本發(fā)明屬于檢測(cè)分析及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及三角形和十字形的dna折紙結(jié)構(gòu)作為探針對(duì)相同序列的目標(biāo)基因的特異性標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)形和線(xiàn)形dna的高分辨基因序列的定位。

背景技術(shù)：

基因定位(genemapping)是基因組測(cè)序、醫(yī)療診斷和病原菌鑒定等領(lǐng)域中的重要手段，包括在染色體上定位基因片段以及測(cè)定基因在染色體上線(xiàn)性排列的順序和距離這兩個(gè)方面。根據(jù)形態(tài)性狀不同進(jìn)行標(biāo)記和利用同工酶標(biāo)記是兩種主要的傳統(tǒng)基因定位方式，基于基因表達(dá)的結(jié)果來(lái)間接反映標(biāo)記效果。近幾十年中，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)蓬勃發(fā)展，一種新興的遺傳標(biāo)記技術(shù)正日漸成熟，那就是dna分子標(biāo)記(dnamapping)。dna分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是dna水平遺傳變異的直接反映。和形態(tài)標(biāo)記及同工酶標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性：①它們對(duì)表型無(wú)影響；②大多數(shù)的分子標(biāo)記是共顯性的，對(duì)隱性性狀的選擇十分便利；③由于基因組dna的變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的。分子標(biāo)記的所有這些特征，奠定了它具有廣泛的應(yīng)用性基礎(chǔ)。

在dna納米技術(shù)領(lǐng)域，為實(shí)現(xiàn)dna分子標(biāo)記，奠基人seeman教授曾利用dna折紙實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性可視化。dna折紙首先由著名科學(xué)家rothemund提出，他利用一條m13mp18噬菌體環(huán)狀單鏈dna為骨架鏈(scaffold)，設(shè)計(jì)合成216條訂書(shū)釘鏈與骨架鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而有效地折疊成二維結(jié)構(gòu)，即dna折紙。dna折紙具有很好的位點(diǎn)可尋址性且位點(diǎn)間的“分辨率”可以達(dá)到4-6nm。利用熒光分子實(shí)現(xiàn)dna分子標(biāo)記是基于dna納米技術(shù)的另一種應(yīng)用技術(shù)。利用核酸內(nèi)切酶作用于單分子dna，再通過(guò)dna聚合酶發(fā)揮作用并攜帶熒光分子標(biāo)記在特定位點(diǎn)，并在全內(nèi)置反射熒光顯微鏡下觀察?；跓晒夥肿訕?biāo)記的dna分子標(biāo)記方法，與dna折紙?zhí)结樀奶禺愋詷?biāo)記相比，其分辨率受限于光學(xué)衍射極限的限制。而dna折紙?zhí)结樉哂袠?gòu)象的多樣性和修飾位點(diǎn)的可尋址性，在原子力顯微鏡可實(shí)現(xiàn)高分辨率的直接可視化觀察。

本發(fā)明基于dna折紙技術(shù)，獲得了一種新型的納米探針，該探針可用于特異性識(shí)別dna序列。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種新型的用于特異性識(shí)別dna序列的納米探針及其應(yīng)用方法，可以實(shí)現(xiàn)單分子dna上具有相同序列的基因的定位。

本發(fā)明提供一種用于特異性識(shí)別dna序列的納米探針，所述探針為dna折紙?zhí)结?，具有三角形或十字形結(jié)構(gòu)。

所述dna折紙?zhí)结槹凑誶othemund和seeman的方法制備，并使用100kda超濾管離心除去多余的訂書(shū)釘鏈或瓊脂糖電泳純化并利用freeze’nsqueezedna凝膠抽提離心柱(freeze’nsqueezednagelextractionspincolumns)濃縮回收。

本發(fā)明還提供上述用于特異性識(shí)別dna序列的納米探針的應(yīng)用方法，所述方法包括以下步驟：

步驟一：制備dna折紙?zhí)结?；按照rothemund和seeman的方法制備折紙，并使用100kda超濾管離心除去多余的訂書(shū)釘鏈或瓊脂糖電泳純化并利用freeze’nsqueezednagelextractionspincolumns濃縮回收；

步驟二：構(gòu)建基于閉合環(huán)狀單鏈dna的phix174模型或線(xiàn)性雙鏈dna的lambda模型；構(gòu)建模型時(shí)采用由三部分組成的“雙嵌段”dna引物，一部分與目標(biāo)dna特定位點(diǎn)結(jié)合并有效地延伸，另一部分與dna折紙?zhí)结橂s交，中間通過(guò)一小段spacer鏈將這兩部分連接起來(lái)；且在延伸單鏈形成雙鏈的過(guò)程利用vent(exo^-)dna聚合酶。

步驟三：折紙?zhí)结樀奶禺愋詷?biāo)記；將過(guò)量dna折紙?zhí)结樑c標(biāo)記有特定雙嵌段引物的目標(biāo)dna分子混合反應(yīng)12小時(shí)以上；

步驟四：原子力顯微鏡下成像觀察。

步驟一中，所述不同構(gòu)象的dna折紙?zhí)结?，基于折紙結(jié)構(gòu)的可塑性和可尋址性，可以選擇任意形狀、任意修飾的dna折紙?zhí)结?，進(jìn)行目標(biāo)基因的多色標(biāo)記。

所述步驟二中，設(shè)置引物部分和捕獲鏈部分的序列長(zhǎng)度，形成多個(gè)組合的雙嵌段引物，并用于延伸phix174閉合環(huán)狀單鏈dna，探索該雙嵌段引物的延伸效果。

所述步驟二中，延伸phix174單鏈形成雙鏈的過(guò)程利用vent(exo^-)dna聚合酶，其既沒(méi)有5’到3’的核酸外切酶活性也不具有3’到5’的核酸外切酶校讀活性，盡管這樣會(huì)對(duì)其保真性有一定的影響，但這能保證在延伸過(guò)程中上游的延伸不會(huì)將下游的引物取代下來(lái)而保證標(biāo)記的可靠性。

所述步驟四中，具體包括，3μl的樣品滴在新剝離云母片上，靜置吸附約3分鐘后利用氮?dú)獯蹈捎诙嗄Ｊ?型afm(nanoscope5型控制器，bruker公司)氣相條件下觀察。

所述步驟四中，所述的原子力顯微鏡下進(jìn)行觀察，標(biāo)記有dna折紙?zhí)结樀哪繕?biāo)dna樣品很容易彎曲折疊，因此需要經(jīng)過(guò)舒展操作處理。這一方法類(lèi)似“分子梳”的過(guò)程，采用含有二價(jià)陽(yáng)離子的1×tae/mg²⁺作為緩沖液，將樣品在云母表明吸附一定時(shí)間后，利用水流的作用和陽(yáng)離子緩沖液環(huán)境下的吸附力的平衡作用將目標(biāo)dna舒展開(kāi)來(lái)，從而得到清晰明朗的afm圖。

利用原子力顯微鏡對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)之間的距離進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以實(shí)現(xiàn)高分辨率的具有相同序列的基因片段的精確定位，具體實(shí)例中可將分辨率提高到約11nm和7.5nm，能夠有效地解決利用熒光分子標(biāo)記在電子顯微鏡下觀察受限于光學(xué)衍射極限限制的問(wèn)題。

所述用于特異性識(shí)別dna序列的納米探針的應(yīng)用方法，不僅能夠?qū)﹂]合環(huán)狀的單鏈dna進(jìn)行相同序列基因片段的定位，而且還適用于普遍存在的線(xiàn)性雙鏈dna。

對(duì)于lambdadna來(lái)說(shuō)，它本身是雙鏈線(xiàn)形結(jié)構(gòu)，如果直接對(duì)其進(jìn)行引物延伸，會(huì)對(duì)標(biāo)記的效率和特異性產(chǎn)生較大的影響，這就需要利用lambda外切酶先將雙鏈變成單鏈。

在構(gòu)建線(xiàn)性雙鏈dna的lambda模型后，用折紙?zhí)结槍?duì)其進(jìn)行特異性標(biāo)記前，需要對(duì)線(xiàn)性雙鏈dna進(jìn)行處理，其處理過(guò)程如下：

(1)將目標(biāo)線(xiàn)性雙鏈dna序列由雙鏈變?yōu)閱捂?，采用的是不?duì)稱(chēng)修飾引物pcr的方法，設(shè)置長(zhǎng)片段pcr程序擴(kuò)增長(zhǎng)片段目標(biāo)序列，得到與目標(biāo)單鏈互補(bǔ)的ssdna且5’端磷酸化，在lambda外切酶的作用下可以將5’端磷酸化的單鏈dna消化掉，從而得到待檢測(cè)的目標(biāo)dna；

(2)將相應(yīng)的雙嵌段引物和上游引物加入后，經(jīng)過(guò)pcr退火和延伸，雙嵌段引物可以特異性地與相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合。

本發(fā)明基于dna折紙標(biāo)記的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)形和線(xiàn)形dna上具有相同序列的基因片段的定位。本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)基于dna折紙標(biāo)記。由于dna折紙可以實(shí)現(xiàn)幾乎任意形狀的結(jié)構(gòu)，且具有修飾位點(diǎn)的可尋址性，我們可以設(shè)計(jì)各種不同的折紙?zhí)结樣糜谀繕?biāo)基因的多色標(biāo)記；

(2)可實(shí)現(xiàn)高分辨率的基因片段的定位。原子力顯微鏡技術(shù)具有原子級(jí)超高分辨率，而利用dna折紙技術(shù)可以構(gòu)建更小尺寸、在原子力顯微鏡下可識(shí)別的折紙?zhí)结?，可以?shí)現(xiàn)對(duì)相同序列的基因片段的精確定位；

(3)直接可視化定位技術(shù)。利用原子力顯微鏡成像技術(shù)可以通過(guò)對(duì)dna折紙形狀和結(jié)構(gòu)的區(qū)分來(lái)確定其對(duì)應(yīng)的信息，并結(jié)合快速掃描的原子力顯微成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)更高通量的基因定位；

(4)可對(duì)單個(gè)dna分子的基因定位分析。利用單分子生物物理的技術(shù)，如分子梳、原子力顯微鏡成像等，可以將單個(gè)dna分子舒展開(kāi)并得到有效信息。

這一方法為單分子dna上基因片段的定位研究提供了一種有效的途徑，未來(lái)的發(fā)展目標(biāo)是對(duì)整條染色體基因組直接進(jìn)行基因分析，基于這一方法我們也可以為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提出有意義的探索。

附圖說(shuō)明

下面將結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：

圖1a為本發(fā)明的實(shí)施例1中雙嵌段引物的設(shè)計(jì)示意圖；

圖1b為本發(fā)明的實(shí)施例1中雙嵌段引物延伸phix174單鏈dna形成雙鏈dna的瓊脂糖凝膠電泳圖(m：15000bpmarker；c:ssdna；o:dsdna)；

圖2a為本發(fā)明的實(shí)施例2三角形和十字形折紙的構(gòu)建以及形成的基于phix174的模型；

圖2b為本發(fā)明的實(shí)施例3中基于phix174的模型從雙嵌段引物的延伸到折紙?zhí)结樀臉?biāo)記示意圖；

圖3a為本發(fā)明的實(shí)施例3中三角形dna折紙對(duì)phix174特定位點(diǎn)的高分辨率特異性標(biāo)記的示意圖；

圖3b為本發(fā)明的實(shí)施例3中三角形和十字形dna折紙對(duì)phix174特定位點(diǎn)的高分辨率特異性標(biāo)記的示意圖；

圖4為本發(fā)明的實(shí)施例4中，基于lambdadna的模型從雙嵌段引物的延伸到折紙?zhí)结樀臉?biāo)記示意圖；

圖5為本發(fā)明所述用于特異性識(shí)別dna序列的納米探針的應(yīng)用方法的示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，其中圖5為本發(fā)明所述用于特異性識(shí)別dna序列的納米探針的應(yīng)用方法的示意圖。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例是關(guān)于不同長(zhǎng)度的雙嵌段引物延伸閉合環(huán)狀單鏈phix174dna模型的建立，其具體操作為：

(1)圖1中的a為構(gòu)建的雙嵌段引物，primer部分與目標(biāo)dna特定位點(diǎn)結(jié)合并有效地延伸，capturer部分與dna折紙?zhí)结橂s交，中間通過(guò)spacer部分的一小段單鏈連接起來(lái)。固定capturer部分的序列長(zhǎng)度為20nt(y＝20nt)，設(shè)置primer部分的序列長(zhǎng)度分別為20nt、17nt、14nt、12nt、10nt、8nt、6nt(x＝20nt、17nt、14nt、12nt、10nt、8nt、6nt)，探索不同長(zhǎng)度的引物對(duì)于phix174dna的延伸效果。30μl反應(yīng)體系中，phix174模板鏈6μl、vent(exo^-)酶0.8μl、10×thermopol緩沖液3μl、雙嵌段引物(10μm)2μl、dnt混合液(2.5mm)2μl、超純水16.2μl?；旌暇鶆?。

(2)將步驟(1)中的混合溶液置于pcr儀中從92℃開(kāi)始高溫變性，在65℃～80℃條件下30個(gè)循環(huán)梯度退火，72℃下維持5min后自然降溫到4℃保存。

(3)將步驟(2)中得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行0.5％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳時(shí)間100min、電壓為80v。

(4)電泳結(jié)束后，染膠后凝膠成像儀下觀察。發(fā)現(xiàn)當(dāng)x＝20nt、17nt、14nt、12nt、10nt時(shí)，單鏈phix174延伸成雙鏈；而x＝8nt、6nt時(shí)，未能延伸成雙鏈。對(duì)形成的目標(biāo)條帶(即形成的雙鏈模型)割膠回收，利用freeze'nsqueezednagelextractionspincolumns進(jìn)行抽提。割回的膠條帶放入冷凍離心柱并于-20℃下冷凍5分鐘，之后13000g下離心3分鐘，收集到的溶液即為所需的基于phix174的雙鏈模型，如圖2中的a所示。

其中，圖1中a設(shè)計(jì)的雙嵌段引物，涉及到的capturer部分為20nt(y＝20nt)，其序列為：5’-attctgcttgagagagcgac-3’；涉及到的primer部分為20nt、17nt、14nt、12nt、10nt、8nt、6nt(x＝20nt、17nt、14nt、12nt、10nt、8nt、6nt)，其堿基序列分別為：5’-tacggtcaggcatccacggc-3’、5’-ggtcaggcatccacggc-3’、5’-ggtcaggcatccac-3’、5’-aaacggcagaag-3’、5’-cagtcgggag-3’、5’-gtcgggag-3’、5’-tcaacg-3’。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例是關(guān)于三角形和十字形dna折紙?zhí)结樀脑O(shè)計(jì)及制備，其具體操作為：

(1)將m13mp18噬菌體環(huán)狀單鏈dna、100多條未修改的訂書(shū)釘鏈、末端修飾捕獲鏈的訂書(shū)釘鏈按照1:10:10的摩爾比進(jìn)行混合，即加入的體積分別為2.5μl、5μl、5μl，然后加入10μl10×tae-mg²⁺緩沖液(mg²⁺濃度12.5mol/l)，補(bǔ)超純水至最終體積為100μl，震蕩搖勻。

(2)將步驟(1)中的混合溶液置于pcr儀中以0.1℃/10s的速率從95℃～20℃退火，反應(yīng)后使用100kda超濾管離心除去多余的訂書(shū)釘鏈或者通過(guò)瓊脂糖電泳純化并利用freeze'nsqueezednagelextractionspincolumns濃縮回收，4℃放置待用。

其中，對(duì)于1292和2710兩個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的三角形折紙的tria65、trib65、tric65末端修飾的捕獲鏈序列為：5’-gtcgctctctcaagcagaat-3’；對(duì)于468和3216兩個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記的十字形折紙的croau6、croad1、croal6、croar1末端修飾的捕獲鏈序列為：5’-gtgctgacacggcctgatcc-3’，形成的三角形折紙和十字形折紙如圖2中的a所示。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例是關(guān)于dna折紙?zhí)结槍?duì)phix174相同基因片段的特異性標(biāo)記以及近距離的高分辨標(biāo)記，其具體操作為：

(1)將過(guò)量dna折紙?zhí)结樑c標(biāo)記有特定雙嵌段引物的目標(biāo)dna分子混合，置于裝有2l45℃的水的密閉泡沫盒中，自然降溫反應(yīng)12小時(shí)以上。從雙嵌段引物的延伸到折紙?zhí)结樀臉?biāo)記，如圖2中的b所示。

(2)步驟(1)得到的產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)后在原子力顯微鏡下進(jìn)行觀察。將3μl的樣品滴在新剝離云母片上，靜置吸附約3分鐘后利用氮?dú)獯蹈捎诙嗄Ｊ?型afm(nanoscope5型控制器，bruker公司)氣相條件下觀察。

(3)對(duì)于3427和3460、1900和1922的近距離高分率標(biāo)記，進(jìn)行同樣的操作。折紙?zhí)结樀臉?biāo)記結(jié)果示意圖如圖3所示。

其中，1292和2710位點(diǎn)的雙嵌段引物序列為：5’-attctgcttgagagagcgactttttcagtcgggag-3’；468和3216位點(diǎn)的雙嵌段引物序列為：5’-ggatcaggccgtgtcagcactttttaaacggcagaag-3’；3427和3460位點(diǎn)的雙嵌段引物序列為：5’-attctgcttgagagagcgactttttgcaatctctt-3’；1900和2898位點(diǎn)的雙嵌段引物序列為：5’-attctgcttgagagagcgactttttaatctcttta-3’；1922和4968位點(diǎn)的雙嵌段引物序列為：5’-ggatcaggccgtgtcagcactttttcacctttagc-3’，其中標(biāo)記位點(diǎn)3427和3460之間的分辨率約11nm，1900和1922之間的分辨率約為7.5nm。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例是關(guān)于所述用于特異性識(shí)別dna序列的納米探針在線(xiàn)形雙鏈dna中的應(yīng)用，其具體操作為：

(1)如圖4，首先選取lambdadna中的一段19kb的基因片段，利用軟件primer5.0設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增。其中設(shè)計(jì)的上游引物的5’端磷酸化處理，下游引物不做修飾。設(shè)置長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增程序：①94℃，1min；②94℃，20s；50℃，30s；68℃，20min；(設(shè)置10個(gè)循環(huán))③94℃，20s；50℃，30s；68℃，20min；68℃，10s；(設(shè)置20個(gè)循環(huán))④68℃，10min；逐漸降溫到4℃保存。50μl反應(yīng)體系中，lambdadna(2ng/μl)0.5μl、taqdna聚合酶0.5μl、taq緩沖液10μl、dnt混合液(2.5mm)1μl、上游引物(10μm)0.5μl、下游引物(10μm)0.5μl、超純水37μl?；旌暇鶆?。

(2)步驟(1)pcr擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行酶切，在lambda外切酶的作用下可以將磷酸化處理的單鏈dna酶切消化掉，從而得到待檢測(cè)的目標(biāo)dna。30μl反應(yīng)體系中，擴(kuò)增產(chǎn)物12μl、10×核酸外切酶反應(yīng)緩沖液3μl、lambda核酸外切酶2μl、超純水13μl。混合均勻。混合溶液置于37℃下孵育6小時(shí)，然后75℃下10min使得外切酶失活。

(3)步驟(2)得到的產(chǎn)物與雙嵌段引物混合后退火延伸。30μl反應(yīng)體系中，酶切產(chǎn)物12μl、10×thermopol緩沖液3μl、雙嵌段引物(10μm)2μl、超純水13μl?；旌暇鶆??；旌弦阂?.1℃/10s的速率于90℃～25℃退火后，再向反應(yīng)體系中加入dnt混合液(2.5mm)2μl、vent(exo^-)酶1μl，并于68℃孵育1小時(shí)。線(xiàn)性擴(kuò)增的產(chǎn)物和最后延伸的產(chǎn)物均需要用瓊脂糖凝膠電泳純化以出去多余的引物、核苷酸、酶、鹽及其他雜質(zhì)。

(4)將過(guò)量三角形折紙?zhí)结樑c標(biāo)記有特定雙嵌段引物的目標(biāo)dna分子混合，置于裝有2l45℃的水的密閉泡沫盒中，自然降溫反應(yīng)12小時(shí)以上。

(5)3μl的樣品滴在新剝離云母片上，靜置吸附約3分鐘后利用氮?dú)獯蹈捎诙嗄Ｊ?型afm(nanoscope5型控制器，bruker公司)氣相條件下觀察。采用含有二價(jià)陽(yáng)離子的1×tae/mg²⁺作為緩沖液，將樣品在云母表明吸附一定時(shí)間后，利用水流的作用和陽(yáng)離子緩沖液環(huán)境下的吸附力的平衡作用將目標(biāo)dna舒展開(kāi)來(lái)，在原子力顯微鏡下成像觀察。其中19kb序列包含四個(gè)具有相同dna序列的基因片段

最后需要說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明所限定的范圍。