專利名稱：胃癌檢測用的標(biāo)志物和胃癌檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將COTLl蛋白質(zhì)作為胃癌檢測用標(biāo)志物，通過測定其在體液中的濃度來檢測胃癌的胃癌檢測方法。本發(fā)明還涉及包含能夠與用于檢測胃癌的上述蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的胃癌的檢測用試劑盒。
背景技術(shù)：
胃是具有將飲食物貯藏幾個小時，通過期間分泌的胃酸使飲食物變?yōu)樗嵝远乐垢瘮?，并且通過消化酶將飲食物消化的功能的重要的消化系統(tǒng)器官。胃癌的發(fā)生頻率，在日本每10萬人口大致為50 60人左右，男女比為I 2:1，呈現(xiàn)男性發(fā)病較高的傾向。另外，其死亡數(shù)每年約5萬人，占所有癌的17%，從第二次世界大戰(zhàn)之后到1990年初，胃癌曾占各部位癌死亡率的第一位。雖然現(xiàn)在隨著患者數(shù)逐年減少而緊隨肺癌列第二位，但依然是患者數(shù)較多的疾病。此外從全世界范圍來看，胃癌在日本、韓國、中國等亞洲地區(qū)以及南美的患者較多。作為胃癌的危險因子，一般可列舉吸煙、食鹽攝取過多的飲食習(xí)慣、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染等。胃癌的治療已知有內(nèi)窺鏡治療、外科手術(shù)、化學(xué)療法、放射線療法等。綜合考慮病期、腫瘤的大小和/或侵入深度、轉(zhuǎn)移的程度等來施用。治療方針依照2004年日本胃癌學(xué)會制成的“胃癌治療方針”來確定。在早期胃癌的情況下，可以通過內(nèi)窺鏡切除或者外科手術(shù)完全切除，復(fù)發(fā)率也非常低。另一方面，在進(jìn)展期胃癌的情況下，即使摘除病變也存在手術(shù)時未能發(fā)現(xiàn)的微小的轉(zhuǎn)移病灶，復(fù)發(fā)的情況不少。胃癌在早期發(fā)現(xiàn)的情況下預(yù)后較好，通常90%以上可以完全治愈。但較大的腫瘤和/或轉(zhuǎn)移后的治療成績較差，為5年生存率約70%。因此其早期發(fā)現(xiàn)具有重要性。然而，大多數(shù)的胃癌在早期階段是無癥狀的，很多情況下如果不是癌進(jìn)展之后則不會出現(xiàn)明確的自覺癥狀。因此通過自覺癥狀來早期發(fā)現(xiàn)胃癌是困難的。作為自覺癥狀，隨著胃癌的進(jìn)展，可見軟便化、黑色便、惡心、胃部不適等，另外作為全身性癥狀，可見易疲勞感、發(fā)燒、體重減輕、貧血等。隨著病情進(jìn)一步進(jìn)展，腫瘤增大，才會感覺到腹部有疙瘩。并且即使出現(xiàn)這樣的自覺癥狀之后，患者也常有放置病情的傾向，通過體檢時的X射線照相才初次發(fā)現(xiàn)已經(jīng)是進(jìn)展的狀態(tài)的情況也不少。因此，開發(fā)出在早期階段高靈敏度且準(zhǔn)確地檢查胃癌的檢測方法變得重要。作為胃癌的檢查法，有利用超聲波檢查、CT檢查、血管造影檢查、X射線照相等的圖像診斷法。圖像診斷法雖然對于發(fā)現(xiàn)早期較小胃癌是有用的方法，但在例如健康診斷等以大量被測人為對象時不能說是有效的方法，并且還存在診斷所需的費(fèi)用比較高的問題。隨著近年的基因組分析或蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)進(jìn)步，作為癌領(lǐng)域的研究成果各種新的腫瘤標(biāo)志物候選逐漸被發(fā)現(xiàn)(例如專利文獻(xiàn)I、專利文獻(xiàn)2)。由于對特定癌為特異性且靈敏度高的血中標(biāo)志物被認(rèn)為能夠進(jìn)行比較廉價且高通量的檢查和/或診斷，因而其開發(fā)被寄予厚望。作為探索標(biāo)志物的方法，可列舉比較癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞在基因表達(dá)和/或蛋白質(zhì)或細(xì)胞的代謝產(chǎn)物等的量的方法，和/或測定癌患者和非癌患者的體液中所含的mRNA、蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物等的量的方法?，F(xiàn)在，作為被臨床使用的胃癌腫瘤標(biāo)志物，已知CEA、BFP、NCC-ST-439、CA72-4、CA 19-9等。此外在組織中發(fā)現(xiàn)了胃蛋白酶原C(非專利文獻(xiàn)I)、hnRNP A2/B1 (非專利文獻(xiàn)2)、NSP3、轉(zhuǎn)膠蛋白、抗增殖蛋白、HSP27、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3、GRP58(非專利文獻(xiàn)3)等標(biāo)志物候選。然而，這些標(biāo)志物和標(biāo)志物候選特異性和/或檢測靈敏度的不足，還未能確立利用來自活體樣品的這些標(biāo)志物和標(biāo)志物候選的有效的檢測方法。因此，其利用僅限于治療后的跟蹤觀察這樣的有限目的，所以期盼特異性和檢測靈敏度更高的胃癌標(biāo)志物?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)I :國際公開W02005/001126專利文獻(xiàn)2 :國際公開TO2003/060121非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Melle, C.等、Journal of proteome research、2。。5、第 5 卷、p.1799-1804非專利文獻(xiàn)2 :Lee, C.等、Proteomics、2005、第 5 卷、p. 1160-1166非專利文獻(xiàn)3 :Ryu, J. W.等、Journal Korean Medical Science、2003、第 18 卷、p. 505-509

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明的課題是提供對胃癌檢測有用的腫瘤標(biāo)志物以及使用了該腫瘤標(biāo)志物的胃癌檢測方法。用于解決課題的方法為了解決上述課題，本發(fā)明者們對胃癌患者的血液和健常體的血液中存在的蛋白質(zhì)群進(jìn)行了比較，從而作為在胃癌患者的血液中被檢測出的新的腫瘤標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)了 C0TL1蛋白質(zhì)，從而完成了本發(fā)明?！癈0TL1”(肌動蛋白輔助蛋白樣I, coactosin-likel)蛋白質(zhì)是肌動蛋白細(xì)胞 骨架結(jié)合性蛋白質(zhì)，已報告在細(xì)胞內(nèi)與5-脂氧合酶結(jié)合，被認(rèn)為參與白三烯的生物合成(Provost P.等、2001 年、Journal of Biological Chemistry、第 276 卷、p. 16520-16527)。另外，已報告該蛋白質(zhì)伴隨風(fēng)濕的發(fā)病而其血中濃度升高(Eun-Heui J.等、2009年、Experimental and Molecular Medicine、第 41 卷、p. 354-361)。并且，已知在膜腺癌組織中表達(dá)高(Nakatsura T.等、2001 年、Biochemical and Biophysical ResearchCommuni cat ion、第256卷、p. 75-80)。然而,至今為止尚未知關(guān)于C0TL1蛋白質(zhì)與胃癌的相關(guān)性的報告。因此，本發(fā)明包含以下發(fā)明。(I) 一種胃癌檢測方法，其中，體外測定來源于被測體的體液中存在的胃癌檢測用標(biāo)志物的量，并基于該量來確定胃癌的罹患，所述胃癌檢測用標(biāo)志物包含C0TL1蛋白質(zhì)、該C0TL1蛋白質(zhì)的突變體和/或它們的片段。
(2)根據(jù)⑴所述的方法，其中，上述COTLl蛋白質(zhì)為序列號I所示的多肽。(3)根據(jù)(I)或(2)所述的方法，其中，在被測體的上述胃癌檢測用標(biāo)志物的量和健常體的該量相比統(tǒng)計學(xué)上有意義的多時，確定為罹患胃癌。(4)根據(jù)(3)所述的方法，其中，上述統(tǒng)計學(xué)上有意義的多的量是健常體的2倍以上。(5)根據(jù)(I) (4)的任一項所述的方法，其中，上述測定使用能和上述胃癌檢測用標(biāo)志物特異性結(jié)合的物質(zhì)。(6)根據(jù)(5)所述的方法，其中，上述能和胃癌檢測用標(biāo)志物特異性結(jié)合的物質(zhì)為抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段。 (7)根據(jù)⑴ (6)的任一項所述的方法，其中，上述胃癌為早期胃癌。(8)根據(jù)⑴ (7)的任一項所述的方法，其中，上述體液樣品為血液或尿。(9) 一種胃癌檢測用試劑盒，包含抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體、它們的片段和/或它們的化學(xué)修飾衍生物。本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請2010-046613號的說明書和/或附圖所記載的內(nèi)容。發(fā)明的效果通過本發(fā)明，能夠容易且高可靠性地檢測胃癌。例如，僅通過測定胃癌患者的血液等體液樣品中所含的COTLl蛋白質(zhì)的濃度，就可以容易地判定是否是胃癌。根據(jù)本發(fā)明的胃癌檢測方法，在早期癌的情況下也能夠檢出這方面是有效的。


圖I是通過蛋白質(zhì)印跡法檢測胃癌患者和健常人的血漿中的COTLl蛋白質(zhì)而得的圖。圖2是通過夾心ELISA法檢測胃癌患者和健常人的血漿中的CEA(圖2A)和CA 19-9 (圖2B)而得的圖。
具體實(shí)施例方式I.胃癌檢測用標(biāo)志物(概要)本發(fā)明的第一方式涉及用于檢測胃癌的胃癌檢測用標(biāo)志物。本發(fā)明是基于COTLl蛋白質(zhì)在胃癌患者血液中的比健常人更多地存在的見解而做出的。如后述的本發(fā)明的第二方式中所說明的那樣，根據(jù)被測體的血液中存在的該蛋白質(zhì)的量的多少，可以檢測出該被測體的胃癌的罹患。(發(fā)明的構(gòu)成)在本發(fā)明中，“胃癌檢測標(biāo)志物”是用于檢測胃癌的生物學(xué)標(biāo)志物，是指成為顯示被測體罹患胃癌的指標(biāo)的物質(zhì)。本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物包含COTLl蛋白質(zhì)、該COTLl蛋白質(zhì)的突變體和/或它們的片段(以下在本說明書中將它們歸納起來，有時稱為“C0TL1蛋白質(zhì)等”)。本發(fā)明的“C0TL1蛋白質(zhì)”如上所述是肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)合性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，對應(yīng)于由142個氨基酸組成的約17KDa的各生物種COTLl蛋白質(zhì)，優(yōu)選為來源于人的COTLl蛋白質(zhì)(GenBank登錄號NP_066972. I)，具體為序列號I所示的多肽。另外，COTLl蛋白質(zhì)還可以是COTLl蛋白質(zhì)、特別是來源于人的COTLl蛋白質(zhì)的突變體或野生型和/或突變型的COTLl蛋白質(zhì)的片段。本發(fā)明者們搞清楚了，COTLl蛋白質(zhì)等由胃癌細(xì)胞產(chǎn)生，在胃癌患者中，多于健常體的量漏出到體液中。在本說明書中，上述COTLl蛋白質(zhì)“突變體”，是指在構(gòu)成COTLl蛋白質(zhì)、優(yōu)選為序列號I所示的來源于人的野生型COTLl蛋白質(zhì)的氨基酸序列或其部分序列中，包含I個以上、優(yōu)選為I個 幾個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的突變體，或者是指與該氨基酸序列或其部分序列顯示約80%以上、約85%以上、優(yōu)選為約90%以上、更優(yōu)選為約95%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上的同一性百分?jǐn)?shù)的突變體。在這里，“幾個”是指 約10、9、8、7、6、5、4、3或2個以下的整數(shù)。此外，“同一性百分?jǐn)?shù)”可以使用利用BLAST和/或FASTA的蛋白質(zhì)檢索系統(tǒng)，在導(dǎo)入間隙或者不導(dǎo)入間隙的條件下確定。(Karlin，S.等、1993 年、Proceedings of the National Academic Sciences U.S.A.、第 90 卷、p. 5873-5877 ;Altschul, S. F.等、1990 年、Journal of Molecular Biology> 第 215 卷、p. 403-410; Pearson, ff. R.等、1988 年、Proceedings of the NationalAcademic SciencesU. S. A.、第85卷、p. 2444-24488)。作為COTLl蛋白質(zhì)的突變體的具體例，可列舉基于被測體的種類(例如，在被測人的情況下為種族)和/或個體的多態(tài)性(含SNIPs)、剪接突變
坐寸o在本說明書中，“片段”是指下述多肽片段，所述多肽片段包含構(gòu)成野生型C0TL1蛋白質(zhì)、優(yōu)選為序列號I所示的來源于人的野生型C0TL1蛋白質(zhì)或其突變體的氨基酸的至少7個以上且少于總數(shù)、至少10個以上且少于總數(shù)、至少15個以上且少于總數(shù)、優(yōu)選至少20個以上且少于總數(shù)、至少25個以上且少于總數(shù)、更優(yōu)選至少35個以上且少于總數(shù)、至少40個以上且少于總數(shù)、至少50個以上且少于總數(shù)的連續(xù)氨基酸殘基，且保持I個或幾個表位。這樣的片段可以與后述的本發(fā)明所涉及的抗體或其片段免疫特異性地結(jié)合。這樣的肽片段也包含在C0TL1蛋白質(zhì)中的原因是，即使被片段化，只要能定量血液中的C0TL1蛋白質(zhì)，就能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，而且，血液中的上述野生型C0TL1蛋白質(zhì)(優(yōu)選為序列號I所示的來源于人的野生型C0TL1蛋白質(zhì))或其突變體的全長多肽，也可能被例如血液中存在的蛋白酶和/或肽酶等片段化而存在。2.胃癌檢測方法(概述)本發(fā)明的第二方式涉及檢測胃癌的方法。本發(fā)明是基于C0TL1蛋白質(zhì)在胃癌患者的血液中比健常人更多地存在的見解，測定來源于被測體的體液中存在的本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物的量，由其結(jié)果來檢測胃癌的方法。(發(fā)明的構(gòu)成)本發(fā)明的方法包括⑴胃癌檢測用標(biāo)志物測定工序，和⑵罹患確定工序。以下對于各個工序進(jìn)行詳細(xì)說明。2-1.胃癌檢測用標(biāo)志物測定工序“胃癌檢測用標(biāo)志物測定工序”，是體外測定來源于被測體的體液中存在的本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物即C0TL1蛋白質(zhì)、該C0TL1蛋白質(zhì)的突變體和/或它們的片段的量的工序。在本說明書中，“被測體”是成為胃癌罹患的檢測對象的樣本，對應(yīng)于脊椎動物，優(yōu)選為哺乳動物，特別優(yōu)選為人。在本說明書中，在被測體是人的情況下，以后特別稱為“被測人”。在本說明書中，“體液”是被提供用于胃癌檢測的樣品，是指生物學(xué)上的流體。體液只要是可能含有本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物的生物學(xué)上的流體即可，不特別限定。包含例如，血液、尿、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清、腦脊液、消化液(包含胃液、唾液)、汗、腹水、鼻粘液、淚、陰道分泌液、精液等。優(yōu)選為血液或者尿。這里所說的“血液”包含全血、血漿和血清。全血不分靜脈血、動脈血或臍帶血。體液也可以是由同一個體獲得的兩種以上不同體液的組合。由于本發(fā)明的胃癌檢測方法通過侵襲性低的血液和/或尿也能夠檢測，所以作為簡便的檢測方法非常有用?！皝碓从诒粶y體的體液”是指已經(jīng)從被測體采取的體液，本發(fā)明的方式并不包含采 取體液的行為本身。關(guān)于來源于被測體的體液，可以在從被測體采取之后直接用于本發(fā)明的方法，也可以在采取后直接或?qū)嵤┻m當(dāng)?shù)奶幚碇筮M(jìn)行冷藏或冷凍，并在供給至本發(fā)明的方法之前恢復(fù)到室溫再使用。作為冷藏或冷凍前的適當(dāng)?shù)奶幚?，包括例如向全血中添加肝素等進(jìn)行抗凝固處理后，再作為血漿或血清分離等。這些處理基于本領(lǐng)域公知的技術(shù)來進(jìn)行即可。在本說明書中，“本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物的量”是指來源于被測體的體液中存在的COTLl蛋白質(zhì)等的量。該量可以是絕對量或相對量的任一種。在絕對量的情況下，對應(yīng)于在規(guī)定的體液量中所含的胃癌檢測用標(biāo)志物的質(zhì)量或者容量。在相對量的情況下，是指通過相對于特定的測定值的來源于被測體的胃癌檢測用標(biāo)志物的測定值來表示的相對的值。可列舉例如，濃度、熒光強(qiáng)度、吸光度等。胃癌檢測用標(biāo)志物的量可以在體外使用公知的方法測定。可列舉例如，使用與上述蛋白質(zhì)等能夠特異性地結(jié)合的物質(zhì)進(jìn)行測定的方法。在本說明書中，“能夠特異性地結(jié)合”是指，某物質(zhì)僅能夠與本發(fā)明的目標(biāo)胃癌檢測用標(biāo)志物即COTLl蛋白質(zhì)、該COTLl蛋白質(zhì)的突變體和/或它們的片段實(shí)質(zhì)地形成復(fù)合體。這里的“實(shí)質(zhì)地”是指除了非特異性結(jié)合以外的結(jié)合。作為“能夠特異性地結(jié)合的物質(zhì)”，可列舉例如COTLl結(jié)合蛋白質(zhì)等。更具體地說，例如，以COTLl蛋白質(zhì)作為抗原，識別并結(jié)合該抗原的“抗COTLl抗體”;優(yōu)選為識別并結(jié)合具有序列號I所示的氨基酸序列的多肽的抗體；或者以COTLl蛋白質(zhì)的突變體作為抗原，識別并結(jié)合該抗原的“抗COTLl突變體抗體”;優(yōu)選為識別并結(jié)合具有序列號I的突變體的氨基酸序列的多肽的抗體；和/或這些抗體的抗體片段?；蛘咭部梢允沁@些抗體的化學(xué)修飾衍生物。這里“化學(xué)修飾衍生物”包括以下任一者在獲得或保持上述抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段的與COTLl蛋白質(zhì)等特異性結(jié)合的活性方面所需的功能上的修飾；或者在檢測上述抗COTLl抗體，抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段方面所需的用于標(biāo)記的修飾。功能上的修飾可列舉例如糖基化、去糖基化、PEG化。標(biāo)記上的修飾可列舉利用例如熒光色素(FITC、羅丹明、德克薩斯紅(Texas Red)、Cy3、Cy5)、熒光蛋白質(zhì)(例如PE、APC、GFP)、酶類(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶)、或者生物素或(鏈霉)親和素等進(jìn)行的標(biāo)記?？贵w可以是多克隆抗體和單克隆抗體的任一者。為了能夠特異性地檢測，優(yōu)選為單克隆抗體。與COTLl蛋白質(zhì)等特異性地結(jié)合的抗COTLl多克隆抗體等(包含抗COTLl多克隆抗體、抗COTLl突變體多克隆抗體和/或?qū)@些抗體的片段的多克隆抗體)或抗COTLl單克隆抗體等(包含抗COTLl單克隆抗體、抗COTLl突變體單克隆抗體和/或?qū)@些抗體的片段的單克隆抗體)可以通過后述的方法制作。此外，抗人COTLl多克隆抗體已經(jīng)由Protein Group公司等市售，也可利用該市售品。本發(fā)明的抗體的球蛋白類型只要具有上述特征即可，不特別限定，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中任一種,優(yōu)選為IgG和IgM0抗體片段包含例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ScFv等，但不限于這些。還包含能夠通過遺傳工程學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的抗體片段和衍生物。這樣的抗體包含例如合成抗體、重組抗體、多重特異性抗體(含雙重特異性抗體)、單鏈抗體等。本發(fā)明的抗COTLl蛋白質(zhì)抗體等是針對包含上述蛋白質(zhì)的至少5個、優(yōu)選為至少8個氨基酸的I個或幾個表位的抗體。特異性的多克隆抗體例如可以通過以下方法制作，所述方法包括在瓊脂糖等載體上結(jié)合了 COTLl蛋白質(zhì)等的柱 中通入免疫了該蛋白質(zhì)的兔等的抗血清,再回收結(jié)合于柱載體上的IgG抗體的工序。(I)抗COTLl抗體的制作以下具體說明本發(fā)明中使用的抗COTLl多克隆抗體等和抗COTLl單克隆抗體等的制作方法。(1-1)免疫原的調(diào)制在本發(fā)明中制作抗體時，調(diào)制作為免疫原(抗原)的COTLl蛋白質(zhì)等。能夠在本發(fā)明中作為免疫原使用的COTLl蛋白質(zhì)，例如具有序列號I所示的氨基酸序列的人COTLl蛋白質(zhì)或者其突變體或者其多肽片段，或者它們與其他肽(例如，信號肽、標(biāo)記肽等)的融合多肽。作為免疫原的COTLl蛋白質(zhì)，例如可以利用序列號I的氨基酸序列信息，通過本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法、例如固相肽合成法等，來合成用作免疫原的COTLl蛋白質(zhì)片段。在使用COTLl蛋白質(zhì)片段作為免疫原的情況下，優(yōu)選將其與KLH、BSA等載體蛋白質(zhì)連接而使用。此外，作為免疫原的COTLl蛋白質(zhì)等也可以利用公知的DNA重組技術(shù)獲得。編碼COTLl蛋白質(zhì)等的cDNA可以通過cDNA克隆化法制作。從表達(dá)免疫原COTLl基因等的胃上皮細(xì)胞等生物體組織中提取總RNA，將其使用寡聚dT纖維素柱處理，從所得的多聚A (+) RNA通過RT-PCR法制作cDNA文庫，由該文庫通過雜交篩選、表達(dá)篩選、抗體篩選等篩選來獲得目標(biāo)cDNA克隆。根據(jù)需要還可以通過PCR法將cDNA進(jìn)一步擴(kuò)增。這樣就可以得到與目標(biāo)基因?qū)?yīng)的cDNA。cDNA克隆化技術(shù)記載于例如Sambrook, J.和Russel, D.著、MolecularCloning, A LABORATORY MANUAL (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)、Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001年I月15日發(fā)行、第I卷7. 42 7. 45、第2卷8. 9 8. 17。接下來，將通過上述方法等獲得的cDNA克隆整合到表達(dá)載體中，再通過培養(yǎng)用該載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細(xì)胞，從而可以從該細(xì)胞獲得目標(biāo)的C0TL1蛋白質(zhì)等。此時，在從培養(yǎng)上清中獲取目標(biāo)的蛋白質(zhì)等的情況下，可以通過在編碼該多肽的DNA的5’末端側(cè)翼化編碼分泌信號序列的核苷酸序列，從而使成熟多肽分泌到細(xì)胞外。作為表達(dá)載體，可列舉來源于大腸菌的質(zhì)粒(例如pET21a、pGEX4T、pC118、pC119、pC18、pC19等)、來源于枯草菌的質(zhì)粒(例如pUBllO、pTP5等)、來源于酵母的質(zhì)粒(例如YEpl3、YEp24、YCp50等)，作為噬菌體DNA可列舉入-噬菌體(入gtll、入ZAP等)。并且，也可以使用牛痘病毒等動物病毒、桿狀病毒等昆蟲病毒載體。載體和表達(dá)系統(tǒng)可以從Novagen公司、寶酒造、第一化學(xué)藥品、Qiagen公司、Stratagene公司、Promega公司、RocheDiagnositics 公司、Invitrogen 公司、Genetics Institute 公司、GE Healthcare 公司等購得。為了向表達(dá)載體插入COTLl蛋白質(zhì)等的cDNA，可采用首先，將純化后的DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖袛?，再插入到合適的限制性酶位點(diǎn)或者多克隆位點(diǎn)而與載體連接的方法等。載體除了含有編碼該蛋白質(zhì)的DNA之外，還可 以含有調(diào)節(jié)元件，例如啟動子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、復(fù)制起始位點(diǎn)、終止子、選擇標(biāo)志物等。此外為容易地純化多肽可以在多肽的C末端或者N末端連接標(biāo)記肽而制成融合多肽。代表性的標(biāo)記肽可列舉6 10個殘基的組氨酸重復(fù)、FLAG、myC肽、GFP蛋白質(zhì)等，但標(biāo)記肽不限于這些，此外，關(guān)于DNA重組技術(shù)在Sambrook, J.和Russel, D.(上述)中記載。為了將DNA片段與載體片段連接，使用公知的DNA連接酶。作為宿主細(xì)胞,可以使用細(xì)菌等原核細(xì)胞(例如大腸桿菌(Escherichia coli)等大腸菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等枯草菌)、酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆蟲細(xì)胞(例如，Sf細(xì)胞)、哺乳動物細(xì)胞(例如，COS、CHO、BHK)等。向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的導(dǎo)入方法只要是向各個宿主導(dǎo)入DNA的方法即可，沒有特別限定。向細(xì)菌導(dǎo)入該載體的方法，可列舉例如，熱激法、使用鈣離子的方法、電穿孔法等。這些技術(shù)都是本領(lǐng)域公知的,在各種文獻(xiàn)中記載。例如可參照Sambrook, J.et. al. , (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Second Ed.(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York0Jlt^,向動物細(xì)胞導(dǎo)入該載體的方法，優(yōu)選使用例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(PNAS (1989) Vol. 86，6077)、(PNAS(1987) Vol. 84，7413)、電穿孔轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法(Virology (1973) Vol. 52，456-467)、使用脂質(zhì)體的方法、DEAE-Dextran (DEAE-葡聚糖)法等。作為用于培養(yǎng)以大腸菌、酵母菌等微生物作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，含有微生物能夠同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等，只要是能有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可，可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基的任一者。培養(yǎng)通常在震蕩培養(yǎng)或者通風(fēng)攪拌培養(yǎng)等有氧條件下、在37°C進(jìn)行6 24小時。培養(yǎng)過程中pH值保持在中性附近。pH值的調(diào)整使用無機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液等進(jìn)行。培養(yǎng)中可根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素和/或四環(huán)素等抗生素。在培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化體的情況下，也在適合各種細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，回收培養(yǎng)上清或者細(xì)胞內(nèi)所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。此時培養(yǎng)基可以含有血清，也可以不含有血清，但更優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在COTLl蛋白質(zhì)等在菌體內(nèi)或者細(xì)胞內(nèi)的情況下，通過破碎菌體或細(xì)胞來提取蛋白質(zhì)。此外在COTLl蛋白質(zhì)等在菌體外或者細(xì)胞外生產(chǎn)的情況下，直接使用培養(yǎng)液，或者通過離心分離等除去菌體或者細(xì)胞。在不附加標(biāo)記肽的情況下生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的情況下，作為其純化法可列舉例如利用離子交換層析的方法。此外也可以是組合凝膠過濾層析和/或疏水性層析、等電點(diǎn)層析等的方法。此外，在該蛋白質(zhì)上帶有組氨酸重復(fù)、FLAG、myc、GFP等標(biāo)記肽的情況下,可以列舉利用一般使用的適合各種標(biāo)記肽的親和層析的方法。優(yōu)選構(gòu)建分離和/或純化容易的表達(dá)載體。特別是如果以多肽與標(biāo)記肽的融合蛋白質(zhì)的形態(tài)表達(dá)的方式構(gòu)建表達(dá)載體，用遺傳工程學(xué)的方法調(diào)制該蛋白質(zhì)，則分離和/或純化也容易。是否真正獲得了 COTLl蛋白質(zhì)等，可以通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等來確認(rèn)。(1-2)抗體的制作以這樣獲得的COTLl蛋白質(zhì)等作為抗原，可以獲得特異性地識別COTLl蛋白質(zhì)等的抗體。更具體地說，蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)突變體、融合蛋白質(zhì)等，包含用于引起抗體形成的抗原決定簇或者表位，這些抗原決定簇或表位既可以是直鏈，也可以是更高級結(jié)構(gòu)(斷續(xù)的)。此外，該抗原決定簇或表位可以通過在本技術(shù)領(lǐng)域已知的所有方法來鑒定。通過本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以誘導(dǎo)所有形態(tài)的抗體。只要分離出該蛋白質(zhì)的全部或者一部分或者表位，就可以用常用的技術(shù)制造多克隆抗體和單克隆抗體的任一者。方法例如有 Kennet 等(主編)，Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension inBiological Analyses, Plenum Press, New York, 1980 中所列舉的方法。 (1-2-1)多克隆抗體的制作為了制作多克隆抗體，首先將所得的C0TL1蛋白質(zhì)等在緩沖液中溶解調(diào)制免疫原。此外，根據(jù)需要，為了有效地進(jìn)行免疫可以添加佐劑。作為佐劑的例子，可列舉市售的弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)等，可以將它們單獨(dú)或者混合使用。接下來，將上述調(diào)制的免疫原對哺乳動物例如大鼠、小鼠(例如近交系小鼠Balb/C)、兔等施與、免疫。免疫原的一次的施與量根據(jù)免疫動物的種類、施與途徑等適宜確定，每I只動物約50 200 u g。作為免疫原的施與方法，可列舉例如，使用FIA或FCA進(jìn)行的皮下注射、使用FIA進(jìn)行的腹腔內(nèi)注射、以及使用0. 15mol/L的氯化鈉進(jìn)行的靜脈注射等，但不限于此。此外，對免疫的間隔不特別限定，初次免疫之后，以幾天到幾周間隔、優(yōu)選以I 4周間隔進(jìn)行2 10次、優(yōu)選為3 4次追加免疫。初次免疫后，通過ELISA (Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay,酶聯(lián)免疫吸附測定)法等來反復(fù)測定免疫動物血清中的抗體效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到平高線(Plateau)時，向靜脈內(nèi)或者腹腔內(nèi)注射免疫原，作為最終免疫。免疫之后，可以從血液中回收針對C0TL1蛋白質(zhì)等的多克隆抗體。在需要單克隆抗體的情況下，制作后述的產(chǎn)生抗C0TL1抗體的雜交瘤。(1-2-2)單克隆抗體的制作從免疫動物回收產(chǎn)生抗體的細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明，可以制作生產(chǎn)特異性地識別C0TL1蛋白質(zhì)等的抗C0TL1單克隆抗體的雜交瘤。這種雜交瘤能夠通過常用的技術(shù)產(chǎn)生并且鑒定。用于產(chǎn)生這種雜交瘤的方法之一，將動物用本發(fā)明的蛋白質(zhì)免疫，從免疫后的動物采取產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并使該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤(myeloma)細(xì)胞株融合，由此生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞，并且鑒定產(chǎn)生與C0TL1蛋白質(zhì)等結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤即可。作為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，可列舉脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、末梢血細(xì)胞等，優(yōu)選脾細(xì)胞或局部淋巴結(jié)細(xì)胞。這些細(xì)胞使用從用C0TL1蛋白質(zhì)等免疫過的動物中摘出或者采取的即可。對動物免疫的方法依據(jù)上述多克隆抗體制作的項。作為與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞株，可以使用小鼠等動物的一般可以購得的株化細(xì)胞。作為使用的細(xì)胞株，優(yōu)選具有藥劑選擇性，并具有在未融合的狀態(tài)下在HAT選擇性培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基喋呤、胸苷)中無法生存、只有在與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞融合了的狀態(tài)下才能生存的性質(zhì)。此外株化細(xì)胞優(yōu)選來源于與免疫動物同種系的動物。作為骨髓瘤細(xì)胞株的具體例，有來源于BALB/c小鼠的次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷細(xì)胞株 P3X63-Ag. 8 株(ATCC TIB9)、P3X63_Ag. 8. Ul 株(JCRB9085)、P3/NSI/l_Ag4_l 株(JCRB0009)、P3x63Ag8. 653 株(JCRB0028)或 Sp2/0_Agl4 株(JCRB0029)等。細(xì)胞融合細(xì)胞融合，在不含血清的DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基等動物細(xì)胞用培養(yǎng)基中，將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞株以約I: I 20:1的比例混合，在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下進(jìn)行融合反應(yīng)。作為細(xì)胞融合促進(jìn)劑，可以以約10 80%濃度使用平均分子量為1500 4000道爾頓的聚乙二醇等。另外根據(jù)情況不同，為提高融合效率也可以并用二甲基亞砜等輔助齊U。還可以進(jìn)一步使用利用了電刺激(例如電穿孔)的市售的細(xì)胞融合裝置來使產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞株融合(Nature, 1977，Vol. 266，550-552)。雜交瘤的分選和克隆化從細(xì)胞融合處理后的細(xì)胞中分選出作為目標(biāo)的產(chǎn)生抗COTLl抗體等的雜交瘤。作為其方法，將細(xì)胞懸浮液用例如含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基等進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，?微量滴定板上以200萬個/孔左右接種。向各孔內(nèi)加入選擇培養(yǎng)基，之后適當(dāng)?shù)馗鼡Q選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20 40°C，優(yōu)選為約37°C。在骨髓瘤細(xì)胞為HGPRT缺陷株或者胸苷激酶缺陷株的情況下，可以通過使用含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的選擇性培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)僅選擇性地培養(yǎng)具有產(chǎn)生抗體的能力的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株的雜交瘤，使其增殖。其結(jié)果是，可以獲得從使用選擇培養(yǎng)基開始培養(yǎng)后約14天前后生長的細(xì)胞作為雜交瘤。接下來，篩選在增殖的雜交瘤的培養(yǎng)上清中是否存在目標(biāo)抗體。雜交瘤的篩選按照通常的方法即可，不特別限定。例如，采取作為雜交瘤生長的孔中所含的培養(yǎng)上清的一部分，通過酶免疫測定法(EIA =Enzyme Immuno Assay、和ELISA)、放射線免疫測定法(RIA Radio Immuno Assay)等來進(jìn)行。融合細(xì)胞的篩選通過有限稀釋法等來進(jìn)行，最終樹立作為產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞的雜交瘤。本發(fā)明的雜交瘤如下所述，在利用RPMI-1640、DMEM等基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)中是穩(wěn)定的，并產(chǎn)生、分泌與來源于胃癌的COTLl蛋白質(zhì)特異性地反應(yīng)的單克隆抗體?？贵w的回收單克隆抗體可以使用常用的技術(shù)回收。即，作為從樹立好的雜交瘤中采取單克隆抗體的方法，采用通常的細(xì)胞培養(yǎng)法或者腹水形成法等。在細(xì)胞培養(yǎng)中，將雜交瘤在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基或者無血清培養(yǎng)基等動物細(xì)胞培養(yǎng)基中，在常用的培養(yǎng)條件(例如37°C、5% CO2濃度)下培養(yǎng)2 10天，從其培養(yǎng)上清中獲得抗體。在腹水形成法的情況下，可以將雜交瘤以約1000萬個施與至與骨髓瘤細(xì)胞所來源的哺乳動物同種系的動物的腹腔內(nèi)，使雜交瘤大量增殖。然后在I 2周之后采取腹水或者血清。在上述抗體的采取方法中，如果需要純化抗體，則可以適宜選擇硫酸銨鹽析法、離子交換層析法、親和層析法、凝膠層析法等公知的方法，或者通過上述方法的組合，從而獲得被純化的本發(fā)明的單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體包含嵌合抗體，例如鼠科單克隆抗體的人化型。此外，根據(jù)本發(fā)明，還可提供上述抗體的抗原結(jié)合片段。作為可以使用常用的技術(shù)產(chǎn)生的抗原結(jié)合片段的例子，包含F(xiàn)ab及F(ab’)2片段，但不限于這些。此外也可提供可以通過遺傳工程學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的抗體片段和衍生物。本發(fā)明的抗體在體外和體內(nèi)的任一種情況都可以在用于檢測本發(fā)明的多肽或其(多)肽片段的存在的分析中使用。此外本發(fā)明的抗體也可以用于通過免疫親和層析法來純化蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段。為了實(shí)現(xiàn)分析中的特異性檢測，優(yōu)選使用單克隆抗體，但即使是多克隆抗體，也可以通過所謂吸收法獲得特異抗體，所述吸收法包含使抗體與結(jié)合有純化多肽的親和柱結(jié)
口 o(2)使用抗COTLl抗體等的本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物的體外測定作為使用上述(I)所制作的抗COTLl抗體等，來體外測定來源于被測人的體液中所存在的本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物、即COTLl蛋白質(zhì)等的量的方法(用免疫學(xué)方法)，可列舉例如，酶免疫測定法(ELISA、EIA)、熒光免疫測定法、放射免疫測定法(RIA)、發(fā)光免疫測定法、免疫比濁法、膠乳凝集反應(yīng)、膠乳比濁法、紅血球凝集反應(yīng)、顆粒凝集反應(yīng)或者蛋白 質(zhì)印跡法。在將本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物測定方法通過酶免疫測定法、熒光免疫測定法、放射免疫測定法或者發(fā)光免疫測定法等使用標(biāo)記的免疫測定法來實(shí)施的情況下，優(yōu)選將上述抗COTLl抗體等進(jìn)行固定化，或者將樣品中的成分固定化，從而進(jìn)行這些免疫學(xué)反應(yīng)。作為固相載體，可以使用由聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯基甲苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚甲基丙烯酸酯、膠乳、明膠、瓊脂糖、纖維素、Sepharose (瓊脂糖凝膠)、玻璃、金屬、陶瓷或者磁性體等材質(zhì)制成的珠、微板、試管、棒或者試驗(yàn)片等形狀的不溶性載體。固定化可以如下進(jìn)行按照物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法或它們的并用等公知的方法，使固相載體與上述抗COTLl抗體等或樣品成分結(jié)合。在本發(fā)明中，為了更容易地檢測上述抗COTLl抗體等與體液中的來源于胃癌細(xì)胞的本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物的反應(yīng)，可以通過標(biāo)記上述抗COTLl抗體等來直接檢測該反 應(yīng)，或者通過使用標(biāo)記二抗來間接檢測該反應(yīng)。在本發(fā)明的胃癌檢測方法中，從靈敏度的方面考慮，優(yōu)選利用后者的間接檢測(例如夾心法等)。作為標(biāo)記物質(zhì)，在酶免疫測定法的情況下，可以使用過氧化物酶(POD)、堿性磷酸酶、P -半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、乳酸脫氫酶、淀粉酶或者生物素-親和素復(fù)合體等；在熒光免疫測定法的情況下，可以使用異硫氰酸熒光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、取代異硫氰酸羅丹明、二氯三嗪基異硫氰酸酯、Alexa或AlexaFluoro等；而且在放射免疫測定法的情況下，可以使用氚、碘125或碘131等。此外發(fā)光免疫測定法可以使用NADH-、FMNH2-、螢光素酶系、魯米諾-過氧化氫-POD系、吖啶酯系或者二氧雜環(huán)丁烷化合物系等。關(guān)于標(biāo)記物質(zhì)與抗體的結(jié)合方法，在酶免疫測定法的情況下，可以使用戊二醛法、馬來酰亞胺法、二硫化吡啶法或者高碘酸法等公知的方法；在放射免疫測定法的情況下，可以使用氯胺T法、鮑爾通-亨特(Bolton-Hunter)法等公知的方法。測定的操作法可以通過公知的方法(Current protocols in Protein Sciences、1995 年、John ffiley&Sons Inc.、Current protocols in Immunology、2001 年、John ffiley&Sons Inc.)進(jìn)行。例如，在將上述抗COTLl抗體等直接標(biāo)記的情況下，可以將體液中的成分固定化，使其與標(biāo)記后的上述抗C0TL1抗體等接觸，形成本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物(C0TL1蛋白質(zhì)等)-抗C0TL1抗體等的復(fù)合體。然后清洗分離未結(jié)合的標(biāo)記抗體，通過結(jié)合標(biāo)記抗體量或未結(jié)合標(biāo)記抗體量，可以測定體液中的胃癌檢測用標(biāo)志物(C0TL1蛋白質(zhì)等)的量。
此外，例如，在使用標(biāo)記二抗的情況下，使本發(fā)明的抗體與樣品反應(yīng)(一次反應(yīng))，再與標(biāo)記二抗反應(yīng)(二次反應(yīng))。一次反應(yīng)和二次反應(yīng)可以以相反的順序進(jìn)行，也可以同時進(jìn)行，或延遲時間進(jìn)行。通過一次反應(yīng)和二次反應(yīng)，形成固定化了的本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物-抗COTLl抗體等-標(biāo)記二抗的復(fù)合體、或者固定化了的抗COTLl抗體等-本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物-標(biāo)記二抗的復(fù)合體。然后清洗分離未結(jié)合的標(biāo)記二抗，通過結(jié)合標(biāo)記二抗量或未結(jié)合標(biāo)記二抗量，可以測定樣品中的胃癌檢測用標(biāo)志物的質(zhì)量。具體地，在酶免疫測定法的情況下，使標(biāo)記酶在其最適條件下與底物反應(yīng)，通過光學(xué)方法等測定其反應(yīng)生成物的量。在熒光免疫測定法的情況下，測定標(biāo)記熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度；在放射免疫測定法的情況下，測定放射性物質(zhì)標(biāo)記產(chǎn)生的放射能量。在發(fā)光免疫測定法的情況下，測定發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的發(fā)光量。在本發(fā)明的方法中，在對于將免疫比濁法、膠乳凝集反應(yīng)、膠乳比濁法、紅血球凝集反應(yīng)或顆粒凝集反應(yīng)等的免疫復(fù)合體凝集物的生成，通過利用光學(xué)方法測定其透射光或散射光、或目測測定的測定法來實(shí)施的情況下，作為溶劑可以使用磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖 液、Tris緩沖液或者Good緩沖液等，還可以在反應(yīng)系中進(jìn)一步含有聚乙二醇等反應(yīng)促進(jìn)劑和/或非特異性的反應(yīng)抑制劑。顯示本發(fā)明的檢測法的優(yōu)選實(shí)施方式的一例。首先將本發(fā)明的抗體作為一抗固定于不溶性載體。并優(yōu)選將未吸附抗原的固相表面用與抗原無關(guān)的蛋白質(zhì)(小牛血清、牛血清白蛋白、明膠等)進(jìn)行封閉。接下來使固定化的一抗與被測樣品接觸。接著，使在與上述一抗不同的部位與本發(fā)明的胃癌檢測用標(biāo)志物反應(yīng)的標(biāo)記二抗接觸，檢測來自該標(biāo)記的信號。這里使用的“在與一抗不同的部位與胃癌檢測用標(biāo)志物反應(yīng)的二抗”只要是識別一抗與胃癌檢測用標(biāo)志物(C0TL1蛋白質(zhì)等)的結(jié)合部位以外的部位的抗體即可，不特別限制，無論免疫原的種類，可以是多克隆抗體、抗血清、單克隆抗體的任一種，還可以使用這些抗體的片段(如Fab、F(ab’)2、Fab、Fv、ScFv等)。此外作為二抗還可以使用多種單克隆抗體。此外，還可以與此相反，將本發(fā)明的抗體附加標(biāo)記作為二抗，將在與本發(fā)明的抗體不同的部位與胃癌檢測用標(biāo)志物反應(yīng)的抗體作為一抗固定于不溶性載體，使該固定化的一抗與被測樣品接觸，接著與作為二抗的帶標(biāo)記的本發(fā)明的抗體接觸，檢測來自上述標(biāo)記的信號。此外因?yàn)楸景l(fā)明的抗體如上所述與來源于胃癌細(xì)胞的胃癌檢測用標(biāo)志物特異性地反應(yīng)，所以可以作為癌的檢測藥使用。本發(fā)明的檢測藥含有本發(fā)明的抗體，因此可以使用本發(fā)明的檢測藥，通過檢測從可能罹患胃癌的個體中采取的樣品中所含的來源于胃癌細(xì)胞的胃癌檢測用標(biāo)志物，來檢測該個體的胃癌罹患。另外，本發(fā)明的檢測藥，雖然只要是用于進(jìn)行免疫學(xué)測定的方法就在任一方法中都可以利用，但通過與本技術(shù)領(lǐng)域公知的免疫層析用試紙條等簡便的方法組合使用，可以進(jìn)一步簡便且迅速地檢測癌。免疫層析用試紙條例如由包含容易吸收樣品的材料的樣品接受部、含有本發(fā)明的檢測藥的試劑部、進(jìn)行樣品與檢測藥的反應(yīng)生成物的移動的展開部、使展開的反應(yīng)生產(chǎn)物顯色的標(biāo)記部、進(jìn)行顯色的反應(yīng)生產(chǎn)物的展開的提示部等構(gòu)成，可以制成與妊娠診斷藥相同的形態(tài)。首先，在樣品接收部加入樣品后，樣品接收部吸收樣品而使樣品到達(dá)試劑部。接著，在試劑部，樣品中的來源于胃癌細(xì)胞的胃癌檢測用標(biāo)志物與抗COTLl抗體等的反應(yīng)發(fā)生，反應(yīng)生成的復(fù)合體移動通過展開部而到達(dá)標(biāo)記部。在標(biāo)記部，上述的反應(yīng)復(fù)合體與標(biāo)記二抗的反應(yīng)發(fā)生,與該標(biāo)記二抗的反應(yīng)生成物展開抵達(dá)提示部,則顯色被確認(rèn)。上述免疫層析用試紙條因?yàn)橥耆粫Ыo使用者痛苦和/或試劑使用產(chǎn)生的危險性，所以可以在家庭中的監(jiān)測中使用，將其結(jié)果在各醫(yī)療機(jī)構(gòu)水平上精查和/或治療(外科手術(shù)切除等)，從而可以預(yù)防轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)。而且現(xiàn)在該試紙條可以通過例如日本特開平10-54830號公報所記載的那樣的制造方法來廉價地大量生產(chǎn)。此外通過將本發(fā)明的檢測藥與已知的對胃癌的腫瘤標(biāo)志物的檢測藥組合使用，可以實(shí)現(xiàn)可靠性高的診斷。2-2.罹患確定工序“罹患確定工序”是基于上述胃癌檢測用標(biāo)志物測定工序中測定的蛋白質(zhì)的質(zhì)量來確定胃癌的罹患的工序。基于測定的胃癌檢測用標(biāo)志物、即COTLl蛋白質(zhì)等的質(zhì)量來確定胃癌的罹患。作為確定方法的一例，可列舉例如，在被測體的胃癌檢測用標(biāo)志物的量和健常體的該量相比在統(tǒng)計學(xué)上有意義的多時，確定為罹患胃癌的方法。 這里所指的“健常體”至少是指未罹患胃癌的個體，優(yōu)選為健康的個體。并且健常體要和被測體為同一生物種。例如，在供檢查的被測體為人(被測人)的情況下，健常體也必須為人(在本說明書中以下稱為“健常人”)。健常體的身體條件優(yōu)選與被測體相同或近似。身體條件例如，在人的情況下，對應(yīng)于種族、性別、年齡、身高、體重等?！敖y(tǒng)計學(xué)上有意義的”，可列舉例如，所得的值的危險率(有意義水準(zhǔn))小于5%、1%或者0. 1%的情況。因此“統(tǒng)計學(xué)上有意義的多”是指在將從被測體和健常體分別獲得的胃癌檢測用標(biāo)志物的量的差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理時，兩者之間存在有意義的差異，并且被測體的上述蛋白質(zhì)的量要高于健常體的該量。通常，關(guān)于體液中的胃癌檢測用標(biāo)志物的量，被測體多達(dá)健常體的2倍以上，優(yōu)選為3倍以上，更優(yōu)選為4倍以上，最優(yōu)選為以5倍以上。如果量的差異為3倍以上，則可以說信賴度高，統(tǒng)計學(xué)上也有意義的多。統(tǒng)計學(xué)的處理的檢驗(yàn)方法只要適宜使用能夠判斷有意義性的有無的公知的檢驗(yàn)方法即可，不特別限定。例如，可以使用學(xué)生t檢驗(yàn)法、多重比較檢驗(yàn)法等方法。健常體的體液中的胃癌檢測用標(biāo)志物的量，優(yōu)選使用與在上述工序中已經(jīng)說明的被測體的體液中的胃癌檢測用標(biāo)志物的量的測定方法同樣的方法來測定。健常體的體液中的胃癌檢測用標(biāo)志物的量還可以在每逢測定被測體的體液中的胃癌檢測用標(biāo)志物的量時測定，但也可以利用事先測定好的胃癌檢測用標(biāo)志物的量。特別是如果事先測定好各種身體條件的健常體的胃癌檢測用標(biāo)志物的量，并將其數(shù)值輸入電腦而數(shù)據(jù)庫化，則通過在該電腦中輸入被測體的身體條件，就可以馬上利用具有與該被測體相比較最適合的身體條件的健常體的胃癌檢測用標(biāo)志物的量，因此是方便的。被測體的體液中的胃癌檢測用標(biāo)志物的量與健常體的體液中的胃癌測出用標(biāo)志物的量相比在統(tǒng)計學(xué)上有意義的多的情況下，判定該被測體罹患胃癌。對成為本發(fā)明的對象的胃癌的病期并沒有特別的限制，遍及早期胃癌到晚期胃癌。特別在即使是早期胃癌也能夠?qū)崿F(xiàn)其檢測這一點(diǎn)，有本發(fā)明的實(shí)際效益?！霸缙谖赴笔侵妇窒抻谀[瘤發(fā)生的局部(粘膜內(nèi))，未向周圍組織浸潤的胃癌，或者即使有浸潤其范圍也局限于局部的胃癌。早期胃癌包含病期分類的0期和I期，胃癌的早期檢測顯著提高5年生存率。這樣，根據(jù)本發(fā)明的胃癌檢測方法，包括使用抗體免疫學(xué)測定體液樣品中的胃癌檢測用標(biāo)志物的工序。通過本發(fā)明的方法，不僅可以判定被測體是否罹患胃癌，還可以識別胃癌患者和非胃癌患者。
3.胃癌檢測用試劑盒本發(fā)明的第三方式是胃癌檢測用試劑盒“胃癌檢測用試劑盒”是指為了檢測胃癌罹患的有無、罹患的程度或改善的有無和/或改善的程度，以及為了篩選對預(yù)防、改善或者治療胃癌有用的候選物質(zhì)，而直接或間接地被利用的試劑盒。本方式的試劑盒，作為其構(gòu)成物，包含能夠特異性識別并結(jié)合以下蛋白質(zhì)的物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是在與胃癌的罹患有關(guān)的體液樣品中、特別是血液、血清、血漿中表達(dá)變動的COTLl蛋白質(zhì)，優(yōu)選為具有序列號I所示的氨基酸序列或者其突變體序列的蛋白質(zhì)。具體地說，包括例如抗COTLl蛋白質(zhì)抗體等或其片段、或者它們的化學(xué)修飾衍生物。這些抗體可以與固相載體結(jié)合。此外，還可以包含例如，標(biāo)記二抗、以及為檢測標(biāo)記所需的底物、載體、清洗緩沖液、樣品稀釋液、酶底物、反應(yīng)停止液、純化的作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的COTLl蛋白質(zhì)等、使用 說明書等。實(shí)施例以下通過實(shí)施例來更具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明不受該實(shí)施例限制。<參考例>(I)中空絲過濾器的制作將膜表面具有截留分子量約5萬的孔徑的聚砜中空絲100根捆成束，在不使中空絲中空部堵塞的前提下將兩末端用環(huán)氧樹脂系封裝劑固定在玻璃管上，制成微型模塊。該微型模塊(模塊A)可用于去除血清或血漿中的高分子量蛋白質(zhì)，其直徑約7mm，長度約為17cm。同樣地使用截留分子量約3千的孔徑的膜制成用于濃縮低分子量蛋白質(zhì)的微型模塊(模塊B)。微型模塊在一側(cè)具有與中空絲內(nèi)腔連接的入口，另一側(cè)的端成為出口。中空絲入口和出口是通過硅管形成的封閉循環(huán)系流路，液體受蠕動泵的驅(qū)動而在該流路內(nèi)循環(huán)。另夕卜，中空絲外套的玻璃管具備使從中空絲濾出的液體排出的端口，這就構(gòu)成了一個模塊組件。在循環(huán)回路的中途介由T字的連接器連接模塊，將3根模塊A和I根模塊B串聯(lián)連接制成一個中空絲過濾器。將該中空絲過濾器用蒸餾水清洗，填充PBS (含0. 15mM NaCl的磷酸緩沖液，PH值7. 4)水溶液。分級原液的血清或血漿從該中空絲過濾器的流路入口被注入，分級、濃縮之后由流路出口被排出。注入該中空絲過濾器中的血清或血漿在每個模塊A中與分子量約5萬的分子篩作用，分子量低于5萬的低分子的成分被模塊B濃縮、調(diào)制。<實(shí)施例I >(I)健常人及胃癌患者血中的蛋白質(zhì)檢定調(diào)制從50多歲 70多歲的胃癌患者6名獲得的血清的混合液、以及從同齡的健常人6名獲得的血清的混合液。將各混合液通過孔徑0. 22 y m的過濾器過濾除去雜質(zhì)，調(diào)制成蛋白質(zhì)濃度50mg/mL。將該血漿再用25mM碳酸氫銨溶液(pH值8. 0)稀釋成12. 5mg/mL，使用參考例(I)所示的中空絲過濾器根據(jù)分子量進(jìn)行分級。將分級后的血清樣本(總量1.8mL、最多含有250iig的蛋白質(zhì))凍結(jié)干燥之后，使用100 y L的25mM碳酸氫銨溶液溶液(pH值8.0)再次溶解。對于該樣本，用總蛋白質(zhì)量的1/50量的胰蛋白酶，在37°C、2 3小時的條件下進(jìn)行肽消化，使用脫鹽柱(Waters公司)進(jìn)行脫鹽處理后，再使用離子交換柱(KYA今” D —文)8分級。將各個級分使用反向柱(KYA ”)D—文、進(jìn)一步分級，對于溶出的肽，使用在線連接的質(zhì)量分析儀Q-TOF Ultima (Micromass公司)，以使用Survey Scan模式進(jìn)行3次測定。作為血液蛋白質(zhì)的鑒定基準(zhǔn)，使用如下兩個基準(zhǔn)，在能夠極力排除錯誤的蛋白質(zhì)鑒定的條件下進(jìn)行分析，所述基準(zhǔn)為(i)在屬于該蛋白質(zhì)的肽中，至少一條以上以P值
0.05以下的高可靠性被檢出；(ii)肽的MS數(shù)據(jù)的測定值和MS/MS數(shù)據(jù)的測定值、與肽的理論值之間的誤差為0. 3道爾頓以下。將數(shù)據(jù)在健常人和癌患者之間進(jìn)行比較，在被鑒定的蛋白質(zhì)中，作為3次的胃癌患者的樣本測定的MASCOT得分的平均值與健常人樣本測定MASCOT得分的平均值相比有意義的聞的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了 COTLl蛋白質(zhì)(表I)。表I [Wt Hit fm- 健常胃癌 Pfl胃癌
__(第I次)(第2次)(第3次)(平均)(第I次}(第2次)(第3次)(平均)
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得分000 0 131 130 114 125(2)通過蛋白印跡法檢測血液中的COTLl蛋白質(zhì)從胃癌患者16名(I期7名、III期5名、IV期4名)以及健常對照12名獲得血漿樣本。向IOOiI L各樣本中加入IOOiiL的Affi-Gel藍(lán)膠(Bio-Rad)和50 y L的ProteinA-Sepharose (GE Healthcare),在4°C下反應(yīng)一夜,去除了樣本中的白蛋白和免疫球蛋白。將這樣得到的樣本使用SDS上樣緩沖液(50mM Tris鹽酸、pH值6. 8、ImM DTT,5%SDS、10%甘油)進(jìn)行可溶化和沸騰處理，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠(16% )電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使其與兔多克隆抗體(Proteintech Group公司)以及過氧化物酶標(biāo)記二抗反應(yīng)°使用 SuperSignal West Femto MaximumSensitivitySubstrate (Pierce 公司)使X射線膜感光從而將免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)可視化,使用Scion Image (Scion Corporation)通過圖像分析將相當(dāng)于COTLl的條帶的信號強(qiáng)度數(shù)值化。其結(jié)果是，在早期和進(jìn)展期胃癌患者中，檢測到了高于健常對照人的值的血漿中C0TL1蛋白質(zhì)濃度(圖I)。<比較例1>(I)與胃癌檢測中的CEA和CA-19的性能比較。作為比較對象的腫瘤標(biāo)志物，選擇CEA和CA-19。CEA (癌胚抗原)是在臨床上最廣泛且頻繁地被利用的腫瘤標(biāo)志物的一種，除胃癌之外，在肺癌、乳腺癌、膽道癌、胰腺癌、大腸癌等的檢測中使用。另一方面，CA19-9已知主要在胃癌、大腸癌和胰腺癌、膽囊及膽管癌的進(jìn)展例中顯示高的陽性率。然而，兩種標(biāo)志物均靈敏度低，不適合早期癌的檢測。使用CagAg CEA EIA試劑盒(富士 > e才社)測定胃癌患者血漿和健常對照中的CEA水平(圖2A)。CEA僅在IV期顯示高值，不能檢測出早期胃癌。使用CagAg CA19-9EIA試劑盒(富士 >匕' 才社)測定CA 19-9水平(圖2B)。雖然存在CA19-9在III期和VI期中顯示特別高值的樣本，但不能檢測出早期胃癌。由從以上的結(jié)果證明，本發(fā)明在早期胃癌檢測上是極為優(yōu)異的方法。產(chǎn)業(yè)可利用性本發(fā)明由于能通過簡易且廉價的方法有效地檢測胃癌，因而可以實(shí)現(xiàn)胃癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療。此外，通過本發(fā)明的方法，能夠使用患者血液非侵襲性地檢測胃癌，因而可以簡便且迅速地檢測胃癌。 本說明書中引用的全部發(fā)行物、專利和專利申請均作為參考而引入本說明書中。
權(quán)利要求
1.一種胃癌檢測方法，其中，體外測定來源于被測體的體液中存在的胃癌檢測用標(biāo)志物的量，并基于該量來確定胃癌的罹患，所述胃癌檢測用標(biāo)志物包含C O T LI蛋白質(zhì)、該COTLl蛋白質(zhì)的突變體和/或它們的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，上述COTLl蛋白質(zhì)為序列號I所示的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，在被測體的上述胃癌檢測用標(biāo)志物的量和健常體的該量相比統(tǒng)計學(xué)上有意義的多時，確定為罹患胃癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，上述統(tǒng)計學(xué)上有意義的多的量是健常體的2倍以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4的任一項所述的方法，其中，上述測定使用能和上述胃癌檢測用標(biāo)志物特異性結(jié)合的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，上述能和胃癌檢測用標(biāo)志物特異性結(jié)合的物質(zhì)為抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體和/或它們的片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6的任一項所述的方法，其中，上述胃癌為早期胃癌。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7的任一項所述的方法，其中，上述體液樣品為血液或尿。
9.一種胃癌檢測用試劑盒，其包含抗COTLl抗體、抗COTLl突變體抗體、它們的片段和/或它們的化學(xué)修飾衍生物。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供對被測人的侵襲性低、且檢測靈敏度和準(zhǔn)確度高的胃癌檢測方法。本發(fā)明提供體外測定來源于被測人的體液樣品中的COTL1蛋白質(zhì)、該COTL1蛋白質(zhì)的突變體和/或它們的片段，并基于其量來檢測胃癌罹患的有無的檢測方法，并且提供包含能夠與該蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體的胃癌診斷用試劑盒。
文檔編號G01N33/574GK102782500SQ20118001205
公開日2012年11月14日 申請日期2011年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者岡部寬, 坂井義治, 小林道元, 田中祥德, 鄭基晚, 金森智子 申請人:東麗株式會社, 國立大學(xué)法人京都大學(xué)