本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

大豆是世界上重要經(jīng)濟農(nóng)作物，大豆擬莖點種腐病菌(phomopsislongicolla)是大豆生產(chǎn)上的一種重要病原菌，可侵染大豆的根部、莖部和豆莢，引致大豆種腐、根腐和莖枯等。莖部感病后，常在下部莖稈葉、分枝與莖連接處產(chǎn)生病斑，顏色較淡，病斑沿莖擴展、環(huán)莖，失水褪綠、萎縮和干枯，導(dǎo)致植株上部萎蔫和枯死，葉片不脫落；病株根系完整、健康；發(fā)病較輕植株，上部葉片沿脈間褪綠。豆莢或種子感染后，發(fā)病的種子會出現(xiàn)皺縮、伸長、破裂、發(fā)白，影響種子質(zhì)量，造成大豆品質(zhì)下降，并可能導(dǎo)致大豆種子不能發(fā)芽或發(fā)芽緩慢，重發(fā)時能造成90％的種子不能萌發(fā)或腐爛。目前該菌在美國、阿根廷、意大利、韓國、南斯拉夫等都有報道。我國是大豆消費大國，也是大豆貿(mào)易大國，每年需大量進口大豆，其中2015年進口大豆達8169萬噸，是國內(nèi)生產(chǎn)量的6.8倍，占國內(nèi)消費量的87％。進口大豆多來自美國、巴西等大豆種腐病等病害發(fā)生較重的國家，而大豆擬莖點種腐病菌常殘留在大豆種子和豆莢、豆稈等病殘體上，并通過遠距離運輸而傳播蔓延，因此，我國存在較大的擬莖點種腐病菌輸入風(fēng)險。大豆擬莖點種腐病菌侵染到大豆組織后具有一定的潛育期，并未顯癥或癥狀不明顯，常導(dǎo)致漏診或誤診。在這種嚴峻的形勢下，快速準(zhǔn)確地檢測病原菌和診斷病害是控制病害成災(zāi)的主要措施之一。

擬莖點霉屬真菌檢測與鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。目前擬莖點霉屬傳統(tǒng)的檢測方法主要以形態(tài)學(xué)監(jiān)測為基礎(chǔ)，即：將待鑒定菌株接種在培養(yǎng)基上或其寄主上培養(yǎng)，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡等儀器觀察菌落特征、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子結(jié)構(gòu)等表型特征，結(jié)合寄主上的發(fā)病癥狀，對照相關(guān)資料，再確定該菌的分類地位。這種方法需要較長的時間，且需大量的形態(tài)觀察，無疑加大了檢測難度。血清學(xué)檢測方法主要是elisa法，該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測中，但在真菌檢測中并不普遍，同時，由于血清制備困難、近似種特異性差及檢測成本過高，以及成品試劑盒不易獲得等原因，elisa方法在擬莖點霉真菌檢測上的應(yīng)用很少。用于擬莖點霉屬真菌分子檢測鑒定的常用方法包括pcr、多重pcr、巢式pcr、熒光pcr、rlfp、rapd、ssr等，近年來，dna指紋、基因芯片技術(shù)等亦開始起步，雖然這些分子檢測技術(shù)的效率高、靈敏度高，且能從植物組織中直接檢測到病原菌，但大部分技術(shù)又存在重復(fù)性、可操作性、多態(tài)性、成本、檢測范圍及環(huán)境因素等問題，例如巢式pcr、多重pcr需要染膠處理，實時熒光pcr因熒光染料和熒光探針的價格及儀器價格等因素使得檢測成本較高，rapd只能對室內(nèi)純培養(yǎng)的菌進行檢測，而在自然界的發(fā)病植株中，往往會感染多種真菌，這會導(dǎo)致分子檢測結(jié)果不全面，只能檢測到某種或某幾種病原菌。因此，這些檢測技術(shù)并未能得到普遍應(yīng)用。

2000年，notomi等人研發(fā)出了一項全新的核酸擴增技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(lamp,loop-mediatedisothermalamplification)。該技術(shù)使用四條或六條引物，以bstdna聚合酶作為擴增酶，恒溫條件下對目標(biāo)片段進行擴增。其產(chǎn)物可以通過凝膠電泳進行觀察，同時可以通過田間顯色反應(yīng)指示劑目測直接進行觀察。lamp技術(shù)的發(fā)明，為病原物快速檢測建立了一個良好的平臺，該技術(shù)具有非常鮮明的特點，不需要模板核酸片段的熱變性、長時間的溫度變化循環(huán)、實驗結(jié)果不需要凝膠電泳染色后進行紫外觀察，這就避免了普通pcr所需要昂貴的實驗儀器以及專業(yè)的實驗操作場所，因而該技術(shù)適合在基層、進出口檢疫部門進行快速的病原物診斷。

發(fā)展分子檢測最重要的一點就是選用合適的分子檢測靶標(biāo)。鈣調(diào)素(calmodulin,cam)編碼基因在進化較為保守，其外顯子區(qū)域在屬間具有一定的保守性，同時該基因存在序列差異較大的非編碼的內(nèi)含子區(qū)域，該區(qū)域在堿基水平上具有明顯的種間差異，因此該編碼基因可以用來作為分子檢測的靶標(biāo)而加以應(yīng)用。本發(fā)明通過序列比對分析大豆擬莖點種腐病菌和其他擬莖點霉病菌及大豆常發(fā)病原菌在cam基因序列上的差異，設(shè)計了大豆擬莖點種腐病菌特異性的lamp引物，在此基礎(chǔ)上建立了大豆擬莖點種腐病菌lamp快速檢測試劑盒。本發(fā)明能實現(xiàn)擬莖點種腐病菌引致病害的早期準(zhǔn)確診斷，對及時采取防控措施、減少農(nóng)藥使用、保障大豆生產(chǎn)安全和質(zhì)量安全具有重要作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了鈣調(diào)素cam蛋白編碼基因序列作為靶標(biāo)在檢測大豆擬莖點種腐病菌中的應(yīng)用，目的是提供一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組。

本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的是提供用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp試劑盒。

為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案如下：

鈣調(diào)素cam蛋白編碼基因序列作為靶標(biāo)在檢測大豆擬莖點種腐病菌中的應(yīng)用，其特征在于：所述的基因序列如序列表中seqidno.1所示。

用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組，包括下列引物：

正向外引物f3:5’-tgctaacggaccgttttcg-3’，

反向外引物b3:5’-aagggaccgcatgactgt-3’，

正向內(nèi)引物fip(f1c+f2):

5’-tgcgtagctgagaaagaggggagcctgcaggataaggatgg-3’，

反向內(nèi)引物bip(b1c+b2):

5’-cgtgcagctactccgaccgagtgatttgtcctacacgcca-3’

所述的用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp試劑盒，包括：2.5μl10×thermopolbuffer，6mmmgso4、0.8mbetaine,1.4mmdntps,lamp所用的lamp特異性引物0.2μmf3,0.2μmb3,1.6μmfip,1.6μmbip，8ubstdnapolymerase組成的檢測溶液。

一種大豆擬莖點種腐病菌的lamp檢測方法，取16.5μl檢測溶液，加入2μl待檢測dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑，陽性反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，表示存在大豆擬莖點種腐病菌，陰性反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，表示不存在大豆擬莖點種腐病菌，或所含大豆擬莖點種腐病菌未達到最低檢測量。

有益效果：

與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比，本發(fā)明具有更高的準(zhǔn)確性、靈敏度和時效性。以形態(tài)特征為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)檢測方法耗時長、需要檢測的樣品量大，而且要求操作者具備專業(yè)的真菌分離、形態(tài)學(xué)鑒定知識和豐富的實踐操作經(jīng)驗，因而經(jīng)常導(dǎo)致漏檢，檢測準(zhǔn)確率較低。本發(fā)明通過實驗驗證，在不同的大豆病害之間，大豆擬莖點種腐病菌的檢出率為100％，準(zhǔn)確性及特異性高；本發(fā)明最低可以檢測出100pgdna含量的樣品，靈敏度高；本發(fā)明的耗時只要60min，加上樣品的富集及dna的提取，一般只需要半個工作日，時效性高。

本發(fā)明在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，通過基因序列比對分析，得到的鈣調(diào)素(calmodulin,cam)編碼基因在進化時較為保守，其外顯子區(qū)域在屬間具有高度的保守性，同時該基因存在序列差異較大的非編碼的內(nèi)含子區(qū)域，該區(qū)域在堿基水平上具有明顯的種間差異，因此該編碼基因可以用來作為分子檢測的靶標(biāo)而加以應(yīng)用。通過lamp引物設(shè)計軟件設(shè)計出多條符合設(shè)計參數(shù)的引物，但并不是每組引物都具有較好的特異性和擴增靈敏度，容易出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致出現(xiàn)誤判及錯誤的檢測結(jié)果。因此，如何將軟件設(shè)計的引物同實際應(yīng)用結(jié)合起來，顯得尤為關(guān)鍵，本發(fā)明核心正是在一定的理論基礎(chǔ)上，經(jīng)過數(shù)次實驗篩選、驗證和甄別出來的。

與現(xiàn)在普遍使用的普通pcr分子檢測技術(shù)相比較，本發(fā)明對實驗場所的要求簡單、實驗操作方便、結(jié)果觀察簡便直觀。普通pcr分子檢測技術(shù)需要不同的溫度變化循環(huán)，需要較為專業(yè)的pcr操作儀器，實驗結(jié)果需要凝膠電泳染色后在凝膠成像儀中進行觀察，因此整個實驗需要專業(yè)、昂貴的實驗操作儀器，而且操作較為繁瑣。本發(fā)明在62℃恒溫條件下對目標(biāo)片段進行擴增，實驗結(jié)果通過直接觀察反應(yīng)體系顏色的變化即可進行判斷。因此本發(fā)明非常適合在基層及進出口檢驗檢疫部門推廣使用。

具體實施方式

一種用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp引物組，包括下列引物：

正向外引物f3：5’-tgctaacggaccgttttcg-3’，

反向外引物b3：5’-aagggaccgcatgactgt-3’，

正向內(nèi)引物fip：

5’-tgcgtagctgagaaagaggggagcctgcaggataaggatgg-3’

反向內(nèi)引物bip：

5’-cgtgcagctactccgaccgagtgatttgtcctacacgcca-3’。

實施列1

用于檢測大豆擬莖點種腐病菌的lamp試劑盒，包括：2.5μl10×thermopolbuffer，6mmmgso4、0.8mbetaine,1.4mmdntps,lamp所用的lamp特異性引物0.2μmf3,0.2μmb3,1.6μmfip,1.6μmbip，8ubstdnapolymerase組成的檢測溶液。各組分的濃度表示其在檢測溶液中的終濃度。

實施列2大豆擬莖點種腐病菌lamp引物的特異性試驗

為驗證大豆擬莖點種腐病菌lamp引物的特異性，選擇了4個大豆擬莖點種腐病菌、14個其它病原菌(1-4：phomopsislongicolla，5:diaportheactinidiae，6：diaporthemelonis，7：colletotrichumtruncatum，8:c.scovillei，9：c.spaethianum，10：fusariumoxysporum，11：f.equiseti，12:f.graminerum，13：f.solani，14：f.proliferatum，15：f.culmorum，16：phytophthorasojae，17:alternariatenussima，18：nigreosporasphaerica)的dna作為模版，取16.5μl實施列1所述的檢測溶液，加入2μl待檢測dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑。含有大豆擬莖點種腐的樣品(1-4號)反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，反應(yīng)結(jié)果為陽性。而其它病原菌為模版的反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，反應(yīng)結(jié)果為陰性，表示不存在大豆擬莖點種腐病菌。該結(jié)果表示，利用大豆擬莖點種腐病菌lamp引物及其反應(yīng)溶液，恒溫擴增后添加sybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑可以特異性的檢測出含有大豆擬莖點種腐病原菌的存在，且具有省時、省錢、省力、可操作性強等諸多優(yōu)點。

實施列3大豆擬莖點種腐病菌lamp特異性引物的靈敏度試驗

為驗證大豆擬莖點種腐病菌lamp特異性引物的靈敏度，將提取的大豆擬莖點種腐病菌菌株dna進行10倍遞度稀釋后(從1μg/μl到1fg/μl)，取16.5μl實施列1所述的檢測溶液，加入2μl系列稀釋的dna溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑進行結(jié)果觀察，模版濃度較高時，發(fā)生lamp擴增時，陽性反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，在含量較低的模版中，反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，反應(yīng)結(jié)果為陰性。在25μl的反應(yīng)體系中，lamp體系所能檢測的最低靈敏度為100pg/μl。

實施列4感病大豆植株lamp檢測試驗

取9株接種大豆擬莖點種腐病菌7天后的大豆莖基部組織1-2cm，使用堿裂解法快速提取dna，每毫克組織加入10μl0.5mnaoh，充分研磨后轉(zhuǎn)移至1.5ml的ep管中，12000rpm離心5min，取2μl直接用于lamp反應(yīng)。取16.5μl實施列1所述的檢測溶液，加6.5μl滅菌超純水至反應(yīng)總體積25μl，反應(yīng)62℃，60min。反應(yīng)結(jié)束后加入0.25μlsybrgreeni作為顯色反應(yīng)指示劑進行結(jié)果觀察，接種大豆擬莖點種腐病菌7天后的大豆莖基部組織的dna作為模版發(fā)生lamp擴增，反應(yīng)溶液變?yōu)辄S綠色，紫外燈下可以觀察到熒光，而以健康植株提取的dna作為模版，反應(yīng)溶液沒有出現(xiàn)顏色變化，仍為橙色，紫外燈下不發(fā)熒光，反應(yīng)結(jié)果為陰性。

seqidno.1

tgcgcctgatgctaacggaccgttttcggcctgcaggataaggatggcgatggttagtgcggtcaccgcttcctcccctctttctcagctacgcacgcgtcatactcgatccgccgcgacggtctgcgcgtgcagctactccgaccgaccgaccatcaaatctatcacgagtagtatgctaaggctggcgtgtaggacaaatcaccaccaaggagctcggcacagtcatgcggtcccttggtcaaaacccttccgagtccgagctgcaggacatgatcaacgaggtcgacgccgacaacaacggcaccattgacttccctggtgagtctagatcctcgtacactggatattc