本發(fā)明涉及一種檢測異尖線蟲的引物和探針序列，尤其是涉及一種用于簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp-lfd檢測的引物和探針序列。

背景技術：

異尖線蟲（anisakisspp.）通常寄生于硬骨魚類的內臟和肌肉組織中，當人食用生的、半成品的或者腌制的魚時會引起過敏癥狀，導致異尖線蟲病。隨著食用生鮮魚片的普及，異尖線蟲病發(fā)病率逐年增加。2013年《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》將異尖線蟲病列為二類傳染病，這種傳染病在一定程度上限制了海產品的進出口貿易（http://www.aqsiq.gov.cn）。異尖線蟲病的感染主要與簡單異尖線蟲（a.simplex）相關。研究表明，異尖線蟲有三個姐妹種，分別為簡單異尖線蟲（a.simplexs.str.）、派氏異尖線蟲（a.pegreffii）和c型異尖線蟲（a.simplexc）三種，其中簡單異尖線蟲和派氏異尖線蟲分布非常廣泛，有研究表明簡單異尖線蟲和派氏異尖線蟲在魚類和頭足類動物中感染率達到80％。而且，這兩種線蟲在中國的寄生較為廣泛。因此，建立快速、準確、靈敏的檢測簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的新方法，對于疾病的早期診斷和預警、實時監(jiān)測，具有重要的意義。

目前，異尖線蟲物種主要通過傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察來鑒定。然而，此方法檢測周期較長，且需要專業(yè)人士進行操作。近年來，國內外有許多學者建立了基于pcr的分子鑒定手段：sscp法，常規(guī)pcr，多重pcr，pcr-rflp和核糖體dna和線粒體dna測序法。這些分子的方法都需要復雜的儀器設備和專業(yè)的技術人員。

notomi報道的環(huán)介導的等溫擴增（lamp）可在等溫條件下更加快速和便捷的完成檢測，這項技術吸引了各個領域的關注。lamp產物可通過瓊脂糖凝膠電泳（age）顯現(xiàn)的梯狀條帶，裸眼觀察濁度計和核酸染色（sybrgreeni，鈣黃綠素等）等方法檢測。雖然基于熒光的實時監(jiān)控也可方便直觀的檢測，但是實時熒光儀器的價格較高。橫向流動試紙條（lfd）是一種新型的方法，它能夠高效、準確的檢測lamp產物。利用生物素標記的lamp產物與異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，fitc）標記的探針進行特異性雜交，雜交產物與lfd上的抗fitc的抗體結合，形成免疫復合物。當其通過lfd的檢測線時會被生物素配體所捕獲，結合在檢測線；未被捕獲的將通過檢測線，結合在質控線上。這種方法最初應用于檢測水生病原體，病毒和細菌方面，如今在獸醫(yī)和植物病害的檢測中也得到了一定的應用。目前，國內外還未見報道將該技術應用于簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種檢測速度快，檢測成本低，檢測靈敏度和準確性高的用于簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的lamp-lfd檢測的引物和探針序列。

本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種用于簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的lamp-lfd檢測的引物和探針序列，其根據(jù)簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲（genbank登錄號：ku991876）的rdna-its2區(qū)段設計lamp的三對引物序列和一條探針序列，引物序列具體如下：

aniits-f3：5’-gaattgcagacacattgagc-3’

aniits-b3：5’-atagtagattcggtgttgacg-3’，

aniits-fip：5’-gtaattcgaccctcagccagacactaagaattcgaacgcaca-3’，

aniits-bip：5’-ctgtgaagcattcggcaagcaaccgctcgtcatattgtc-3’，

aniits-lf：5’-tgccatcgggaatgaacc-3’，

aniits-lb：5’-ttgctgttgtgttgttggtg-3’，

探針aniits-hp：5’-ggtgaactgtcttcacggtt-3’，

其中，aniits-fip的5’端為生物素標記；探針aniits-hp的5’端為異硫氰酸熒光素標記。

其用于檢測簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的具體檢測步驟如下：

1）配置lamp反應體系：反應體系各成分的終濃度分別為：外引物aniits-f3和aniits-b3各0.2μmol/l，內引物aniits-fip和aniits-bip各1.6μmol/l，環(huán)引物aniits-lf和aniits-lb各0.4μmol/l，dntps1.4mmol/l，ph8.8的tris-hcl20mmol/l，kcl10mmol/l，mgso46.5mmol/l，(nh4)2so410mmol/l，tritonx-1000.1%，8ubstdna聚合酶大片段(newenglandbiolabs)和2μl樣品模板，加雙蒸水使反應體系總體積為25μl；

2）lamp反應體系擴增：將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為63℃，擴增反應時間為40min；

4）探針雜交和lfd檢測：擴增后將20pmol的探針aniits-hp加入反應體系中，63℃溫育5min，進行雜交，取5μl雜交液加入100μl緩沖液中混勻，然后將lfd試紙條浸入加入雜交液的緩沖液中顯色，判斷橫向流動試紙條檢測lamp擴增的結果。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、檢測靈敏度高，本方法基于單條簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲l3，檢測靈敏度為單體l3蟲體基因組的10^-5倍。

2、檢測時間短，擴增反應只需40min，從樣品基因組dna的提取到完成結果判斷，整個檢測可以在50min之內完成，比常規(guī)pcr檢測技術縮短超過1.5h，大幅度提高檢測速度。

3、特異性強，所用的特異性引物根據(jù)簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的rdna-its2區(qū)段的八個不同區(qū)域設計，并且還有dna的特異性探針，可有效避免利用瓊脂糖凝膠電泳、熒光染料等方法引起的假陽性問題。

4、儀器設備要求低，無需常規(guī)pcr所用的pcr儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)等，只需一個水浴鍋，即可完成檢測。

5、操作簡單，結果明顯，整個檢測過程不涉及復雜儀器和設備，稍具分子生物學基礎的人員即可完成操作；檢測結果清晰明顯，肉眼觀察即可判斷。

綜上所述，使用本發(fā)明的引物和探針采用lamp-lfd方法對簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲進行檢測，具有更高的快捷性、特異性和靈敏度，儀器需求簡單，可滿足基層檢測機構和現(xiàn)場疫源地檢測的需要。

附圖說明

圖1為簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp特異性實驗結果；m：100bpplusdnaladder(fermentas,美國)；nc：以雙蒸水作為模板；asi：以簡單異尖線蟲的基因組dna為模板，ape：以派氏異尖線蟲的基因組dna為模板，aph、aty、con、cmu、had、hfa、rlo、pde、aca、nme、alu、asu、hco、cel：分別以抹香鯨異尖線蟲、典型異尖線蟲、対盲囊線蟲、灰海鰻対盲囊線蟲、內彎宮脂線蟲、費氏宮脂線蟲、針蛔線蟲、偽地新線蟲、棘頭蟲、梅氏新貝尼登蟲、人蛔蟲、豬蛔蟲、捻轉血矛線蟲和秀麗隱桿線蟲的基因組dna為模板。

圖2為簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp-lfd特異性實驗結果；nc：以雙蒸水作為模板；asi：以簡單異尖線蟲的基因組dna為模板，ape：以派氏異尖線蟲的基因組dna為模板，aph、aty、con、cmu、had、hfa、rlo、pde、aca、nme、alu、asu、hco、cel：分別以抹香鯨異尖線蟲、典型異尖線蟲、対盲囊線蟲、灰海鰻対盲囊線蟲、內彎宮脂線蟲、費氏宮脂線蟲、針蛔線蟲、偽地新線蟲、棘頭蟲、梅氏新貝尼登蟲、人蛔蟲、豬蛔蟲、捻轉血矛線蟲和秀麗隱桿線蟲的基因組dna為模板。

圖3為簡單異尖線蟲lamp靈敏度實驗結果；m：100bpplusdnaladder(fermentas,美國)；nc：以雙蒸水作為模板；10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5：簡單異尖線蟲基因組dna作為模板。

圖4為簡單異尖線蟲lamp-lfd靈敏度實驗結果；nc：以雙蒸水作為模板；10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5：簡單異尖線蟲基因組dna作為模板。

圖5為派氏異尖線蟲lamp-lfd靈敏度實驗結果；nc：以雙蒸水作為模板；10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5：派氏異尖線蟲基因組dna作為模板。

圖6為簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp時間優(yōu)化實驗結果；m：100bpplusdnaladder(fermentas,美國)；nc：以雙蒸水作為模板；25、30、35、40、45、50、55和60min：簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲靈敏度基因組dna作為模板。

圖7為簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp-lfd時間優(yōu)化實驗結果；nc：以雙蒸水作為模板；25、30、35、40、45、50、55和60min：簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲靈敏度基因組dna作為模板。

具體實施方式

以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例1

lamp-lfd技術檢測簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的方法的建立

1.引物設計：根據(jù)ncbi中已經(jīng)發(fā)表的簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲rdna-its2（genbank登錄號：ku991876）的編碼序列進行設計，其中，引物序列具體如下：

aniits-f3：5’-gaattgcagacacattgagc-3’

aniits-b3：5’-atagtagattcggtgttgacg-3’，

aniits-fip：5’-gtaattcgaccctcagccagacactaagaattcgaacgcaca-3’，

aniits-bip：5’-ctgtgaagcattcggcaagcaaccgctcgtcatattgtc-3’，

aniits-lf：5’-tgccatcgggaatgaacc-3’，

aniits-lb：5’-ttgctgttgtgttgttggtg-3’，

探針aniits-hp：5’-ggtgaactgtcttcacggtt-3’，

其中，aniits-fip的5’端為生物素標記；探針aniits-hp的5’端為異硫氰酸熒光素標記。

2.樣品dna提?。焊魅湎x分離株單條蟲體經(jīng)70%乙醇處理，去除乙醇后，參照組織基因組dna提取試劑盒的方法進行。溶解于20μl無菌ddh2o用于lamp驗證。

3.簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp反應

利用步驟1設計的特異性引物，以簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲基因組dna為模板進行l(wèi)amp擴增。

3.1lamp反應體系，各成分的終濃度分別為：外引物aniits-f3和aniits-b3各0.2μmol/l，內引物aniits-fip和aniits-bip各1.6μmol/l，環(huán)引物aniits-lf和aniits-lb各0.4μmol/l，dntps1.4mmol/l，tris-hcl（ph8.8）20mmol/l，kcl10mmol/l，mgso46.5mmol/l，(nh4)2so410mmol/l，tritonx-1000.1%，8ubstdna聚合酶大片段(newenglandbiolabs)和2μl樣品模板，加雙蒸水使反應體系總體積為25μl；

3.2lamp反應條件：將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為63℃，擴增反應時間為60min。

4.探針雜交和lfd檢測：擴增后將20pmol的aniits-hp探針加入反應體系中，63℃溫育5min，進行雜交，取5μl雜交液加入100μlbuffer中混勻，然后將lfd試紙條浸入加入雜交液的buffer中顯色，判斷l(xiāng)amp的擴增情況。

實施例2

使用本發(fā)明的引物和探針進行簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp-lfd檢測的特異性測定

利用所設計的特異性引物和探針，分別以簡單異尖線蟲、派氏異尖線蟲、抹香鯨異尖線蟲、典型異尖線蟲、対盲囊線蟲、灰海鰻対盲囊線蟲、內彎宮脂線蟲、費氏宮脂線蟲、針蛔線蟲、偽地新線蟲、棘頭蟲、梅氏新貝尼登蟲、人蛔蟲、豬蛔蟲、捻轉血矛線蟲和秀麗隱桿線蟲等的基因組dna為模板，按上述實施例1的步驟3和步驟4進行l(wèi)amp-lfd反應，驗證引物和探針的特異性，雙蒸水作為陰性對照。結果如圖1和圖2所示，利用電泳法（圖1）和lfd（圖2）都只能從簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的基因組dna樣品中擴增獲得目的條帶，其它樣品無擴增條帶，說明使用本發(fā)明提供的引物和探針進行l(wèi)amp-lfd檢測，具有良好的特異性。

實施例3

使用本發(fā)明的引物和探針進行簡單異尖線蟲lamp-lfd檢測的靈敏度測定

采用上述實施例1的步驟2的方法提取簡單異尖線蟲l3的基因組dna，進行10倍梯度稀釋，選擇10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5：簡單異尖線蟲基因組作為模板，按上述實施例1的步驟3和步驟4進行l(wèi)amp-lfd反應，驗證引物和探針的靈敏度，雙蒸水作為陰性對照。結果如圖3和圖4所示，使用本發(fā)明提供的引物和探針進行的lamp-lfd檢測的靈敏度為單條蟲體基因組dna提取液的10^-4倍。由于簡單異尖線蟲l3基因組dna提取液的總體積為20μl，取2μl為模板進行l(wèi)amp反應，因此，可計算得lamp-lfd的靈敏度為單條蟲體基因組dna的10^-5倍，與lamp的擴增產物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的靈敏度一致（圖3）。

實施例4

使用本發(fā)明的引物和探針進行派氏異尖線蟲lamp-lfd檢測的靈敏度測定

采用上述實施例1的步驟2的方法提取派氏異尖線蟲l3的基因組dna，進行10倍梯度稀釋，選擇10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5：派氏異尖線蟲基因組作為模板，按上述實施例1的步驟3和步驟4進行l(wèi)amp-lfd反應，驗證引物和探針的靈敏度，雙蒸水作為陰性對照。結果如圖5所示，使用本發(fā)明提供的引物和探針進行的lamp-lfd檢測的靈敏度為單條蟲體基因組dna提取液的10^-4倍。由于派氏異尖線蟲l3基因組dna的總體積為20μl，取2μl為模板進行l(wèi)amp反應，計算得lamp-lfd的靈敏度為單條蟲體基因組dna的10^-5倍。

實施例5

使用本發(fā)明的引物和探針進行簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp-lfd檢測的時間優(yōu)化

采用上述實施例1的步驟2的方法提取簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲l3的基因組dna，選擇靈敏度濃度的基因組dna作為模板，按上述實施例1的步驟3和步驟4進行l(wèi)amp-lfd反應，將lamp反應時間分別設置為25、30、35、40、45、50和60min，雙蒸水作為陰性對照。結果如圖6和圖7所示，使用本發(fā)明提供的引物進行的lamp反應的最優(yōu)時間為40min；lamp產物添加探針并孵育后，lamp-lfd檢測可在50min內完成。

實施例6

用本發(fā)明lamp-lfd技術檢測魚臨床樣本中的簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲

1.待檢測樣品基因組dna提取

于寧波市批發(fā)市場購買海水魚若干條，解剖并分離內臟中的蠕蟲。蠕蟲用生理鹽水浸洗后進行形態(tài)學鑒定。然后，取單條蟲體，提取其基因組dna。

2.lamp反應體系配制及反應條件，按照實施例1步驟3進行。

3.lfd顯色，檢測結果判斷，按照實施例1步驟4進行。

4.利用pcr產物進行dna測序的方法進行鑒定

結果顯示，根據(jù)形態(tài)學特征得出檢測臨床樣本中蠕蟲多屬于異尖科線蟲（表1）。利用lamp-lfd方法發(fā)現(xiàn)簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的在臨床樣本中的感染率為94%。利用pcr結合測序方法鑒定得出一致的結果（表1）。表明本試驗建立的lamp-lfd方法可用于簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的現(xiàn)場檢測。

表1利用顯微觀察、lamp-lfd以及pcr結合dna測序方法對魚體樣品中簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲的檢測結果

注：“+”表示檢測結果陽性；“-”表示檢測結果陰性。

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發(fā)明的實質范圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發(fā)明的保護范圍。

序列表

<110>寧波大學

<120>用于簡單異尖線蟲/派氏異尖線蟲lamp-lfd檢測的引物和探針序列

<130>

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>aniits-f3

<400>1

gaattgcagacacattgagc20

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>aniits-b3

<400>2

atagtagattcggtgttgacg21

<210>3

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>aniits-fip

<400>3

gtaattcgaccctcagccagacactaagaattcgaacgcaca42

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>aniits-bip

<400>4

ctgtgaagcattcggcaagcaaccgctcgtcatattgtc39

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>aniits-lf

<400>5

tgccatcgggaatgaacc18

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>aniits-lb

<400>6

ttgctgttgtgttgttggtg20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>aniits-hp

<400>7

ggtgaactgtcttcacggtt20