際癌癥雜志》40，314(1987)；Calvo，M.，Laborda，J.，Naval，J.，Georgoulias，V.和Uriel，J.發(fā)表在ISOBM的XIII次會(huì)議(巴黎1985)；Torres，J.M.，Anel，A.，和Uriel，J.，《細(xì)胞生理學(xué)雜志》150，458(1992)；Torres，J.M.，Gueskens，M.和Uriel，J，《國際癌癥雜志》47，112(1991)]，以及phitto血凝素激活的人T淋巴細(xì)胞[Torres，J.M.，Laborda，J.，Naval，J.，Darracq，N.，Calvo，M.，Mishal，Z.和Uriel.J.《分子免疫學(xué)》26，851(1989)]，人惡性單核細(xì)胞系U937[Suzuki，Y.，Zeng，C.Q.，Alpert.E.《臨床研究雜志》90，1530(1992)]和HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞系[Esteban，C.，Gueskens.M.和Uriel.J.，《國家癌癥雜志》49，425(1991)]。
這些發(fā)現(xiàn)把AFP受體看作是相關(guān)于惡性狀態(tài)而不是腫瘤類型的廣泛的癌胚抗原。
針對(duì)AFP受體的單克隆抗體可能是由于固定過程中受體結(jié)合位點(diǎn)的部分變性和標(biāo)記AFP對(duì)它的受體顯示出的較低的親和力，標(biāo)記的AFP(FITC，放射性跟蹤物)不結(jié)合到在石蠟組織切片中的腫瘤細(xì)胞上，所以，利用一組人乳房癌作為免疫原產(chǎn)生了針對(duì)AFP受體的單克隆抗體(Mabs)[Moro，R.，Tamaoki，T.，Wegmann.T.G.，Longenecker，B.M.，和Laderoute，M.P.《腫瘤生物學(xué)》14，116(1993)，該文引入作為參考文獻(xiàn)]。
兩個(gè)IgM產(chǎn)生的Mabs識(shí)別非還原條件下的PAGE凝膠上的一條67KD的雙譜帶。該67KD譜帶也能與125I-AFP反應(yīng)。這些Mabs與AFP受體的結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)，因?yàn)樗鼈円种艫FP與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，并相反在過量AFP存在下他們與細(xì)胞的結(jié)合受到抑制，Mabs不與AFP反應(yīng)。他們識(shí)別在組織切片中的胎兒細(xì)胞和乳房癌，但不識(shí)別乳腺腺瘤或者大多數(shù)其他正常成人組織。
在過去幾十年中，科學(xué)家們已經(jīng)試圖鑒定與惡性相關(guān)的抗原。應(yīng)被認(rèn)為是一個(gè)癌胚抗原的AFP受體，可以滿足臨床有用的腫瘤標(biāo)記的許多要求。利用這一廣泛的與癌相關(guān)的抗原的單克隆抗體的進(jìn)一步工作將使人們能夠確定他們的臨床用途，同時(shí)也能研究AFP受體的生理作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種檢測病人癌癥的方法，該方法包括將標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP導(dǎo)入到一個(gè)病人的生物學(xué)樣品，以使標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP與生物學(xué)樣品中的AFP受體結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的步驟，接著的步驟是鑒定生物學(xué)材料中與標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP反應(yīng)的AFP受體結(jié)合位點(diǎn)，以確定癌的存在。優(yōu)選地，在導(dǎo)入步驟之前，有一個(gè)從病人身體中獲得生物學(xué)樣品的步驟。
本發(fā)明涉及一種治療病人癌細(xì)胞的方法，該方法包括給病人的癌細(xì)胞導(dǎo)入AFP受體抗體的步驟，接著的步驟是使AFP受體抗體與癌細(xì)胞的AFP受體反應(yīng)來抑制癌細(xì)胞的生長或殺死癌細(xì)胞。
本發(fā)明涉及一種監(jiān)測病人的方法，該方法包括治療病人的癌癥的步驟，接著的步驟是在治療之后在預(yù)定的時(shí)間間隔檢測病人的AFP受體位點(diǎn)水平。
本發(fā)明涉及一種治療病人的方法，該方法包括檢測病人的AFP受體的步驟，接著的步驟是如果測試顯示病人存在AFP受體則將AFP受體抗體或AFP導(dǎo)入病人以便與病人的癌細(xì)胞反應(yīng)的步驟。
本發(fā)明涉及一種治療病人的癌細(xì)胞的方法，該方法包括給病人的癌細(xì)胞導(dǎo)入經(jīng)修飾的AFP的步驟，接著的步驟是將修飾的AFP與癌細(xì)胞的AFP受體反應(yīng)來抑制癌細(xì)胞的生長或殺死癌細(xì)胞。
本發(fā)明的目的是通過檢測體液和組織中的α-胎蛋白受體(AFP受體)來診斷和跟蹤癌癥疾病和懷孕。盡管檢測溶液中(體液)或附著于固體基質(zhì)(組織切片)上的AFP受體的原理和方法是相似的，為了清楚起見將分別論述他們。


在附圖中，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選方法說明如下圖1是一個(gè)癌性的和非惡性疾病的圖。
圖2是一個(gè)乳房癌的照片，其中明亮的細(xì)胞是癌性的。
圖3是一個(gè)乳房癌的照片，其中暗棕色細(xì)胞是癌性的。
圖4是良性乳腺瘤。
圖5是肺癌的照片，其中棕色細(xì)胞是癌細(xì)胞。
圖6是胃癌的照片，其中暗棕色的是癌細(xì)胞。
圖7是腸癌的照片。
圖8是顯示AFPr-1對(duì)P-388生長的抑制的照片。
圖9是注射五天后，上邊三個(gè)對(duì)照動(dòng)物和四個(gè)治療動(dòng)物的照片。
圖10是另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物照片，其中三個(gè)治療動(dòng)物解除了疾病，兩個(gè)仍攜帶大的腫瘤。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及一種檢測病人的癌癥的方法，該方法包括將標(biāo)記的抗體或標(biāo)記的AFP導(dǎo)入到病人的一個(gè)生物學(xué)樣品中以使標(biāo)記的抗體或標(biāo)記的AFP與生物學(xué)樣品中的AFP受體結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的步驟。生物學(xué)樣品可以是血液、唾液、組織、血清、粘液、痰、尿或眼淚或含有癌細(xì)胞的材料。生物學(xué)樣品可以是組織切片。組織切片可以是固定的組織，新鮮的組織或冷凍的組織?？贵w可以是單克隆抗體，抗體可以是多克隆抗體。接著的步驟是在生物學(xué)材料中鑒定與標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP反應(yīng)的AFP受體結(jié)合位點(diǎn)，以確定癌癥的存在。優(yōu)選地，在導(dǎo)入步驟之前，有一個(gè)從病人身體中獲得生物學(xué)樣品的步驟。
導(dǎo)入步驟包括將放射性同位素標(biāo)記的抗體或放射性同位素標(biāo)記的AFP導(dǎo)入到病人的生物學(xué)樣品中以使標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP與生物學(xué)樣品中的AFP受體反應(yīng)的步驟，然后的鑒定步驟包括鑒定生物學(xué)樣品中存在的放射性。更具體地說，鑒定步驟可以包括測量生物學(xué)樣品的放射性計(jì)數(shù)的步驟，或者鑒定步驟包括用照像乳膠包被生物學(xué)樣品，顯影照像乳膠，觀察包被的生物學(xué)樣品的步驟?；蛘撸飳W(xué)樣品是病人，導(dǎo)入步驟包括用放射性同位素標(biāo)記的抗體或放射性同位素標(biāo)記的AFP注射病人的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)入步驟包括導(dǎo)入用酶標(biāo)記的抗體或用酶標(biāo)記的AFP到病人的生物學(xué)樣品中以使標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP與生物學(xué)樣品中的AFP受體結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的步驟，酶標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的AFP改變了生物學(xué)樣品的顏色，鑒定步驟可以包括把生物學(xué)樣品的顏色與一個(gè)已知顏色相比較來確定癌癥存在的步驟。酶可以是過氧化物酶，導(dǎo)入步驟包括導(dǎo)入過氧化物酶標(biāo)記的抗體到病人的組織中的步驟?；蛘撸瑢?dǎo)入步驟可以包括放一滴生物學(xué)樣品到硝酸纖維素或尼龍的一個(gè)位置上，然后加過氧化物酶標(biāo)記的抗體到這個(gè)位置的步驟。然后鑒定步驟包括確定是否在硝酸纖維素或尼龍上的這一位置改變了顏色的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，酶標(biāo)記的抗體或酶標(biāo)記的AFP釋放離子改變了處理樣品的溶液的電導(dǎo)。因而鑒定步驟包括測定溶液的電導(dǎo)來確定生物學(xué)樣品中癌的存在的步驟。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)入步驟可以包括導(dǎo)入螢光色素標(biāo)記的抗體或螢光色素標(biāo)記的AFP到生物學(xué)樣品中以使標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP與生物學(xué)樣品中的AFP受體反應(yīng)的步驟，然后鑒定步驟包括用紫外光照射生物學(xué)樣品，測量來自被照射的生物學(xué)樣品的光輻射的步驟。作為另一個(gè)例子，生物學(xué)樣品可以是在玻片上的含有癌細(xì)胞的生物學(xué)材料的涂片，鑒定步驟包括用顯微鏡或通過熒光細(xì)胞測定法檢查涂片的步驟。
本發(fā)明涉及一種治療病人癌細(xì)胞的方法，該方法包含導(dǎo)入AFP受體抗體到病人的癌細(xì)胞中的步驟?？贵w可以是單克隆抗體，多克隆抗體，來自于不同于病人的種類的抗體，或來自于相同于病人的種類的淋巴細(xì)胞體外產(chǎn)生的抗體。然后還有一個(gè)步驟是使AFP受體抗體與癌細(xì)胞的AFP受體反應(yīng)來抑制癌細(xì)胞的生長或殺死癌細(xì)胞。
導(dǎo)入步驟包括給病人注射AFP受體抗體的步驟，注射步驟可以包括通過靜脈注射AFP抗體受體進(jìn)入病人的血流的步驟，或者，注射步驟可以包括注射AFP受體抗體進(jìn)入病人的一個(gè)鄰近癌細(xì)胞的位置。
或者，導(dǎo)入步驟可以包括針對(duì)癌細(xì)胞免疫接種病人的步驟，免疫接種步驟可以包括注射一個(gè)不同于病人的種類的AFP受體進(jìn)入病人來引起病人產(chǎn)生針對(duì)注射的AFP受體的AFP受體抗體的步驟。病人產(chǎn)生的AFP受體抗體與病人的AFP受體或癌細(xì)胞交叉反應(yīng)。
反應(yīng)步驟可以包括將AFP受體抗體與病人癌細(xì)胞的AFP受體反應(yīng)以使癌細(xì)胞的AFP受體被封閉或功能受損的步驟?；蛘撸珹FP受體抗體是固定補(bǔ)體的AFP受體抗體。那么反應(yīng)步驟即是使固定補(bǔ)體的AFP受體抗體與癌細(xì)胞反應(yīng)以使當(dāng)產(chǎn)生補(bǔ)體鏈反應(yīng)時(shí)，在癌細(xì)胞的膜上穿孔殺死癌細(xì)胞。
或者，AFP受體抗體與藥物或毒素偶聯(lián)，然后，反應(yīng)步驟包括使偶聯(lián)藥物或毒素的AFP受體抗體與癌細(xì)胞反應(yīng)以使癌細(xì)胞吞沒進(jìn)入癌細(xì)胞的藥物或毒素，在癌細(xì)胞中，癌細(xì)胞的酶把藥物或毒素從抗體上切割下來引起細(xì)胞不可逆地?fù)p害或死亡。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，AFP受體抗體是放射性標(biāo)記的，接著的反應(yīng)步驟是包括使放射性標(biāo)記的AFP受體抗體與病人的癌細(xì)胞反應(yīng)，以使放射性標(biāo)記的AFP受體抗體從短距離對(duì)癌細(xì)胞DNA輻射，以損壞DNA從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡。
本發(fā)明涉及一種監(jiān)測病人的方法，該方法包括治療病人的癌癥的步驟，然后是在治療之后在預(yù)定間隔測試病人的AFP受體位點(diǎn)水平。
本發(fā)明涉及一種治療病人的方法，該方法包括測試病人的AFP受體的步驟，接著如果測試表明病人具有AFP受體則將AFP受體抗體或AFP導(dǎo)入病人以與病人的癌細(xì)胞反應(yīng)。
本發(fā)明涉及一種治療病人的癌細(xì)胞的方法，該方法包括導(dǎo)入修飾的AFP到病人的癌細(xì)胞中的步驟，修飾的AFP可以是合成地產(chǎn)生或者是AFP的一部分。接著的步驟是使修飾的AFP與癌細(xì)胞的AFP受體反應(yīng)來抑制癌細(xì)胞或殺死癌細(xì)胞。
導(dǎo)入步驟可以包括給病人注射修飾的AFP的步驟，注射步驟包括通過靜脈注射修飾的AFP進(jìn)入病人的血流的步驟，或者，注射步驟包括注射修飾的AFP進(jìn)入病人的一個(gè)鄰近癌細(xì)胞的位置的步驟。
反應(yīng)步驟可以包括使病人的癌細(xì)胞的AFP受體與修飾的AFP反應(yīng)以使癌細(xì)胞的AFP受體位點(diǎn)被封閉或功能受損的步驟。
一般來說，除了運(yùn)用或利用與AFP受體反應(yīng)的AFP，修飾的AFP或抗體，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員一般是公知上述的技術(shù)。
本發(fā)明的操作在體液中在細(xì)胞死亡之后，通過分泌或通過被動(dòng)擴(kuò)散，來自癌或胎兒/胚胎組織的AFP受體可以被釋放進(jìn)入血流并從那里進(jìn)入許多其他液象尿，眼淚，唾液等，然后在體液(包括血清)中AFP受體的濃度在健康個(gè)體和癌癥或懷孕病人之間有明顯的不同。這可以用于診斷，同時(shí)，AFP受體濃度在這些體液中的進(jìn)化可以用于跟蹤，例如一病人被診斷有乳腺癌那么AFP受體的血清濃度是高的。病人被開刀并且腫瘤被移走，隨后血清中AFP受體的測定顯示了外科手術(shù)后的即刻的劇烈下降，接著是一個(gè)平穩(wěn)階段。然而六個(gè)月后血清中AFP受體的濃度又開始增加，這表示了癌癥的再出現(xiàn)或轉(zhuǎn)移，這可能領(lǐng)先于傳統(tǒng)的臨床或其他診斷方法，被所提出的一個(gè)不昂貴的測試所提醒；現(xiàn)在醫(yī)師用更精確昂貴并且如果需要用侵害的方法尋找惡性塊。
在組織樣品中AFP受體存在于大多數(shù)癌細(xì)胞中，所以，可以通過免疫組織學(xué)方法或用合適地標(biāo)記的AFP溫育來檢測AFP受體(盡管后者還沒有成功地用于石蠟切片，它只適用于冰凍切片)。在這個(gè)基礎(chǔ)上可進(jìn)行惡性疾病的診斷，除此之外，用螢光素作標(biāo)記，在一個(gè)組織切片上可以點(diǎn)出很少的陽性細(xì)胞，這降低了傳統(tǒng)病理學(xué)分析所產(chǎn)生的錯(cuò)誤的界限，在傳統(tǒng)病理學(xué)分析中，在一個(gè)正常組織中的少數(shù)癌細(xì)胞可能看不到。另外，由于AFP受體的表達(dá)不是以結(jié)構(gòu)上變化而是以分化和生化變化為條件的，因而很可能看上去正常而事實(shí)上處于腫瘤發(fā)生早期的細(xì)胞在測試AFP受體的檢測中會(huì)呈現(xiàn)陽性。
同樣，為了清楚起見，盡管原理上沒有差別并且所用的技術(shù)上僅有微小差別，在體液中和組織切片中的AFP受體的檢測將被分別論述體液實(shí)施例1在本例中，通過酶免疫測定(EIA)測試了來自非癌病人的22個(gè)血清樣品和來自癌癥病人的17個(gè)樣品的AFP受體濃度，所用的技術(shù)如下用在磷酸緩沖鹽水(PBS)(0.05MPO4，0.15MNaCl，pH7.5)中稀釋1/16384的來自上述組中的血清樣品包被EIA96孔板1小時(shí)到過夜。以類似的方法以1/256稀釋倍數(shù)用來自乳房癌肺轉(zhuǎn)移的病人的胸膜滲出液包被一些孔。由于可大量獲得，這一材料，稱為P89被用作標(biāo)準(zhǔn)，這使得P89被用作同樣的標(biāo)準(zhǔn)來比較所有實(shí)驗(yàn)中的所有樣品和所有其他樣品。在用PBS洗3次之后，1％在PBS中的卵白蛋白或明膠封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)。在洗3次之后，在每個(gè)孔中溫育3小時(shí)100μl用1％在PBS中的卵白蛋白稀釋1/200的鼠產(chǎn)生的抗AFP受體的單克隆抗體(Mab)腹水(如在[Moro，R.，Tamaoki，T.，Wegmann，T.G.，Longenecker.B.M.，和Laderante，M.P.《腫瘤生物學(xué)》14，116(1993)]所述的Mab167H.4，引為參考文獻(xiàn))，然后用PBS洗孔3次并且以廠家(Sigma Chemicals.S.Louis)所推薦的濃度加入商購的過氧化物酶抗小鼠IgM偶聯(lián)物，1小時(shí)后用PBS洗板3次并且以廠家(Sigma)所推薦的濃度加入過氧化物酶的顯色底物。在室溫下做所有的溫育，30分鐘后，用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的Titertek讀板器在405nm處讀出每個(gè)孔中的光密度(O.D.)，結(jié)果如表1和圖1所示表1器官 腫瘤類型1卵巢 粘液性腺癌2 淋巴性白血病3肢體 血管肉瘤4子宮 腺癌5軟組織 肉瘤6卵巢 囊性腺癌7直腸 腺癌8骨盆 癌病9 一般傳播腫瘤10腦星形細(xì)胞瘤11肺瘤形成12肝初級(jí)肝細(xì)胞瘤13骨盆 瘤形成14腎瘤形成(轉(zhuǎn)移)15結(jié)腸 瘤形成16骨骨肉瘤該表顯示了研究過程中病人、腫瘤的類型以及樣品與用作標(biāo)準(zhǔn)的P89的比例，結(jié)果表明當(dāng)陽性和陰性的臨界設(shè)定在54％的P89時(shí)，除一人外所有的癌癥病人都是陽性，利用同樣的界限除一人外所有的非癌病人都是陰性。一個(gè)單獨(dú)的T-測試報(bào)告了如下值(利用Excel(TM))中數(shù)據(jù)分析)
t-測試具有不等方差的兩個(gè)樣品變量1 變量2平均 84.7457 133.26582方差 709.91373300.2051觀察資料 16 22Pearson相關(guān) #N/A合并方差 3.5df 24.02215t6.758736P(T＜＝t)單尾2.72E-07t臨界單尾1.710882P(T＜＝t)雙尾5.44E-07t臨界雙尾2.063898一個(gè)雙尾分析產(chǎn)生了P＝0.00000054，一個(gè)特別顯著的數(shù)據(jù)，即使是對(duì)少量所考慮的樣品也是如此。
在陰性對(duì)照組的一個(gè)病人(不在表中)是陽性的，被所獲得的數(shù)據(jù)的高顯著性所提醒，負(fù)責(zé)這一病人的醫(yī)師用CAT掃描她并發(fā)現(xiàn)一個(gè)正好是惡性腎上腺樣的腫瘤。這一惡性首先通過利用這一測試檢測到，后來被臨床證實(shí)。
圖1示出了以圖表表示的相同結(jié)果。在該圖中，x軸分成兩部分(惡性的和非惡性的，單位無關(guān))，并且Y軸代表每個(gè)病人的P89的百分?jǐn)?shù)。水平線代表54％+/-界限。
實(shí)施例2在另一個(gè)實(shí)施方案中，用AFP受體的單克隆抗體(Mab)以適當(dāng)?shù)臐舛劝灰环N適當(dāng)?shù)乃芰系幕虿ＡЩ?EIA板或試管)。在洗掉多余的Mab后，用一種不相關(guān)的蛋白質(zhì)或氨基酸封閉基底以防止非特異結(jié)合，并且用所包被的基底溫育病人的體液(血清、唾液、尿等)的合適的樣品稀釋液一段時(shí)間，在洗滌除去未結(jié)合的樣品材料之后，加入多克隆類型的第二抗體(通過免疫動(dòng)物產(chǎn)生多克隆抗體并利用它的血清作為反應(yīng)的抗體源，其與Mab相反，Mab是通過培養(yǎng)無限增殖的脾細(xì)胞的個(gè)別克隆或移植進(jìn)入一個(gè)合適的寄主而產(chǎn)生)，這個(gè)抗體可以與合適的標(biāo)記或酶偶聯(lián)以顯色，或者，通過加入用所說的標(biāo)記或酶標(biāo)記的一個(gè)抗第二抗體可以進(jìn)行可測定的反應(yīng)或者測定。如果反應(yīng)涉及這第三抗體，那么第二抗體應(yīng)該在一個(gè)不同于第一抗體的種類中產(chǎn)生并且第一和第三抗體之間應(yīng)觀察到無交叉反應(yīng)。然后通過對(duì)應(yīng)于所進(jìn)行的反應(yīng)的類型(顏色，傳導(dǎo)性，化學(xué)發(fā)光等)的一個(gè)合適的檢測器來讀這一反應(yīng)。
實(shí)施例3相同于實(shí)施例2但是使用了兩個(gè)不同的多克隆抗體代替單克隆抗體和抗體以分別作為第一和第二抗體。
實(shí)施例4相同于實(shí)施例2，其中的基底為硝酸纖維素或尼龍膜，反應(yīng)不是通過儀器來測定，而是反應(yīng)在基底上作為顏色點(diǎn)顯示。用裸眼判斷反應(yīng)為陽性或陰性。
實(shí)施例5相同于實(shí)施例3，其中的基底為硝酸纖維素或尼龍膜，反應(yīng)不是通過儀器來測定，而是反應(yīng)在基底上作為顏色點(diǎn)顯示，通過裸眼看出反應(yīng)為陽性或陰性。
實(shí)施例6在實(shí)施例2-5中的抗體中的一個(gè)被結(jié)合到受體上的同源的或異源的AFP所替代。
實(shí)施例7濃度超過0.4M的KCl解離AFP受體復(fù)合物，這可能會(huì)釋放一定量的可能檢測不到的AFP受體，因?yàn)楸磺袄龅呐潴w(Mab，多克隆抗體或AFP)中之一識(shí)別可能被存在于循環(huán)AFP受體復(fù)合物中的內(nèi)源AFP所削弱。結(jié)果，可以增加AFP受體的量從而增加測試的靈敏度。在本例中，可以在與分析法的固相溫育過程中或之前用KCL處理樣品。
實(shí)施例8所有上述提到的例子中的標(biāo)記是一個(gè)放射活性化合物(用于放射性免疫測定和相關(guān)的技術(shù))。
實(shí)施例9所有上述實(shí)施例中的測定的閱讀通過cheuriluminescence或熒光。
實(shí)施例10所有上述閱讀是基于傳導(dǎo)性。
在組織樣品中以下面幾種方式獲得并加工組織樣品獲得(a)來自于外科手術(shù)移去的器官(b)來自分泌物或其它體液或通過接觸的涂片(PAP涂片)。
(c)來自針活體解剖在AFP受體染色之前加工組織組織樣品可以被固定和切割，如果需要以如下幾種方式進(jìn)行(a)冰凍切片在切割之前將組織冰凍成固體，在這些切片上可以使用或不用固定劑。
(b)石蠟切片其中常規(guī)地加工組織以在切割之前把樣品包埋在一個(gè)石蠟塊中。
(c)丙烯加工和其他加工主要是為了用于電子顯微鏡而加工。
實(shí)施例11在這個(gè)例子中，利用了來自醫(yī)院的病理學(xué)部門的常規(guī)石蠟切片。組織被切成4-8μm厚的切片，在再水合之后，用1∶2000稀釋的抗AFP受體的單克隆抗體(Mab)腹水溶液溫育切片，45分鐘后，洗玻片并用一種抗小鼠IgG+IgG過氧化物或堿性蕊香紅標(biāo)記的偶聯(lián)物溫育玻片，45分鐘后，再一次洗玻片，并在合適的光源下用顯微鏡觀察或者用過氧化物底物DAB溫育直到顯色，然后常規(guī)固定玻片并在可見光下觀察。圖2-7顯示了乳房癌(圖2-3)，良性乳腺瘤(圖4)，肺癌(圖5)，胃癌(圖6)，和腸癌(圖7)的堿性蕊香紅染色的AFP受體的照片，這些圖顯示了癌細(xì)胞或癌細(xì)胞的索或條是陽性染色的，而非惡性的鄰近組織不是陽性，這一點(diǎn)在圖4中是明顯的，該圖顯示一個(gè)良性乳腺瘤，其中細(xì)胞是陰性的，在腺瘤細(xì)胞和周圍正常組織之間沒有染色上的差別。癌癥治療在癌細(xì)胞表面的癌標(biāo)記的表達(dá)使得有可能利用它們來定位癌細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)治療目的。
有許多方法可通過定位表面抗原促進(jìn)細(xì)胞死亡，例如，可以用固定補(bǔ)體的抗體，當(dāng)發(fā)生補(bǔ)體鏈反應(yīng)時(shí)，在細(xì)胞上穿孔導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另一種可能性是利用抗腫瘤抗原抗體偶聯(lián)藥物或毒素，一旦附著于細(xì)胞表面，偶聯(lián)物被吞入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在那里細(xì)胞的酶把藥物或毒素從抗體上切割下來。一旦釋放，藥物或毒素不可逆地?fù)p壞細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在另一種情況下，可以使用放射性標(biāo)記抗體，一旦與細(xì)胞粘連，其與細(xì)胞DNA的短距離的輻射產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞DNA的損傷從而誘導(dǎo)細(xì)胞在下一個(gè)復(fù)制時(shí)死亡。
在所有上述過程中的關(guān)鍵成份是特異地識(shí)別惡性細(xì)胞的抗體，如果(AFP受體)被用作癌癥標(biāo)記，那么不僅僅抗其的抗體了可作為靶分子，而α-胎蛋白(AFP)本身將特異地識(shí)別AFP受體，所以也可以用各種溶細(xì)胞的試劑標(biāo)記AFP來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
除了損壞癌細(xì)胞，后者還可以被誘導(dǎo)停止增殖，如下例所示。
實(shí)施例12用抗AFP受體的一個(gè)單克隆抗體的不同稀釋液溫育表達(dá)AFP受體的P-388小鼠細(xì)胞。先進(jìn)行了一個(gè)補(bǔ)體固定試驗(yàn)并顯示沒有由于補(bǔ)體固定而導(dǎo)致的細(xì)胞破壞。在誘導(dǎo)了2-6小時(shí)之后，加3H-胸苷到P-388細(xì)胞中，清洗并計(jì)數(shù)。圖9顯示了用同樣濃度的AFPr-1(一個(gè)抗AFP受體單克隆抗體)或正常小鼠血清處理的細(xì)胞的放射性胸苷計(jì)數(shù)，正如所描述的，通過Mab大大地降低了P388的增殖。另人感興趣的是，當(dāng)用Mab溫育細(xì)胞幾個(gè)小時(shí)后，然后清洗并再培養(yǎng)，它們的復(fù)制速率接近于那些用不相干抗體(正常鼠血清)處理的對(duì)照細(xì)胞的復(fù)制速率，從而指出細(xì)胞不是被殺死而是被Mab抑制了增殖，在人LoVo消化道癌細(xì)胞系中也觀察到體外增殖抑制(結(jié)果未顯示)。
細(xì)胞增殖被抑制的原因不清楚，一個(gè)可能的解釋是在胎兒期中，據(jù)信AFP攜帶脂肪酸進(jìn)入胎兒細(xì)胞，這些脂肪酸對(duì)細(xì)胞合成膜，即器官發(fā)生過程中一個(gè)非常積極的任務(wù)是必需的。由于AFP的細(xì)胞外濃度隨著時(shí)間以及從一種組織到另一組織而變化著，對(duì)細(xì)胞來說，當(dāng)它周圍的AFP的濃度不合適時(shí)，進(jìn)入復(fù)制可能是致命的。這一概念支持了AFP受體能作為細(xì)胞膜和核之間的信使的論點(diǎn)。在使用P388的實(shí)驗(yàn)中所述的抗AFP受體的抗體可能在某種程度上“干擾”(jam)信息傳遞到核，從而細(xì)胞不能進(jìn)入分裂期，這很重要因?yàn)檫€有其他方法可以用如下將要討論的Mab以外的物質(zhì)“干擾”AFP受體系統(tǒng)。
在這個(gè)例子和其他例子中的一個(gè)重要的考慮是針對(duì)人AFP受體產(chǎn)生的小鼠抗AFP受體單克隆抗體也能識(shí)別小鼠癌細(xì)胞，當(dāng)溫育來自一個(gè)種類的AFP并結(jié)合到來自不同種類的細(xì)胞上時(shí)，在結(jié)合研究中觀察到了類似的種類間的交叉反應(yīng)，從而提示了不同種類的AFP受體之間的相似性。
實(shí)施例13同時(shí)用2×106EL-4細(xì)胞注射C57黑鼠的腹部并在尾巴靜脈注射100μl抗AFP受體腹水或作為對(duì)照的正常鼠血清，由于次要組織不相容性，用300rad照射動(dòng)物，這幫助EL-4細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤。動(dòng)物被觀察了21天；殺死動(dòng)物并照相。圖10和11顯示了兩個(gè)這樣的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖10描述了上部的3個(gè)對(duì)照動(dòng)物(注射了正常鼠血清)和4個(gè)治療動(dòng)物(注射了正常鼠血清)和4個(gè)注射5天后的治療動(dòng)物。對(duì)照組中的腫瘤(它們中的一些被一種紅氈所染色而使它們更清楚)的直徑大約是5mm，治療動(dòng)物沒有疾病(僅在注射位置可以看到一個(gè)疤痕)。圖11顯示了來自另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的幾個(gè)動(dòng)物，其中所有5個(gè)治療動(dòng)物沒有疾病(顯示了其中3個(gè))，2個(gè)有大的腫瘤(在注射的15天殺死動(dòng)物)。
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，治療動(dòng)物活了8個(gè)月沒有任何疾病的信號(hào)或異常狀態(tài)。樣品和體液AFP受體存在于細(xì)胞膜上也在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)然當(dāng)放射性AFP與癌細(xì)胞溫育時(shí)，發(fā)現(xiàn)大約其2/3在細(xì)胞質(zhì)中，很可能與AFP受體相關(guān)，(參考文獻(xiàn)32 Naval，J.，Villacampa，M.J.，Goguel，A.和Uriel，J.，《美國國家科學(xué)進(jìn)展》82，3301(1985)在我送你的總的介紹中)，已開發(fā)了一種從人索血清中純化AFP受體的方法[Moro，R.，Tamaoki，T.，Wegmann，T.G.，Longenecker，B.M.，和Laderoute，M.P.《腫瘤生物學(xué)》14，116(1993)]，引入作為參考文獻(xiàn)，實(shí)行這個(gè)方法是因?yàn)閾?jù)信垂死的細(xì)胞釋放或主動(dòng)地分泌循環(huán)的AFP受體，事實(shí)是正如所希望的，AFP受體是存在于新生兒血液中的一個(gè)可溶性蛋白。
同樣情況發(fā)生于一個(gè)帶腫瘤的個(gè)體中，只是AFP受體的起源是惡性細(xì)胞而不是生理表達(dá)其的胎兒細(xì)胞，所以，在腫瘤胞外液體中存在AFP受體，這是重要的，因?yàn)橐恍w液或分泌物可以直接從胞外液體中獲得，例如，一個(gè)腹膜癌病(轉(zhuǎn)移到腹膜并傳播到整個(gè)腹腔的任何起源的癌細(xì)胞)正常地產(chǎn)生我們已經(jīng)測到并富于AFP受體的腹水液體(不要與在鼠中作為單克隆抗體源誘導(dǎo)的腹水混淆，盡管病理生理學(xué)機(jī)制是相同的，在腹腔中的癌細(xì)胞(在這種情況下，產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤)產(chǎn)生一個(gè)炎性反應(yīng)，其產(chǎn)生腹水，雜交瘤細(xì)胞釋放單克隆抗體到腹水中)。
我們?cè)诿该庖邷y定中用作參考標(biāo)準(zhǔn)的P89是一個(gè)帶有乳房癌肺轉(zhuǎn)移的病人的胸膜滲出液，這里的情況是來自乳房癌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺并在胸膜上開始生長，膜包裹著肺。胸膜以同樣于腹膜的方式與癌細(xì)胞反應(yīng)，只是液體稱作胸膜滲出液而不是腹水，在這些情形中(腹水和胸膜滲出液)，與液體直接接觸(或漂浮在其中)的癌細(xì)胞直接釋放AFP受體進(jìn)入液體。
腹水和胸膜滲出液通過用針穿刺來收集。在其他情況下，分泌物可以自發(fā)地排到體外，例如，一個(gè)膀胱癌可以釋放AFP受體進(jìn)入隨后能監(jiān)測的尿中，支氣管癌可以釋放AFP受體到粘液中，其可通過強(qiáng)迫病人咳嗽以痰來收集。
如果惡性細(xì)胞與血液有緊密接觸，正如白血病和一些淋巴瘤的情況，則AFP受體的最高濃度是在血清中。
所有上述均是確實(shí)的情況，但不是最可能發(fā)生的，最普通癌癥胃、乳房、子宮、結(jié)腸和肺將釋放AFP受體進(jìn)入血流，這一體液在用于分析的液體中將顯示最高的標(biāo)記物濃度。然而，由于不同的免疫化學(xué)技術(shù)的靈敏度的增加，也有可能在其它液體中檢測AFP受體，例如，大部分血清蛋白均有少量存在于唾液中。顯然獲得唾液樣品比血樣更容易，如果AFP受體的量足夠高并且所用的反應(yīng)的靈敏度也足夠的話，人們可以用唾液而不是血來診斷和跟蹤，對(duì)其他體液也同樣。
總之，在某些情況下，用體液如腹水，關(guān)節(jié)液(例如關(guān)節(jié)骨癌)，胸膜滲出液、痰、腦脊髓液、尿、糞便等是方便的。在其他情況下，血或血清是最佳選擇，最后，在某些其他情況下，盡管更多的AFP受體可能存在于血清中，但為了實(shí)際或法律的原因測試其他體液如唾液或尿可能更方便，可以通過自發(fā)分泌或用一根合適的針穿刺來收集體液。
免疫化學(xué)方法這些方法可以分成2組一類在試管或平板孔中進(jìn)行，其中反應(yīng)所“粘連”的固相是一個(gè)人工物，另一類，其中固相是寄主的一個(gè)天然部分，例如，組織切片或血細(xì)胞涂片。前者通常稱為免疫化學(xué)測定，后者稱為免疫組織化學(xué)(在組織切片的情況)或免疫細(xì)胞化學(xué)(當(dāng)細(xì)胞如在涂片上那樣疏松時(shí))技術(shù)。原理是相同的；最初的材料不同，對(duì)免疫化學(xué)測定，待測或測量的分子必須在溶液中，而在免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)測定中，檢查的分子是反應(yīng)中的細(xì)胞的一部分。
這些反應(yīng)的一般原理是簡單的抗體(單克隆的或來自血清或免疫動(dòng)物)非常特異地識(shí)別他們與之反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。如果用非常純的人清蛋白的一部分免疫一種動(dòng)物，它的血清將只識(shí)別存在于可能含有非常高濃度的上百種其他蛋白的一個(gè)樣品中的清蛋白。抗體還具有對(duì)產(chǎn)生他們的(稱為抗原)的物質(zhì)的巨大的親和力，所以，很少量的這些抗原也可以被檢測出來。
實(shí)現(xiàn)免疫化學(xué)或免疫組織化學(xué)(免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)包括在后者中，因?yàn)槲ㄒ坏牟顒e是在一種情況下，細(xì)胞是所切割的放在玻片上的一塊組織的結(jié)構(gòu)的一部分，在另一種情況下，細(xì)胞被涂在玻片上)反應(yīng)的方法是相同的所檢測的物質(zhì)(抗原，這里為AFP受體)與一個(gè)特異于那個(gè)抗原的抗體反應(yīng)。以某種方式標(biāo)記(標(biāo)簽)兩個(gè)(抗體或抗原)中的一個(gè)。在把兩者一起溫育之后，洗去過量的試劑并且以許多方式使標(biāo)記物顯示，如果標(biāo)記是放射性同位素則用一個(gè)合適的檢測器測量其放射性計(jì)數(shù)(通常，在這些技術(shù)中用125I并測量γ射線輻射，這些技術(shù)被總稱為放射性免疫測定(RIA)。如果在一個(gè)組織切片上進(jìn)行與放射性標(biāo)記物的溫育，那么3H是優(yōu)選的，在用照相乳膠包被它之后，它即暴露于玻片上，在有放射性的地方顯現(xiàn)銀顆粒(黑色)，可以在顯微鏡下觀察這些顆粒。
另一種非常普遍的技術(shù)是利用一種酶作為標(biāo)記。酶是一種催化劑，正因?yàn)槿绱?，它可以把一種底物轉(zhuǎn)化成一種新的產(chǎn)物，這里感興趣的特征是一個(gè)單一的酶分子(如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶(2個(gè)最常用的))可以催化10,000個(gè)或者更多的底物分子，所以，由于存在一個(gè)10,000倍的放大因子，靈敏度是巨大的，這些反應(yīng)被稱為酶免疫測定(EIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。這些酶通常在底物中產(chǎn)生顏色變化，在可溶性測定(免疫化學(xué)反應(yīng))中，在試管中或平板孔中的溶液改變顏色，然后測量這個(gè)變化就可以定量這一反應(yīng)(用光比色計(jì)或分光光度計(jì))。在其他情況下，酶從非離子溶液釋放離子從而改變了溶液的電導(dǎo)，隨后可以進(jìn)行電測量。在這些技術(shù)的一個(gè)變化方案中，標(biāo)記物是生物素，其隨后被與酶偶聯(lián)的抗生素蛋白識(shí)別。抗生素蛋白-生物素反應(yīng)提高了測定的總靈敏度。
最近，介紹了另一類標(biāo)記，這些標(biāo)記是螢光色素，他們?cè)诒籙V光激發(fā)在可見光譜發(fā)射質(zhì)子，在暴露于一個(gè)高強(qiáng)度的UV刺激光脈沖之后馬上用光電池測量反應(yīng)，這些技術(shù)被稱為免疫化學(xué)發(fā)光。
不管標(biāo)記分子的方式或閱讀反應(yīng)的方式，反應(yīng)以下述確定好的順序發(fā)生競爭測定在這種情況下，自由抗原(這里是AFP受體)必須是以相當(dāng)高的量和非常純的形式獲得，抗體(Ab)附著于固相(試管或塑料平板孔或一個(gè)合適的膜，以下更多的是后者)，將含抗原(Ab)的樣品與已知量的純的標(biāo)記抗原混合，用在固相上的Ab溫育混合物，在原始樣品中的Ag越多，可以附著于固相上的給定量的Ab上的標(biāo)記Ag越少(Ag與Ab量比較處于飽和狀態(tài))，通過針對(duì)含有已知量的非標(biāo)記Ag的溶液的外推法定量反應(yīng)。這項(xiàng)技術(shù)只適用于可溶性抗原，對(duì)組織樣品沒有用途，競爭測定具有的主要優(yōu)點(diǎn)是它們只需要一個(gè)抗體。
三文治技術(shù)有許多變化方案傳統(tǒng)的夾心ELISA包括把Ab化學(xué)地附著于固相，然后加入含有Ag的待測樣品，稀釋液是使反應(yīng)在過量的Ab中進(jìn)行。在溫育幾分鐘到幾小時(shí)后，洗去過量的試劑并加入第二抗體，這第二抗體必須識(shí)別Ag分子上不同于第一Ab識(shí)別的位點(diǎn)的位點(diǎn)，否則，第一Ab將占據(jù)位點(diǎn)而不發(fā)生反應(yīng)(除非Ag具有多于1個(gè)第二Ab識(shí)別的相同的結(jié)合位點(diǎn)，這種情況很少見)。第二抗體也過量存在以識(shí)別所有的Ag，這第二Ab是被標(biāo)記的。在又一次清洗之后讀出反應(yīng)。夾心技術(shù)有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，那就是不需要純Ag，缺點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間較長(至少需要2次溫育)并需要2個(gè)不同的抗體。
“一片”夾心被用于本例中并被用于大多數(shù)組織中上的免疫組織化學(xué)反應(yīng)中。這里，Ag被固定在固相上，然后在其上溫育標(biāo)記的Ab(只有1個(gè)Ab)。當(dāng)用試管作固相時(shí)，缺點(diǎn)是Ag附著于試管的方式可能影響反應(yīng)的強(qiáng)度并且“粘度”可能依賴于樣品中在一個(gè)病人的血清與另一個(gè)之間變化很大的其他組份(這是因?yàn)橄鄬?duì)于結(jié)合Ag到它的Ab上，將蛋白質(zhì)結(jié)合到試管或平板孔的玻璃或塑料的力是靜電力并很弱)。為了避免這樣是用過量的第一Ab進(jìn)行上述雙夾心。如果附著于固相的第一抗體或多或少是不相干的，由于與固相的非特異結(jié)合總是用相同于測定中的產(chǎn)物(第一Ab制備液)，因而量總是足夠的，從一個(gè)樣品到另一個(gè)樣品也沒有變化。這里在癌癥和非癌癥病人之間的實(shí)驗(yàn)差別是它們不能用所用的塑料板的包被的不同來解釋。
關(guān)于固相其可以是在顯微鏡玻片上的組織或一個(gè)通常通過靜電力附著分子的合適的表面(制備液通常剛好在試管中溫育幾個(gè)小時(shí)然后洗滌，蛋白質(zhì)仍然附著于玻璃或塑料上)。然而在其他一些情況下，固相可以是通常由尼龍或硝酸纖維素做的膜，這些膜是白色的。如果一旦用Ag或Ab包被膜，則實(shí)現(xiàn)了一個(gè)類似于在顯微鏡組織切片上實(shí)現(xiàn)的測定并且利用一種不改變顏色而是產(chǎn)生有顏色的沉淀的底物顯色，接著在此過程結(jié)束時(shí)，有顏色的點(diǎn)指示反應(yīng)為陽性或陰性。如果有顏色，則有反應(yīng)，如果沒有顏色則反應(yīng)是陰性的，這是前面所提到的“有或沒有”類型的反應(yīng)的一個(gè)例子，其有巨大的優(yōu)點(diǎn)，它不需要讀數(shù)指示儀器；有裸眼就夠了。主要的缺點(diǎn)是不精確。
人體中抗體的導(dǎo)入有幾種方法可以使病人的癌細(xì)胞暴露于抗AFP受體抗體一種方法是注射純的鼠單克隆抗體(Mab)給病人。如果惡性細(xì)胞是與血液直接接觸(如白血病)則選擇靜脈注射途徑，如果腫瘤只能從血液達(dá)到，用同樣的途徑。然而在有些情況下，其它途徑可能更好，如上所述，一些腫瘤生長在限定空間如胸腔或腹腔，在這些情況下，注射抗體直接進(jìn)入腔內(nèi)而不是血液可能更好。另一個(gè)得到針對(duì)AFP受體的抗體的方法是通過在寄主中誘導(dǎo)它們，可以用不同種類的AFP受體免疫癌癥病人，在受體的人類和其他種的組成之間的細(xì)微差別可能允許在那個(gè)病人中產(chǎn)生抗甚至例如鼠或牛AFP受體并與自體人AFP受體交叉反應(yīng)的抗體，所以，病人得到抗其本身腫瘤的“接種”。值得一提的是抗體不是在癌細(xì)胞表面阻塞受體的唯一方法，一個(gè)變性的AFP可以達(dá)到同樣的目的，甚至于AFP的一個(gè)合成片段也可以獲得那樣的結(jié)果，所以它可以用于終止腫瘤生長。
有幾種不同的方法可以獲得修飾的AFP，其為天然存在的AFP的一部分或通過分子工程從DNA合成的部分，關(guān)鍵是與AFP受體反應(yīng)的AFP的部分是有活力的，但是AFP剩余部分是不存在的或被改變或損害到足以不能實(shí)現(xiàn)它的功能，所有這些方法本身在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，AFP被簡單地用于這些方法中的每一種，他們是，例如用來自例如貝克曼儀器的多肽合成儀來生產(chǎn)與AFP受體反應(yīng)的AFP的合成部分，對(duì)應(yīng)于與AFP受體反應(yīng)的AFP的部分的氨基酸順序進(jìn)入多肽合成儀，激活了合成儀，產(chǎn)生了合成的多肽。或者，利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的合適的載體將所希望的DNA序列導(dǎo)入寄主系統(tǒng)可以合成AFP部分，寄主系統(tǒng)隨后表達(dá)所期望的AFP部分，其可被收集并如果需要加以純化?；蛘?，通常把所希望的DNA序列放入如牛受精卵中可以利用轉(zhuǎn)基因合成，那么所期望的AFP部分從出生后動(dòng)物中獲得，正如本領(lǐng)域所公知的。例如參見Maniatis et al.(1982)。另一種獲得所期望的AFP的方法是通過切割天然存在的AFP，用一個(gè)鏈反應(yīng)劑如花菁苷溴化物切開AFP并隨后純化得到所期望的AFP部分。




雖然在前述的實(shí)施方案中已經(jīng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明，應(yīng)理解的是這種描述僅是為了舉例說明，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以做一些變異。在下面的權(quán)利要求中限定了本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗體，其與生物學(xué)樣品中的AFP受體或AFP受體結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)。
2.一種標(biāo)記的抗體，其與生物學(xué)樣品中的AFP受體或AFP受體結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其同時(shí)鑒定生物學(xué)樣品中癌的存在。
4.標(biāo)記的AFP，其與生物學(xué)樣品中的AFP受體或AFP受體結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)。
全文摘要
一種檢測病人的癌癥的方法，該方法包括把標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP導(dǎo)入病人的生物學(xué)樣品以使標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP與AFP受體結(jié)合位點(diǎn)在生物學(xué)樣品中反應(yīng)的步驟，然后是在生物學(xué)材料中鑒定與標(biāo)記抗體或標(biāo)記AFP反應(yīng)的AFP受體結(jié)合位點(diǎn)來確定癌的存在的步驟，優(yōu)選的是，在導(dǎo)入步驟之前還有一個(gè)從病人身體中獲得生物學(xué)樣品的步驟。一種用于治療病人癌細(xì)胞的方法，該方法包括給病人的癌細(xì)胞導(dǎo)入AFP受體抗體的步驟，然后是AFP受體抗體與癌細(xì)胞的AFP受體反應(yīng)來抑制癌細(xì)胞的生長或殺死癌細(xì)胞的步驟。一種監(jiān)測病人方法，該方法包括治療病人的癌癥的步驟，然后是在治療之后以預(yù)定間隔檢測病人的AFP受體位點(diǎn)水平的步驟。一種治療病人的方法，該方法包括測試病人AFP受體的步驟，如果測試表明AFP受體存在于病人中，則然后是給病人導(dǎo)入AFP受體抗體或AFP以便與病人的癌細(xì)胞反應(yīng)的步驟。一種治療病人癌細(xì)胞的方法，該方法包括給病人癌細(xì)胞導(dǎo)入修飾的AFP的步驟，然后是使修飾的AFP與癌細(xì)胞的AFP受體反應(yīng)來抑制癌細(xì)胞的生長或殺死癌細(xì)胞的步驟。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1502994SQ200310104769
公開日2004年6月9日 申請(qǐng)日期1995年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月19日
發(fā)明者里卡爾多·J·莫羅, 里卡爾多 J 莫羅 申請(qǐng)人:里卡爾多·J·莫羅, 里卡爾多 J 莫羅