本發(fā)明涉及一種中藥配方的篩選方法。
背景技術(shù)：
抗生素在殺菌同時(shí)，也會(huì)造成人體損害，影響肝、腎臟功能、胃腸道反應(yīng)等。濫用抗生素可能引起某些細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)感染的治療會(huì)變得十分困難。目前，幾乎沒(méi)有一種抗菌藥物不存在耐藥現(xiàn)象。開(kāi)發(fā)具有抗菌作用的中藥及配方具有積極意義。
許多中藥及配方藥具有抗菌消炎作用，一些中草藥的有效成分和分子結(jié)構(gòu)等也已經(jīng)全部或部分地研究清楚。例如黃連和黃柏止痢的主要成分小蘗堿（黃連素）、黃芩抗菌的主要成分黃芩素等等。大量事實(shí)證明，中國(guó)古代勞動(dòng)人民通過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐所積累起來(lái)的醫(yī)藥遺產(chǎn)是極為豐富、極為寶貴的。我們應(yīng)當(dāng)珍視這個(gè)祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)的偉大寶庫(kù)，努力發(fā)掘，加以提高，從中可以開(kāi)發(fā)具有抗菌消炎作用的中藥，可以取代或部分取代抗生素。
厭氧菌是一類在無(wú)氧條件下比在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)好的細(xì)菌，而不能在有空氣存在情況下生長(zhǎng)的細(xì)菌。這類細(xì)菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無(wú)氧發(fā)酵的方式進(jìn)行。它能引起人體不同部位的感染，包括闌尾炎、膽囊炎、中耳炎、口腔感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、腹膜炎等多種疾病。在傳統(tǒng)的開(kāi)發(fā)針對(duì)某種厭氧菌的中藥新配方過(guò)程中，一般是在滅菌的培養(yǎng)基中接種厭氧菌后加入中藥組分，在特殊的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一段時(shí)間后再取樣進(jìn)行劃線培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)，從而確定某中藥組成配方是否有抑菌作用。劃線培養(yǎng)也需要在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，且培養(yǎng)周期至少要幾天，因此整個(gè)周期長(zhǎng)，效率低。本方法是針對(duì)上述問(wèn)題發(fā)明的一種中藥配方的快速篩選方法。
本方法的基本原理：?jiǎn)慰寺】贵w或抗原分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，這種結(jié)合不會(huì)改變單克隆抗體、抗原的免疫學(xué)特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會(huì)與特異性的抗原結(jié)合。而三元Co-Cr材料具有鐵磁性，其元素Co外層具有多個(gè)未成對(duì)電子，具有高飽和磁化強(qiáng)度，在粒徑小到一定程度時(shí)，會(huì)出現(xiàn)順磁和超順磁特性，Co-Cr納米材料會(huì)對(duì)周?chē)肿拥暮舜殴舱褡孕?晶格弛豫時(shí)間的影響非常大，具有放大核磁共振馳豫信號(hào)的作用。非常微量的Co-Cr納米材料就會(huì)造成水的核磁共振弛豫時(shí)間大幅下降。因此可以通過(guò)構(gòu)建Co-Cr納米探針，從磁共振的角度來(lái)做檢測(cè)是否存在目標(biāo)菌，從而間接評(píng)估中藥成分的抑菌作用。
主要步驟：
1）. Co-Cr納米探針制備。從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)順磁Co-Cr納米材料，也可以通過(guò)其他方法制備納米級(jí)的Co-Cr。使用硅烷偶聯(lián)劑，其通式為:Y(CH2)nSiX3。此處，n為0-3；X為可水解的基團(tuán)；Y為有機(jī)官能團(tuán)。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，這些基團(tuán)水解時(shí)即生成硅醇(Si(OH)3)，而與無(wú)機(jī)物質(zhì)結(jié)合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、環(huán)氧基、甲基丙烯酰氧基、巰基。這些反應(yīng)基團(tuán)可與有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)而結(jié)合。因此，通過(guò)使用硅烷偶聯(lián)劑，可在無(wú)機(jī)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)的界面之間架起“分子橋”，把兩種性質(zhì)懸殊的材料連接在一起提高復(fù)合材料的性能和增加粘接強(qiáng)度的作用。通過(guò)硅烷偶聯(lián)劑反應(yīng)可以得到表面修飾的氨基化或羧基化的Co-Cr納米材料。進(jìn)一步通過(guò)偶聯(lián)抗體，可實(shí)現(xiàn)表面功能化，形成特異性免疫探針，封閉多余的活性位點(diǎn)，離心分離后可以將過(guò)量的抗體分離，即可以得到抗性修飾的Co-Cr納米探針。
2）. 采用聚苯乙烯材料制作的樣品管進(jìn)行中藥篩選。聚苯乙烯材料與酶標(biāo)板類似，探針表面抗體會(huì)由于吸附作用而結(jié)合在聚苯乙烯材料的表面，但是，探針表面的抗體吸附到聚苯乙烯材料表面的速度與探針表面抗體結(jié)合目標(biāo)菌的速度相比，前者速度慢的多，兩者是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。因此，在聚苯乙烯樣品管中加入滅菌的厭氧菌的培養(yǎng)基，接種目標(biāo)厭氧菌后加入需要篩選的中藥提取液，密閉厭氧培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入步驟1）所制備的Co-Cr納米探針，充分混合震蕩反應(yīng)一段時(shí)間，若樣品管中有目標(biāo)菌生長(zhǎng)，則Co-Cr納米探針表面的抗體首先會(huì)與目標(biāo)菌結(jié)合，從而使得Co-Cr納米探針留在液體中。若樣品管中沒(méi)有目標(biāo)菌，則Co-Cr納米探針表面的抗體會(huì)逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面，從而使液體中沒(méi)有Co-Cr納米探針。前已述及，微量的Co-Cr納米材料就會(huì)造成水的核磁共振弛豫時(shí)間大幅下降。以無(wú)菌的沒(méi)有接種目標(biāo)菌的培養(yǎng)基液體為空白，測(cè)得的懸濁液的弛豫時(shí)間相比有顯著降低，則說(shuō)明液體中含有探針，從而間接證明樣品中有目標(biāo)菌，探針的量與弛豫時(shí)間的下降值呈正比，通過(guò)加標(biāo)定量探針可以間接定量出目標(biāo)菌的量。有目標(biāo)菌存在，則說(shuō)明中藥抑菌作用不明顯，反之則說(shuō)明有抑菌作用。
該方法的主要優(yōu)點(diǎn)就是快速、靈敏度高。在一定程度上可以對(duì)目標(biāo)菌實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)控。相對(duì)于厭氧菌培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時(shí)間，核磁共振檢測(cè)只需幾分鐘。此方法不需要厭氧培養(yǎng)箱，只需在無(wú)氧條件下接種后將樣品管密封即可培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)用注射器將定量的探針注入即可進(jìn)行后續(xù)的核磁共振檢測(cè)。因此，用該方法可做大規(guī)模中藥及配方的篩選。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一種基于Co-Cr納米探針篩選厭氧菌中藥抑制劑的方法。該方法是一種客觀有效的檢出樣品中目標(biāo)菌的方法，可以做大規(guī)模中藥及配方的快速篩選，從而在某種程度上大大縮減針對(duì)某種厭氧菌有效的中藥開(kāi)發(fā)時(shí)間。
一種基于Co-Cr納米探針篩選厭氧菌中藥抑制劑的方法。利用核磁共振儀對(duì)順磁物質(zhì)的響應(yīng)敏感性，提出核磁共振弛豫參數(shù)變化與Co-Cr納米粒子順磁免疫探針含量的相關(guān)性指標(biāo)。該方法依賴于順磁納米Co-Cr納米探針用于樣品中目標(biāo)菌的檢測(cè)來(lái)評(píng)估中藥配方的抑菌效果。采用偶聯(lián)了特異性單克隆抗體的順磁Co-Cr納米探針，可以對(duì)樣品中的特異性厭氧菌進(jìn)行檢測(cè)。由于核磁共振儀對(duì)Co-Cr納米粒子非常敏感，存在微量的順磁Co-Cr納米粒子，則水的自旋-晶格弛豫時(shí)間和/自旋-自旋弛豫就會(huì)顯著下降。通過(guò)空白對(duì)照及加標(biāo)定量檢測(cè)出樣品中的免疫探針含量，從而可以間接定量出樣品中的厭氧菌菌落數(shù)。檢測(cè)出的厭氧菌含量與探針含量線性相關(guān)，擬合度較好。最終以順磁Co-Cr納米探針與厭氧菌間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為紐帶，確定樣品中的厭氧菌菌落數(shù)。從而間接確定中藥的抑菌作用是否有效。相對(duì)于厭氧菌培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時(shí)間，核磁共振檢測(cè)只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規(guī)模中藥及配方的篩選。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，步驟如下：
1）目標(biāo)菌抗體包被順磁納米Co-Cr納米探針的制備。
2）在聚苯乙烯樣品管中加入滅菌的厭氧菌的培養(yǎng)基，接種目標(biāo)厭氧菌。加入需要篩選的中藥提取液，培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入步驟1）所制備的Co-Cr納米探針，充分混合震蕩反應(yīng)一段時(shí)間，若樣品管中有目標(biāo)菌，則首先會(huì)與Co-Cr納米探針表面的抗體結(jié)合，從而使得Co-Cr納米探針留在液體中。若樣品管中沒(méi)有有目標(biāo)菌，則Co-Cr納米探針表面的抗體會(huì)逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面而與液體分離。此時(shí)，對(duì)樣品管進(jìn)行核磁共振弛豫時(shí)間的測(cè)定。以無(wú)菌的沒(méi)有接種目標(biāo)菌的培養(yǎng)基液體為空白，測(cè)得的懸濁液的弛豫時(shí)間相比有顯著降低，則說(shuō)明含有探針，從而間接證明樣品中有目標(biāo)菌，探針的量與弛豫時(shí)間的下降呈正比，通過(guò)加標(biāo)定量探針而間接定量出目標(biāo)菌的量。
所述Co-Cr納米探針為具有順磁特性的納米級(jí)Co-Cr材料，納米粒徑小于300納米。
所述的目標(biāo)菌的最終檢出評(píng)價(jià)方法基于核磁共振技術(shù)的弛豫時(shí)間的變化，弛豫時(shí)間包括自旋－晶格弛豫時(shí)間和自旋－自旋弛豫時(shí)間。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供一種客觀的快速篩選對(duì)厭氧菌有抑制作用的中藥配方的方法，其特征是以順磁Co-Cr納米探針與厭氧菌間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為紐帶，確定樣品中的厭氧菌菌落數(shù)。從而間接確定中藥的抑菌作用是否有效。相對(duì)于厭氧菌培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時(shí)間，核磁共振檢測(cè)只需幾分鐘。因此，用該方法可做大規(guī)模中藥及配方的篩選。
具體實(shí)施方式
實(shí)例1
篩選對(duì)痤瘡桿菌（厭氧菌）有抑制或治療作用的中藥配方。
１）納米Co-Cr免疫探針制備：
Co-Cr納米粒子可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)，也可以參考文獻(xiàn)用物理或化學(xué)方法合成。
二氧化硅包被納米Co-Cr：取47.5g硅酸鈉，用去離子水溶解于燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為12-13。取5.0g納米Co-Cr加入到此燒杯中，機(jī)械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時(shí)攪拌。升溫到85?C，逐滴加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值6-7，生成沉淀。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉淀，洗滌3-4次。然后，將沉淀分散于250mL甲醇中。以上過(guò)程重復(fù)三次，保證硅依附在Co-Cr上。
胺基硅烷化Co-Cr納米材料：將制得的二氧化硅包被的納米Co-Cr加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀釋到150mL。然后加入150mL甘油混合。超聲30min，轉(zhuǎn)移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入10mL氨基硅烷偶聯(lián)劑（AEAPS），在80-90 ?C下快速攪拌3h后，轉(zhuǎn)移出產(chǎn)物。產(chǎn)物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏斗抽濾)。真空干燥。需要注意的是，抽濾由于有甘油，所以比較慢，抽一段時(shí)間后可適時(shí)用吸管吸去上層液體，抽濾過(guò)程約需6-8h。最后將得到的氨基硅烷化Co-Cr納米材料真空干燥12h。
抗體修飾：稱取一定量的氨基修飾的Co-Cr納米粒子，加入2倍質(zhì)量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混勻儀上，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)，反應(yīng)45min。）將活化時(shí)間到的樣品進(jìn)行10000r/min離心，時(shí)間5min，然后再加入0.01M的PBS進(jìn)行洗滌離心，重復(fù)3次。將離心完的樣品各加入過(guò)量痤瘡桿菌抗體，在混勻儀上偶聯(lián)1h。偶聯(lián)完成后加入的10%BSA封閉液45min。封閉結(jié)束后，轉(zhuǎn)速8000r/min離心分離5min，用0.01M的PBS清洗離心，重復(fù)3次，則將多余的抗體、BSA洗去，最后加入PBS進(jìn)行重懸。制備的抗性修飾的Co-Cr納米粒子即為免疫探針，保存在4 ℃待用。
2）在一批聚苯乙烯樣品管中各自加入適量滅菌的培養(yǎng)基，在無(wú)氧條件接種痤瘡桿菌，分別加入需要篩選的中藥提取液密封后，培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入步驟1）所制備的Co-Cr納米探針，充分混合震蕩反應(yīng)，若樣品管中有目標(biāo)菌，則首先會(huì)與Co-Cr納米探針表面的抗體結(jié)合，從而使得Co-Cr納米探針留在液體中；若樣品管中沒(méi)有有目標(biāo)菌，則Co-Cr納米探針表面的抗體會(huì)逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面。反應(yīng)1小時(shí)后，對(duì)樣品管進(jìn)行核磁共振弛豫時(shí)間的測(cè)定（上海紐邁NMR20核磁共振儀）。以無(wú)菌的沒(méi)有接種目標(biāo)菌的培養(yǎng)基液體為空白，測(cè)得的懸濁液的弛豫時(shí)間自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫時(shí)間相比有顯著降低，則說(shuō)明含有探針，說(shuō)明樣品管中有目標(biāo)菌，從而間接說(shuō)明中藥的抑菌作用不明顯，反之則反。探針的量與自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫時(shí)間的下降呈正比，通過(guò)加標(biāo)定量探針而間接定量出目標(biāo)菌的量。有目標(biāo)菌存在說(shuō)明加入的中藥沒(méi)有抑制作用。反之則反。
具體實(shí)施方式
實(shí)例2
篩選對(duì)梭狀芽孢桿菌（厭氧菌）有抑制或治療作用的中藥配方。
１）納米Co-Cr免疫探針制備：
Co-Cr納米粒子可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)，也可以參考文獻(xiàn)用物理及化學(xué)方法合成。
二氧化硅包被納米Co-Cr：取47.5g硅酸鈉，用去離子水溶解于燒杯中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為12-13。取5.0g納米Co-Cr加入到此燒杯中，機(jī)械攪拌(用玻璃棒)5min。將混合液超聲30min，適時(shí)攪拌。升溫到85?C，逐滴加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值6-7，生成沉淀。邊磁分離邊用去離子水洗滌沉淀，洗滌3-4次。然后，將沉淀分散于250mL甲醇中。以上過(guò)程重復(fù)三次，保證硅依附在Co-Cr上。
胺基硅烷化Co-Cr納米材料：將制得的二氧化硅包被的納米Co-Cr加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀釋到150mL。然后加入150mL甘油混合。超聲30min，轉(zhuǎn)移到有攪拌裝置的500mL三口燒瓶中。加入10mL氨基硅烷偶聯(lián)劑（AEAPS），在80-90 ?C下快速攪拌3h后，轉(zhuǎn)移出產(chǎn)物。產(chǎn)物用去離子水洗滌3次，甲醇洗滌2次(用布氏漏斗抽濾)。真空干燥。需要注意的是，抽濾由于有甘油，所以比較慢，抽一段時(shí)間后可適時(shí)用吸管吸去上層液體，抽濾過(guò)程約需6-8h。最后將得到的氨基硅烷化Co-Cr納米材料真空干燥12h。
抗體修飾：稱取一定量的氨基修飾的Co-Cr納米粒子，加入2倍質(zhì)量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混勻儀上，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)，反應(yīng)45min。）將活化時(shí)間到的樣品進(jìn)行10000r/min離心，時(shí)間5min，然后再加入0.01M的PBS進(jìn)行洗滌離心，重復(fù)3次。將離心完的樣品各加入過(guò)量梭狀芽孢桿菌抗體，在混勻儀上偶聯(lián)1h。偶聯(lián)完成后加入的10%BSA封閉液45min。封閉結(jié)束后，轉(zhuǎn)速8000r/min離心分離5min，用0.01M的PBS清洗離心，重復(fù)3次，則將多余的抗體、BSA洗去，最后加入PBS進(jìn)行重懸。制備的抗性修飾的Co-Cr納米粒子即為免疫探針，保存在4 ℃待用。
2）在一批聚苯乙烯樣品管中各自加入適量滅菌的培養(yǎng)基，在無(wú)氧條件接種梭狀芽孢桿菌，分別加入需要篩選的中藥提取液密封后，培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入步驟1）所制備的Co-Cr納米探針，充分混合震蕩反應(yīng)，若樣品管中有目標(biāo)菌，則首先會(huì)與Co-Cr納米探針表面的抗體結(jié)合，從而使得Co-Cr納米探針留在液體中。若樣品管中沒(méi)有有目標(biāo)菌，則Co-Cr納米探針表面的抗體會(huì)逐漸吸附在聚苯乙烯樣品管表面。反應(yīng)1小時(shí)后，對(duì)樣品管進(jìn)行核磁共振弛豫時(shí)間的測(cè)定（上海紐邁NMR20核磁共振儀）。以無(wú)菌的沒(méi)有接種目標(biāo)菌的培養(yǎng)基液體為空白，測(cè)得的懸濁液的自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫時(shí)間相比有顯著降低，則說(shuō)明含有探針，說(shuō)明樣品管中有目標(biāo)菌，從而間接說(shuō)明中藥的抑菌作用不明顯，反之則反。探針的量與自旋-晶格弛豫時(shí)間和自旋-自旋弛豫時(shí)間的下降呈正比，通過(guò)加標(biāo)定量探針而間接定量出目標(biāo)菌的量。有目標(biāo)菌存在說(shuō)明加入的中藥沒(méi)有抑制作用。反之則反。