胃癌的生物標志物dact1的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了通過檢測DACT1基因的抑制表達來診斷個體的胃癌和確定個體的胃癌預后的方法，在某些情況下，所述DACT1基因的抑制表達是由于該基因的基因組序列中的甲基化水平提高。還提供了用于所述方法的試劑盒和裝置。此外，本發(fā)明提供了通過提高DACT1基因表達或活性來治療胃癌的方法。
【專利說明】胃癌的生物標志物DACT1
[0001]發(fā)明背景
[0002]胃癌(gastric cancer)，也稱為胃癌(stomach cancer)，是世界范圍內(nèi)第四常見的癌癥，每年診斷出約1，000，000個病例。胃癌是一種具有高死亡率的疾病(每年約有800，000人死亡)，這使得它成為僅次于肺癌的世界范圍內(nèi)癌癥死亡的第二常見的原因。在男性中和在發(fā)展中國家(包括很多亞洲國家)中胃癌的發(fā)病率明顯更高。
[0003]在胃癌早期，通常沒有臨床癥狀或僅表現(xiàn)出不明確的癥狀，因而很多病例在疾病到達晚期之前無法作出診斷。這通常導致較差的預后:在診斷為胃癌的個體的80-90%中發(fā)生轉(zhuǎn)移，早期診斷出的個體中的65%具有6個月的存活率，而晚期診斷出的個體中僅有少于15%具有6個月的存活率。
[0004]由于胃癌的普遍性及其對患者預期壽命的嚴重影響，因此需要診斷、監(jiān)測和治療胃癌的新方法。本發(fā)明滿足該需求和其它相關(guān)的需求。
[0005]發(fā)明概述
[0006]第一方面，本發(fā)明提供了檢測個體胃癌的方法。所述方法包括以下步驟:(a)測量取自所述個體的樣品中DACTl的表達水平；以及(b)將在步驟(a)中所獲得的表達水平與標準對照進行比較。與標準對照比較時，檢測到DACTl表達水平的下降指示個體可能患有胃癌。通常，本方法中所用的樣品是胃粘膜樣品，例如包括胃上皮細胞的胃粘膜樣品。
[0007]在一些實施方案中，DACTl的表達水平是DACTl蛋白水平。在其它實施方案中，DACTl的表達水平是DACTl mRNA水平。當測量DACTl蛋白水平時，步驟(a)可以包括利用能特異性結(jié)合DACTl蛋白的抗體進行免疫測定。例如可以使用Western印跡分析。在其它情況下，步驟(a)可以包括質(zhì)譜測量或基于雜交的測定，例如與微陣列、熒光探針或分子信標的雜交。
[0008]當測量DACTl mRNA水平時，某些情況下，步驟(a)可以包括擴增反應，如聚合酶鏈式反應(PCR)，尤其是逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)。在其它情況下，檢測步驟可以包括多核苷酸雜交測定，例如Southern印跡分析或Northern印跡分析或原位雜交測定。例如，在多核苷酸雜交測定中可以使用多核苷酸探針，使其與SEQ ID N0:l、4或6或以上的互補物雜交。在一些情況下，多核苷酸探針可以包括可檢測的部分。
[0009]在一些實施方案中，當進行完第一輪上述方法步驟之后指示所述患者患有胃癌時，所述方法還可以包括在一段時間之后利用來自所述個體的相同類型的樣品重復步驟(a)。與最初的步驟(a)的DACTl的表達水平的量相比，在所述一段時間之后DACTl表達水平的增加，指示胃癌的改善，而降低則指示胃癌的惡化。
[0010]在第二方面，本發(fā)明提供了檢測個體胃癌的方法。所述方法包括以下步驟:(a)用能差異修飾甲基化DNA和非甲基化DNA的試劑處理取自所述個體的樣品；以及(b)確定含CpG的基因組序列中的每一個CpG是甲基化的還是非甲基化的，所述含CpG的基因組序列是SEQ ID N0:1或6的至少一個區(qū)段并且包含至少一個CpG。當在含CpG的基因組序列中檢測到存在一個甲基化的CpG時，這指示所述個體可能患有胃癌。
[0011]在一些實施方案中，含CpG的基因組序列含有兩個或更多個CpG，并且當所有CpG中的至少50%為甲基化的時，指示個體患有胃癌。在一些情況下，含CpG的基因組序列是SEQ ID NO:1或6的至少15、20、50或更多個連續(xù)核苷酸的區(qū)段。在其它情況下，含CpG的基因組序列是SEQID NO:1或6。在請求保護的方法的一個實施方案中，含CpG的基因組序列是SEQ ID NO:6，并且當含CpG的基因組序列中所有CpG的至少5個為甲基化的時，指示個體很可能患有胃癌。[0012]在一些實例中，請求保護的方法中使用的樣品是胃粘膜樣品。在其它實例中，當進行完第一輪所述方法之后指示個體患有胃癌時，所述方法還包括在一段時間之后利用來自所述個體的相同類型的樣品重復步驟(a)和(b)。與最初的步驟(b)中確定的甲基化CpG的數(shù)量相比，在一段時間之后檢測到的甲基化CpG數(shù)量的增加，指示胃癌的惡化，而減少則指示胃癌的改善。
[0013]在一些實施方案中，請求保護的方法中使用的能差異修飾甲基化DNA和非甲基化DNA的試劑是優(yōu)先切割甲基化DNA的酶、優(yōu)先切割非甲基化DNA的酶或亞硫酸氫鹽。在其它實施方案中，所述方法的步驟(b)包括擴增反應；或步驟(b)可以包括對DNA分子進行測序。
[0014]在第三方面，本發(fā)明提供了用于檢測個體胃癌的試劑盒，所述試劑盒含有(I)提供DACTl蛋白或DACTl mRNA的平均量的標準對照；以及(2)能特異且定量鑒定DACTl蛋白或DACTl mRNA的試劑。在一些情況下，試劑可以是特異性結(jié)合DACTl蛋白的抗體；或者試劑可以是能與DACTl mRNA雜交的多核苷酸探針。例如，多核苷酸探針具有SEQ IDN0:1、4或6或以上的互補物所示的核苷酸序列。試劑可以包括可檢測的部分。在其它情況下，所述試劑盒還可以包含用于在擴增反應中特異性擴增SEQ ID N0:2或3或其互補物的至少一個區(qū)段的兩個寡核苷酸引物。通常，所述試劑盒還可以包括操作手冊。
[0015]在第四方面，本發(fā)明提供了抑制胃癌細胞生長的方法。請求保護的方法包括以下步驟:將胃癌細胞與有效量的⑴包含SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列的多肽，或⑵包含編碼SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的核酸接觸。在一些實施方案中，所述核酸是包含與編碼SEQ ID NO:5的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子的表達盒。多種啟動子可以用于所述方法中，例如，啟動子可以是上皮細胞特異性啟動子。在其它實施方案中，所述核酸包含SEQ ID N0:2或3所示的多核苷酸序列。在其它實施方案中，胃癌細胞位于患者體內(nèi)。
[0016]在第五方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其具有與SEQ ID N0:l、2、3、4或6或以上的互補物的約20-100個連續(xù)核苷酸的區(qū)段至少95% —致的核苷酸序列。在一些實施方案中，核酸具有與SEQ ID NO: 1、2、3、4或6或以上的互補物的約20-100個連續(xù)核苷酸的區(qū)段一致的核苷酸序列。在其它實施方案中，所述核酸與可檢測的部分綴合。
[0017]此外，本發(fā)明提供了檢測胃癌的試劑盒。所述試劑盒包含:⑴能差異修飾甲基化DNA和非甲基化DNA的試劑，以及(2)指示物，在用所述試劑處理來自進行胃癌檢測的個體的樣品之后，所述指示物能確定含CpG的基因組序列中的每一個CpG是甲基化的還是非甲基化的。含CpG的基因組序列是SEQ ID NO:1或6的至少一個區(qū)段且包含至少一個CpG。本發(fā)明還提供了用于抑制胃癌細胞生長的組合物。所述組合物含有有效量的(I)包含SEQID NO:5所示的氨基酸序列的多肽(例如，由SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列組成的多肽)或(2)包含編碼SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的核酸或由編碼SEQ ID N0:5的多核苷酸序列組成的核酸(例如，包含SEQ ID N0:2或3的多核苷酸序列的核酸序列)以及藥學可接受的載體。因此，本發(fā)明還提供了包含SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列的多肽(例如，由SEQ ID NO:5的氨基酸序列組成的多肽)或包含編碼SEQID NO:2或3的多核苷酸序列的核酸(例如，包含SEQ ID N0:2或3的多核苷酸序列的核酸序列或由SEQ ID N0:2或3的多核苷酸序列組成的核酸序列)在制備用于抑制胃癌細胞生長的藥物中的用途。此外，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO: 1、2、3、4或6的區(qū)段或以上的互補物的區(qū)段的多核苷酸序列或者由SEQ ID NO: 1、2、3、4或6的區(qū)段或以上的互補物的區(qū)段組成的多核苷酸序列在制備用于檢測胃癌的試劑盒中的用途。所述區(qū)段通常為SEQ ID N0:l、2、3、4或6或其互補物的約20-100個連續(xù)核苷酸。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1顯示了在一個實施方案中的正常組織和胃細胞系中的DACTlmRNA表達。
[0019]圖2顯示了在一個實施方案的胃癌細胞系中的DACTl啟動子的亞硫酸氫鹽基因組測序結(jié)果(SEQ ID N0S: 15-18)。
[0020]圖3顯示了在一個實施方案中去甲基化試劑對DACTl表達的影響。
[0021]圖4顯示了在一個實施方案的集落形成測定中DACTl a表達對轉(zhuǎn)染的細胞的影響。
[0022]圖5顯示了在一個實施方案的細胞生長曲線中DACTl a表達對轉(zhuǎn)染的細胞的影響。
[0023]圖6顯示了在一個實施方案中DACTl a對細胞鋪展、F-肌動蛋白形成、細胞遷移和侵襲能力的抑制性影響。
[0024]圖7顯示了在一個實施方案的裸鼠中DACTl a表達的生長抑制效應。
[0025]圖8顯示了在一個實施方案中原發(fā)胃癌和正常胃組織樣品中DACTl的甲基化狀態(tài)(SEQ ID N0S16和18)及胃癌存活患者的Kaplan-Meier分析。
[0026]定義
[0027]本文所用的術(shù)語“DACT1基因”或“DACT1蛋白”指任何天然存在的變體或突變體、種間同系物或直系同源物、或者人DACTI基因或DACTI蛋白的人工變體。人DACTI基因位于染色體14q23.1。人野生型DACTl基因的cDNA序列如GenBank登錄號NM_016651所示(本文作為SEQ ID NO: 3提供)，其編碼798個氨基酸的DACTl蛋白(本文作為SEQID NO: 5提供)。本申請含義內(nèi)的DACTl蛋白通常與人野生型DACTl蛋白具有至少80%或90%或95%或更高的序列一致性。
[0028]在本文中，術(shù)語“胃癌(gastric cancer)”和“胃癌(stomach cancer)”具有相同的含義，并且指胃部或胃細胞的癌癥。這類癌癥可以是發(fā)生在胃內(nèi)膜(粘膜或或胃上皮)中的腺癌，還可以發(fā)生在胃的幽門部、體部或賁門部(下部、體部和上部)。“胃癌細胞”是具有胃癌特征的胃上皮細胞，并且包括癌前細胞，所述癌前細胞處于向癌細胞轉(zhuǎn)變的早期或傾向于轉(zhuǎn)變成癌細胞。這類細胞可以表現(xiàn)出癌細胞的一種或多種表型性狀特征。
[0029]在本文中，術(shù)語“或(者)”通常的含義包括“和/或”，除非文中內(nèi)容明確表明并非如此。[0030]本文所用的術(shù)語“基因表達”用于指DNA轉(zhuǎn)錄形成編碼特定蛋白(例如，人DACTl蛋白)的RNA分子，或指由多核苷酸序列所編碼的蛋白的翻譯。換句話而言，本文中的術(shù)語“基因表達”包括由目的基因(例如，人DACTl基因)所編碼的mRNA水平和蛋白水平兩者。
[0031]在本文中，術(shù)語“生物樣品”或“樣品”包括諸如活檢和尸檢樣品的組織切片、以及采集用于組織學目的的冷凍切片、或所述任何這些樣品的處理后形式。生物樣品包括血液或血液成分或產(chǎn)物(例如，血清、血衆(zhòng)、血小板、紅細胞等)、痰或唾液、淋巴組織和舌組織、培養(yǎng)的細胞(例如，原代培養(yǎng)物、外植組織和轉(zhuǎn)化的細胞)、糞便、尿液、胃活檢組織等。生物樣品通常獲自真核生物，所述真核生物可以是哺乳動物、可以是靈長類動物，并可以是人類個體。
[0032]在本文中，術(shù)語“活檢”是指移除用于診斷或預后評估的組織樣品的過程以及指組織樣本本身。本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何活檢技術(shù)都可以應用于本發(fā)明的診斷和預后方法。所應用的活檢技術(shù)將取決于待評估的組織類型(例如，舌、結(jié)腸、前列腺、腎、膀胱、淋巴結(jié)、肝、骨髓、血細胞、胃組織等)以及其它因素。代表性的活檢技術(shù)包括但不限于，切除活檢、切口活檢、穿刺活檢、手術(shù)活檢和骨髓活檢，并且可以包括結(jié)腸鏡檢查。本領(lǐng)域技術(shù)人員對于多種活檢技術(shù)是公知的，并能用最少的試驗在它們之間作出選擇并實施它們。
[0033]在本文中，術(shù)語“分尚的”核酸分子表不從通常與所述分尚的核酸分子相聯(lián)的其它核酸分子分開的核酸分子。因此，“分離的”核酸分子包括但不限于，不含分離的核酸所來源的生物基因組中天然存在于所述核酸的一端或兩端的核苷酸序列的核酸分子(例如，通過PCR或限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)。通常將這種分離的核酸分子引入載體(例如，克隆載體或表達載體)，以方便操控或用于產(chǎn)生融合的核酸分子。此外，分離的核酸分子可以包括改造的核酸分子，例如重組的或合成的核酸分子。例如，在核酸文庫(例如，cDNA或基因組文庫)或含有限制性消化的基因組DNA的凝膠(例如，瓊脂糖或聚丙烯酰胺)中的數(shù)百至數(shù)百萬其它核酸分子內(nèi)存在的核酸分子不是“分離的”核酸。 [0034]術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特別限定，所述術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有與參照核酸相似的結(jié)合特性且以與天然存在的核苷酸相似的方式進行代謝。除非另外指出，具體的核酸序列還隱含地包括其保守型修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)、等位基因、直系同源物、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和互補序列，以及明確指明的序列。具體地，可以通過產(chǎn)生一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基所取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer et al., NucleicAcid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985);以及Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。術(shù)語核酸與基因、cDNA 以及基因編碼的mRNA可交換使用。
[0035]術(shù)語“基因”表示參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA區(qū)段，其包含編碼區(qū)前后的參與基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄/翻譯和轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控的區(qū)域(前導區(qū)和尾區(qū))，以及單獨的編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
[0036]在本申請中，術(shù)語“多肽”、“肽”以及“蛋白”在本文可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是對應天然存在的氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的這些術(shù)語包括任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。[0037]術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸以及以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸以及隨后經(jīng)修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。為了本申請的目的，氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學結(jié)構(gòu)的化合物，即，與氫、羧基、氨基和R基相連的碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這些類似物具有修飾的R基(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)。為了本申請的目的，氨基酸模擬物是指這樣的化合物，所述化合物具有與氨基酸的通常化學結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但是以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能。
[0038]氨基酸可以包括具有非天然存在的D-手性的氨基酸(如WO 01/12654中所公開的)，這可以提高包含一個或多個這種D-氨基酸的多肽的穩(wěn)定性(例如，半衰期)、生物利用度和其它特性。在一些情況下，治療性多肽的一個或多個氨基酸具有D-手性，并可能全部氨基酸都具有D-手性。 [0039]在本文中，可以通過公知的三字母符號或通過IUPAC-1UB生物化學命名委員會推薦的單字母符號來提及氨基酸。同樣，可以通過核苷酸的公認的單字母代碼來提及核苷酸。
[0040]當描述兩個或更多個多核苷酸或氨基酸序列時，本文所用的術(shù)語“一致的”或“一致性”百分比是指:當利用下述序列比較算法之一或通過人工比對和肉眼檢查進行測定，在比較窗或指定區(qū)域為最大對應性進行比較和比對時，得出的相同的兩個或更多個序列或子序列，或具有指定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸的兩個或更多個序列或子序列(例如，本發(fā)明方法中所用的變體DACTl蛋白(例如，用于治療胃癌)與參照序列(例如野生型人DACTl蛋白)具有至少80%的序列一致性，優(yōu)選85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性)。這樣的序列被稱為“基本上一致的”。關(guān)于多核苷酸序列，該定義還指測試序列的互補物。優(yōu)選地，一致性存在于長度為至少約50個氨基酸或核苷酸的區(qū)域，或更優(yōu)選地，存在于長度為75-100個氨基酸或核苷酸的區(qū)域。
[0041]為了序列比較，通常將一條序列作為與測試序列進行比較的參照序列。當使用序列比較算法時，將測試和參照序列輸入計算機，如果需要的話，指定子序列坐標，然后指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J程序參數(shù)，或者可以指定可選的參數(shù)。然后基于程序參數(shù)，序列比較算法計算出測試序列相對于參照序列的序列一致性百分比。對于核酸和蛋白的序列比較，使用下文論述的BLAST和BLAST 2.0算法和默認參數(shù)。
[0042]本文使用的“比較窗”包括具有選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150個連續(xù)位置數(shù)中任一連續(xù)位置數(shù)的區(qū)段，其中在某一序列與具有相同連續(xù)位置數(shù)的參照序列進行最優(yōu)比對后，可以將這兩條序列進行比較。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的?？梢酝ㄟ^下述來進行用于比較的序列最優(yōu)比對:例如Smith&ffaterman, Adv.App1.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman&ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源性比對算法、Pearson&Lipman, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA85:2444(1988)的相似性檢索方法，這些算法可以通過計算機實施(威斯康辛遺傳學軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，遺傳學計算機集團(Genetics Computer Group), 575 Science Dr.，Madison, WI)、或者通過人工比對和肉眼檢查(參見，例如 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel etal.，eds.1995 補充))。
[0043]適于確定序列一致性百分比和序列相似性的算法的實例是BLAST和BLAST 2.0算法，這兩種算法分別在 Altschul et al.，(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 和 Altschul etal.(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述。通過國家生物技術(shù)信息中心(theNational Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站 ncb1.nlm.nih.gov 可公開獲得用于運行BLAST分析的軟件。該算法首先涉及通過鑒定詢問序列中長度為W的短字符來鑒定高評分序列對(HSP)，當詢問序列中長度為W的短字符與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字符比對時，其能匹配或符合某正值的閾值評分T。T被稱為相鄰字符評分閾值(Altschul etal.,同上)。這些初始的相鄰字符命中作為啟動檢索的基礎(chǔ)，用于發(fā)現(xiàn)含有它們的更長的HSP。然后，在可以增加累加比對評分的前提下，將字符命中在兩個方向沿每一序列延伸。對于核苷酸序列，可以利用參數(shù)M(匹配殘基對的獎勵評分；一直大于0)以及N(錯配殘基的懲罰評分；一直小于0)來計算累加評分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累加評分。當出現(xiàn)以下情況時停止每一方向的字符命中延伸:累加比對評分從其最大實現(xiàn)值下降X量時；由于一個或多個負評分殘基比對的累積而使累加評分達到零或零以下時；或者到達任一序列的末端時。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字長(W)為28、期望值(E)為10、M=l、N=-2和雙鏈比較作為默認參數(shù)。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長(W)為3、期望值(E)為10和BL0SUM62評分矩陣作為默認參數(shù)(參見，Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915 (1989))。
[0044]BLAST算法還執(zhí)行兩條序列間的相似性的統(tǒng)計分析(參見，例如，Karlin andAltschul, Proc.Nat，1.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787 (1993))。BLAST 算法提供的相似性的一項測定結(jié)果是最小和概率(P(N))，其提供了兩條核苷酸或氨基酸序列間偶然發(fā)生匹配的概率指示。例如，如果在測試核酸與參照核酸比較中，最小和概率小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，以及最優(yōu)選小于約0.001時，則認為所述測試核酸與參照序列是相似的。
[0045]如下文所述，兩條核酸序列或多肽基本一致的指示是由第一核酸編碼的多肽與針對第二核酸所編碼的多肽產(chǎn) 生的抗體發(fā)生免疫交叉反應。因此，例如，如果一條多肽與另一多肽的差異僅在于保守型取代，那么兩條肽通常是基本一致的。如下文所述，兩條核酸序列基本一致的另一指示是兩個分子或其互補物能在嚴緊條件下彼此雜交。兩條核酸序列基本一致的另一指示是可以使用相同的引物來擴增所述序列。
[0046]在本文中，術(shù)語“嚴緊的雜交條件”和“高嚴緊性”是指探針與其靶標子序列(通常處于復雜的核酸混合物中)雜交而不與其它序列雜交的條件。嚴緊的條件是序列依賴性的，并且在不同情況下會不同。較長的序列在較高的溫度下特異性地雜交。核酸雜交的廣泛指導見于 Ti jssen, Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes (生物化學和分子生物學技術(shù)-核酸探針的雜交)，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid assays (雜交原理和核酸測定策略的概述)〃(1993),并且容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解。通常，將嚴緊的條件選擇為比限定的離子強度、PH下具體序列的熱熔點(Tm)低約5-10° C。Tm是平衡時與靶標互補的探針中的50%與靶序列雜交時的溫度(在限定的離子強度、PH和核酸濃度下)(由于靶序列是過量存在的，在Tm下，50%的探針在平衡時被占據(jù))。添加例如甲酰胺的去穩(wěn)定劑也可以實現(xiàn)嚴緊的條件。對于選擇性雜交或特異性雜交，陽性信號至少是背景的2倍，優(yōu)選為背景雜交的10倍。示例性的嚴緊雜交條件可以如下:50%甲酰胺，5父55(:和1%505，42。C下孵育，或5 X SSC，1%SDS，65。C下孵育，并在65。C下0.2 X SSC和0.1%SDS中洗滌。
[0047]對于在嚴緊的條件下不彼此雜交的核酸，如果它們編碼的多肽是基本上相同的，則所述核酸仍然是基本上相同的。例如，當使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時，會發(fā)生這種情況。在這些情況下，所述核酸通常在中等嚴緊的雜交條件下雜交。示例性的“中等嚴緊的雜交條件”包括:在37° C下、40%甲酰胺、IM NaCl、1%SDS的緩沖液中雜交，并在45° C下IXSSC中洗滌。陽性雜交至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地認識到，其它雜交和洗滌條件可以用于提供相似嚴緊性的條件。用于確定雜交參數(shù)的其它指導在很多參考文獻中提供，例如，Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel, et al.。
[0048]“表達盒”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有允許特定多核苷酸在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的一系列指定的核酸元件。表達盒可以是質(zhì)粒、病毒基因組或核酸片段的一部分。通常，表達盒包括與啟動子可操作地連接的待轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。在此背景下，“可操作地連接”表示將兩個或更多個遺傳元件(諸如多核苷酸編碼序列和啟動子)置于允許元件發(fā)揮合適的生物功能(諸如啟動子指導編碼序列轉(zhuǎn)錄)的相對位置。可以存在于表達盒中的其它元件包括增強轉(zhuǎn)錄(例如，增強子)和終止轉(zhuǎn)錄(例如，終止子)的元件，以及賦予表達盒所產(chǎn)生的重組蛋白某種結(jié)合親和力或抗原性的元件。
[0049]本文所用的術(shù)語“亞硫酸氫鹽”包括能夠通過化學方式將胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化成尿嘧啶(U)而不會化學修飾甲基化胞嘧啶，因而能用來基于DNA的甲基化狀態(tài)差異修飾DNA序列的所有類型的亞硫酸氫鹽，例如亞硫酸氫鈉。 [0050]本文所用的能“差異修飾”甲基化DNA或非甲基化DNA的試劑包括在一過程中能與甲基化和非甲基化DNA發(fā)生差異性反應的任何試劑，通過該過程，從甲基化和非甲基化DNA產(chǎn)生可區(qū)別的產(chǎn)物或在量上可區(qū)別的結(jié)果(例如，結(jié)合或沉淀的程度)，進而允許鑒定DNA甲基化狀態(tài)。這樣的過程可以包括但不限于，化學反應(諸如通過亞硫酸氫鹽的非甲基化C-U的轉(zhuǎn)化)、酶處理(諸如通過甲基化依賴性核酸內(nèi)切酶的切割)、結(jié)合和沉淀。因此，優(yōu)先切割甲基化DNA的酶是當DNA為甲基化的時能以明顯更高的效率切割DNA分子的酶，而優(yōu)先切割非甲基化DNA的酶則在DNA是非甲基化的時表現(xiàn)出顯著更高的效率。在本發(fā)明的背景下，“差異修飾”甲基化或非甲基化DNA的試劑還指在其與DNA序列結(jié)合中或DNA序列的沉淀中根據(jù)這些DNA序列的甲基化狀態(tài)而能表現(xiàn)出差異性能力的任何試劑。所述試劑中的一類由甲基化DNA結(jié)合蛋白組成。
[0051]本文所用的“含CpG的基因組序列”是指位于個體基因組中限定位置的DNA序列區(qū)段。通常，“含CpG的基因組序列”的長度為至少15個連續(xù)核苷酸，且含有至少一個CpG對。在一些情況下，其長度可以為至少18、20、25、30、50、80、100、150、200、250或300個連續(xù)核苷酸，且含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個0卩6對。對于給定位置處(例如，人DACTl基因組序列區(qū)域內(nèi)(諸如含有啟動子和外顯子I的區(qū)域))的任一“含CpG的基因組序列”，核苷酸序列變異可以存在于個體之間，以及甚至存在于同一個體的等位基因之間。此外，“含CpG的基因組序列”可以包括轉(zhuǎn)錄成或未轉(zhuǎn)錄成蛋白產(chǎn)物的核苷酸序列，并且核苷酸序列可以為蛋白編碼序列、非蛋白編碼序列(例如轉(zhuǎn)錄啟動子)或以上的組合。[0052]術(shù)語“免疫球蛋白”或“抗體”(本文可互換使用)是指具有由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的基本四多肽鏈結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合蛋白，所述鏈例如通過鏈間二硫鍵來穩(wěn)定，所述抗原結(jié)合蛋白具有特異地結(jié)合抗原的能力。重鏈和輕鏈都折疊成結(jié)構(gòu)域。
[0053]術(shù)語“抗體”還指可以用于免疫親和測定中的抗體的抗原結(jié)合片段和表位結(jié)合片段，例如，F(xiàn)ab片段。有很多已充分表征的抗體片段。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)的二硫鍵的C端消化抗體,從而產(chǎn)生Fab 二聚體F (ab) ’ 2，所述Fab自身是通過二硫鍵與Vh-ChI連接的輕鏈。F(ab)’2可以在溫和的條件下被還原，從而破壞鉸鏈區(qū)的二硫鍵，進而將(Fab’)2二聚體轉(zhuǎn)化為Fab’單體。Fab’單體在本質(zhì)上是具有一部分鉸鏈區(qū)的Fab (對于其它抗體片段的更詳細的描述，參見例如，F(xiàn)undamental Immunology, Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993))。盡管根據(jù)完整抗體的消化來定義不同的抗體片段，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解的是，可以通過化學方法從頭合成片段或通過利用重組DNA技術(shù)合成片段。因此，術(shù)語抗體還包括通過整個抗體的修飾所產(chǎn)生的抗體片段或利用重組DNA技術(shù)合成的抗體片段。 [0054]當在描述特定分子與蛋白或肽的結(jié)合關(guān)系的上下文中使用時，短語“特異性地結(jié)合”是指能在蛋白和其它生物制劑的混雜群體中確定蛋白的存在的結(jié)合反應。因此，在指定的結(jié)合測定條件下，指定的結(jié)合試劑(例如，抗體)與特定蛋白的結(jié)合至少為背景的二倍，并且基本上不以顯著的量與樣品中存在的其它蛋白結(jié)合。在這種條件下，抗體的特異性結(jié)合可能需要選擇對特定蛋白具有特異性的抗體，或?qū)δ骋坏鞍拙哂刑禺愋远粚υ摰鞍椎南嗨啤敖忝谩钡鞍拙哂刑禺愋缘目贵w。多種免疫測定模式可用于選擇能與特定的蛋白或以特定的形式發(fā)生特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定常被用于選擇能與蛋白發(fā)生特異性免疫反應的抗體(對于可用于確定特異性免疫反應性的免疫模式和條件的描述，參見例如，Harlow&Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988))。通常，特異性或選擇性結(jié)合反應為背景信號或噪音的至少兩倍，更通常超過背景的10至100倍。另一方面，當涉及一條多核苷酸序列與另一多核苷酸序列形成雙鏈復合物時，術(shù)語“特異性地結(jié)合”描述基于Watson-Crick堿基配對的“多核苷酸雜交”，正如在術(shù)語“多核苷酸雜交方法”的定乂中所述。
[0055]本申請中所用的“增加”或“降低”是指與比較對照在量上可檢測出的正向或負向改變，所述比較對照例如是建立的標準對照(諸如非癌性胃組織中的DACTl mRNA或蛋白的平均表達水平)。增加是通常為對照值的至少10%或至少20%或50%或100%的正向改變，并且可以高達對照值的至少2倍、至少5倍或甚至10倍。同樣，降低是通常為對照值的至少10%或至少20%、30%或50%或者甚至高達至少80%或90%的負向改變。指示與比較基準的量的改變或差異的其它術(shù)語在本申請中以上述相同的方式使用，諸如“多于”、“少于”、“高于”和“低于”。相比之下，術(shù)語“基本相同的”或“基本沒有變化的”指示與標準對照值在量上具有極小改變或沒有改變，改變通常在標準對照的土 10%以內(nèi)，或土 5%、土 2%以內(nèi)，或者甚至與標準對照相比具有更小的改變。
[0056]本文所用的“多核苷酸雜交方法”是指在合適的雜交條件下，基于預先確定的多核苷酸序列與已知序列的多核苷酸探針形成Watson-Crick堿基配對的能力，來檢測預先確定的多核苷酸序列的存在和/或量的方法。這類雜交方法的實例包括Southern印跡、Northern印跡和原位雜交。
[0057]本文所用的“引物”是指可以在擴增方法(如聚合酶鏈式反應(PCR))中使用來基于對應于目的基因(例如，人DACTl的cDNA或基因組序列或其一部分)的多核苷酸序列擴增核苷酸序列的寡核苷酸。通常，用于擴增多核苷酸序列的至少一條PCR引物對于該多核苷酸序列是序列特異性的。引物的確切長度取決于多種因素，包括溫度、引物來源和所用的方法。例如，對于診斷和預后應用，根據(jù)靶序列的復雜性，寡核苷酸引物通常含有至少10、或15、或20、或25或更多個核苷酸，但是其可以含有更少的核苷酸或更多的核苷酸。確定引物合適長度涉及的因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。具體實施方案中所用的引物如本文的表1所示，其中標明了它們的具體應用。在本文中，術(shù)語“引物對”表示與靶DNA分子的相反鏈雜交或與位于待擴增的核苷酸序列側(cè)翼的靶DNA區(qū)域雜交的引物對。在本文中，術(shù)語“引物位點”表示與引物雜交的靶DNA或其它核酸的區(qū)域。
[0058]“標記”、“可檢測的標記”或“可檢測的部分”是可通過分光光度計、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其它物理方式進行檢測的組成部分。例如，有用的標記包括32P、熒光染料、電子密度試劑、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、或可被制成可檢測的(例如，通過將放射性成分并入肽中)或用于檢測抗體與肽發(fā)生特異性反應的半抗原和蛋白。通常，將可檢測的標記與具有確定的結(jié)合特性的探針或分子(例如，具有已知結(jié)合特異性的多肽或多核苷酸)連接，以允許容易地檢測探針(以及其結(jié)合靶標)的存在。
[0059]本文所用的“標準對照”是指存在于已建立的正常無疾病組織樣品(例如，正常的胃上皮組織樣品)中的預定量或濃度的多核苷酸序列或多肽(例如，DACTl mRNA或蛋白)。標準對照值適合用于本發(fā)明的方法，用作比較測試樣品中所存在的DACTl mRNA或蛋白的量的基礎(chǔ)。用作標準對照的已建立的樣品提供了對于不患有常規(guī)定義的任何胃病尤其是胃癌的普通健康人的胃上皮組織樣品(例如，胃粘膜)中一般的DACTl mRNA或蛋白的平均量。標準對照值可以根據(jù)樣品的性質(zhì)以及其它因素而變化，所述其它因素例如建立該對照值所基于的個體的性別、年齡、種族。
[0060]當描述不患有常規(guī)定義的任何胃病(尤其是胃癌)的健康人時，術(shù)語“平均”是指能代表隨機選擇的不患有任何胃病(尤其是胃癌)的健康人群的人的胃組織(例如上皮組織或胃粘膜)中存在的某些 特性，尤其是人DACTl mRNA或DACTl蛋白的量。所選擇的人群應當包括足夠數(shù)量的人，使得這些個體的胃粘膜的DACTl mRNA或蛋白的平均量能以合理的準確性反映出健康總?cè)巳褐蠨ACTl mRNA/蛋白的對應量。此外，所選擇的人群通常與胃組織樣品被用于測試胃癌指示的個體具有相似的年齡。而且，還應考慮諸如性別、種族、病史等其它因素，并且優(yōu)選測試個體與所選的建立“平均”值的個體組之間的特征緊密匹配。
[0061]本申請中所用的術(shù)語“量(amount) ”是指樣品中存在的目的多核苷酸或目的多肽(例如，人DACTl mRNA或蛋白)的量。所述量可以以絕對方式來表示，即樣品中多核苷酸或多肽的總量，或以相對形式來表示，即樣品中多核苷酸或多肽的濃度。
[0062]本申請中所用的術(shù)語“治療(treat) ”或“治療(treating) ”描述能導致消除、減輕、緩解、逆轉(zhuǎn)或預防或延遲相關(guān)病癥的任何癥狀的發(fā)生或復發(fā)的行為。換句話說，“治療”病癥包括對該病癥的治療性干預和預防性干預。
[0063]本文所用的術(shù)語“有效量”是指在量上足以產(chǎn)生期望效應的給定物質(zhì)的量。例如，有效量的編碼DACTl mRNA的多核苷酸是能實現(xiàn)DACTl蛋白表達水平或生物活性的增加的所述多核苷酸的量，使得在為治療性目的給予多核苷酸的患者中胃癌癥狀被減輕、逆轉(zhuǎn)、消除、預防或延遲發(fā)生。足以實現(xiàn)這點的量被定義為“治療有效劑量”。劑量范圍隨所給予的治療劑的性質(zhì)以及諸如給藥途徑和患者病癥的嚴重程度等其它因素而改變。
[0064]本文所用的術(shù)語“個體”或“需要治療的個體”包括由于具有患胃癌的風險或?qū)嶋H患有胃癌而尋求醫(yī)療幫助的個體。個體還包括尋求治療方案改進的當前正進行治療的個體。需要治療的個體包括表現(xiàn)出胃癌癥狀或具有患有胃癌或其癥狀的風險的個體。例如，需要治療的個體包括具有胃癌遺傳傾向或家族史的個體、過去已忍受相關(guān)癥狀的個體、已暴露于觸發(fā)物質(zhì)或事件的個體以及忍受病癥的慢性或急性癥狀的個體?！靶枰委煹膫€體”可以處于生命的任何年齡。
[0065]DACTl蛋白的“抑制劑”、“激活劑”和“調(diào)節(jié)劑”分別指利用DACTl蛋白結(jié)合或信號轉(zhuǎn)導的體外和體內(nèi)測定鑒定出的抑制性分子、激活性分子或調(diào)節(jié)性分子，例如配體、激動劑、拮抗劑及其同系物和模擬物。術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”包括抑制劑和激活劑。例如，抑制劑是部分或完全阻斷碳水化合物結(jié)合，降低DACTl蛋白活性、阻止DACTl蛋白活性、延遲激活DACTI蛋白、使DACTl蛋白失活、使DACTl蛋白活性去敏感或下調(diào)DACTl蛋白活性的試劑。在一些情況下，抑制劑直接或間接與DACTl蛋白結(jié)合，例如中和抗體。本文所用的抑制劑與失活劑和拮抗劑同義。例如，激活劑是刺激DACTl蛋白活性、增加DACTl蛋白活性、促進DACTl蛋白活性、增強DACTl蛋白激活、使DACTl蛋白活性敏感化或上調(diào)DACTl蛋白活性的試劑。調(diào)節(jié)劑包括DACTl蛋白配體或結(jié)合伴侶，包括經(jīng)修飾的天然存在的配體和以合成方式設計的配體、抗體和抗體片段、拮抗劑、激動劑、包括含碳水化合物的分子的小分子、siRNA, RNA適體等。[0066]發(fā)明詳述
[0067]I?引言
[0068]由于胃癌在其早期發(fā)展階段缺乏明確癥狀的性質(zhì)，胃癌患者通常面臨嚴酷的預后。因而，胃癌的早期檢測對提高患者存活率是至關(guān)重要的。
[0069]本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)胃癌細胞中DACTl蛋白的表達受到抑制。這種DACTl蛋白的抑制表達是由于DACTl基因組序列，尤其是該基因的啟動子區(qū)內(nèi)的甲基化增加，導致DACTlmRNA的轉(zhuǎn)錄減少。該發(fā)現(xiàn)為檢測、監(jiān)測和治療胃癌提供了重要的手段。
[0070]I1.一般方法
[0071]本發(fā)明的實施利用分子生物學領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。公開了本發(fā)明使用的一般方法的基礎(chǔ)教科書包括 Sambrook and Russell, MolecularCloning, A Laboratory Manual (第 3版? 2001) ;Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual (1990);以及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.，1994))。
[0072]對于核酸，以千堿基對(kb)或堿基對(bp)給出大小。核酸大小是從瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳、從測序的核酸或從公開的DNA序列得到的估計值。對于蛋白，以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數(shù)給出大小。蛋白大小是從凝膠電泳、從測序的蛋白、從推導的氨基酸序列或從公開的蛋白序列估算的。
[0073]例如，可以按照Van Devanter et.al., Nucleic Acids Res.12:6159-6168 (1984)的描述，利用自動化合成儀根據(jù)Beaucage and Caruthers, TetrahedronLett.22:1859-1862(1981)首次描述的固相亞磷酰胺三酯法通過化學方法合成不能商購的寡核苷酸。利用任何本領(lǐng)域公認的策略(例如天然丙烯酰胺凝膠電泳或Pearson andReanier, J.Chrom.255:137-149 (1983)所描述的陰離子交換高效液相色譜(HPLC))進行寡核苷酸的純化。
[0074]可以利用例如Wallace et al.，Genel6:21-26 (1981)所述的對雙鏈模板進行測序的鏈終止法驗證本發(fā)明所用的目的序列，例如，人DACTl基因的多核苷酸序列和合成的寡核苷酸(例如，引物)。
[0075]II1.組織樣品的獲得和DACTl mRNA或DNA的分析
[0076]本發(fā)明涉及測量DACTl mRNA的量或分析人胃組織(尤其是胃上皮樣品)中的DACTl基因組DNA的甲基化模式，將其作為檢測胃癌的存在、評估發(fā)展成胃癌的風險和/或監(jiān)測胃癌的進展或治療功效的手段。因此，實施本發(fā)明的第一步是從測試個體獲得胃上皮組織樣品并從所述樣品提取mRNA或DNA。
[0077]A.胃組織樣品的獲取和制備
[0078]從待利用本發(fā)明的方法檢測或監(jiān)測胃癌的人獲得胃組織樣品。按照醫(yī)院或診通常遵循的標準步驟(例如在內(nèi)窺鏡檢查期間)進行從個體的胃上皮組織樣品的收集。收集合適量的胃上皮，并且可以在進一步制備之前按照標準程序進行保存。
[0079]可以利用例 如胃粘膜進行本發(fā)明的患者胃上皮樣品中存在的DACTImRNA或DNA的分析。制備用于提取核酸的組織樣品的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，應當首先處理個體的胃粘膜樣品來破壞細胞膜，以便釋放細胞內(nèi)含有的核酸。
[0080]B.RNA的提取和定量
[0081]有很多從生物樣品提取mRNA的方法?？梢宰裱璵RNA制備的一般方法(例如，如 Sambrook and Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d ed., 2001所描述的)。還可以使用各種商購的試劑或試劑盒從測試個體的生物樣品獲得mRNA，例如 Trizol 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)、Oligotex Direct mRNA 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA) >RNeasy Mini 試劑盒(Qiagen, Hilden, Germany)和PoIyAI tract'?Series 9600TM(Promega, Madison, WI) ?還可以使用這些方法中的多種的組合。
[0082]從RNA制備物消除所有DNA污染是必要的。因此，應當小心處理樣品、用DNA酶進行徹底的處理，并在擴增和定量步驟中使用合適的陰性對照。
[0083]1.基于PCR的mRNA水平定量測定
[0084]從樣品提取出mRNA后，就可以對人DACTl mRNA的量進行定量。測定mRNA水平的優(yōu)選方法是基于擴增的方法，例如，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，尤其是逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。
[0085]在擴增步驟之前，必須合成人DACTl mRNA的DNA拷貝(cDNA)。這通過逆轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)，可以作為單獨的步驟進行逆轉(zhuǎn)錄或以均相(homogeneous)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進行，均相逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應是用于擴增RNA的一種改良的聚合酶鏈式反應。適于核糖核酸PCR擴增的方法如以下所述:Romero and Rotbart,Diagnostic Molecular Biology!Principles and Applications pp.401—406;Persinget al.,eds., Mayo Foundation, Rochester, MN, 1993;Egger et al.,J.Clin.Microbiol.33:1442-1447，1995 ;以及美國專利第 5，075，212 號。
[0086]PCR的一般方法是本領(lǐng)域公知的，因而未在本文詳細描述。對于PCR方法、方案和設計引物的原理的綜述，參見例如，Innis, et al., PCR Protocols:A Guide to Methodsand Applications, Academic Press, Inc.N.Y.，1990。PCR 試劑和方案還可以從供應商獲得，例如 Roche Molecular Systems。
[0087]最通常的情況下，利用熱穩(wěn)定酶以自動化過程來實施PCR。在該過程中，使反應混合物的溫度自動地通過變性區(qū)、引物退火區(qū)和延伸反應區(qū)進行循環(huán)。特別適用于該目的的儀器是可商購獲得的。
[0088]盡管在實施本發(fā)明中通常使用靶mRNA的PCR擴增，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應當認識到,可以通過任何已知的方法來實現(xiàn)母體血液樣品中這些mRNA種類的擴增，例如連接酶鏈式反應(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增和半保留序列復制或基于核酸序列的擴增(NASBA)，這些方法中的每一種都能提供充分的擴增。最近研發(fā)的支鏈DNA技術(shù)也可以用于定量地測定母體血液中mRNA標志物的量。對于用于臨床樣品中核酸序列的直接定量的支鏈DNA信號擴增的綜述，參見 Nolte, Adv.Clin.Chem.33:201-235，1998。
[0089]2.其它定量方法
[0090]還可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它標準技術(shù)檢測DACTlmRNA。盡管在檢測步驟之前通常進行擴增步驟，但是本發(fā)明的方法不是一定需要擴增。例如，無論事先是否進行擴增步驟，都可以通過大小分級(例如，凝膠電泳)來鑒定mRNA。按照公知的技術(shù)在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中跑樣并用溴化乙錠進行標記(參見例如，Sambrook and Russell,同上)之后，與標準對照相比存在相同大小的條帶指示靶mRNA的存在，然后基于條帶的強度比較所述靶mRNA的量與對照?；蛘?，DACTl mRNA的特異性寡核苷酸探針可用于檢測該mRNA的存在，并基于探針提供的信號強度通過與標準對照比較來指示mRNA的量。
[0091]序列特異性探針雜交是檢測包含其它種類核酸的特定核酸的公知方法。在足夠嚴緊的雜交條件下，探針只與基本上互補的序列特異性雜交?？梢苑潘呻s交條件的嚴緊性，以允許不同量的序列錯配。
[0092]本領(lǐng)域中公知很多雜交模式，包括但不限于液相、固相或混合相雜交測定。以下的文獻提供了多種雜交測定模式的綜述:Singer et al., Biotechniques4:230，1986;Haase et al.，Methods in Virology, pp.189-226, 1984;Wilkinson, In situHybridization, Wilkinson ed., IRL Press,Oxford University Press,Oxford;以及Hames and Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach, IRLPress, 1987。
[0093]按照公知的技術(shù)檢測雜交復合物?？梢酝ㄟ^常用于檢測雜交核酸存在的數(shù)種方法中的任一種標記能夠與靶核酸(即mRNA或擴增的DNA)特異性雜交的核酸探針。一種常用的檢測方法是利用用3H、1251、35S、14C或32P等標記的探針的放射自顯影技術(shù)。放射性同位素的選擇取決于鑒于合成方便性、穩(wěn)定性和所選同位素的半衰期的研究偏好。其它標記包括化合物(例如，生物素和地高辛)，其與用熒光團、化學發(fā)光試劑和酶標記的抗配體或抗體結(jié)合?；蛘撸结樋梢耘c諸如熒光團、化學發(fā)光試劑和酶的標記直接綴合。標記的選擇取決于所需的敏感度、與探針綴合的方便性、穩(wěn)定性需要和可利用的儀器。
[0094]可以利用公知的技術(shù)合成和標記實施本發(fā)明所需的探針和引物。例如，可以按照Van Devanter e t.al.，Nucleic Acids Res.12:6159-6168，1984所描述的，利用自動化合成儀根據(jù)Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett.22:1859-1862，1981 首次描述的固相亞磷酰胺三酯法通過化學方法合成用作探針和引物的寡核苷酸。例如，可以通過非變性丙烯酰胺凝膠電泳或Pearson and Reanier, J.Chrom.255:137-149，1983所描述的陰離子交換HPLC進行寡核苷酸的純化。
[0095]C.DACTl基因組序列中甲基化的檢測
[0096]研究含有一個或多個CpG (胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸)對的DACTl基因組序列區(qū)段的甲基化狀態(tài)，以提供關(guān)于測試個體是否患有胃癌、個體是否有發(fā)展成胃癌的風險或個體的胃癌是惡化還是改善的指示。
[0097]通常，對于甲基化模式所分析的DACTl基因組序列區(qū)段包括5'非翻譯區(qū)(諸如啟動子區(qū))并包括一個或多個CpG核苷酸對。例如，SEQ IDNO:1或6或其一部分可用于確定序列內(nèi)有多少CpG對是甲基化的以及有多少CpG對是非甲基化的。被分析的序列應當足夠長，以含有至少I個CpG 二核苷酸對，且該CpG位點處的甲基化檢測通常足以指示胃癌細胞的存在。被分析的序列的長度通常為至少15或20個連續(xù)核苷酸，并且可以更長，具有至少
25、30、50、100、200、300、400或更多個連續(xù)核苷酸。序列內(nèi)存在至少I個，通常為2個或更多個，常常為3、4、5、6、7、8、9或更多個CpG核苷酸對。在分析多個(2個或更多個)CpG位點的甲基化狀態(tài)的情況下，當所分析的基因組序列內(nèi)至少50%的CpG對被證實為甲基化的時，所測試的個體被認為患有胃癌或發(fā)展成胃癌的風險增加。舉例來說，SEQ ID N0:1(即DACTl基因組序列區(qū)段(相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的-556至-383))和SEQ ID N0:6 WPDACTl基因組序列區(qū)段(相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的-18至+102))含有數(shù)個CpG對。在建立的胃癌細胞系和獲自胃癌的樣品中，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)的一些或大多數(shù)CpG對是甲基化的，而非癌的胃上皮細胞顯示非常少的甲基化CpG位點(如果存在的話)。為了確定DACTl基因組序列的甲基化模式，進行亞硫酸氫鹽處理，隨后進行DNA測序是非常有用的，因為亞硫酸氫鹽將非甲基化胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，而保持甲基化胞嘧啶不變，從而允許通過DNA測序過程進行直接鑒定。任選地，在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化之后且DNA測序之前，包括諸如PCR的擴增過程。
[0098]1.DNA提取和處理
[0099]從生物樣品提取DNA的方法是公知的，且在分子生物學領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)實施，參見例如,Sambrook and Russell,同上。應當消除RNA污染以避免對DNA分析的干擾。然后,用能以甲基化差異方式修飾DNA的試劑處理DNA，即在處理之后從甲基化胞嘧啶(C)殘基和非甲基化C殘基產(chǎn)生不同的且可區(qū)別的化學結(jié)構(gòu)。通常，這種試劑能與DNA分子內(nèi)的非甲基化C殘基反應，將每個非甲基化C殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)殘基，而甲基化C殘基保持不變。這種非甲基化C — U的轉(zhuǎn)化允許基于核酸的一級序列的改變進行甲基化狀態(tài)的檢測和比較。適用于該目的的示例性試劑是亞硫酸氫鹽，諸如亞硫酸氫納。使用亞硫酸氫鹽進行DNA化學修飾的方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的(參見例如,Herman et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:9821-9826, 1996)。
[0100]正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認識到的，本文未提及的但具有化學(或通過任何其它機制)差異修飾甲基化和非甲基化DNA的相同特性的任何其它試劑都可以用于實施本發(fā)明。例如，還可以通過甲基化敏感的限制性酶來實現(xiàn)DNA的甲基化特異性修飾，其中的一些酶通常切割非甲基化DNA片段但不切割甲基化DNA片段，而其它(例如，甲基化依賴性核酸內(nèi)切酶McrBC)切割含甲基化胞嘧啶的DNA，但不切割非甲基化DNA。此外，化學修飾和限制性酶處理的組合可用于實施本發(fā)明，例如，結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性內(nèi)切酶分析(COBRA)(Xiong et al.1997 Nucleic Acids Res.25 (12): 2532-2534)。其它可利用的檢測 DNA 甲基化的方法包括，例如，通過Southern印跡或PCR分析來分析甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶(MSRE)、甲基化特異性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的單核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、高分辨率熔解(HRM)分析、亞硫酸氫鹽測序、焦磷酸測序、甲基化特異性單鏈構(gòu)象分析(MS-SSCA)、甲基化特異性變性梯度凝膠電泳(MS-DGGE)、甲基化特異性熔解曲線分析(MS-MCA)、甲基化特異性變性高效液相色譜(MS-DHPLC)、甲基化特異性微陣列(MSO)。這些測定可以是PCR分析、利用熒光標記的定量分析或Southern印跡分析。示例性的甲基化敏感的DNA切割試劑例如限制性酶，包括AatI1、Aci1、Acl1、Age1、Asc1、Asp718、Aval、BbrPl> BceAI> BmgBI> BsaAI> BsaH1、BsiE1、BsiffI> BsmBI> BspDI> BsrFI> BssHI1、BstB1、BstU1、Cla1、Eag1、Eag1-HFTM、Fau1、Fse1、Fsp1、HaeI1、Hga1、Hha1、HinPl1、HpaI1、Hpy991、HpyCH4IV、Kas1、Mlu1、Nar1、NgoMIV、Not1、Notl-HFTM、Nru1、Nt.BsmA1、PaeR71、PspX1、Pvu1、RsrI1、SacI1、Sail、Sal1-HFTM、Sfo1、SgrA1、Sma1、SnaBI 或 TspMI。
[0101]2.任選的擴增和序列分析
[0102]在以甲基化差異方式修飾DNA之后，對處理的DNA進行基于序列的分析，以便可以確定DACTl基因組序列的甲基化狀態(tài)。在甲基化特異修飾之后序列分析之前，任選地進行擴增反應。多種多核苷酸擴增方法是成熟的，且經(jīng)常地用于研究中。例如，用于多核苷酸序列擴增的聚合酶鏈式反應(PCR)的一般方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，因而未在本文詳細描述。對于PCR方法、方案和設計引物的原理的綜述,參見例如，Innis, et al., PCR ProtocolsiAGuide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.N.Y.，1990。PCR 試劑和方案還可以從供應商獲得，例如Roche Molecular Systems。
[0103]盡管在實施本發(fā)明中通常使用PCR擴增，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應當認識到，可以通過任何已知的方法實現(xiàn)相關(guān)基因組序列的擴增，例如連接酶鏈式反應(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增和半保留序列復制或基于核酸序列的擴增(NASBA)，這些中的每一種都能提供充分的擴增。
[0104]用于測定多核苷 酸序列的技術(shù)也是成熟的，且在相關(guān)研究領(lǐng)域中廣泛實施。例如，多核苷酸測序的基本原理和一般技術(shù)在多種關(guān)于分子生物學和重組遺傳學的研究報道和論文中有描述，例如，Wallace et al.,同上;Sambrook and Russell,同上，以及 Ausubelet al.,同上。研究實驗室中常規(guī)實施的手動或自動DNA測序方法都可以用于實施本發(fā)明。適于實施本發(fā)明的方法中檢測多核苷酸序列的改變(例如，C —U)的其它手段包括但不限于質(zhì)譜測量、引物延伸、多核苷酸雜交、實時PCR、熔解曲線分析、高分辨率熔解分析、異源雙螺旋分析、焦磷酸測序和電泳。
[0105]IV.多肽的定量
[0106]A.獲得樣品
[0107]實施本發(fā)明的第一步驟是從要測試、評估或監(jiān)測胃癌、發(fā)展成胃癌風險或病癥的嚴重程度/進展的個體獲得胃上皮的樣品。應當從對照組(未患任何胃病尤其是腫瘤的正常個體)和測試組(例如，要測試可能存在胃癌的個體)采集相同類型的樣品。正如上面的章節(jié)中所陳述的，為了該目的，通常遵循醫(yī)院和診所中常規(guī)使用的標準程序。
[0108]為了檢測測試個體中胃癌的存在或評估發(fā)展成胃癌的風險，可以采集個體患者的胃粘膜樣品，并且測量人DACTl蛋白的水平，然后與標準對照進行比較。如果與對照水平比較時，觀察到人DACTl蛋白水平的降低，則認為測試個體患有胃癌或發(fā)展成胃癌的風險增加。為了監(jiān)測胃癌患者的疾病進展或評估療效，可以在不同的時間點采集個體患者的胃上皮樣品，從而可以測量人DACTl蛋白的水平來提供指示疾病狀態(tài)的信息。例如，當患者的DACTl蛋白水平顯示出隨時間大體上增加的趨勢時，認為患者的胃癌的嚴重程度正在改善或認為患者接受的治療是有效的?；颊逥ACTl蛋白水平未發(fā)生改變或甚至持續(xù)降低的趨勢指示疾病的惡化和給予患者的治療無效。通常，在患者中觀察到更低的DACTl蛋白水平指示患者所患胃癌的更嚴重的形式和疾病更差的預后，例如表現(xiàn)為更短的預期壽命、更高的轉(zhuǎn)移率、對治療的抗性等。
[0109]B.制備用于DACTl蛋白檢測的樣品
[0110]來自個體的胃組織樣品適用于本發(fā)明，且可以通過公知的方法和前面部分所陳述的方法獲得。在本發(fā)明的某些應用中，胃粘膜可以是優(yōu)選的樣品類型。
[0111]C.測丨定人DACTl蛋白的水平[0112]可以利用多種免疫學測定來檢測任何特定種類的蛋白，如DACTl蛋白。在一些實施方案中，可以通過用對多肽具有特異性結(jié)合親和力的抗體從測試樣品捕獲所述多肽來進行夾心測定。然后，可以用對多肽具有特異性結(jié)合親和力的標記抗體來檢測它?？梢岳梦⒘魇窖b置(例如微陣列蛋白芯片)來實施所述免疫學測定。還可以通過凝膠電泳(諸如二維凝膠電泳)和利用特異性抗體的Western印跡分析來檢測目的蛋白(例如，人DACTl蛋白)?；蛘?，可以利用合適的抗體的標準免疫組織學技術(shù)來檢測指定蛋白(例如，人DACTl蛋白)。單克隆抗體和多克隆抗體(包括具有期望的結(jié)合特異性的抗體片段)可用于多肽的特異性檢測?？梢酝ㄟ^已知技術(shù)來產(chǎn)生這類抗體及它們的對特定蛋白(例如，人DACTl蛋白)具有特異性結(jié)合親和力的結(jié)合片段。
[0113]對于實施本發(fā)明中DACTl蛋白水平的測定，還可以利用其它方法。例如，基于質(zhì)譜測量技術(shù)已開發(fā)出多種技術(shù)來快速和精確定量靶蛋白(甚至在大量樣品中)。這些方法涉及高精密儀器，例如利用多反應監(jiān)測(MRM)技術(shù)的三級四極(triple Q)儀器、基質(zhì)輔助激光解吸電離/電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(MALDI T0F/T0F)、利用選擇性離子檢測(SIM)模式的離子阱儀器以及基于電噴霧離子化(ESI)的QTOP質(zhì)譜儀。參見例如，Pan etal., JProteome Res.2009 February;8(2):787 - 797。
[0114]V.建立標準對照
[0115]為了建立用于實施本發(fā)明方法的標準對照，首先選擇未患有常規(guī)定義的任何胃病(尤其是任何形式的腫瘤，例如胃癌)的一組健康人。為了利用本發(fā)明的方法篩查和/或監(jiān)測胃癌，如果可以的話，這些個體符合合適的參數(shù)。任選地，所述個體具有相同的性別、相似的年齡或相似的種族背景。
[0116]通過成熟的、常規(guī)使用的方法來確認所選個體的健康狀態(tài)，所述方法包括但不限于個體的常規(guī)體檢以及他們的醫(yī)療史的總體審查。
[0117]此外，所選的健康個體組必須具有合理的樣本大小，使得能夠合理認為獲自所述組的胃組織樣品的人DACTl mRNA或DACTl蛋白的平均量/濃度代表總的健康人群的正?；蚱骄?。優(yōu)選地，選擇的組包括至少10個人。
[0118]一旦基于所選健康對照組的每個個體中的個體值建立DACTl mRNA或DACTl蛋白的平均值，該平均值或中值或代表值或特征被視為標準對照。在相同的過程中還確定標準差。在一些情況下，可以為具有不同特征(諸如年齡、性別或種族背景)的單獨定義的組建立單獨的標準對照。
[0119]V1.胃癌的治療
[0120]通過證明DACTl蛋白的抑制表達與胃癌的相關(guān)性，本發(fā)明還提供了治療胃癌患者的手段:通過增加DACTl蛋白表達或生物活性的方法。本文所用的胃癌治療包括減輕、逆轉(zhuǎn)、緩解或消除胃癌的一種或多種癥狀，以及預防或延遲一種或多種相關(guān)癥狀的發(fā)生。
[0121]A.增加DACTl表汰或活件
[0122]1.編碼DACTl蛋白的核酸
[0123]可以通過使用編碼功能性DACTl蛋白的核酸來實現(xiàn)DACTl基因表達的增強。所述核酸可以是在有利條件下能翻譯成活性形式的DACTl蛋白的單鏈核酸(諸如mRNA)或雙鏈核酸(諸如DNA)。
[0124]在一個實施方案中，以表達盒的形式提供DACTl編碼核酸，所述表達盒通常由重組產(chǎn)生，并具有與編碼DACTl蛋白的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子。在一些情況下，啟動子是在所有或多數(shù)組織類型中指導基因表達的通用啟動子。在其它情況下，啟動子是特異性地在上皮細胞(尤其是胃上皮細胞)中指導基因表達的啟動子。給予所述核酸能增加靶組織(例如胃上皮)中的DACTl蛋白表達。由于已知人DACTl基因cDNA序列的GenBank登錄號NM_016651，并且在本文作為SEQ ID NO: 3提供，所以可以從所述序列、物種同系物和這些序列的變體獲得合適的DACTl編碼核酸。 [0125]2.DACTl 蛋白
[0126]通過將有效量的活性DACTl蛋白直接給予患有胃癌且表現(xiàn)出受抑制的DACTl蛋白表達或活性的患者，也可以有效治療該疾病。例如，這可以通過將重組產(chǎn)生的具有生物活性的DACTl蛋白給予胃癌患者來實現(xiàn)。遞送基于蛋白或多肽的治療劑的制劑和方法是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。
[0127]3.DACTl蛋白的激活劑
[0128]可以用能激活DACTl蛋白表達或增強DACTl蛋白活性的試劑來實現(xiàn)DACTl蛋白活性的增加。例如，去甲基化試劑(例如，5-Aza)可能能夠通過去除由DACTl基因的啟動子區(qū)的甲基化所引起的DACTl基因表達的抑制來激活DACTl基因表達。其它激活劑可以包括DACTl啟動子和/或增強子特異性的轉(zhuǎn)錄激活劑。可以利用本文實施例中所描述的DACTl表達測定來篩選和鑒定這類激活劑。
[0129]DACTl蛋白的激動劑(諸如激活抗體)是另一種DACTl蛋白激活劑。這類激活劑通過增強DACTl蛋白的生物活性，通常(但并非必須)通過與DACTl蛋白和/或其相互作用蛋白的直接結(jié)合來發(fā)揮作用。這類激動劑的初步篩選可以起始于用鑒定與DACTl蛋白發(fā)生物理相互作用的分子的結(jié)合測定。
[0130]B.藥物纟目合物
[0131]1.制劑
[0132]本發(fā)明的化合物可用于藥物組合物或藥物的制備?？梢詫⑺幬锝M合物或藥物給予個體用于治療胃癌。
[0133]本發(fā)明所用的化合物(例如，DACTl蛋白、編碼DACTl蛋白的核酸、DACTl基因表達的激活劑)可用于制備包含有效量的所述化合物的藥物組合物或藥物，所述有效量的化合物與適于應用的賦形劑或載體組合或混合。[0134]用于增強DACTl表達的示例性藥物組合物包含(i)包含本文所述的編碼人DACTl蛋白的多核苷酸序列的表達盒，和(ii)藥學上可接受的賦形劑或載體。術(shù)語“藥學上可接受的”和“生理學上可接受的”在本文同義使用。對于本文所述的治療方法中的使用，可以提供治療有效劑量的表達盒。
[0135]可以通過脂質(zhì)體給予DACTl蛋白或編碼DACTl蛋白的核酸，所述脂質(zhì)體的作用是將綴合物靶向于特定的組織，以及增加組合物的半衰期。脂質(zhì)體包括乳劑、起泡劑、膠束、不溶性單層、液態(tài)晶體、磷脂分散劑、片狀層等。在這些制劑中，將待遞送的抑制劑作為脂質(zhì)體的一部分并入，所述待遞送的抑制劑是單獨的或與能結(jié)合例如所靶向的細胞(例如，皮膚細胞)中廣泛存在的受體的分子或其它治療性或免疫原性組合物聯(lián)合。因此，用本發(fā)明的蛋白或核酸填充的脂質(zhì)體可被引導至治療位點，然后在該治療位點，所述脂質(zhì)體遞送所選的蛋白或核酸組合物。用于本發(fā)明中的脂質(zhì)體由形成標準囊泡的脂質(zhì)形成，所述形成標準囊泡的脂質(zhì)通常包括中性和帶負電的磷脂和留醇(例如膽固醇)。通?？紤]以下因素來指導脂質(zhì)的選擇，例如，脂質(zhì)體尺寸、血流中脂質(zhì)體的酸不穩(wěn)定性和穩(wěn)定性。可獲得用于制備月旨質(zhì)體的多種方法，如在例如 Szoka et al.(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467,美國專利第4，235，871號、第4，501，728號和第4，837，028號中所描述的。 [0136]可以利用一種或多種生理學上可接受的載體或賦形劑，通過標準技術(shù)制備用于本發(fā)明中的藥物組合物或藥物。合適的藥物載體在本文和E.W.Martin的“Remington’sPharmaceutical Sciences”中有描述?？梢詫⒈景l(fā)明的化合物和藥劑及它們的生理學上可接受的鹽及溶劑化物配制用于通過任何合適的途徑進行給藥，包括吸入給藥、局部給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)口給藥、腸胃外給藥或直腸給藥。
[0137]用于局部給藥的典型劑型包括乳膏、軟膏、噴霧劑、洗液和膏藥。然而，藥物組合物可以被配制成任何類型的給藥，例如，利用注射器或其它裝置的皮內(nèi)注射、皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、鼻內(nèi)注射、顱內(nèi)注射、氣管內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、膀胱內(nèi)注射、胸膜內(nèi)注射、冠狀動脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)注射。還打算通過吸入(例如，氣霧劑)給藥或口服給藥、直腸給藥或陰道給藥的劑型。
[0138]2.給藥途徑
[0139]用于局部施加于例如皮膚和眼部的合適劑型優(yōu)選本領(lǐng)域內(nèi)公知的水性溶液、軟膏、乳膏或凝膠。這種劑型可以含有增溶劑、穩(wěn)定劑、張力增強劑、緩沖劑和防腐劑。
[0140]用于經(jīng)皮施加的合適劑型包括有效量的本發(fā)明的化合物或藥劑和載體。優(yōu)選的載體包括用于輔助通過宿主皮膚的可吸收的藥學上可接受的溶劑。例如，經(jīng)皮裝置采用繃帶的形式，所述繃帶包括支持構(gòu)件、含有化合物和任選載體的貯存器，任選的速率控制屏障以及將所述裝置固定于皮膚的部件，所述速率控制屏障以受控和預定的速率在延長的時間段內(nèi)將化合物遞送至宿主皮膚。還可以使用基質(zhì)經(jīng)皮劑型。
[0141]對于口服給藥，藥物組合物或藥物可以采用例如用藥學上可接受的賦形劑通過常規(guī)方法制備的片劑或膠囊的形式。優(yōu)選的是包含以下的片劑和明膠膠囊:活性成分(即DACTl蛋白或編碼DACTl蛋白的核酸)，以及(a)稀釋劑或填充劑，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素(例如，乙基纖維素、微晶纖維素)、糖膠、果膠、聚丙烯酸酯和/或磷酸氫鈣、硫酸鈣，(b)潤滑劑，例如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、金屬硬脂酸鹽、膠體二氧化硅、氫化植物油、玉米淀粉、苯甲酸鈉、醋酸鈉和/或聚乙二醇；對于片劑還可以包含(C)粘合劑，例如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或羥丙基纖維素；如果需要還可以包含(d)崩解劑，例如淀粉(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉鈉)、乙醇酸鹽(酯)、瓊脂、褐藻酸或其鈉鹽、或起泡混合物；(e)潤濕劑，例如月桂基硫酸鈉和/或⑴吸收劑、著色劑、芳香劑和甜味劑。
[0142]還可以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法用薄膜包被或用腸衣包被片劑。用于口服給藥的液體制劑可以采用例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或者可以將它們提供為干的產(chǎn)品，使用前用水或其它合適介質(zhì)復原?？梢杂盟帉W上可接受的添加劑通過常規(guī)方式制備這種液體制齊?，所述添加劑例如懸浮劑，如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪；乳化劑，如卵磷脂或阿拉伯樹膠；非水性介質(zhì)，如杏仁油、油酯、乙醇或分級的植物油；以及防腐劑，如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸。視情況，所述制劑還可以含有緩沖鹽、芳香劑、著色劑和/或甜味劑。需要時，口服給藥的制劑可以被適當配制以實現(xiàn)活性化合物的控釋。
[0143]本發(fā)明的化合物和藥劑可以配制成通過注射的腸胃外給藥，例如通過彈丸注射或連續(xù)輸注?？梢砸詥挝粍┝啃问教峁┯糜谧⑸涞膭┬?，例如添加了防腐劑的安瓿或多劑量容器?？勺⑸涞慕M合物優(yōu)選是水性等滲溶液或懸浮液，并且栓劑優(yōu)選由脂肪乳劑或懸浮液制備。組合物可以是無菌的和/或含有佐劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑、溶解促進劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑?；蛘?，活性成分可以為粉末形式，在使用前用合適的介質(zhì)(例如，無菌無熱原的水)復原。此外，它們還可以含有其它有有治療價值的物質(zhì)。分別按照常規(guī)的混合、制?；虬路椒▉碇苽浣M合物，且組合物含有約0.1至75%，優(yōu)選約I至50%的活性成分。
[0144]為了通過吸入給藥，可以用合適的推進劑從加壓包或或噴霧器中以氣霧劑噴霧的方式方便地遞送活性成分(例如，DACTl蛋白或編碼DACTl蛋白的核酸)，所述推進劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。就加壓氣霧劑而言，劑量單位可以通過提供閥來遞送既定的量來確定。在吸入器或吹入器中使用的例如明膠膠囊或藥筒可以被配制成含有化合物的粉末混合物和合適的粉末基質(zhì)(例如，乳糖或淀粉)。
[0145]還可以將本發(fā)明的化合物和藥劑配制在直腸組合物中，例如，栓劑或保留灌腸劑，例如含有諸如可可油或其它甘油酯的常規(guī)栓劑基質(zhì)。
[0146]此外，可以將活性成分配制成貯庫型制劑。這種長效劑型可以通過植入(例如，皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射來給藥。因此，例如，活性成分可以與合適的聚合材料或疏水材料(例如作為可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂一起配制，或者可以被配制成微溶的衍生物,例如微溶的鹽。
[0147]本發(fā)明的藥物組合物或藥物包含(i)有效量的本文所述的能提高DACTl蛋白水平或活性的化合物，和(ii)另一種治療劑。當與本發(fā)明的化合物一起使用時，所述治療劑可以單獨使用、依次使用或與一種或多種其它這類治療劑(例如第一治療劑、第二治療劑和本發(fā)明的化合物)聯(lián)合使用。給藥可以通過相同或不同的給藥途徑進行或可以在同一藥物制劑中一起進行。
[0148]3.劑量
[0149]可以以能預防、治療或控制本文所述的胃癌的治療有效劑量給予個體藥物組合物或藥物。以足以引起個體中有效的治療反應的量給予藥物組合物或藥物。
[0150]所給予的活性劑的劑量取決于個體的體重、年齡、個體狀況、待治療區(qū)域的表面積或體積以及給藥形式。劑量大小還由特定個體中具體化合物的給藥所伴隨的任何不良反應的存在、性質(zhì)和程度來決定。例如，每種DACTl蛋白或編碼DACTl蛋白的核酸都很可能具有獨特的劑量。用于口服給予約50至70kg的哺乳動物的單位劑量可以含有約5至500mg的活性成分。通常，本發(fā)明的活性化合物的劑量是足以實現(xiàn)期望效應的劑量。最佳劑量方案可以從個體體內(nèi)的藥劑累積的測量值來計算。通常，可以每天、每周或每月一次或多次地給予劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定最佳劑量、劑量方法和重復率。
[0151]為了實現(xiàn)期望的療效，可以以治療有效的每日劑量分多日給予化合物或藥劑。因此，治療個體中本文所述的相關(guān)病癥或疾病的化合物的治療有效給藥需要周期性(例如，每日)給予，持續(xù)3天至兩周或更長的時間。通常，藥劑的給藥持續(xù)至少連續(xù)3天，通常至少連續(xù)5天，更通常至少連續(xù)10天，有時連續(xù)20、30、40或更多天。盡管連續(xù)的每日給藥是達到治療有效劑量的優(yōu)選途徑，但是即使沒有每天給予藥劑也能實現(xiàn)治療有益效果，只要足夠頻繁地重復給藥以維持個體中藥劑的治療有效濃度。例如，可以每隔一天、每隔三天給予藥劑，或者如果使用更高的劑量范圍并且能被個體所耐受，則每周給予一次。
[0152]所述化合物或藥劑的最佳劑量、毒性或療效可以隨個體化合物或藥劑的相對效力而不同，并且可以通過細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游锏臉藴仕帉W方法來確定，例如，通過測定LD50 (導致50%的群體死亡的劑量)和ED5tl (在50%的群體中治療有效的劑量)。毒性效應和療效的劑量比是治療指數(shù)，且可以表示為比值LD5(i/ED5(i。優(yōu)選表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的藥劑。盡管可以使用表現(xiàn)出毒副作用的藥劑，但是應當考慮設計能將這類藥劑靶向于受累組織位點的遞送系統(tǒng)，從而使對正常細胞的潛在破壞最小化，進而降低副作用。
[0153]例如，從細胞培 養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于制定在人類中使用的劑量范圍。這類化合物的劑量優(yōu)選位于包括ED5tl但具有較小毒性或沒有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)變化，這取決于所用的劑型和給藥途徑。對于本發(fā)明方法中所用的任何藥劑，首先可以從細胞培養(yǎng)測定估算治療有效劑量?？梢砸詣游锬Ｐ椭贫▌┝?，以實現(xiàn)包括細胞培養(yǎng)所測定的IC5tl(能實現(xiàn)癥狀的最大抑制的一半的藥劑濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。這些信息可用于更精確地確定人類可用的劑量。例如，可以通過高效液相色譜(HPLC)測量血漿中的水平。通常，對于一般的個體，藥劑的劑量當量為約lng/kg至IOOmg/
kg ο
[0154]提供了本文所述的DACTl蛋白或編碼DACTl蛋白的核酸的示例性劑量。當玻璃體內(nèi)給藥時，DACTl編碼核酸(例如表達盒)的劑量可以為0.1-0.5mg/眼(例如，5_30mg/kg)。小的有機化合物激活劑可以以5-1OOOmg 口服給予,或以10-500mg/ml靜脈內(nèi)輸注?？梢园凑找韵铝客ㄟ^靜脈內(nèi)注射或輸注給予單克隆抗體激活劑:50-500mg/ml (120分鐘的時間內(nèi))；l_500mg/kg(60分鐘的時間內(nèi))；或Ι-lOOmg/kg(推注)，每周5次。DACTl蛋白或肽激活劑可以以10-500mg皮下給予；以0.l_500mg/kg每天兩次或約50mg每周一次或25mg每周兩次靜脈內(nèi)給予。
[0155]本發(fā)明的藥物組合物可以單獨給藥或與至少一種其它治療性化合物聯(lián)合給藥。示例性的有利的治療性化合物包括全身和局部抗炎藥、止疼藥、抗組胺劑、麻醉化合物等。其它治療性化合物可以與主要的活性成分(例如，DACTl蛋白或編碼所述蛋白的核酸)同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分(諸如DACTl蛋白或編碼DACTl蛋白的核酸)的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥，這取決于個體的具體癥狀和特征。
[0156]可以在治療過程中，根據(jù)癥狀的嚴重程度、復發(fā)的頻率和對治療方案的生理應答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常參與治療方案的這種調(diào)整。
[0157]VI1.試劑盒和裝置
[0158]本發(fā)明提供了用于實施本文所述方法來評估個體中DACTl mRNA或DACTl蛋白水平的組合物和試劑盒，其可用于多種目的，例如在患者中檢測或診斷胃癌的存在、確定發(fā)展成胃癌的風險以及監(jiān)測胃癌的進展。
[0159]用于實施測定DACTl mRNA水平的試劑盒通常包括至少一種可用于與DACTl編碼序列或其互補序列的至少一個區(qū)段特異性雜交的寡核苷酸。任選地，用可檢測的部分標記所述寡核苷酸。在一些情況下，所述試劑盒可以包括能在通過PCR(尤其是通過RT-PCR)擴增DACTl DNA或mRNA的至少一個區(qū)段中使用的至少兩個寡核苷酸引物。
[0160]用于實施測定DACTl蛋白水平的試劑盒通常包括至少一種可用于與DACTl蛋白的氨基酸序列特異性結(jié)合的抗體。任選地，用可檢測的部分標記所述抗體?？贵w可以是單克隆抗體或多克隆抗體。在一些情況下，所述試劑盒可以包括至少兩種不同的抗體，一種用于與DACTl蛋白特異性結(jié)合(即一抗)，另一種用于一抗的檢測(即二抗)，所述二抗通常與可檢測的部分連接。
[0161]通常，所述試劑盒還包括合適的標準對照。標準對照指示未患胃癌的健康個體的胃上皮的DACTl蛋白或DACTl mRNA的平均值。在一些情況下，可以以設定值的方式提供所述標準對照。此外，本發(fā)明 的試劑盒可以提供操作手冊，用于指導使用者分析測試樣品和評估測試個體中胃癌的存在、風險或狀態(tài)。
[0162]在另一方面，還可以以一種裝置或包括一種或多種這種裝置的系統(tǒng)來實施本發(fā)明，所述裝置或系統(tǒng)能實施本文所述的所有或部分方法步驟。例如，在一些情況下，在收到從為了檢測胃癌、評估發(fā)展成胃癌的風險或監(jiān)測病癥進展的受試個體采集的胃組織樣品(例如，胃粘膜樣品)之后，所述裝置或系統(tǒng)執(zhí)行以下步驟:(a)測定樣品中DACTl mRNA或DACTl蛋白的量或濃度；(b)將所述量或濃度與標準對照值進行比較；以及(c)提供指示個體中是否存在胃癌或個體是否有發(fā)展成胃癌的風險、或個體胃癌疾病狀態(tài)是否有變化(即，惡化或改善)的結(jié)果。在其它情況下，在進行步驟(a)且將來自(a)的量或濃度輸入裝置之后，本發(fā)明的裝置或系統(tǒng)執(zhí)行步驟(b)和(C)的任務。優(yōu)選地，所述裝置或系統(tǒng)是部分或完全自動化的。
實施例
[0163]僅通過說明而非限制的方式提供以下實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應當認識到，可以改變或修改各種非關(guān)鍵性參數(shù)來產(chǎn)生基本相同或相似的結(jié)果。
[0164]材料和方法
[0165]人胃樣本
[0166]組織樣品[0167]石蠟包埋的腫瘤組織樣品獲自1999年I月至2006年12月中國廣州中山大學第一附屬醫(yī)院診斷的205名胃癌患者。此外，招募20名年齡匹配的上部胃鏡檢查正常的個體作為對照。研究方案經(jīng)中山大學醫(yī)學院臨床研究倫理委員會批準。
[0168]腫瘤細胞系
[0169]本研究中使用十種胃癌細胞系(AGS、KatoII1、MKN28、MKN45、N87、SNUl、SNU16、SNU719、BGC823和MGC803)和一種正常胃上皮細胞系(GESl)。將細胞系在含有10%胎牛血清的 RPM1-1640 或 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco BRL, Rockville, MD)中維持。
[0170]基因表汰分析
[0171]RNA 分離
[0172]使用Qiazol 試劑(Qiagen, Valencia, CA, USA)分離總 RNA。首先，將約 5-10 X IO6細胞或30mg組織在ImL Qiazol試劑中勻漿，并在室溫下孵育10分鐘。向每個樣品加入
0.2mL氯仿。將混合物劇烈振蕩15秒，在室溫下再靜置3分鐘。將樣品在4° C、以12，OOOg離心20分鐘，樣品分為兩層。將含RNA的上層水相轉(zhuǎn)移到新管中，與0.7ml異丙醇混合，在室溫下孵育10分鐘，并然后在4° C、以12，OOOg離心10分鐘。棄去上清后，用ImL 75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次；風干5分鐘，并用不含RNA酶的水重新溶解RNA。通過用不含RNA酶的 DNA 酶 I 消化(GE Healthcare, Buckinghamshire, England)去除 DNA 污染。通過使用NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)測量 260nm/280nm 的吸光度來測定總RNA的質(zhì)量和獲得量。純化的RNA在使用之前保存在-80° C。
[0173]cDNA 合成
[0174]使用MultiScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)來合成cDNA。反應混合物含有IX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、I XdNTP、l X隨機引物(試劑盒提供)、
2.5U/ μ L逆轉(zhuǎn)錄酶、IU/ μ L RNA酶抑制劑和2 μ g總RNA。將混合物在25° C下孵育10分鐘，然后37° C下孵育120分鐘,然后85° C下孵育5分鐘來使酶失活。cDNA在其他應用之前保存在-80° C。
[0175]半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)
[0176]以總體積25 μ L的反應進行半定量RT-PCR，所述反應含有GeneAmpl XPCR緩沖液II (Applied Biosystems) >2.5mM MgCl2、每種 dNTP 200 μ M、每種引物 200ηΜ、0.5U AmpliTaqGold DNA 聚合酶(Applied Biosystems)和 30_50ng cDNA。PCR 程序以 95。C 持續(xù) 10 分鐘的初始變性開始，然后是32 - 35個擴增循環(huán)(94° C持續(xù)30秒、退火溫度持續(xù)30秒和72° C持續(xù)30秒)，在72° C下進行10分鐘的最終延伸。在紫外光下觀察PCR條帶并照相。用作為內(nèi)參的管家基因β_肌動蛋白的表達將靶基因的表達標準化。用于擴增轉(zhuǎn)錄本的所有引物列在表1中。
[0177]DNA甲某化分析
[0178]基因組DNA提取
[0179]使用DNA小型試劑盒(Qiagen),按照試劑盒實驗方案從GC細胞系和組織樣品分離基因組DNA。將約25mg樣品在1.5mL微離心管中的180 μ L QIAamp ATL緩沖液和20 μ L蛋白酶K中于56° C下裂解I小時。加入4yL RNA酶A(100mg/ml，QIAgen)，并用漩渦脈沖混合15秒，然后于室溫下孵育2分鐘。然后，將200yL AL緩沖液加到裂解液中，將樣品在70° C下孵育10分鐘。添加200 μ L無水乙醇后，用漩渦脈沖將溶液混合15秒。然后，按照生產(chǎn)商說明，使用QIAamp柱純化裂解液。將基因組DNA稀釋于200 μ L不含DNA酶的水中。通過使用NanoDropND-1OOO(NanoDrop)測量260nm/280nm處的吸光度來測定DNA的質(zhì)量和獲得量。
[0180]亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化
[0181]按照Tao et al.，Hum.Mol.Genet.，11 (18): 2091-2101 所述的偏亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA。簡單而言，將溶解于30yL TE緩沖液(Sigma-Aldrich)中的5yg基因組DNA與3.3 μ L的3mM NaOH混合至終濃度0.3mM,并在37° C下孵育15分鐘。變性的DNA與333 μ L亞硫酸氫鹽溶液混合，并在55° C下避光處理4小時。亞硫酸氫鹽溶液被制備為2.4Μ 偏亞硫酸氧納(pH 5.0 - 5.2) (Sigma-Aldrich)和 0.5mM 氧酉昆(Sigma-Aldrich)。使用Qiaex II試劑盒(Qiagen),按照試劑盒提供的實驗方案,將處理過的DNA脫鹽和純化。然后，用0.3M NaOH在37° C下處理DNA 15分鐘，并用3M醋酸銨和3體積的乙醇進行沉淀。將回收的DNA溶解于100 μ LTE緩沖液中(pH 8.0)并保存在-20° C。
[0182]使用5-氮雜-2’ -脫氧胞苷(“5-Aza”)的脫甲基處理
[0183]以每個IOOmm皿IXlO5的密度接種細胞，并使細胞生長24小時。然后，用2μΜ5-氮雜-2’-脫氧胞苷(“5-Aza”)(Sigma-Aldrich)處理細胞5天。每天補充5_Aza。使用半定量RT-PCR評價DACTl的基因表達。
[0184]甲基化特異性PCR (MSP)
[0185]設計甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物來評價GC細胞系中的甲基化狀態(tài)。PCR混合物含有 I XPCR緩沖液 II (Applied Biosystems)、2mM MgCl2、每種 dNTP 200 μ Μ、每種引物 600ηΜ、0.5U AmpliTaq GoldDNA 聚合酶(Applied Biosystems)和 20ng 亞硫酸氫鹽處理過的DNA。PCR程序為95° C持續(xù)10分鐘，然后是38個擴增循環(huán)(94° C持續(xù)30秒、60 ° C持續(xù)30秒和72 ° C持續(xù)30秒)，在72 ° C下最終延伸5分鐘。在紫外燈下觀察MSP條帶并照相。
[0186]直接的亞硫酸氫鹽基因組測序(BGS)
[0187]用表1中所列的引物擴增亞硫酸氫鹽處理的DNA。用2 μ L亞硫酸氫鹽處理的DNA的PCR擴增產(chǎn)生了大約170bp的PCR產(chǎn)物，其在DACTl啟動子區(qū)含有9個CpG 二核苷酸。對擴增的 BGS 產(chǎn)物進行測序。通過 SeqScape 軟件(Applied Biosystems, Foster City, CA)進行測序分析。
[0188]陣列比較某閔鉬雜奪(Array CGH)
[0189]利用不同的熒光團，對來自五種胃癌細胞系(MKN45、MKN28、KatoII1、N87、SUN1)和正常胃組織參照樣品的DNA進行差異性標記，并將其與Array-CGH (Agi IentTechnologies, Santa Clara, CA)雜交。通過 Agilent G4175AA CGH Analytics
3.4(Agilent Technologies)分析結(jié)果。然后，計算胃癌細胞系與正常參照DNA的熒光強度t匕，從而評估基因組特定位置處的拷貝數(shù)變化。利用兩個探針來檢測DACTl基因的拷貝數(shù)變化:基因座I位于chrl4的58177255至58177309，基因座II位于chrl4的58179290至58179349。
[0090] 生物學功能分析
[0191]DACTl α的克隆和表達載體的構(gòu)建
[0192]通過PCR克隆產(chǎn)生DACTla基因表達載體的全長cDNA。將來自人胃的總RNA(Ambion, Austin, TX, USA)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過PCR擴增對應于DACTl α的開放讀碼框(ORF)的序列。將PCR產(chǎn)物克隆入P⑶NA3.1表達載體和pBABE-puro載體。
[0193]DACTla基因轉(zhuǎn)染
[0194]將細胞以大約6X105細胞/孔接種于不含抗生素的6孔板中，孵育約24小時，直至細胞密度達到約90%匯合。然后，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen),用2μ gDACTl α和對照載體(pCDNA3.1)分別轉(zhuǎn)染細胞。將稀釋于125 μ LOpt1-MEM(Invitrogen)的 Lipofectamine 2000 (6.0 μ L)在室溫下孵育 5 分鐘。然后，將稀釋于125 μ L Opt1-MEM的質(zhì)粒DNA與Lipofectamine混合物混合。在5%C02培養(yǎng)箱中于37° C下孵育24-48小時后，收獲細胞，用于轉(zhuǎn)基因表達的測試。對于穩(wěn)定細胞系，以1: 10的比例將細胞傳代至含有合適濃度的新霉素(G418) (Invitrogen)的新鮮生長培養(yǎng)基中。選擇14-21天之后收獲穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞，用于功能測定。 [0195]集落形成測定
[0196]轉(zhuǎn)染后兩天，以1:20的比例將細胞隨后分到含有RPMI1640的6孔板中，RPMI1640含有10%FBS和500 μ g/mL新霉素(G418)。選擇14-18天后，用70%乙醇固定細胞10分鐘，并用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10分鐘。對每個集落大于50個細胞的集落進行計數(shù)。以三個獨立地一式三份樣品進行實驗。
[0197]膜聯(lián)蛋白V凋亡測定
[0198]膜聯(lián)蛋白V是可以結(jié)合已發(fā)生凋亡但還未失去膜的完整性的細胞膜的蛋白。使用膜聯(lián)蛋白V和7-氨基-放射菌素(7-AAD)雙染色評估凋亡細胞的比例。簡單而言，將用IXPBS洗滌的細胞重懸于IOOyL冰冷的膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液中(IOmM HEPES U 40mMNaCl和2.5mM CaCl2, ρΗ7.4)，該緩沖液中含有5 μ L偶聯(lián)了 Alexa Fluor 488的膜聯(lián)蛋白V(Invitrogen)和2 μ L7-AAD染色液(50 μ g/mL)。室溫下孵育15分鐘后，將細胞與另外的400 μ L冰冷的膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液混合，并使用流式細胞儀進行分析。
[0199]細胞鋪展測定和F-肌動蛋白染色
[0200]通過胰酶消化收集用pcDNA3.1-DACTl或pcDNA3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BGC823和MGC803細胞，用DMEM培養(yǎng)液洗滌兩次，并重懸于蓋玻片和培養(yǎng)板上。允許細胞在DMEM中鋪展6個小時，然后拍照。用3%多聚甲醛固定具有鋪展的細胞的蓋玻片以用于F-肌動蛋白染色。用TritonX-1OO滲透蓋玻片上的細胞，然后進行封閉。為了 F-肌動蛋白染色，用若丹明-鬼筆環(huán)肽(Invitrogen)對細胞進行染色。最后，洗漆細胞，并用含DAPI的封固劑(VectorLaboratories, Burlingame, CA)封片。通過突光顯微鏡捕獲圖像。
[0201]細胞遷移和侵襲測定
[0202]進行傷口愈合測定以分析細胞遷移。將用pcDNA3.1-DACTl或pcDNA3.1對照載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的AGS和MGC803接種入6孔培養(yǎng)板。24小時之后，用塑料吸管的尖端手動刮下單層細胞，然后用PBS洗滌。在孵育O小時和24小時時對細胞進行拍照(相差顯微鏡)。在非細胞區(qū)的兩條界限之間測量細胞移動的距離，并將結(jié)果表示為DACTl轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細胞的比值。為了測量細胞侵襲活性，利用BD BioCoat?Growth Factor ReducedMATRIGEL? Invasion Chamber(BD Biosciences)進行穿孔(Transwell)測定。
[0203]體內(nèi)腫瘤發(fā)生
[0204]為了產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒，用pBABE-puro-DACT I α或pBABE-puro空載體、兩種包裝質(zhì)粒 pUMVC (Addgene)和 pCMV-VSV-G (Addgene)以 1: 0.9:0.1 的比例共轉(zhuǎn)染 293FT 細胞(InvitiOgen)。轉(zhuǎn)染后24小時時，向細胞提供新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48小時時，收集含有逆轉(zhuǎn)錄病毒pBABE-puro-DACTl α或pBABE-puro對照的上清液，并保存于-80 ° C。為了產(chǎn)生穩(wěn)定的表達DACTl α的細胞系和對照細胞系，向BGC823細胞添加含有逆轉(zhuǎn)錄病毒pBABE-puro-DACTl α或pBABE-puro對照的上清液。轉(zhuǎn)導24小時之后，移出含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，并換成含有0.5 μ g/ml抗生素嘌呤霉素(Invitrogen)的新鮮培養(yǎng)基用于選擇。將穩(wěn)定表達DACTl的細胞或?qū)φ誃GC823細胞(0.2mL PBS中的5X IO5細胞)經(jīng)皮下分別注射入4周齡雄性Balb/c裸鼠(4/組)的左背側(cè)或右背側(cè)。每隔3天測量腫瘤體積直到第3周。通過測量腫瘤的最長直徑和最短直徑來估算腫瘤體積(mm3)，并按如下計算:體積=(最短直徑)2X (最長直徑)X0.5。動物看護及所有的實驗方案都經(jīng)香港中文大學動物倫理委員會批準。3周后，處死小鼠，對腫瘤進行稱重，并將其在福爾馬林中固定用于組織學分析。
[0205]統(tǒng)計學分析
[0206]數(shù)據(jù)表示為平均值土標準差(SD)。利用獨立學生t檢驗來比較2個預選組之間的差異。小鼠細胞生長曲線或腫瘤生長率的差異通過變量重復測量分析(ANOVA)來確定。利用皮爾遜卡方檢驗(Pearson’ s ch1-square test)比較DACTl甲基化和胃癌患者臨床生理學特征之間的相互關(guān)系。Kaplan-Meier存活曲線和對數(shù)秩檢驗用于評價對應于DACTl甲基化狀態(tài)的整體存活數(shù)據(jù)。當P小于0.05時，認為數(shù)據(jù)是統(tǒng)計學顯著的；當P小于0.01時，認為數(shù)據(jù)是統(tǒng)計學非常顯著的。
[0207]結(jié)果
[0208]胃癌中DACTl的沉默或下調(diào)
[0209]DACTl在大多數(shù)人類組織中表達
[0210]DACTl在所檢測的所有正常成人組織和胎兒組織以及正常人胃上皮細胞系(GESl)中表達(圖1A)。
[0211]癌細胞系中DACTl受到表觀遺傳抑制
[0212]10種肺癌細胞系中有9種的DACTl的mRNA表達被沉默或降低。為了闡述啟動子甲基化在DACTl下調(diào)中的作用，通過MSP檢測DACTl甲基化狀態(tài)。在5種沉默細胞系(KatoII1、AGS、MKN45、SNU719、MGC803)中觀察到甲基化，但在正常的胃上皮細胞GESl中沒有檢測到(圖1B)。通過BGS證實DACTl甲基化狀態(tài)。BGS結(jié)果與MSP的結(jié)果一致，其中在甲基化的細胞系(MKN45和KatoIII)中發(fā)現(xiàn)密集的甲基化，但在非甲基化的MKN28和正常胃組織(圖2)中未發(fā)現(xiàn)。
[0213]在脫甲基處理之后，DACTl表達能被恢復
[0214]為了測試甲基化是否能直接介導DACTl沉默，用去甲基化試劑5-Aza處理三種沉默的細胞系(MKN28、AGS、KatoIII)。該處理恢復了 AGS和KatoIII細胞系中的DACTl表達(圖3)，推測胃癌細胞中DACTl的轉(zhuǎn)錄沉默由啟動子甲基化介導。
[0215]功能測定
[0216]DACTl α對細胞增殖的抑制
[0217]通過集落形成測定和細胞生長曲線，在不表達DACTl α的細胞系(AGS、BGC823和MGC803)中檢測DACTla對細胞生長的體外生物學效應。三種轉(zhuǎn)染DACTl α的細胞中所形成的集落在數(shù)量上顯著少于轉(zhuǎn)染對照載體的細胞，在大小上顯著小于轉(zhuǎn)染對照載體的細胞(圖4)。伴隨這一發(fā)現(xiàn)，AGS細胞中DACTl α的異常表達顯著降低了細胞生長曲線(圖5)。集落形成測定和細胞生長曲線測定兩者有力地證實了 DACTl α能夠體外抑制GC細胞的細胞生長。
[0218]DACTl α對細胞凋亡的誘導
[0219]為了檢驗凋亡對所觀察到的轉(zhuǎn)染DACTla的細胞的生長抑制的貢獻，通過利用膜聯(lián)蛋白V-APC和7-AAD雙染色的流式細胞術(shù)來確定細胞凋亡。結(jié)果表明，與對照載體轉(zhuǎn)染的細胞中的早期凋亡細胞的數(shù)量相比，轉(zhuǎn)染DACTla的細胞中的早期凋亡細胞的數(shù)量增加(BGC823:2.73%±0.05% 對 3.60%±0.45%, P=0.03 ；MGC803:2.36%±0.25% 對
3.63%± 0.25%)。
[0220]DACTla抑制胃癌細胞鋪展、遷移和侵襲
[0221]DACTla的再表達顯示出細胞鋪展的顯著減少(圖6A)。與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染DACTla的BGC823(P〈0.01)和MGC803細胞(P=0.001)中單個細胞的鋪展程度基本上被抑制(圖6A)。同時，通過若丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色，DACTl α抑制BGC823和MGC803細胞中的肌動蛋白微絲形成(圖6B)。DACTla再表達使在AGS和MGC803細胞邊緣顯示出細胞遷移刮出的“傷口”變慢(圖6C)。在24小時時的定量分析證實，與轉(zhuǎn)染載體的對照細胞相比，轉(zhuǎn)染DACTl α的AGS(P〈0.01)和MGC803 (P〈0.05)細胞中傷口閉合顯著降低(圖6C)。此外，如通過穿孔測定分別在AGS(P〈0.05)和MGC803(P〈0.01)細胞中所測量的，DACTl α顯著減弱了細胞侵襲能力(圖6D).[0222]體內(nèi)腫瘤抑制
[0223]通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒pBABE-puro-DACTl α或pBABE-puro對照轉(zhuǎn)染BGC823細胞并用嘌呤霉素選擇，來產(chǎn)生穩(wěn)定表達DACTl α的細胞系和對照細胞系。穩(wěn)定表達DACTl α的BGC823細胞或?qū)φ誃GC82 3細胞經(jīng)皮下注射入4周齡雄性Balb/c裸鼠的左背側(cè)或右背側(cè)，從而比較體內(nèi)的腫瘤生長模式。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 DACTla或空載體的BGC823的體內(nèi)腫瘤生長曲線如圖7A所示。DACTla轉(zhuǎn)染的裸鼠中的腫瘤體積顯著小于載體對照小鼠(P〈0.001)。在實驗結(jié)束時，分離腫瘤并稱重。DACTl α轉(zhuǎn)染的裸鼠中的平均腫瘤重量顯著低于載體對照小鼠(P〈0.01)(圖7B)，這表明DACTl α在胃癌發(fā)生中起到腫瘤抑制物的作用。
[0224]胃癌患者中的甲基化狀態(tài)
[0225]胃癌組織和正常胃組織中的甲基化狀態(tài)
[0226]在205份原發(fā)胃癌樣品和20份健康胃組織樣品中評估DACTl甲基化的臨床應用。在205個胃癌病例中，有29.3%(60/205)個病例檢測到DACTl部分且密集的啟動子甲基化，但在20份健康胃組織樣品中沒有甲基化(圖8A)。
[0227]DACTl甲基化和臨床特征間的關(guān)聯(lián)性
[0228]DACTl甲基化與晚期腫瘤大小(P〈0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P〈0.05)和遠端轉(zhuǎn)移(P=0.05)相關(guān)(表2)。DACTl甲基化在TNM III/IV期比I/II期病例頻繁(Ρ〈0.0005)(表2)。而且，如在Kaplan-Meier存活曲線中顯示，具有DACTl甲基化的胃癌患者與沒有DACTl甲基化的胃癌患者相比，具有顯著更短的存活期(P=0.007，對數(shù)秩檢驗)(圖SB).[0229]將本申請中引用的所有專利、專利申請以及其它出版物(包括GenBank登錄號)的全文通過引用并入本文，并用于所有目的。[0230]表1.本研究中所用的引物的DNA序列
[0231]
【權(quán)利要求】
1.檢測個體胃癌的方法，其包括以下步驟: (a)測量取自所述個體的樣品中DACTl的表達水平；以及 (b)將在步驟(a)中所獲得的表達水平與標準對照進行比較， 其中與標準對照比較時，DACTl表達水平的下降指示所述個體患有胃癌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是胃粘膜樣品。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DACTl的表達水平是DACTl蛋白水平。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DACTl的表達水平是DACTlmRNA水平。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中步驟(a)包括利用能特異性結(jié)合DACTl蛋白的抗體進行免疫測定。
6.如權(quán)利要求5所述的方法,其中步驟(a)包括Western印跡分析。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)包括質(zhì)譜測量或與微陣列、熒光探針或分子信標雜交。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(a)包括擴增反應。
9.如權(quán)利要求8所述 的方法，其中所述擴增反應是聚合酶鏈式反應(PCR)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述PCR是逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)。
11.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述檢測步驟包括多核苷酸雜交測定。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述多核苷酸雜交測定是Southern印跡分析或Northern印跡分析。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述多核苷酸雜交測定是原位雜交測定。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中多核苷酸探針用于所述多核苷酸雜交測定中與SEQ ID NO: 1、4或6或以上的互補物雜交。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多核苷酸探針包含可檢測的部分。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，當所述個體被指示患有胃癌時，其還包括在一段時間之后利用來自所述個體的相同類型的樣品重復步驟(a)，其中在所述一段時間之后DACTl表達水平與最初的步驟(a)的量相比增加指示胃癌的改善，而降低則指示胃癌的惡化。
17.檢測個體胃癌的方法，其包括以下步驟: (a)用差異修飾甲基化DNA和非甲基化DNA的試劑處理取自所述個體的樣品；以及 (b)確定含CpG的基因組序列中的每一個CpG是甲基化的還是非甲基化的，其中所述含CpG的基因組序列是SEQ ID NO:1或6的至少一個區(qū)段并且包含至少一個CpG， 其中所述含CpG的基因組序列中存在一個甲基化CpG指示所述個體患有胃癌。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述含CpG的基因組序列包含兩個或更多個CpG，并且其中所有CpG中的至少50%被甲基化指示所述個體患有胃癌。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述含CpG的基因組序列是SEQID NO:1或6的至少15個連續(xù)核苷酸的區(qū)段。
20.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述含CpG的基因組序列是SEQID NO:1或6的至少20個連續(xù)核苷酸的區(qū)段。
21.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述含CpG的基因組序列是SEQID NO:1或6的至少50個連續(xù)核苷酸的區(qū)段。
22.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述含CpG的基因組序列是SEQID NO:1或6。
23.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述含CpG的基因組序列是SEQIDNO:6,并且其中所有CpG中的至少5個被甲基化指示所述個體患有胃癌。
24.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述樣品是胃粘膜樣品。
25.如權(quán)利要求17所述的方法，當所述個體被指示患有胃癌時，其還包括在一段時間之后利用來自所述個體的相同類型的樣品重復步驟(a)和(b)，其中在所述一段時間之后甲基化CpG數(shù)量與最初的步驟(b)中確定的甲基化CpG的數(shù)量相比增加指示胃癌的惡化，而降低則指示胃癌的改善。
26.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述能差異修飾甲基化DNA和非甲基化DNA的試劑是優(yōu)先切割甲基化DNA的酶、優(yōu)先切割非甲基化DNA的酶或亞硫酸氫鹽。
27.如權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟(b)包括擴增反應。
28.如權(quán)利要求17所述的方法，其中步驟(b)包括DNA分子的測序。
29.用于檢測個體胃癌的試劑盒，包含(I)提供DACTl蛋白或DACTlmRNA的平均量的標準對照；以及⑵能特異且定量鑒定DACTl蛋白或DACTlmRNA的試劑。
30.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述試劑是能特異性結(jié)合DACTl蛋白的抗體。
31.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述試劑是能與所述DACTlmRNA雜交的多核苷酸探針。
32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中所述多核苷酸探針具有SEQIDN0:1、4或6或以上的互補物所示的核苷酸序列。
33.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述試劑包含可檢測的部分。
34.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其還包括能在擴增反應中特異性擴增SEQID NO:2或3或其互補物的至少一個區(qū)段的兩條寡核苷酸引物。
35.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其還包括操作手冊。
36.抑制胃癌細胞生長的方法，其包括將所述胃癌細胞與有效量的包含SEQID N0:5所示的氨基酸序列的多肽或包含編碼SEQ ID NO: 5的多核苷酸序列的核酸接觸。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述核酸是包含與所述編碼SEQ IDN0:5的多核苷酸序列可操作地連接的啟動子的表達盒。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述啟動子是上皮細胞特異性啟動子。
39.如權(quán)利要求36或37所述的方法，其中所述核酸包含SEQID N0:2或3所示的核苷酸序列。
40.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述胃癌細胞位于患者體內(nèi)。
41.分離的核酸，其具有與SEQID NO: 1、2、3、4或6或以上的互補物的約20-100個連續(xù)核苷酸的區(qū)段至少95%—致的核苷酸序列。
42.如權(quán)利要求41所述的核酸，其具有與SEQID N0:l、2、3、4或以上的互補物的約20-100個連續(xù)核苷酸的區(qū)段一致的核苷酸序列。
43.如權(quán)利要求41或42所述的核酸，其與可檢測的部分綴合。
【文檔編號】G01N33/68GK103627785SQ201210549153
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月16日
【發(fā)明者】于君, 沈祖堯, 王世研 申請人:香港中文大學