專利名稱：胃癌的檢測(cè)標(biāo)志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的檢測(cè)。具體地，本發(fā)明涉及遺傳和/或蛋白質(zhì)標(biāo)志物用于檢測(cè)癌癥的用途，并且更特別地，涉及遺傳和/或蛋白質(zhì)標(biāo)志物用于檢測(cè)胃癌的用途。背景在早期檢測(cè)到癌癥并得到治療時(shí)，癌癥患者的存活得到很大程度的提高。在胃癌的情況中，與診斷為晚期疾病患者大約10%的5-年存活率相比，診斷為早期疾病的患者具有90%的5-年存活率。然而，大多數(shù)胃癌患者通常患有晚期疾病。因此，導(dǎo)致胃癌早期診斷的發(fā)展可以導(dǎo)致改善的患者預(yù)后。生物樣品中特定癌癥相關(guān)標(biāo)志物的鑒定可以提供癌癥早期診斷的有價(jià)值的方法， 導(dǎo)致早期治療和提高的預(yù)后，所述生物樣品包括體液，例如，血液、尿液、腹膜沖洗液和糞便提取物。特定癌癥標(biāo)志物還可以提供監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的手段，能夠追蹤外科手術(shù)治療、放療和化療的療效。然而，對(duì)于許多主要的癌癥，可用的標(biāo)志物存在靈敏度和特異性不足的問題。 例如，對(duì)于胃癌最常用的標(biāo)志物cal9-9、ca72-4和癌胚抗原(CEA)只能檢測(cè)出約15-50% 的任一階段的胃腫瘤，對(duì)于早期疾病，降至大約2-11%。因此，存在非常高頻率的可導(dǎo)致患者和保健醫(yī)生認(rèn)為不存在疾病的假陰性測(cè)試，然而實(shí)際上，患者患有需要立即注意的嚴(yán)重癌癥。此外，這些標(biāo)志物在高達(dá)1/3受到良性胃病影響的個(gè)體中產(chǎn)生假陽性信號(hào)。發(fā)明概述本發(fā)明的幾個(gè)方面提供了可以提供早期癌癥檢測(cè)并且降低假陽性和假陰性測(cè)試結(jié)果頻率的方法、組合物和裝置。在特定的實(shí)施方案中，分子分析可以用于鑒定在胃腫瘤組織中與非惡性胃組織相比高表達(dá)，但不必定是過表達(dá)的基因。這樣的分析包括微陣列和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (qPCR)方法。癌癥基因、RNA以及由那些基因編碼的蛋白質(zhì)在此稱為胃腫瘤標(biāo)志物(GTM)。 將理解術(shù)語GTM不需要標(biāo)志物只對(duì)胃腫瘤是特異性的。而是，GTM的表達(dá)在其他類型的腫瘤中得到提高，所述腫瘤包括惡性或非惡性腫瘤，包括胃癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、皮膚癌(例如，黑素瘤)、肝癌、食道癌、子宮內(nèi)膜癌和腦癌。然而，應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語GTM 不包括現(xiàn)有技術(shù)的標(biāo)志物，如CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA，或任何其他之前已經(jīng)鑒定為表示胃腫瘤的標(biāo)志物。從腫瘤中分泌或逸出一些GTM，其水平足以以高度可靠性來診斷胃癌，并且在其他情況中，兩種或多種GTM的測(cè)量可以提供可靠的胃癌診斷。由細(xì)胞分泌或裂解出來的蛋白質(zhì)，單獨(dú)或互相結(jié)合，具有作為用于胃癌診斷的血清或體液標(biāo)志物或作為用于監(jiān)測(cè)已確定疾病進(jìn)展標(biāo)志物的效用?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法，并且包括使用單克隆抗體、多克隆抗血清等，來進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)志物的檢測(cè)。具體地，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)胃癌的方法，包括(i)提供生物樣品；和(ii)檢測(cè)所述樣品中人酶原粒蛋白16( “ZG16”)的水平。在一個(gè)方面中，患者中ZG16的過表達(dá)表示患者患有胃癌。根據(jù)本發(fā)明的其他GTM家族成員可以選自黏蛋白5AC( “MUC5AC”)或黏蛋白17 (“MUC17")。該方法可以涉及 ZG16 和 MUC5AC、ZG16 和 MUC17，或 ZG16 和 MUC5AC 和 MUC17 的檢測(cè)。所述其他GTM家族成員還可以包含一個(gè)或多個(gè)更多的GTM家族成員，例如， MUC5AC、MUC17、ZG16、羧肽酶 N、多肽 2，83kDa 鏈(CPN2)、基質(zhì)金屬蛋白酶 12 (MMPU)、抑制素(“訊冊(cè)々”)、胰島素樣生長(zhǎng)因子7( “IGFBP7”)、Y-谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cyStatin)S( “CST4”)、 分泌型卷曲相關(guān)蛋白4( “SFRP4”)、aSp0rin( “ASPN”)、具有EF手型結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1( “CGREF1”)、激肽釋放酶IO(KLKlO)、金屬蛋白酶的組織抑制劑1( “TIMP1”)、 分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白(“SPARC”)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，13-誘導(dǎo)的(“TGFBI”)、 含有EGF的fibulin-樣胞外基質(zhì)蛋白2( “EFEMP2”)、基膜聚糖(lumican) ( “LUM”)、 stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白1( “SPP1 ”)、硫酸軟骨素蛋白聚糖2 ( “CSPG2”)、N_?；拾贝减０匪饷?“ASAH1”)、絲氨酸蛋白酶11( “PRSS11”)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白 2( “SFRP2”)J^^_A2，XIIB 組(“PLA2G12B”)、spondin2，胞外基質(zhì)蛋白(“SP0N2”)、 嗅介蛋白(olfactomedin) 1 ( “0LFM1”)、含有血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)1 ( “TSRC1 ”)、血小板反應(yīng)蛋白2( “THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN( 乂511”)、賴氨酰氧化酶樣酶2( “L0XL2”)、甲狀腺球蛋白(“TG”)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 1( “TGFB1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade H成員1 ( “SERPINH1 ”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade B成員5 (“SERPINB5”)、基質(zhì)金屬蛋白酶2 (“ΜΜΡ2”)、前蛋白 (proprotein)轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 5型(“PCSK5”)、乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan) 糖蛋白連接蛋白 4 ( “ HAPLN4 ”)、CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原、CEA、MUC5AC 和 MUC17。根據(jù)本發(fā)明的組合GTM標(biāo)志物的一個(gè)實(shí)例是MUC5AC、MUC17、ZG16、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 SN、serpinHl 和 serpinB5?？梢允褂萌魏魏线m的用于檢測(cè)GTM水平的方法，并且可以包括檢測(cè)GTM mRNA、GTM cDNA的水平，使用與所述GTM cDNA的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸，使用正向引物和反向引物的qRT-PCR方法，檢測(cè)GTM蛋白的水平，檢測(cè)GTM肽的水平，例如，使用針對(duì)所述GTM的抗體?？梢允褂萌魏魏线m的抗體，并且可以是單克隆抗體或多克隆抗血清。可以使用夾層型免疫試驗(yàn)方法或使用抗體芯片來進(jìn)行該方法。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)GTM的裝置，其包括其上具有GTM捕獲試劑的基質(zhì)；和與所述基質(zhì)相連的檢測(cè)儀，所述檢測(cè)儀能夠檢測(cè)與所述捕獲試劑相結(jié)合的GTM。GTM捕獲試劑可以是GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽特異性的寡核苷酸或抗體。本發(fā)明的再一個(gè)方面是用于檢測(cè)癌癥的試劑盒，其包括其上具有GTM捕獲試劑的基質(zhì)；用于顯現(xiàn)所述GTM捕獲試劑和GTM的復(fù)合物的工具；和使用說明書，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。GTM捕獲試劑是對(duì)GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽有選擇性的GTM特異性寡核苷酸或GTM特異性抗體。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)胃癌的方法，其包括步驟提供來自處于患有胃癌風(fēng)險(xiǎn)中的患者的測(cè)試樣品；測(cè)量所述測(cè)試樣品中GTM蛋白的存在；和
將所述測(cè)試樣品中存在的GTM的量與獲自未患有胃癌受試者的對(duì)照樣品的值進(jìn)行比較，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種用于篩選胃癌的方法，其包括步驟提供來自測(cè)試受試者的測(cè)試樣品；測(cè)量所述測(cè)試樣品中GTM的存在；和將所述測(cè)試樣品中存在的GTM的量與獲自未患有胃癌受試者的對(duì)照樣品的值進(jìn)行比較，其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。 GTM可以是GTM蛋白或肽，或GTM特異性的寡核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA。根據(jù)該方法，測(cè)量步驟可以使用ELISA試驗(yàn)。測(cè)試樣品可以獲自血漿、組織、尿液、胃液、血清和糞便。附圖簡(jiǎn)述參照其特定實(shí)施方案和參照附圖來描述本發(fā)明，其中

圖1描繪了微陣列分析表，顯示了在腫瘤組織中相對(duì)高表達(dá)的基因。將腫瘤組織和非惡性組織中每個(gè)基因的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行了分級(jí)。該表顯示了比現(xiàn)有胃癌標(biāo)志物CEA(由基因CEACAM5編碼)具有更高等級(jí)的GTM。圖2描繪了顯示出抗體陣列分析中所用的血清樣品特征的表。圖3描繪了直方圖，其顯示了腫瘤和非惡性樣品根據(jù)其(a)ZG16和(b)MUC17表達(dá)水平的分布。使用RT-qPCR獲得了兩個(gè)基因的表達(dá)水平。圖4描繪了 boxplot，顯示了使用抗體陣列和RCA檢測(cè)的胃癌患者和對(duì)照的血清中 (a)MUC17 禾口 (b)ZG16 的檢測(cè)。詳述定義在詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案之前，提供本文中所用術(shù)語的一些定義將是有用的。術(shù)語“GTM”或“胃腫瘤標(biāo)志物，，或“GTM家族成員，，意思是與胃癌相關(guān)或另外鑒定與胃癌相關(guān)分子的基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。作為本發(fā)明的一部分公開的GTM不包括現(xiàn)有技術(shù)中已知的與胃癌相關(guān)的分子，例如，CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA。然而，本發(fā)明的標(biāo)志物可以與之前公開的GTM以新的和創(chuàng)造性的組合來一起使用。術(shù)語“標(biāo)志物”指與生物學(xué)現(xiàn)象的存在定量或定性相關(guān)的分子。“標(biāo)志物”的實(shí)例包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產(chǎn)物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段；或任何相關(guān)的代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段，不管是否與現(xiàn)象下的機(jī)理直接或間接相關(guān)。本發(fā)明的標(biāo)志物包括如本文所公開的核苷酸序列(例如，GenBank序列)，特別是全長(zhǎng)序列、其任何編碼序列、任何片段或任何互補(bǔ)物， 以及上述定義的其任何可測(cè)量標(biāo)志物。如本文所用，“抗體”及類似術(shù)語指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有特異結(jié)合抗原(與之發(fā)生免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。這些包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、FC、Fab、Fab，和Fal^2片段，以及Fab表達(dá)文庫?？贵w分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何一類，這些類別根據(jù)分子中存在的重鏈的性質(zhì)而彼此不同。這些還包括亞類，如IgGl、IgG2等。輕鏈可以是κ鏈或λ鏈。本文提及的抗體包括所有類、亞類和類型。還包括嵌合抗體，例如，對(duì)超過一種的來源(例如，小鼠或人序列)是特異性的單克隆抗體或其片段。還包括駝?lì)惪贵w(camelid antibody)、鯊魚抗體或納米抗體。術(shù)語“癌癥”和“癌性的”是指或者描述了哺乳動(dòng)物中通常以異?；蚴д{(diào)的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的生理狀態(tài)。癌癥和癌癥病理可以與例如轉(zhuǎn)移、干擾鄰近細(xì)胞的正常機(jī)能、以異常水平釋放細(xì)胞因子或其他分泌產(chǎn)物、抑制或加重炎性或免疫應(yīng)答、瘤形成、癌前病變、惡性腫瘤、周圍或遠(yuǎn)距離組織或器官如淋巴結(jié)的侵入等相關(guān)。特別包括的是黑素瘤。術(shù)語“腫瘤”指的是所有腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，不管惡性還是良性的，以及所有癌前和癌細(xì)胞和組織。術(shù)語“胃癌”指的是源自胃的腫瘤。這些腫瘤能夠轉(zhuǎn)移至任何器官。術(shù)語“差異地表達(dá)” “差異的表達(dá)”及相似短語是指相對(duì)于在對(duì)照受試者(例如， 參照樣品)中的表達(dá)，在患有病癥(特別是癌癥，如黑素瘤)的受試者(例如，測(cè)試樣品) 中的表達(dá)被激活至較高或較低水平的基因標(biāo)志物。該術(shù)語還包括其表達(dá)在如下情況被激活至較高或較低的水平的標(biāo)志物在相同疾病的不同階段；在具有好或差的預(yù)后的疾病中； 或在具有較高或較低增殖水平的細(xì)胞中。差異表達(dá)的標(biāo)志物可以在多核苷酸水平或多肽水平被激活或抑制，或可以接受選擇性剪接而導(dǎo)致不同的多肽產(chǎn)物。例如，這些差異可以通過 mRNA水平、表面表達(dá)、多肽分泌或其他分配上的變化而得到證明。差異表達(dá)可以包括比較兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物(例如，基因或其基因產(chǎn)物)間的表達(dá)； 或比較兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物(例如，基因或其基因產(chǎn)物)間的表達(dá)比率；或比較相同標(biāo)志物的兩種不同加工的產(chǎn)物(例如，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或多肽)，其在正常受試者和患病受試者之間不同； 或在相同疾病的不同階段之間不同；或在具有好或差的預(yù)后的疾病之間不同；或在具有較高和較低增殖水平的細(xì)胞之間不同；或在正常組織和患病組織(特別是癌癥或黑素瘤)之間不同。差異表達(dá)包括基因或其表達(dá)產(chǎn)物在例如正常和患病細(xì)胞中、或在經(jīng)歷不同疾病事件或疾病階段的細(xì)胞中、或在具有不同增殖水平的細(xì)胞中，在時(shí)間或細(xì)胞表達(dá)模式上的定量以及定性差異。術(shù)語“表達(dá)”包括多核苷酸和多肽的產(chǎn)生，特別地，從基因或基因的一部分產(chǎn)生 RNA(例如，mRNA)，且包括RNA或基因或基因的一部分編碼的多肽的產(chǎn)生，以及與表達(dá)相關(guān)的可檢測(cè)物質(zhì)的出現(xiàn)。例如，例如從多肽-多肽相互作用、多肽-核苷酸相互作用等形成復(fù)合物，也包括在術(shù)語“表達(dá)”的范圍內(nèi)。另一個(gè)實(shí)例是結(jié)合配體，如雜交探針或抗體，與基因或其他多核苷酸或寡核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)片段的結(jié)合以及結(jié)合配體的顯影。因此，微陣列、雜交印跡(如Northern印跡)，或免疫印跡(如Wfestern印跡)，或珠陣列上的，或通過 PCR分析的斑點(diǎn)強(qiáng)度，包括在生物分子下的術(shù)語“表達(dá)”的范圍內(nèi)。術(shù)語“表達(dá)閾值”和“限定的表達(dá)閾值”可以互換使用，并且指的是正談?wù)摰臉?biāo)志物的水平，在該水平外，多核苷酸或多肽作為患者存活的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。閾值將取決于所建立的預(yù)測(cè)模型，所述模型從臨床研究(如以下實(shí)施例中所述的那些)實(shí)驗(yàn)性地產(chǎn)生。根據(jù)所用的預(yù)測(cè)模型，設(shè)定表達(dá)閾值以獲得最大的靈敏度，或最大的特異性，或最小的誤差(最大的分類級(jí)別)。例如，設(shè)定較高的閾值，以獲得最小誤差，但這可能導(dǎo)致較低的靈敏度。因此， 對(duì)于任何給定的預(yù)測(cè)模型，將使用臨床研究來設(shè)定通常獲得最高靈敏度同時(shí)具有最小誤差率的表達(dá)閾值。對(duì)于任何情況的表達(dá)閾值的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。術(shù)語“靈敏度”意思是(通過模型)測(cè)試的患病個(gè)體為陽性的比例。因此，提高的靈敏度意味著較低的假陰性測(cè)試結(jié)果。術(shù)語“特異性”意思是(通過模型)測(cè)試未患病個(gè)體為陰性的比例。因此，提高的特異性意味著較低的假陽性測(cè)試結(jié)果。術(shù)語“微陣列”指的是捕獲劑(優(yōu)選，多核苷酸(例如，探針)或多肽)在基質(zhì)上的有序或無序排列。參見，例如，Microarray Analysis (微陣列分析)，M. Schena，John Wiley & Sons，2002 ;Microarray Biochip ^Technology (微陣列生物芯片技術(shù))，Μ. Schena 編輯， Eaton Publishing, 2000 ；Guide to Analysis of DNA Microarray Data (DNA 微陣列數(shù)據(jù)分析指導(dǎo))，S.Knudsen, John Wiley & Sons, 2004 禾口 Protein Microarray Technology, D. Kambhampati 'ΦΜ, John Wiley & Sons，2004。術(shù)語“寡核苷酸”指的是多核苷酸，通常是探針或引物，包括，但不限于，單鏈脫氧核糖核苷酸、單鏈或雙鏈核糖核苷酸，RNA: DNA雜合體及雙鏈DNA。寡核苷酸，如單鏈DNA探針寡核苷酸，經(jīng)常利用化學(xué)方法來合成，例如，使用可購得的自動(dòng)寡核苷酸合成儀，或通過多種其他方法，包括體外表達(dá)系統(tǒng)、重組技術(shù)以及在細(xì)胞和生物中的表達(dá)。術(shù)語“過表達(dá)”或“過表達(dá)的”指的是患者中高于正常組織中所看到的基因或標(biāo)志物的表達(dá)水平。如果是正常組織中表達(dá)的1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9、2倍或高于 2倍，則認(rèn)為表達(dá)是過表達(dá)的。術(shù)語“多核苷酸”，以單數(shù)或復(fù)數(shù)使用時(shí)，通常指的是任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。這包括，但不限于，單鏈和雙鏈DNA、包括單鏈和雙鏈區(qū)域的DNA、單鏈和雙鏈RNA，以及包括單鏈和雙鏈區(qū)域的RNA， 包含可以是單鏈或更一般地是雙鏈或包括單鏈和雙鏈區(qū)域的DNA和RNA的雜合分子。還包括包含RNA或DNA或既包含RNA又包含DNA的三鏈區(qū)域。特別包括mRNA、cDNA和基因組 DNA，及其任何片段。該術(shù)語包括包含一個(gè)或更多個(gè)修飾堿基(如，氚化堿基或稀有堿基，如肌苷)的DNA和RNA。本發(fā)明的多核苷酸可以包括編碼或非編碼序列，或正義或反義序列。 將理解本文中每次涉及“多核苷酸”或類似術(shù)語，將包括全長(zhǎng)序列及其任何片段、衍生物或變體。如本文所用，“多肽”指的是寡肽、肽或蛋白質(zhì)序列，或其片段，以及天然產(chǎn)生的、重組的、合成的或半合成的分子。其中本文引用的“多肽”指的是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列，“多肽”及類似術(shù)語不意味著限定氨基酸序列為全長(zhǎng)分子的完整天然氨基酸序列。將理解本文中每次涉及“多肽”或類似術(shù)語，將包括全長(zhǎng)序列及其任何片段、衍生物或變體。術(shù)語“qPCR”或“QPCR”指的是例如PCR Technique Quantitative PCR(PCR 技術(shù) 定量 PCR)，J. W. Larrick 編輯，Eaton Publishing，1997 和 A-Z of Quantitative PCR(定量PCR的A-Z)，S. Bustin編輯，IUL Press, 2004中所述的定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。術(shù)語RCA是滾環(huán)擴(kuò)增的縮寫。RCA是一種涉及環(huán)形模版的重復(fù)拷貝而以線性方式來擴(kuò)大信號(hào)的技術(shù)。雜交反應(yīng)的“嚴(yán)謹(jǐn)性”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易測(cè)定的，并且通常取決于探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。通常，較長(zhǎng)的探針需要較高的溫度，用于正確的退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常取決于在低于解鏈溫度的環(huán)境中存在互補(bǔ)鏈時(shí)，變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間所需的同源性程度越高，可以使用的相對(duì)溫度越高。因此，斷定較高的相對(duì)溫度將傾向于使得反應(yīng)條件更嚴(yán)謹(jǐn)，而較低的溫度因此使反應(yīng)條件不太嚴(yán)謹(jǐn)。雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性的其他詳細(xì)內(nèi)容和解釋可以在例如Ausuble 等，Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)通用實(shí)驗(yàn)方案)，Wiley Interscience Publishers, (1995)中找至丨J。如本文所定義，“嚴(yán)謹(jǐn)條件”或“高嚴(yán)謹(jǐn)條件”通常為(1)使用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行洗滌，例如0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 1 %十二烷基硫酸鈉，50°C ； (2) 雜交期間使用變性劑，如甲酰胺，例如50% (ν/ν)甲酰胺，與0. 牛血清白蛋白/0. Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5，與750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，42°C ；或(3)使用 50% 甲酰胺，5XSSC(0. 75M NaCl, 0. 075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6. 8)，0. 焦磷酸鈉，5X，Denhardt' s溶液，超聲波處理的鮭精DNA(50 μ g/ml)，0. 1 % SDS，和10%硫酸葡聚糖，42°C，并在0. 2X SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中于42°C和50%甲酰胺中于55°C洗滌，接著是包括于55°C在含EDTA的0. IXSSC中的高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌?！爸械葒?yán)謹(jǐn)條件”可如 Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，New York, Cold Spring Harbor I^ress，1989所述的來予以確認(rèn)， 并且包括使用不如上文所述那么嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南礈烊芤汉碗s交條件(例如，溫度、離子強(qiáng)度和 SDS%)0中等嚴(yán)謹(jǐn)條件的一個(gè)實(shí)例是于37°C在包含20%甲酰胺，5XSSC(150mM NaCl, 15mM 檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH 7. 6) ,SXDenhardt' s溶液，10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切鮭精DNA的溶液中過夜溫育，接著在IXSSC中于約37-50°C下洗滌濾器。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明了如何按照需要對(duì)溫度、離子強(qiáng)度等進(jìn)行調(diào)整，以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。術(shù)語“MUC5AC”意思是黏蛋白5AC (Seq ID No. 1和4)，并且包括標(biāo)志物MUC5AC，包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產(chǎn)物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì)片段；或任何相關(guān)的代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物，或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段。術(shù)語“MUC17”意思是細(xì)胞表面結(jié)合的人黏蛋白17 (Seq ID No 2和5)，并且包括標(biāo)志物MUC17，包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產(chǎn)物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì)片段；或任何相關(guān)的代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物，或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段。術(shù)語“ZG16”意思是人酶原粒蛋白16 (Seq ID No 3和6)，并且包括標(biāo)志物ZG16， 包括多核苷酸，如基因或基因片段、RNA或RNA片段；或基因產(chǎn)物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì)片段；或任何相關(guān)的代謝產(chǎn)物、副產(chǎn)物，或任何其他鑒定分子，如抗體或抗體片段。除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這落入本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說明，如Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))， 第 2 版，Sambrook 等，1989 Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)，MJ Gait 編
1984 ；Animal Cell Culture, R. I. Freshney 'ΦΜ, 1987 ；Methods in Enzymology ( g| 學(xué)方法)，Academic Press, Inc. ；Handbook of Experimental Immunology (實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè))，第 4 版，D.M.Weir & CC. Blackwell 編輯，Blackwell Science Inc. , 1987 ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體)，J. M. Miller & Μ· P. Calos 編輯，1987 ;Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)通用實(shí)驗(yàn)方案)，F(xiàn). Μ· Ausubel 等編輯，1987 ；以及 PCR :The Polymerase Chain Reaction (PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，Mullis等編輯，1994。將理解以上術(shù)語可以指蛋白質(zhì)、DNA序列和/或RNA序列。還將理解以上術(shù)語還指具有本文所示同源序列的非人蛋白質(zhì)、DNA和/或RNA。發(fā)明詳述通常，腫瘤標(biāo)志物在腫瘤組織和相應(yīng)的非惡性組織之間差異地表達(dá)。這提供了一種區(qū)分患有和未患有癌癥的患者的方法。然而，很可能即使那些標(biāo)志物在腫瘤組織中不是過表達(dá)的，腫瘤組織的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和生理學(xué)特征也將導(dǎo)致血清和其他生物液體中標(biāo)志物累積的差異。特別地，預(yù)測(cè)與非惡性組織相比，異常的腫瘤細(xì)胞極性、滲漏的脈管系統(tǒng)和腫瘤組織的高間隙壓力將促進(jìn)特定的標(biāo)志物流出腫瘤組織。因此，猜測(cè)在胃腫瘤組織中以非常高的水平表達(dá)，但與非惡性胃組織相比未必是過表達(dá)的分泌蛋白質(zhì)將構(gòu)成有用的胃癌標(biāo)志物。使用微陣列分析和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)的組合，已經(jīng)鑒定出用于胃癌檢測(cè)的新標(biāo)志物。這種新的胃腫瘤標(biāo)志物(GTM)，在胃癌的早期檢測(cè)中提供了更多工具。具體地，本發(fā)明包括新的 GTM :MUC5AC6eq ID No 1 和 4)、MUC17 (kq ID No 2 和 5)和 ZG16 (kq ID No 3 和 6)。新的GTM可以單獨(dú)使用，或備選地，可以組合在一起作為標(biāo)記(包含兩種或多種 GTM)。根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)記包括MUC5AC、MUC17和ZG16中的至少一種，和至少一種另外的GTM， 其可以是根據(jù)本發(fā)明的GTM，或任何其他GTM，包括已知的GTM。已知的適于結(jié)合本發(fā)明公開的GTM—起使用的GTM包括羧肽酶N、多肽2，83kDa鏈 (CPN2)、基質(zhì)金屬蛋白酶12(MMP12)、抑制素(“INHBA”)、胰島素樣生長(zhǎng)因子7 (“ IGFBP7”)、 Y-谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑S( “CST4”)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白4( “SFRP4”)、aSp0rin( “ASPN”)、具有EF手型結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1( “CGREF1”)、激肽釋放酶IO(KLKlO)、金屬蛋白酶的組織抑制劑1( “TIMP1”)、分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白(“SPARC”)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，13-誘導(dǎo)的 (“TGFBI”)、含有EGF的fibulin-樣胞外基質(zhì)蛋白2( “EFEMP2”)、基膜聚糖(“LUM”)、 stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白1( “SPP1 ”)、硫酸軟骨素蛋白聚糖2 ( “CSPG2”)、N_?；拾贝减０匪饷?“ASAH1”)、絲氨酸蛋白酶11( “PRSS11”)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白 2( “5卩1^2”)、磷脂酶六2，父1仍組(“PLA2G12B”)、spondin2，胞外基質(zhì)蛋白(“SP0N2”)、嗅介蛋白1 (“0LFM1”)、含有血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)1 (“TSRC1”)、血小板反應(yīng)蛋白2 (“THBS2”)、 adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN( “CST1”)、賴氨酰氧化酶樣酶2( “L0XL2”)、甲狀腺球蛋白(“TG”)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1( “TGFB1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade H成員1( “SERPINH1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade B成員5( “SERPINB5”)、基質(zhì)金屬蛋白酶2 ( “ΜΜΡ2”)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 5型(“PCSK5”)、乙酰透明質(zhì)酸糖蛋白連接蛋白4( “HAPLN4”)、CA19-9、 CA72-4、胃蛋白酶原和CEA，或之前已經(jīng)鑒定為表示胃腫瘤的任何其他標(biāo)志物。CN 102459646 A說明書8/21 頁通過術(shù)語“可靠性”，我們包括假陽性和/或假陰性的低發(fā)生率。因此，使用較高可靠性的標(biāo)志物，與使用該標(biāo)志物形成的診斷相關(guān)的假陽性和/或假陰性較低。因此，在特定的實(shí)施方案中，提供了允許以高于現(xiàn)有技術(shù)標(biāo)志物的可靠性約50%的可靠性來檢測(cè)胃癌的標(biāo)志物。在其他實(shí)施方案中，提供了可靠性高于約70%的標(biāo)志物；在其他實(shí)施方案中，高于約73 %，在更多的其他實(shí)施方案中，高于約80 %，在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，高于約90 %， 在其他實(shí)施方案中，高于約95 %，在更多的實(shí)施方案中，高于約98%，并且在特定的實(shí)施方案中，約100%的可靠性。癌癥檢測(cè)的一般方法以下列出了用于測(cè)定表達(dá)水平的一般方法，盡管將認(rèn)識(shí)到用于測(cè)定表達(dá)水平的任何方法將是合適的。定量PCR(qPCR)可以使用GTM特異性引物和探針，對(duì)腫瘤樣品、血清和血漿進(jìn)行定量PCR(qPCR)。 在受控的反應(yīng)中，PCR反應(yīng)中形成的產(chǎn)物量(Sambrook, J.，E Fritsch, E.和T Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor)與起始模板的量相關(guān)?？梢酝ㄟ^ PCR 反應(yīng)處于對(duì)數(shù)期時(shí)，在試劑變得限制之前，停止PCR反應(yīng)來進(jìn)行PCR產(chǎn)物的定量。然后將PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用溴化乙錠或相當(dāng)?shù)腄NA染色劑進(jìn)行染色，并且通過密度測(cè)定法來測(cè)量染色強(qiáng)度?；蛘撸梢允褂肞CR儀器，如Applied Biosystems'Prism 7000或Roche LightCycler來測(cè)定PCR反應(yīng)的進(jìn)展，這些儀器實(shí)時(shí)地測(cè)量產(chǎn)物積累。實(shí)時(shí) PCR測(cè)量DNA嵌入染料如Sybr綠進(jìn)入合成的PCR產(chǎn)物中的熒光，或報(bào)告分子從淬滅分子中裂解出來時(shí)釋放的熒光；報(bào)告分子和淬滅分子結(jié)合至寡核苷酸探針中，所述寡核苷酸探針在DNA鏈從引物寡核苷酸延伸后與目標(biāo)DNA分子雜交。寡核苷酸探針在下一個(gè)PCR循環(huán)中通過Taq聚合酶的酶作用得到置換和降解，將報(bào)告分子從淬滅分子中釋放出來。在一種稱為korpion 的變型中，探針與引物共價(jià)連接。反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)RT-PCR可以用于比較正常以及用或未用藥物治療的腫瘤組織中不同樣品群中的 RNA水平，以表征表達(dá)模式、分辨密切相關(guān)的RNA和分析RNA結(jié)構(gòu)。對(duì)于RT-PCR，第一步是從目標(biāo)樣品中分離出RNA。起始材料通常是分別從人腫瘤或腫瘤細(xì)胞系以及相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系分離的總RNA。可以從多種樣品分離RNA，樣品例如為來自乳房、肺、結(jié)腸(例如，大腸或小腸)、結(jié)直腸、胃、食管、肛門、直腸、前列腺、腦、 肝臟、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、睪丸、卵巢、子宮、膀胱等組織的腫瘤樣品，來自原發(fā)性腫瘤或腫瘤細(xì)胞系，以及來自從健康供體收集的樣品。如果RNA來源是腫瘤，例如，可以從冷凍或存檔的石蠟包埋和固定的(例如，福爾馬林固定的)組織樣品中提取出RNA。通過RT-PCR制作基因表達(dá)譜的第一步是將RNA模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，接著在PCR反應(yīng)中進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。兩種最常用的反轉(zhuǎn)錄酶是禽成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)。反轉(zhuǎn)錄步驟通常利用特異性引物、隨機(jī)六聚體或寡聚dT引物引發(fā)，這將視情況和制作表達(dá)譜的目標(biāo)而定。例如，可以利用GeneAmp RNA PCR 試劑盒(Perkin Elmer，CA，USA)，按照生產(chǎn)商的說明，對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后將所得到的cDNA在隨后的PCR反應(yīng)中用作模板。
雖然PCR步驟能夠利用多種熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶，但通常采用Taq DNA 聚合酶，其具有5’_3’核酸酶活性，但缺乏3’_5’校對(duì)核酸內(nèi)切酶活性。因此，TaqMan qPCR 通常利用Taq或Tth聚合酶的5’核酸酶活性來水解結(jié)合目標(biāo)擴(kuò)增子的雜交探針，但任何具有等同5’核酸酶活性的酶均可使用?？梢岳脙蓚€(gè)寡核苷酸引物來產(chǎn)生PCR反應(yīng)典型的擴(kuò)增子。設(shè)計(jì)第三個(gè)寡核苷酸或探針來檢測(cè)位于兩個(gè)PCR引物之間的核苷酸序列。探針是不能通過Taq DNA聚合酶延伸的，并用報(bào)告熒光染料和淬滅熒光染料標(biāo)記。當(dāng)兩種染料如其在探針上一樣位置緊靠在一起時(shí)，任何激光誘導(dǎo)的報(bào)告染料的發(fā)射將被淬滅染料淬滅。在擴(kuò)增反應(yīng)期間，Taq DNA聚合酶以模板依賴性的方式切割探針。所得到的探針片段在溶液中解離，并且來自所釋放的報(bào)告染料的信號(hào)不受第二個(gè)熒光團(tuán)的淬滅作用的影響。每合成一個(gè)新的分子，就釋放一分子的報(bào)告染料，并且未淬滅的報(bào)告染料的檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)定量解釋的基礎(chǔ)。TaqMan RT-PCR可以使用可購得的設(shè)備來進(jìn)行，如，例如ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)或 Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德國(guó))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在實(shí)時(shí)定量PCR裝置 (如ABI PRISM 7700序列檢測(cè))上運(yùn)行5’核酸酶程序。該系統(tǒng)由熱循環(huán)儀、激光、電荷耦合器件(CCD)、照相機(jī)和計(jì)算機(jī)組成。該系統(tǒng)在熱循環(huán)儀上以96孔的形式擴(kuò)增樣品。在擴(kuò)增過程中，通過光纖光纜實(shí)時(shí)采集所有96個(gè)孔的激光誘導(dǎo)的熒光信號(hào)，并在CCD處進(jìn)行檢測(cè)。該系統(tǒng)包括用于運(yùn)行儀器和用于分析數(shù)據(jù)的軟件。5’核酸酶試驗(yàn)數(shù)據(jù)最初表達(dá)為Ct或閾值循環(huán)。如上文所討論的那樣，在每一循環(huán)中記錄熒光值，其代表在擴(kuò)增反應(yīng)中到該點(diǎn)時(shí)所擴(kuò)增的產(chǎn)物量。第一次記錄到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的熒光信號(hào)時(shí)的點(diǎn)為閾值循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)RT-PCR技術(shù)較為新近的一種變型是實(shí)時(shí)定量PCR，其通過雙重標(biāo)記的熒光生成探針(即TaqMan探針)測(cè)量PCR產(chǎn)物的積累。實(shí)時(shí)PCR與定量競(jìng)爭(zhēng)PCR和定量比較PCR都兼容。前者利用每個(gè)目標(biāo)序列的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，而后者利用樣品內(nèi)所含的歸一化基因或持家基因進(jìn)行RT-PCR。更多細(xì)節(jié)由例如Held等，Genome Research 6:986-994(1996) 來提供?？梢允褂霉潭ǖ?、石蠟包埋的組織作為RNA來源來測(cè)定表達(dá)水平。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，設(shè)計(jì)PCR引物，使其在待擴(kuò)增的基因中存在的內(nèi)含子序列的兩側(cè)。在該實(shí)施方案中，引物/探針設(shè)計(jì)的第一步是描述出基因內(nèi)的內(nèi)含子序列。這可以通過公眾可獲得的軟件來進(jìn)行，如由 Kent，W. J. ,Genome Res. 12(4) =656-64(2002)開發(fā)的 DNA BLAT 軟件，或 BLAST軟件，包括其變型。后續(xù)步驟按照PCR引物和探針設(shè)計(jì)的成熟方法來進(jìn)行。為了避免非特異性信號(hào)，在設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)遮蔽內(nèi)含子內(nèi)的重復(fù)序列是有用的。這可以通過使用Baylor College of Medicine在線獲得的R印eat Masker程序容易地實(shí)現(xiàn)，該程序相對(duì)于重復(fù)元件文庫篩選DNA序列，并返回其中已經(jīng)遮蔽了重復(fù)元件的查詢序列。然后可以將已經(jīng)遮蔽的序列用于設(shè)計(jì)引物和探針序列，利用任何可購得的或其他公眾可獲得的引物/探針設(shè)計(jì)包，如I^imer Express (Applied Biosystems) ；MGB設(shè)計(jì)試驗(yàn) (Applied Biosystems) ；Primer3(Steve Rozen 禾口 Helen J. Skaletsky(2000)Primer3 on the VIMNV for general users and for biologist programmers (用于一般使用者禾口生物學(xué)家程序員的 VIMNV 上的 Primer3)，見Krawetz S, Misener S (編輯)Bioinformatics Methods and Protocols =Methods in Molecular Biology(生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)方案 分子生物學(xué)方法),Humana Press, Totowa, NJ, 365-386 頁)。PCR引物設(shè)計(jì)中考慮的最重要的因素包括引物長(zhǎng)度、解鏈溫度(Tm)和G/C含量、特異性、互補(bǔ)引物序列和3'端序列。通常，最佳PCR引物一般為17-30個(gè)堿基長(zhǎng)，并含有約 20-80%,如，例如約50-60%的G+C堿基。通常優(yōu)選50_80°C，例如，約50_70°C的解鏈溫度。 有關(guān)PCR引物和探針設(shè)計(jì)的更多指南，參見，例如Dieffenbach，C. W.等，General Concepts for PCR Primer Design (PCR 弓 L i殳 i十白勺一M g )， H :PCR Primer, A Laboratory Manual (PCR 引物，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Co Id Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, 133-155 頁 Jnnis 和 Gelfand，Optimization of PCR(PCR 的優(yōu)化)，見PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (PCR 實(shí)驗(yàn)方案，方法和應(yīng)用指導(dǎo))，CRC Press, London, 1994, 5-11 頁；禾口 Plasterer, Τ· N. Primerselect Primer and probe design (引物選擇引物和探針設(shè)計(jì))，Methods Mol.Biol.70 :520-527 (1997)，在此特意將其全部公開內(nèi)容明確引入作為參考。微陣列分析差異表達(dá)也可以使用微陣列技術(shù)來鑒定或驗(yàn)證。因此，可以使用微陣列技術(shù)在新鮮或者石蠟包埋的腫瘤組織中測(cè)量GTM的表達(dá)譜。在這種方法中，在微芯片基質(zhì)上覆蓋或排列目標(biāo)多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。排列的序列(即，捕獲探針)隨之與來自目標(biāo)細(xì)胞或組織(即，靶標(biāo))的特異性多核苷酸雜交。與RT-PCR方法一樣，RNA來源通常為從人腫瘤或腫瘤細(xì)胞系以及相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系中分離出來的總RNA。因此，RNA 可以分離自多種原發(fā)性腫瘤或腫瘤細(xì)胞系。如果RNA的來源是原發(fā)性腫瘤，則可以例如從冷凍或存檔的福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織樣品和固定的(例如，福爾馬林固定的)組織樣品中提取RNA，這些樣品在日常的臨床實(shí)踐中都是常規(guī)制備和保存的。在微陣列技術(shù)的特定實(shí)施方案中，向基質(zhì)上施加PCR擴(kuò)增的cDNA克隆的插入片段?；|(zhì)可以包括高達(dá)1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或75個(gè)核苷酸序列。在其他方面中，基質(zhì)可以包括至少10，000個(gè)核苷酸序列。固定在微芯片上的微陣列序列適合于在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。作為其他實(shí)施方案，用于微陣列的靶標(biāo)可以為至少50、100、200、400、500、 1000 或 2000 個(gè)堿基長(zhǎng)；或 50-100、100-200、100-500、100-1000、100-2000 或 500-5000 個(gè)堿基長(zhǎng)。作為另外的實(shí)施方案，用于微陣列的捕獲探針可以為至少10、15、20、25、50、75、80 或 100 個(gè)堿基長(zhǎng)；或 10-15、10-20、10-25、10-50、10-75、10-80 或 20-80 個(gè)堿基長(zhǎng)。通過反轉(zhuǎn)錄從目標(biāo)組織提取的RNA，通過熒光核苷酸的摻入可以生成熒光標(biāo)記的 cDNA探針。施加到芯片上的標(biāo)記cDNA探針與陣列上的每個(gè)DNA斑點(diǎn)特異性地雜交。嚴(yán)謹(jǐn)洗滌以除去非特異性結(jié)合的探針后，通過共焦激光顯微鏡或通過另一種檢測(cè)方法(如CCD 照相機(jī))來掃描芯片。對(duì)每個(gè)陣列化元素的雜交的定量允許評(píng)估相應(yīng)mRNA的豐度。利用雙色熒光，從兩個(gè)RNA源生成分開標(biāo)記的cDNA探針，其成對(duì)地與陣列雜交。由此，對(duì)應(yīng)于每個(gè)特定基因的來自兩個(gè)來源的轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)豐度可以得以同時(shí)確定。這種小型化規(guī)模的雜交提供了對(duì)大量基因表達(dá)模式的方便快捷的評(píng)價(jià)。此類方法已經(jīng)證明具有檢測(cè)微量轉(zhuǎn)錄物和可再現(xiàn)地檢測(cè)至少大約兩倍的表達(dá)水平差異所需的靈敏度，其中所述微量轉(zhuǎn)錄物僅以每個(gè)細(xì)胞幾個(gè)拷貝的水平表達(dá)Gchena等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 93(2) :106-149(1996))。微陣列分析可以通過可購得的設(shè)備按照生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)方案來進(jìn)行，如使用Affymetrix GenChip技術(shù)、Illunima微陣列技術(shù)或hcyte微陣列技術(shù)。 對(duì)大規(guī)模分析基因表達(dá)的微陣列方法的研發(fā)，使得可以在多種腫瘤類型中系統(tǒng)地尋找癌癥分類和結(jié)果預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物。RNA分離、純化和擴(kuò)增用于mRNA提取的一般方法是本領(lǐng)域公知的，并公開在分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書中，包括 Ausubel 等，Current Protocols of Molecular Biology (分子生物學(xué)通用實(shí)驗(yàn)方案)，John Wiley and Sons (1997)。例如，Rupp 禾口 Locker, Lab Invest. 56 :A67 (1987)，以及De Sandres等，BioiTechniques 18 :42044(1995)中公開了從石賭包埋的組織中提取RNA 的方法。特別地，可以使用來自商業(yè)生產(chǎn)商如Qiagen的純化試劑盒、成套緩沖液和蛋白酶， 按照生產(chǎn)商的說明，來進(jìn)行RNA分離。例如，可以使用Qiagen RNeasy微型柱從培養(yǎng)細(xì)胞分離總RNA。其他可購得的RNA分離試劑盒包括MasterPure Complete DNA和RNA純化試劑盒(EPICENTRE(D，Madison，WI)和 Paraffin Block RNA 分離試劑盒(Ambion, Inc.) 可以使用RNA Mat-60 (Tel-Test公司)從組織樣品分離總RNA。例如，可以通過氯化銫密度梯度離心分離由腫瘤制備的RNA。利用固定的石蠟包埋的組織作為RNA來源進(jìn)行基因表達(dá)譜制作的代表性實(shí)驗(yàn)方案的步驟包括mRNA分離、純化、引物延伸和擴(kuò)增，在多篇發(fā)表的期刊文章中給出(例如 Τ. E. Godfrey 等，J. Molec. Diagnostics 2 :84-91 (2000) ；K. Specht 等，Am. J. Pathol. 158 419-29(2001))。簡(jiǎn)言之，一個(gè)代表性方法從切割約10微米厚的石蠟包埋腫瘤組織樣品切片開始。然后提取RNA，除去蛋白質(zhì)和DNA。分析RNA濃度后，如果需要，可以包括RNA修復(fù)和/或擴(kuò)增步驟，并且利用基因特異性啟動(dòng)子反轉(zhuǎn)錄RNA，接著進(jìn)行RT-PCR。最后，分析數(shù)據(jù)以基于所研究的腫瘤樣品中鑒定到的特征性基因表達(dá)模式來確定患者可用的最佳治療選擇。免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)免疫組織化學(xué)法也適用于檢測(cè)本發(fā)明的增殖標(biāo)志物的表達(dá)水平。因此，利用每種標(biāo)志物特異性的抗體或抗血清，優(yōu)選多克隆抗血清，最優(yōu)選單克隆抗體，來檢測(cè)表達(dá)?？梢酝ㄟ^用例如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、半抗原標(biāo)記(如，生物素)，或酶(如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)直接標(biāo)記抗體本身來檢測(cè)抗體?；蛘撸梢詫⑽礃?biāo)記的一級(jí)抗體與標(biāo)記的二級(jí)抗體聯(lián)合使用，所述二級(jí)抗體包括一級(jí)抗體特異性的抗血清、多克隆抗血清或單克隆抗體。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)方案和試劑盒是本領(lǐng)域公知的并且可商購。蛋白質(zhì)組學(xué)可以用來分析特定時(shí)間點(diǎn)樣品(例如，組織、器官或細(xì)胞培養(yǎng)物)中存在的多肽。特別地，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以用來評(píng)估樣品中多肽表達(dá)的全局變化(也稱為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué))。蛋白質(zhì)組學(xué)分析通常包括(1)通過2-D凝膠電泳Q-D PAGE)分離樣品中單獨(dú)的多肽；(2)鑒定從凝膠中回收的單獨(dú)的多肽，例如，通過質(zhì)譜或N-端測(cè)序，和(3)利用生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)于其他基因表達(dá)譜研究方法是有價(jià)值的補(bǔ)充， 并且可以單獨(dú)使用或與其他方法結(jié)合使用，以檢測(cè)本發(fā)明的增殖標(biāo)志物的產(chǎn)物。使用標(biāo)志物選擇性的核酸探針的雜交方法這些方法涉及將核酸探針結(jié)合支持體，并且在合適的條件下與源自測(cè)試樣品的 RNA 或 cDNA 雜交(Sambrook, J. ，E Fritsch, E.禾口 T Maniatis，Molecular Cloing :ALaboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor (2001))。這些方法適用于源自腫瘤組織或液體樣品的GTM。 通常用熒光或放射性分子來標(biāo)記RNA或cDNA，以能夠檢測(cè)和定量。在一些應(yīng)用中，可以用分支的、熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)將雜交DNA標(biāo)記，以增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度(Nolte，F(xiàn). S. Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens (用于臨床樣品中核酸序列的直接定量的分支DNA信號(hào)擴(kuò)增)，Adv. Clin. Chem. 33，201-35 (1998))。在通過凝膠圖像的熒光檢測(cè)或密度測(cè)定定量雜交量之前， 通過在低鹽溶液(如，0. 1XSSC，0. 5% SDS)中強(qiáng)烈洗滌來除去未雜交的標(biāo)記。支持體可以是固體，如尼龍或硝基纖維素膜，或由在液體懸浮液中時(shí)雜交的微球體或珠子組成。為了可以洗滌和純化，珠子可以是磁性的(Haukanes，B-I和Kvam，C.，Application of magnetic beads in bioassays (磁性珠子在生物試驗(yàn)中的應(yīng)用)，Bio/technology 11,60-63(1993)) 或是熒光標(biāo)記的，以能夠進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(參見，例如Spiro，Α.，Lowe, Μ.和Brown，D.， A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry (使用流式細(xì)胞術(shù)的用于DNA序列的多路鑒定和定量的基于珠子的方法)，Appl. Env. Micro. 66，4258-4265 (2000))。雜交技術(shù)的一種變型是 QuantiGene Plexe 測(cè)定(Genospectra，F(xiàn)remont)，其結(jié)合了熒光珠子支持體和分支DNA信號(hào)擴(kuò)增。雜交技術(shù)的再一種變型是Quantikine mRNA測(cè)定(R&D Systems, Minneapolis).方法按照生產(chǎn)商的說明書中所述的。簡(jiǎn)言之，測(cè)定使用與洋地黃毒苷綴合的寡核苷酸雜交探針。在比色試驗(yàn)中，使用偶聯(lián)堿性磷酸酶的抗洋地黃毒苷抗體來檢測(cè)雜交。其他的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在本文中不需要更多描述。酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)簡(jiǎn)言之，在夾層ELISA測(cè)定中，將對(duì)抗GTM的多克隆或單克隆抗體結(jié)合固相支持體(Crowther，J. R. The ELISA guidebook (ELISA 參考指南)，Humama Press :New Jersey (2000) ；Harlow, Ε.禾口 Lane, D. , Using antibodies :a laboratory manual (使用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor (1999)) 或懸浮液珠子。其他方法是本領(lǐng)域公知的，并且在本文中不需要更多描述。單克隆抗體可以是雜交瘤衍生的，或選自噬菌體抗體文庫(Hust M.和Dubel S. ,Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments (用于體夕卜產(chǎn)生人抗體片段的噬菌體展示載體)，Methods Mol Biol. 295 :71-96(2005))。用非目標(biāo)蛋白制備物和去污劑將非特異性結(jié)合位點(diǎn)阻斷。然后用來自含有GTM抗原的患者的樣品或組織的制備物溫育捕獲抗體。在用檢測(cè)目標(biāo)GTM的二級(jí)抗體溫育抗體/抗原復(fù)合物之前，洗滌混合物。二級(jí)抗體通常綴合熒光分子或可以在酶反應(yīng)中檢測(cè)或用綴合報(bào)告子的第三抗體檢測(cè)的其他報(bào)告分子(Crowther，同上)?；蛘撸谥苯覧LISA中，含有GTM的制備物可以結(jié)合支持體或珠子，并且用抗體-報(bào)告子綴合物直接檢測(cè)目標(biāo)抗原(Crowther，同上)。用于生產(chǎn)單克隆抗體和多克隆抗血清的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在本文中不需要更多描述。免疫檢測(cè)這些方法還可以用于免疫檢測(cè)在外科手術(shù)取出腫瘤前后取自胃癌患者的血清或血漿中的標(biāo)志物家族成員、免疫檢測(cè)患有其他癌癥的患者中的標(biāo)志物家族成員，所述其他癌癥包括但不限于，結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌和腦癌，以及免疫檢測(cè)來自胃癌患者的尿液和糞便中的標(biāo)志物家族成員。還可以使用其他標(biāo)準(zhǔn)免疫檢測(cè)技術(shù)，如免疫印跡或免疫沉淀，來檢測(cè)組織或樣品中的 GTM(Harlow，E.禾口 Lane，D.，Using antibodies :a laboratory manual (使用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor (1999))。在免疫印跡中，將來自含有GTM的組織或液體的蛋白質(zhì)制備物在變性或非變性條件下通過聚丙烯酰胺凝膠電泳。然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜支持體上，如尼龍。然后按照對(duì)免疫組織化學(xué)所述的，將GTM與單克隆或多克隆抗體直接或間接反應(yīng)?；蛘?，在一些制備物中，可以將蛋白質(zhì)直接點(diǎn)在膜上，而沒有之前的電泳分離?？梢酝ㄟ^密度測(cè)定來定量信號(hào)。在免疫沉淀中，用抗GTM的單克隆或多克隆抗體溫育含有GTM的可溶性制備物。然后用惰性珠子溫育反應(yīng)物，所述惰性珠子由具有共價(jià)連接的A蛋白或G蛋白的瓊脂糖或聚丙烯酰胺制備。A或G蛋白珠子與抗體特異性地反應(yīng)，形成結(jié)合珠子的抗體-GTM-抗原的固定化復(fù)合物。洗滌后，可以通過免疫印跡或ELISA檢測(cè)和定量結(jié)合的GTM。閾值測(cè)定對(duì)于使用GTM的測(cè)試，將得到能夠使樣品對(duì)于胃癌稱為陽性或陰性的閾值。這些閾值將通過正在研究胃癌存在的患者群的分析來測(cè)定。閾值對(duì)于不同的測(cè)試應(yīng)用將不同； 例如，使用大部分無泌尿科癥狀的患者群來測(cè)定用于群篩選測(cè)試中的閾值，并且這些閾值不同于用于監(jiān)測(cè)胃癌復(fù)發(fā)患者的測(cè)試中所用的那些?？梢赃x擇閾值，以在所需的臨床背景中提供實(shí)際水平的測(cè)試特異性；即，允許合理靈敏度但沒有過量接受假陽性結(jié)果患者的特異性。該特異性可以在80-90%的范圍內(nèi)。獲得測(cè)試閾值的備選方法是對(duì)于不同的測(cè)試閾值，將靈敏度相對(duì)于特異性作圖(R0C曲線)，然后選擇曲線的拐點(diǎn)。作為單個(gè)閾值的備選，測(cè)試可以使用測(cè)試間隔，其提供了不同程度的疾病存在的可能性，并且其具有與這些可能性相關(guān)的不同臨床結(jié)果。例如，測(cè)試可以具有三個(gè)間隔；一個(gè)與高風(fēng)險(xiǎn)(例如，90%)的胃癌存在相關(guān)，第二個(gè)與低風(fēng)險(xiǎn)的胃癌相關(guān)，而第三個(gè)認(rèn)為是懷疑患病的。“懷疑”的間隔將與限定的時(shí)間段內(nèi)的重復(fù)測(cè)試的推薦相關(guān)。胃癌標(biāo)志物的抗體在其他方面中，本發(fā)明包括制備針對(duì)GTM的抗體。使用本文中所述的方法，可以使用微陣列和/或qRT-PCR方法來鑒定新的GTM。一旦鑒定出推定的標(biāo)志物，可以足量生產(chǎn)以適合于引發(fā)免疫應(yīng)答。在一些情況中，可以使用全長(zhǎng)GTM，而在其他情況中，GTM的肽片段足夠作為免疫原。可以將免疫原注入合適的宿主中(例如，小鼠、兔子等)，并且如果需要，可以注入佐劑，如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑，以提高免疫應(yīng)答?？梢哉J(rèn)識(shí)到制備抗體在免疫學(xué)領(lǐng)域中是常規(guī)的，并且在本文中不需要更多描述。因此，可以產(chǎn)生針對(duì)使用本文中所述方法鑒定的GTM的抗體，包括單克隆或噬菌體展示抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以制備針對(duì)本文中鑒定的腫瘤標(biāo)志物的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)核心的抗體或針對(duì)對(duì)于GTM獨(dú)特的寡核苷酸序列的抗體。盡管特定的蛋白質(zhì)可以糖基化，因此在特定的情況中，糖基化模式的變化可導(dǎo)致缺乏常規(guī)糖基化模式的GTM形式的錯(cuò)誤檢測(cè)。因此，在本發(fā)明的特定方面中，GTM免疫原可以包括脫糖基化的GTM或脫糖基化的 GTM片段?？梢允褂靡环N或多種本領(lǐng)域已知的糖苷酶來完成脫糖基化?；蛘?，GTMcDNA可以在缺乏糖基化的細(xì)胞系中表達(dá)，如在原核細(xì)胞系中表達(dá)，包括大腸桿菌等?？梢灾苽淦渲芯哂蠫TM編碼寡核苷酸的載體。許多這樣的載體可以基于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)載體。載體可以用于轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系，以產(chǎn)生GTM-產(chǎn)生細(xì)胞系，其可以用于產(chǎn)生所需量的GTM，用于研發(fā)特定的抗體或其他試劑，用于檢測(cè)GTM或用于標(biāo)準(zhǔn)化為GTM研發(fā)的測(cè)定法。試劑盒基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，可以設(shè)想和產(chǎn)生幾種類型的測(cè)試試劑盒。首先，可以制備具有預(yù)先裝載了檢測(cè)分子(或“捕獲試劑”)的檢測(cè)裝置的試劑盒。在用于檢測(cè)GTM mRNA的實(shí)施方案中，這樣的裝置可以包括基質(zhì)(例如，玻璃，硅，石英，金屬等)，在其上結(jié)合了寡核苷酸，作為與待檢測(cè)的mRNA雜交的捕獲試劑。在一些實(shí)施方案中，可以通過mRNA(用cy3、 cy5、放射性標(biāo)記或其他標(biāo)記來標(biāo)記)與基質(zhì)上的寡核苷酸雜交來完成mRNA的直接檢測(cè)。在其他實(shí)施方案中，可以通過首先制備所需mRNA的互補(bǔ)DNA(cDNA)來完成mRNA的檢測(cè)。然后，可以將標(biāo)記的cDNA與基質(zhì)上的寡核苷酸雜交，并檢測(cè)?？贵w還可以作為捕獲試劑用于試劑盒中。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)(例如，多孔平板)可以具有與其連接的特異性GTM捕獲試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以包括阻斷試劑。阻斷試劑可以用于降低非特異性結(jié)合。例如，可以使用過量的來自不含有GTM寡核苷酸的任何常規(guī)來源的DNA(如，鮭精DNA)來降低非特異性的寡核苷酸結(jié)合?？梢允褂眠^量的阻斷蛋白(如，血清白蛋白)來降低非特異性的抗體結(jié)合?？梢哉J(rèn)識(shí)到用于檢測(cè)寡核苷酸和蛋白質(zhì)的多種方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以使用特異性地檢測(cè)GTM相關(guān)分子的任何策略，并且認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。結(jié)合固相支持體時(shí)，例如，使用抗體芯片時(shí)，也可以使用抗體，抗體芯片允許使用單個(gè)芯片檢測(cè)多種標(biāo)志物。除了基質(zhì)以外，測(cè)試試劑盒可以包含捕獲試劑(如，探針)、洗滌溶液(例如，SSC、 其他鹽、緩沖劑、去污劑等)，以及檢測(cè)部分(例如，cy3、cy5、放射性標(biāo)記等)。試劑盒還可以包括使用說明書和包裝?？梢允褂萌魏魏线m的技術(shù)來檢測(cè)樣品中的癌癥標(biāo)志物，這些技術(shù)可以包括，但不限于，寡核苷酸探針、QPCR或針對(duì)癌癥標(biāo)志物產(chǎn)生的抗體。將認(rèn)識(shí)到待測(cè)試的樣品不限于懷疑是腫瘤的組織樣品。標(biāo)志物可以分泌至血清或其他體液中。因此，樣品可以包括任何身體樣品，并且包括生檢樣品、血液、血清、腹膜沖洗物、腦脊髓液、尿液和糞便樣品。還將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明不限于人類的癌癥檢測(cè)，而且還適于任何動(dòng)物的癌癥檢測(cè)，包括，但不限于，狗、貓、馬、牛、綿羊、鹿、豬和已知患癌癥的任何其他動(dòng)物。體液中胃癌標(biāo)志物的測(cè)試在幾個(gè)實(shí)施方案中，理想地可以對(duì)獲自血液、血漿、血清、腹膜液(例如，獲自腹膜沖洗物)或其他體液(如，尿液、淋巴、腦脊液、胃液)的樣品或糞便樣品進(jìn)行GTM測(cè)定。通常，測(cè)試這些液體中寡核苷酸、蛋白質(zhì)和肽的方法是本領(lǐng)域已知的?？梢允褂萌?Northern印跡、Southern印跡或微陣列方法，或qPCR的雜交方法來進(jìn)行寡核苷酸的檢測(cè)。 用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，包括如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、具有抗體的蛋白質(zhì)芯片、懸浮液珠子放射免疫測(cè)定(RIA) ,Western印跡和凝集素結(jié)合。然而，為了說明的目的，可以使用夾層型酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來定量GTM的液體水平。對(duì)于血漿測(cè)定，將5uL等份的適當(dāng)稀釋的樣品或連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)GTM和75uL的過氧化物酶綴合的抗-人GTM抗體加入微量滴定平板的孔中。在30°C下30分鐘的溫育期后，用磷酸緩沖鹽水{PBS}中的0.05% 吐溫20洗滌孔，來除去未結(jié)合的抗體。然后在30°C下用含有鄰-亞苯基二胺的H2A溫育結(jié)合的GTM和抗-GTM抗體復(fù)合物15分鐘。通過加入IM H2SO4來停止反應(yīng)，并且用微量滴定平板讀出器來測(cè)量492nm處的吸光值?？梢哉J(rèn)識(shí)到抗-GTM抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗血清。還可以認(rèn)識(shí)到可以合適地研究任何其他體液。在生理學(xué)意義上，標(biāo)志物不必是分泌的才是有用的。相反，標(biāo)志物蛋白質(zhì)或基因進(jìn)入血清的任何機(jī)制在產(chǎn)生可檢測(cè)的、可定量水平的標(biāo)志物中是有效的。因此，可溶性蛋白從細(xì)胞的正常分泌、膜蛋白從質(zhì)膜的脫落、選擇性剪接形式的mRNA或從其表達(dá)的蛋白質(zhì)的分泌、細(xì)胞死亡(或凋亡)可以產(chǎn)生足夠水平的有用標(biāo)志物。對(duì)于使用血清標(biāo)志物作為診斷和/或評(píng)價(jià)多種癌癥類型療效的工具，存在越來越多的支持。Yoshikawa等，(Cancer Letters, 151 :81-86 Q000))，描述了胃癌患者血菜中的基質(zhì)金屬蛋白酶-1的組織抑制劑。Rudland 等，(Cancer Research 62 :3417-3427(2002))描述了骨橋蛋白作為人乳
癌中的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。Buckhaults 等，(Cancer Research 61 :6996-7001 (2002))描述了結(jié)直腸腫瘤中特定分泌的和表達(dá)的細(xì)胞表面基因。Kim等，(JAMA 287(13) :1671-1679(2002))描述了骨橋蛋白作為卵巢癌的潛在診斷生物標(biāo)志物。Hotte 等，(AJ. American Cancer Society 95(3) :507-512 Q002))，描述了血菜骨橋蛋白作為人體液中可檢測(cè)的蛋白質(zhì)，并且與特定的惡性腫瘤相關(guān)。Martin^, (Prostate Cancer Prostatic Dis. 2004^3^ 9 日(PMID :15007379) (摘要))，描述了人激肽釋放酶2，前列腺特異性抗原(PSA)和游離PSA作為檢測(cè)前列腺癌的標(biāo)志物的用途。Hall 等，(Laryngoscope 113(1) :77-81 (2003) (PMID U679418)(摘要))，描述了血清甲狀腺球蛋白在甲狀腺癌中的預(yù)測(cè)價(jià)值。Mazzaferri 等，(J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (4) 1433-1441 Q003)(摘要))， 描述了甲狀腺球蛋白作為甲狀腺癌患者的潛在監(jiān)測(cè)方法。Whitley 等，(Dim Lab. Med. 24(1) =29-47(2004)(摘要))，描述了甲狀腺球蛋白作為甲狀腺癌的血清標(biāo)志物。Kuo 等，(Clin. Chim. Acta. 294(1-2) 157-168 Q000)(摘要))，描述了 HCF-和 HBV-感染患者中的血清基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9。Koopman 等，(Cancer Epidemiol. Biomarkers Prey 13(3) :487-491 O004)(摘要))，描述了骨橋蛋白作為胰腺癌的生物標(biāo)志物。Pellegrini 等，(Cancer Immunol. Immunother. 49(7) :388-394(2000)(摘要))， 描述了可溶性癌胚抗原和TIMPl作為入侵前結(jié)直腸癌的標(biāo)志物的測(cè)量。
Melle 等，(Clin. Chem. 53 (4),629-635 (2007)(摘要))，描述了 HSP27 作為胰腺癌的血清標(biāo)志物。Leman 等，(Urology, 69 (4) 714-20 (2007)(摘要))，描述了 EPCA-2 作為前列腺癌的血清標(biāo)志物。Tsigkou 等，(I Clin Endocrinol Metab，92 (7) 25洸_31 (2007)(摘要))，描述了總抑制素作為卵巢癌的潛在血清標(biāo)志物。Marchi 等，(Cancer 112，1313-13M ^)08)(摘要))，描述了前載脂蛋白 AI 作為肺癌患者腦部轉(zhuǎn)移的血清標(biāo)志物。方法使用以下的一般方法來評(píng)價(jià)多種方法對(duì)胃腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的分子鑒定的適用性。腫瘤收集從首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)院(Seoul National University Hospital)切除的外科手術(shù)樣本收集胃腫瘤樣品和非惡性胃組織?；诎Y狀、生理發(fā)現(xiàn)和組織的組織學(xué)檢查來進(jìn)行胃癌的診斷。RNA 提取在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)定取自腫瘤的樣品中的RNA水平來分析胃腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。將冷凍外科手術(shù)樣本包埋在OCT介質(zhì)中。使用切片機(jī)從組織塊切出60微米的切片，在TriReagent 水(3 1)混合物中均質(zhì)化，然后氯仿萃取。然后使用RNeasy 程序(Qiagen)從水相純化總RNA?？偣矎?8個(gè)胃腫瘤和58個(gè)非惡性(“正常”)胃組織樣品中提取了 RNA，并用于以下所述的微陣列分析中。還從16個(gè)癌細(xì)胞系中提取出RNA，并合并作為參照RNA。微陣列載玻片制備環(huán)氧涂布的玻璃載玻片獲自MWG Biotech AG，K^ersberg，德國(guó)，并且根據(jù)生產(chǎn)商的實(shí)驗(yàn)方案，使用Gene Machines微陣列機(jī)器人用_30，000個(gè)50mer寡核苷酸印刷。RNA標(biāo)記和雜交在含有5-(3-氨基烯丙基)_2’脫氧尿苷_5’ -三磷酸鹽的反應(yīng)物中，使用 Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)從IOug總RNA轉(zhuǎn)錄cDNA。然后將反應(yīng)物在 Microcon柱中去離子，接著在室溫下，在碳酸氫鹽緩沖液中用Cy3或Cy5溫育。使用 Qiaquick柱^jiagen)除去未結(jié)合的染料，并且將樣品在SpeedVac中濃縮至15ul。然后將 Cy3和Cy5標(biāo)記的cDNA與Ambion ULTRAhyb緩沖液混合，在100°C下變性2分鐘，并在雜交室中，在42°C下，與微陣列載玻片雜交16小時(shí)。然后洗滌載玻片，并在Axon 4000A掃描儀中，在兩個(gè)功率設(shè)定下掃描兩次，以產(chǎn)生基因表達(dá)的原始熒光數(shù)據(jù)。歸一化程序?yàn)榱藴y(cè)量腫瘤和非癌組織中癌基因的表達(dá)，通過減去局部背景熒光強(qiáng)度來校正由 Genepixta軟件檢測(cè)的中值熒光強(qiáng)度。排除了背景校正強(qiáng)度低于零的點(diǎn)。為了促進(jìn)歸一化， 將強(qiáng)度比例和整體點(diǎn)強(qiáng)度進(jìn)行了對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化。使用LOCFITta包中實(shí)現(xiàn)的局部回歸對(duì)染料和空間偏差校正了對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的強(qiáng)度比例。同時(shí)對(duì)于整體點(diǎn)強(qiáng)度和位置回歸了對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的強(qiáng)度比例。局部回歸的殘差提供了校正的對(duì)數(shù)-倍數(shù)變化。對(duì)于質(zhì)量控制，相對(duì)于點(diǎn)強(qiáng)度和位置， 對(duì)每個(gè)歸一化的微陣列的比例作圖。隨后目測(cè)檢查圖的可能剩余的假象。此外，方差分析(ANOVA)模型適用于針尖(pin-tip)偏差的檢測(cè)。將歸一化的所有結(jié)果和參數(shù)插入用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的Postgres-數(shù)據(jù)庫中。標(biāo)志物選擇根據(jù)每個(gè)基因在腫瘤和非惡性組織中的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度，將29，718個(gè)基因的每個(gè)微陣列基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分級(jí)。進(jìn)一步的分析限于(i)編碼分泌蛋白的基因，( )在腫瘤組織中具有高于對(duì)編碼現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物CEA的基因(CEACAiK)觀察到的強(qiáng)度等級(jí)的基因和 (iii)在血液或脈管組織中不具有顯著表達(dá)的基因，如通過Unigene數(shù)據(jù)庫中的EST計(jì)數(shù)所測(cè)定的(Wheeler DL等，200 。通過鑒定預(yù)期含有N-端信號(hào)肽的轉(zhuǎn)錄物來預(yù)測(cè)分泌蛋白。丟棄具有不在頭20個(gè)N-端氨基酸的預(yù)測(cè)的跨膜螺旋的蛋白[Krogh A.等，2001]。使用TARGETP[Emanuelsson O等，2000]預(yù)測(cè)更多的亞細(xì)胞定位。相關(guān)寡核苷酸的參考號(hào)(MWG寡聚物#)，以及選定GTM的NCBImRNA和蛋白質(zhì)參考序列顯示于圖1中。圖1還顯示了選定的GTM在腫瘤和非惡性組織中的等級(jí)強(qiáng)度。下文中顯示了本發(fā)明的GTM的全部DNA序列。定量實(shí)時(shí)PCR在其他實(shí)施方案中，可以將實(shí)時(shí)或定量PCR(qPCR)用于PCR模板拷貝數(shù)的絕對(duì)或相對(duì)定量。使用 Primer Express V 2. OTM(Applied Biosystems)設(shè)計(jì) MUC17 的引物組(正向GAGGTGGTCAGCAGCATTGAC ；反向CCTGGGAAGAGTG GTTTTTTAGC)，并使用 STOR 綠色標(biāo)記來檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物。通過Assay-on-Demand 表達(dá)試驗(yàn)Hs. 00380609_ml (Applied Biosystems)來表示ZG16。在ABI Prism 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)上在標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)條件下進(jìn)行了擴(kuò)增。使用由單個(gè)cDNA表示的每個(gè)RNA樣品在兩個(gè)96孔平板上進(jìn)行試驗(yàn)。分析了高達(dá) 45個(gè)來自胃腫瘤和非惡性胃組織的RNA樣品。每個(gè)平板含有參照cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，在625-倍濃度范圍內(nèi)，以一式兩份進(jìn)行。分析由計(jì)算ACT組成(目標(biāo)基因CT-平均參照cDNA CT) 0 ACT與負(fù)log2倍數(shù)變化成正比。然后計(jì)算相對(duì)于中值非惡性log2倍數(shù)變化的log2倍數(shù)變化(log2倍數(shù)變化-中值正常log2對(duì)數(shù)變化)。然后將這些倍數(shù)變化聚類成頻率級(jí)并作圖。蛋白質(zhì)表達(dá)和抗體產(chǎn)生為了證實(shí)蛋白質(zhì)水平的ZG16，必須產(chǎn)生抗重組蛋白的新抗體。使用正向引物 CACCAATGCCATTCAGGCCAGGT 和反向引物 TCAGCATCTGCTGCAGCTA 從人細(xì)胞系 cDNA PCR 擴(kuò)增 ZG16的編碼區(qū)17-167。將PCR產(chǎn)物凝膠純化并且克隆至來自hvitrogen的“(Gateway”進(jìn)入載體“pENTR/dTOPO”中，然后測(cè)序以證實(shí)序列的正確插入。使用“(Gateway”系統(tǒng)，然后從 pENTR/dTOPO將ZG16克隆至含有N端6XHIS標(biāo)記物的hvitrogen表達(dá)載體pDEST17中。 在BL21-AI大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中進(jìn)行ZG16的表達(dá)，將細(xì)胞在37°C下在搖床上生長(zhǎng)，直至它們處于中間對(duì)數(shù)期(0D_ = 0. 5)，由此在0. 2%最終濃度的阿拉伯糖下誘導(dǎo)，并且在37°C下在搖床上再生長(zhǎng)3小時(shí)。通過在6000 X g下離心15分鐘來收集細(xì)胞，并將上清液丟棄。將細(xì)胞重懸浮于PBS(pH7.0)中，并且使用60%功率的Sonics Vibra cell通過超聲波來裂解。通過在12000 Xg下離心10分鐘來澄清裂解的細(xì)胞，并且丟棄上清液。將細(xì)胞沉淀物在含有0. 5% TritonX-100的PBS緩沖液(pH7. 0)中洗滌三次，接著用PBS (pH7. 0) 洗滌一次。然后，使用PBS中的8M脲(pH8. 0)將沉淀物再洗滌一次。通過在12000Xg下離心來澄清每個(gè)洗滌步驟，并且丟棄上清液。然后將沉淀物溶解于含有IOmM TRIS (pH8. 0)、 8M脲、IOOmM NaCl的增溶緩沖液中，在室溫下過夜。將增溶緩沖液在12000 Xg下進(jìn)一步離心，通過0. 45nm膜過濾，并且裝載于用含有PBS (ρΗ7. 0)、8M脲和20mM咪唑的洗滌緩沖液預(yù)先洗滌過的Mkpharose柱上。裝載后，用10柱體積的洗滌緩沖液洗滌柱子，并且將溶解的蛋白質(zhì)在補(bǔ)充500mM咪唑的洗滌緩沖液中洗脫。將洗脫的蛋白質(zhì)脫鹽至PBS(pH7.0) 和8M脲緩沖液中，并且在含有50mM乙酸鈉(pH4. 5)、0. IM NDSB-201、10%甘油、lmM/0. ImM GSH/GSSH的重折疊緩沖液中通過逐滴稀釋來重折疊。通過在12000Xg下離心來澄清重折疊緩沖液，并且使用具有IOKDa標(biāo)稱分子截留的Centripr印濾器(Millipore)來濃縮重折疊蛋白。使用G25脫鹽柱將重折疊蛋白緩沖液交換至補(bǔ)充了 10%甘油的含有IOOmM乙酸鈉的緩沖液(PH5.0)中，并且將等份試樣存儲(chǔ)在_80°C。考馬斯染色的10% SDS PAGE凝膠和 Western印跡分析總體表明了高達(dá)95%純度的18KDa的His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的存在。切除 18KDa考馬斯染色帶并通過MALDI-T0F/T0F MS/MS鑒定含有ZG16。通過用純化的ZG16蛋白淘選噬菌體展示抗體文庫來獲得抗ZG16的抗體 (Antibodies by Design ；Morphosys AG 的一個(gè)分部，德國(guó)。www, morphosys. com)?？贵w陣列使用抗體陣列來證實(shí)候選標(biāo)志物。血清樣品獲自胃癌、結(jié)直腸癌(外科手術(shù)前后)患者，和獲自非惡性疾病的外科手術(shù)患者。通過Dunedin Public Hospital，新西蘭，和Christchurch Cancer Society組織庫，Christchurch，新西蘭，來制備樣品。使用 GeneMachines OminGrid 100陣列機(jī)器人將獲自商業(yè)來源或選自噬菌體文庫(Morphosys) 的抗ZG16和MUC17的抗體印刷在玻璃載玻片上(Schott Nexterion Slide H)。用疏水筆將每個(gè)陣列圈上范圍。然后將載玻片在3 X PBS-0. 5 %吐溫20 (3 X PBS-T)中洗滌，接著用50mM 硼酸鈉緩沖液中的50mM乙醇胺，pH8. 0來封閉，接著用酪蛋白酸鹽封閉緩沖液(3XPBS-T，
酪蛋白酸鈉)封閉。然后將生物素標(biāo)記的血清樣品添加至載玻片上，接著在4°C下溫育過夜。然后將載玻片在3XPBS-T中洗滌，接著空氣干燥。然后使用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)來檢測(cè)結(jié)合的抗體，之前有大量描述(Haab BB, Lizardi PM, RCA-enhanced protein detection arrays (RCA增強(qiáng)的蛋白質(zhì)檢測(cè)陣列)，Methods Mol Biol. 2006 ；328 15-29)。簡(jiǎn)言之，用已經(jīng)綴合寡核苷酸引物(5’-CCT GGT GCT CAA ATT TCA GTT CTG C-3’)的抗生物素抗體溫育載玻片。然后在潮濕的密封室中在37°C下將環(huán)狀DNA模板與載玻片雜交30min，接著將載玻片在遞減濃度的PBS-T(3XPBS-0. 05%吐溫20，IXPBS-0. 05%吐溫20和0. 1XPBS-0. 05% 吐溫20)中洗滌并干燥。然后使用？11口9在301下將模板延伸池！·，接著洗滌載玻片，并通過離心干燥。然后使用同源熒光標(biāo)記的探針來檢測(cè)擴(kuò)增的模板。用Axon 4000A掃描儀掃描載玻片，并用GenePix Pro 6. 1. 0. 4軟件測(cè)量信號(hào)。使用來自R的li_a (Smith，200 包(用于統(tǒng)計(jì)計(jì)算的R包(R Development Core)的normalizeBetweenArrays函數(shù)，使用分位數(shù)歸一化來調(diào)節(jié)Cy5熒光強(qiáng)度。分位數(shù)歸一化調(diào)節(jié)強(qiáng)度值，通過將來自不同區(qū)組的強(qiáng)度分位數(shù)設(shè)定至相同值，使得強(qiáng)度分布對(duì)于每個(gè)區(qū)組是相同的(每個(gè)區(qū)組對(duì)應(yīng)于單獨(dú)的樣品)。每個(gè)強(qiáng)度值的等級(jí)在該程序過程中沒有改變，只有強(qiáng)度的相對(duì)量值發(fā)生了改變。設(shè)想描述抗原濃度范圍的潛在概率分布函數(shù)對(duì)于所有樣品是相同的。該程序提高了所有樣品見的區(qū)組之間信號(hào)的平均相關(guān)性，并且還在考慮僅參照的區(qū)組時(shí)，其表明了數(shù)據(jù)質(zhì)量的改進(jìn)。在采取重復(fù)之間的中值來獲得每種抗體的歸一化強(qiáng)度之前，除去Gen印ix-標(biāo)記的點(diǎn)。因此，我們已經(jīng)鑒定出對(duì)于研發(fā)試劑、檢測(cè)和評(píng)價(jià)胃癌的裝置和試劑盒有用的三種基因和/或蛋白質(zhì)?？梢允褂靡粋€(gè)或多個(gè)胃癌標(biāo)志物，單獨(dú)或結(jié)合使用，以提供用于胃癌的可靠分子測(cè)試。
實(shí)施例在此所述的實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的實(shí)施方案的目的。其他實(shí)施方案、方法和分析類型在分子診斷領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，并且在本文中不需要詳細(xì)描述。 認(rèn)為本領(lǐng)域范圍內(nèi)的其他實(shí)施方案是本發(fā)明的一部分。實(shí)施例1 胃惡性腫瘤的標(biāo)志物的鑒定使用獲自胃腫瘤和非惡性樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)來選擇標(biāo)志物。將以下標(biāo)準(zhǔn)用于標(biāo)志物選擇(i)分泌蛋白特征性的信號(hào)序列的存在，(ii)腫瘤組織中微陣列信號(hào)強(qiáng)度等級(jí)和(iii)血液或脈管組織中相應(yīng)EST的水平。這些標(biāo)準(zhǔn)的使用能夠鑒定在腫瘤組織中大量表達(dá)但可能在血清、血液或血漿中具有低背景的分泌標(biāo)志物。圖1描繪了一張表，其顯示了使用以上標(biāo)準(zhǔn)選擇的胃惡性腫瘤的三個(gè)標(biāo)志物，MUC5AC，MUC17和ZG16。圖1包括基因符號(hào) (“符號(hào)”)、MWG寡聚物號(hào)、NCBI mRNA參照序列號(hào)、蛋白質(zhì)參照序列號(hào)、使用腫瘤組織衍生的陣列上基因的等級(jí)強(qiáng)度和使用非惡性組織衍生的陣列上基因的等級(jí)強(qiáng)度。所有三個(gè)GTM 具有比CEACAM5高的表達(dá)(強(qiáng)度)等級(jí)，CEACAM5是編碼現(xiàn)有胃癌標(biāo)志物CEA的基因。最低的表達(dá)等級(jí)可能是四，718。等級(jí)的檢查還顯示出這些GTM在腫瘤組織中的表達(dá)與非惡性組織相當(dāng)，表明基因在癌形成過程中未得到強(qiáng)烈下調(diào)。血液和脈管組織中這三個(gè)GTM的 unigene EST 計(jì)數(shù)(Wheeler 等，2003)全部為零。實(shí)施例2 qRT-PCR分析使用更靈敏和精確的基因表達(dá)定量技術(shù)qPCR，在腫瘤組織中證實(shí)了 GTM ZG16和 MUC17的豐度和身份。使用方法部分中所述的引物和探針，通過RT-qPCR分析了來自相同患者的高達(dá)45個(gè)胃腫瘤樣品和等量的非惡性胃組織樣品。使用達(dá)到產(chǎn)物擴(kuò)增閾值水平(Ct) 所需的PCR循環(huán)數(shù)來定量這些基因的表達(dá)。qPCR分析證實(shí)了陣列數(shù)據(jù)通過qPCR容易地在腫瘤組織中檢測(cè)到兩個(gè)標(biāo)志物，并且不存在腫瘤組織與非惡性組織相比表達(dá)顯著下降的證據(jù)。通過圖加-b中的直方圖說明了這些RNA在腫瘤組織中與非惡性組織相比的豐度。實(shí)施例3 血清中胃腫瘤標(biāo)志物蛋白的檢測(cè)在特定的實(shí)施方案中，可以使用針對(duì)完整蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段(肽)或蛋白質(zhì)核心的抗體來完成GTM蛋白的檢測(cè)。檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)和肽表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以包括依賴于相對(duì)蛋白質(zhì)或肽產(chǎn)生的特異性抗體的方法?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法來制備單克隆抗體和多克隆抗血清，并且在本文中不需要更多描述。為了檢測(cè)血清中的GTM，使用Gene Machine OmniGrid 機(jī)器人技術(shù)將抗GTM的抗體印刷在玻璃載玻片上。將每個(gè)抗體在陣列上重復(fù)8次。然后在用抗體載玻片溫育之前，用生物素標(biāo)記來自33名胃癌患者和41名對(duì)照的血清樣品。用抗-生物素抗體檢測(cè)結(jié)合的蛋白，并且使用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和熒光標(biāo)記來擴(kuò)增信號(hào)。使用Axon 4000a掃描儀和Gem5Pix 6. 1. 0. 4軟件來定量結(jié)合的蛋白質(zhì)的含量?；颊叩奶卣黠@示于圖2中。
將來自陣列上每個(gè)抗體的熒光信號(hào)歸一化，并且將8個(gè)重復(fù)的中值信號(hào)以任意熒光單位來表示。說明數(shù)據(jù)分布的盒形圖顯示于圖3中。對(duì)于MUC17的中值信號(hào)，胃癌患者為18，836AU，對(duì)照組為16，130。這些中值是顯著差異的(p = 0. 007)。對(duì)于獲自MorphoSys 的兩個(gè)噬菌體展示ZG16抗體(5902和5905)，觀察到中值之間的顯著差異。胃癌患者樣品中ZG16_5902的中值信號(hào)為2139AU，相比，對(duì)照的為1837AU ；患者中的中值ZG16_5905信號(hào)為3063AU，相比，對(duì)照的為1675AU?；颊吆蛯?duì)照之間對(duì)于ZG16_5902和ZG16_5905的中值信號(hào)是顯著不同的(各自為P = 0.05和ρ = 0.005)。該數(shù)據(jù)證明MUC17和ZG16以顯著高于對(duì)照的水平存在于胃癌患者的血清中?；颊吆蛯?duì)照組之間的更多區(qū)別將通過免疫學(xué)測(cè)試程序的改進(jìn)、對(duì)目標(biāo)抗原具有更高特異性的抗體的鑒定和標(biāo)志物的聯(lián)合使用來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例8 用含有GTM的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了可以表達(dá)GTM、GTM片段或肽標(biāo)志物的細(xì)胞。因此可以使用原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。例如，大腸桿菌(原核細(xì)胞)可以用來產(chǎn)生大量缺乏成熟糖基化的GTM (如果特定GTM通常是糖基化的)。COS細(xì)胞、293細(xì)胞和多種其他真核細(xì)胞可以用于產(chǎn)生糖基化的GTM，或具有正確的折疊，并且因此，具有天然形式的GTM蛋白的三維結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的，并且在本文中不需要更多描述。實(shí)施例9:試劑盒基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，可以產(chǎn)生幾種類型的測(cè)試試劑盒。首先，可以制備具有預(yù)先裝載了檢測(cè)分子(或“捕獲試劑”)的檢測(cè)裝置的試劑盒。在用于檢測(cè)GTM mRNA的實(shí)施方案中，這樣的裝置可以包括基質(zhì)(例如，玻璃，硅，石英，金屬等)，其上的寡核苷酸作為與待檢測(cè)的mRNA雜交的捕獲試劑。在一些實(shí)施方案中，可以通過mRNA (用cy3、cy5、放射性標(biāo)記或其他標(biāo)記來標(biāo)記)與基質(zhì)上的寡核苷酸雜交來完成mRNA的直接檢測(cè)。在其他實(shí)施方案中，可以通過首先制備所需mRNA的互補(bǔ)DNA(cDNA)來完成mRNA的檢測(cè)。然后，可以將標(biāo)記的cDNA與基質(zhì)上的寡核苷酸雜交，并檢測(cè)。與所用的檢測(cè)方法無關(guān)，測(cè)試GTM表達(dá)與表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量的比較是所希望的。例如，可以將RNA表達(dá)對(duì)總細(xì)胞DNA、組成型表達(dá)的RNA (例如，核糖體RNA)的表達(dá)或其他相對(duì)不變的標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)化?？贵w也可以用于試劑盒中作為捕獲試劑。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)(例如，多孔平板)可以具有與其連接的特異性GTM捕獲試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以包括封閉試劑。封閉試劑可以用于降低非特異性結(jié)合。例如，可以使用來自不含有GTM寡核苷酸的任何常規(guī)來源的過量DNA(如，鮭精DNA)來降低非特異性的寡核苷酸結(jié)合?？梢允褂眠^量的封閉蛋白(如，血清白蛋白)來降低非特異性的抗體結(jié)合?？梢哉J(rèn)識(shí)到用于檢測(cè)寡核苷酸和蛋白質(zhì)的多種方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以使用特異性地檢測(cè)GTM相關(guān)分子的任何策略，并且認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在依賴于抗體檢測(cè)的實(shí)施方案中，可以基于每個(gè)細(xì)胞，或基于全部細(xì)胞、組織或液體蛋白、液體體積、組織質(zhì)量(重量)來表示GTM蛋白或肽。此外，可以基于相對(duì)高豐度血清蛋白(如，白蛋白)來表示血清中的GTM。除了基質(zhì)，測(cè)試試劑盒可以包括捕獲試劑(如，探針)、洗滌溶液(例如，SSC、其他鹽、緩沖液、去污劑等)以及檢測(cè)部分(例如，cy3、cy5、放射性標(biāo)記等)。試劑盒還可以包括使用說明書和包裝。盡管參照其特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但將認(rèn)識(shí)到可以使用涉及使用所公開標(biāo)志物的其他實(shí)施方案，而沒有脫離本發(fā)明的范圍。工業(yè)實(shí)用性檢測(cè)GTM家族成員的方法包括使用微陣列和/或?qū)崟r(shí)PCR方法來檢測(cè)核酸，以及檢測(cè)蛋白質(zhì)和肽。本發(fā)明的組合物和方法可用于診斷裝置和試劑盒的制備、疾病的診斷、評(píng)價(jià)療效和生產(chǎn)適用于測(cè)量生物樣品中GTM家族成員表達(dá)的試劑。參考文獻(xiàn)Emanuelsson 0, Nielsen H, Rrunak S, von Heiine G. PredictinR subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. J Mol Biol.2000 Jul 21 ；300 (4) :1005-16.KroRh A,Larsson B,von Heiine G,Sonnhammer EL. PredictinR transmembrane protein topology with a hidden Markov model -application to complete genomes. J. Mol Biol. 2001 Jan 19 ；305 (3) :567-80.Smyth, G. K. (2005) · Limma : 1 inear models for microarray data. In ' Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor' . R. Gentleman,V. Carey,S. Dudoit,R. Irizarry,ff. Huber(eds), Springer, New York, pages 397—420.R Development Core Team(2008) · R:A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0，URL http://www. R-proiect. org.Wheeler DL, et al. Database Resources of the National Center for Biotechnology. Nucl Acids Res 31 :28-33 ；2003.
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)胃癌的方法，包括⑴提供生物樣品；和( )檢測(cè)所述樣品中人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)的水平。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品中ZG16的過表達(dá)表明癌癥。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，包括檢測(cè)一種或多種其他GTM家族成員的水平。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)選自黏蛋白 5AC( “MUC5AC”)和黏蛋白17( “MUC17”)的其他GTM家族成員的水平。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述一種或多種其他GTM家族成員選自由 MUC5AC、MUC17、ZG16、羧肽酶N、多肽 2，83kDa鏈(“CPN2”)、基質(zhì)金屬蛋白酶 12 (“MMP12”)、抑制素(“ INHBA”)、胰島素樣生長(zhǎng)因子7 (“IGFBP7”)、γ -谷氨酰水解酶(“GGH”)、富含亮氨酸脯氨酸的蛋白聚糖(“LEPRE1”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑S( “CST4”)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白 4(“SFRP4”)、aSp0rin(“ASPN”)、具有EF手型結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑1 (“CGREF1”)、激肽釋放酶10 (KLKlO)、金屬蛋白酶的組織抑制劑1( “TIMP1”)、分泌型酸性富含半胱氨酸蛋白 (“SPARC”)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，13-誘導(dǎo)的(“TGFBI”)、含有EGF的fibulin-樣胞外基質(zhì)蛋白 2 ( “EFEMP2”)、基膜聚糖(Iumican) ( “LUM”)、stannin ( “SNN”)、分泌型磷蛋白 1 ( “SPP1”)、 硫酸軟骨素蛋白聚糖2( “CSPG2”)、N-?；拾贝减０匪饷?“ASAHl”)、絲氨酸蛋白酶 11 ( “PRSS11”)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白 2( “SFRP2”)、磷脂酶 A2，XIIB 組(“PLA2G12B”)、 spondin 2，胞外基質(zhì)蛋白(“SP0N2”)、嗅介蛋白(olfactomedin) 1 ( “0LFM1”)、含有血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)1( “TSRC1”)、血小板反應(yīng)蛋白2( “THBS2”)、adlican、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SA( “CST2”)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN( 乂511”)、賴氨酰氧化酶樣酶2( “L0XL2”)、甲狀腺球蛋白(“TG”)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子i31(“TGFBl”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade H成員1( “SERPINH1”)、絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑Clade B成員5( “SERPINB5”)、 基質(zhì)金屬蛋白酶2( “匪 2”)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/1 ^^1 5型(“PCSK5”)、乙酰透明質(zhì)酸糖蛋白連接蛋白4( “HAPLN4”)、CA19-9、CA72-4、胃蛋白酶原和CEA組成的組。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其中所測(cè)試的GTM標(biāo)志物包括MUC5AC、MUC17、ZG16、 半胱氨酸蛋白酶抑制劑SN、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白Hl和絲氨酸蛋白酶抑制蛋白B5。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中通過檢測(cè)GTMmRNA的水平進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
8.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中通過檢測(cè)GTMcDNA的水平進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中使用與所述GTMcDNA的至少一部分互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
10.權(quán)利要求8的方法，其中使用正向引物和反向引物用qRT-PCR方法進(jìn)行所述檢測(cè)步馬聚ο
11.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中通過檢測(cè)GTM蛋白的水平進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
12.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其中通過檢測(cè)GTM肽的水平進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中使用針對(duì)所述GTM的抗體進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
14.權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)的方法，其中使用夾層型免疫測(cè)定方法，或使用抗體芯片進(jìn)行所述檢測(cè)步驟。
15.權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
16.權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是多克隆抗血清。
17.一種用于檢測(cè)GTM的裝置，其包括 基質(zhì)，其上具有GTM捕獲試劑；和與所述基質(zhì)相連的檢測(cè)儀，所述檢測(cè)儀能夠檢測(cè)與所述捕獲試劑結(jié)合的GTM，其中所述 GTM包括人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)。
18.權(quán)利要求17的裝置，其中所述GTM捕獲試劑是寡核苷酸。
19.權(quán)利要求17的裝置，其中所述GTM捕獲試劑是對(duì)GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM肽特異的抗體。
20.一種用于檢測(cè)癌癥的試劑盒，其包含 基質(zhì)，其上具有GTM捕獲試劑；用于顯示所述GTM捕獲試劑和GTM復(fù)合物的工具； 試劑；和使用說明書，其中所述GTM包括人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述GTM捕獲試劑是GTM-特異性寡核苷酸。
22.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述GTM捕獲試劑是對(duì)GTM寡核苷酸、GTM蛋白或GTM 肽選擇性的GTM特異性抗體。
23.一種檢測(cè)胃癌的方法，包括步驟提供來自處于患胃癌風(fēng)險(xiǎn)中的患者的測(cè)試樣品；測(cè)量所述測(cè)試樣品中GTM蛋白的存在；和將所述測(cè)試樣品中存在的GTM的量與獲自不患胃癌受試者的對(duì)照樣品的值進(jìn)行比較， 其中所述GTM包含人酶原粒蛋白16 ( “ZG16”)。
24.一種用于篩選胃癌的方法，包括步驟 提供來自測(cè)試受試者的測(cè)試樣品； 測(cè)量所述測(cè)試樣品中GTM的存在；和將所述測(cè)試樣品中存在的GTM的量與獲自不患胃癌受試者的對(duì)照樣品的值進(jìn)行比較， 其中所述GTM包括人酶原粒蛋白16( “ZG16”)。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述GTM是GTM蛋白或肽。
26.權(quán)利要求M的方法，其中所述GTM是GTM特異性的寡核苷酸。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述寡核苷酸是DNA。
28.權(quán)利要求沈的方法，其中所述寡核苷酸是RNA。
29.權(quán)利要求M至觀任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)量步驟使用ELISA測(cè)定法。
30.權(quán)利要求M至四任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試樣品獲自血漿。
31.權(quán)利要求M至30任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)試樣品獲自組織、尿液、胃液、血清和糞便。
全文摘要
腫瘤的早期檢測(cè)是腫瘤(包括胃腫瘤)患者存活的主要決定因素。GTM基因家族的成員可以在胃腫瘤組織中差異地表達(dá)，并且因此可以用作檢測(cè)胃癌和其他類型癌癥的標(biāo)志物。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)腫瘤(包括胃腫瘤)的新GTM，并且特別是人酶原粒蛋白16(ZG16)。GTM可以單獨(dú)使用或與其他已知GTM一起使用，來提供用于腫瘤(包括胃腫瘤)檢測(cè)的新標(biāo)記。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102459646SQ201080031553
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者P·J·吉爾福德 申請(qǐng)人:環(huán)太平洋生物技術(shù)有限公司