相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本專利申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求于2014年11月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/083,092的優(yōu)先權(quán)利益，所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

政府利益聲明

本發(fā)明在由空軍科學(xué)研究辦公室(airforceofficeofscientificresearch)授予的授權(quán)號(hào)fa9550-11-1-0275；以及由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的授權(quán)號(hào)u54ca151880和u54ca159341下由政府支持作出。政府在本發(fā)明中擁有一定的權(quán)利。

電子提交材料以引用的方式并入

本專利申請(qǐng)包含以計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表作為本公開內(nèi)容的分開部分，所述序列表以引用的方式全文并入，并且標(biāo)識(shí)如下：文件名：2014-183_seqlisting.txt；10,070字節(jié)，于2015年11月20日創(chuàng)建。

本公開內(nèi)容涉及用影響球形核酸(sna)納米顆粒通過(guò)細(xì)胞攝取的多核苷酸和核苷酸序列表面功能化的sna納米顆粒。

背景技術(shù)：

球形核酸納米顆粒綴合物(sna)是顯示出與線型核酸相比根本不同性質(zhì)的一類生物納米材料。sna由高度取向的寡核苷酸鏈組成，其密集地填充到納米顆粒核的表面上[cutler等人，jamchemsoc134：1376-1391(2012)]。與單鏈dna不同，sna可自然地進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)而無(wú)需陽(yáng)離子或親脂轉(zhuǎn)染試劑的幫助，盡管它們具有高負(fù)電荷[rosi等人，science312：1027-1030(2006)]。sna的強(qiáng)大的細(xì)胞攝取性質(zhì)提供了關(guān)于開發(fā)細(xì)胞內(nèi)診斷[seferos等人，jamchemsoc129：15477-15479(2007)]和基因調(diào)節(jié)[giljohann等人，jamchemsoc131：2072-2073(2009)]工具的潛力，而沒有傳統(tǒng)上與陽(yáng)離子或親脂試劑相關(guān)的毒性或免疫應(yīng)答[massich等人，molpharm6：1934-1940(2009)]。實(shí)際上，sna在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)目的基因的能力已得到證明[zheng等人，procnatlacadsciu.s.a.109：11975-11980(2012)；jensen等人，scitranslmed5，209ra152(2013)]。

機(jī)制研究已經(jīng)將a類清道夫受體(sr-a)鑒定為負(fù)責(zé)識(shí)別這種結(jié)構(gòu)的主要細(xì)胞受體，并且sna與sr-a的結(jié)合導(dǎo)致質(zhì)膜微囊介導(dǎo)的胞吞作用[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]。富含鳥苷酸(g)的線型核酸天然被sr-a識(shí)別，這已被提出是由于它們折疊成稱為g-四鏈體(g-quadruplex)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力[pearson等人，jbiolchem268：3546-3554(1993)]。相比之下，腺苷酸(a)、胸苷酸(t)和胞苷酸(c)的線型聚合物不折疊成被sr-a識(shí)別的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且像這樣，它們不是天然配體[pearson等人，jbiolchem268：3546-3554(1993)]。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

由于它們的多價(jià)體系結(jié)構(gòu)，sna的細(xì)胞相互作用不僅取決于納米結(jié)構(gòu)的尺寸，還取決于配體呈遞[giljohann等人，nanolett7：3818-3821(2007)]。不受理論的束縛，考慮sna能夠進(jìn)入細(xì)胞而無(wú)需輔助轉(zhuǎn)染試劑，因?yàn)閟na體系結(jié)構(gòu)模擬了該二級(jí)結(jié)構(gòu)形成。另外，本公開內(nèi)容提供了在sna與sr-a的相互作用和隨后的細(xì)胞攝取中起重要作用的寡核苷酸序列。

相應(yīng)地，本文提供的是用多核苷酸和結(jié)構(gòu)域功能化的納米顆粒，結(jié)構(gòu)域(i)位于對(duì)于納米顆粒遠(yuǎn)側(cè)的多核苷酸的末端處，和(ii)包含為至少50％但小于100％鳥苷酸的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于多核苷酸的5′末端處。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于多核苷酸的3′末端處。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于多核苷酸內(nèi)的內(nèi)部區(qū)域處。在各種實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度為約2至約50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，多核苷酸是dna。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，多核苷酸是rna。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含至少三個(gè)(ggx)基序。在一些實(shí)施例中，x是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。在一些實(shí)施例中，x是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸或胞苷酸。在某些實(shí)施例中，x是鳥苷酸。在一些實(shí)施例中，x不是鳥苷酸。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，x是經(jīng)修飾的核苷酸。

在一些實(shí)施例中，納米顆粒用另外的多核苷酸功能化。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，另外的多核苷酸包含結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，另外的多核苷酸是dna。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，另外的多核苷酸是rna。

在各種實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含聚鳥苷酸(聚g)核苷酸序列，其包含多于一個(gè)鳥苷酸。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含聚鳥苷酸(聚g)序列，其包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十個(gè)鳥苷酸核苷酸。

在一些方面，本公開內(nèi)容還提供了增加多核苷酸功能化的納米顆粒的細(xì)胞攝取的方法，其包括修飾納米顆粒以進(jìn)一步包含結(jié)構(gòu)域的步驟，與缺乏結(jié)構(gòu)域的多核苷酸功能化的納米顆粒相比，所述結(jié)構(gòu)域增加所述寡核苷酸功能化的納米顆粒的細(xì)胞攝取。在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含聚鳥苷酸(聚g)核苷酸序列，其包含多于一個(gè)鳥苷酸。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含聚g序列，其包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十個(gè)鳥苷酸核苷酸。在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于多核苷酸的5′末端處。在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于多核苷酸的3′末端處。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于多核苷酸內(nèi)的內(nèi)部區(qū)域處。在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域與多核苷酸共線(colinear)。在各種實(shí)施例中，多核苷酸是dna。在一些實(shí)施例中，多核苷酸是rna。

考慮本公開內(nèi)容的方法中的任一種均用如本文公開的多核苷酸功能化的納米顆粒進(jìn)行。

在本公開內(nèi)容的進(jìn)一步方面，提供了用多核苷酸功能化的納米顆粒，其中多核苷酸的遠(yuǎn)端以包含至少三個(gè)(ggx)基序的序列終止。在一些實(shí)施例中，至少三個(gè)(ggx)基序位于多核苷酸的5′末端上。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，至少三個(gè)(ggx)基序位于多核苷酸的3′末端上。在一些實(shí)施例中，x是脫氧核糖核苷酸，并且在進(jìn)一步的實(shí)施例中，x是核糖核苷酸。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，x是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸或胞苷酸。本公開內(nèi)容還考慮在一些實(shí)施例中，x是經(jīng)修飾的核苷酸。

在各種實(shí)施例中，納米顆粒用另外的多核苷酸功能化。在一些實(shí)施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是dna。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是rna。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是sirna。

在本公開內(nèi)容的方面或?qū)嵤├娜我粋€(gè)中，sna具有凈負(fù)電荷。

在一些方面，本公開內(nèi)容提供了增加多核苷酸功能化的納米顆粒的細(xì)胞攝取的方法，其包括修飾多核苷酸使得多核苷酸的遠(yuǎn)端(即，與使納米顆粒功能化的末端相反的末端)以包含至少三個(gè)(ggx)基序的序列終止的步驟，其中與缺乏修飾的多核苷酸功能化的納米顆粒相比，包含修飾的多核苷酸功能化的納米顆粒的攝取增加。在一些實(shí)施例中，至少三個(gè)(ggx)基序位于多核苷酸的5′末端上。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，至少三個(gè)(ggx)基序位于多核苷酸的3′末端上。在另外的實(shí)施例中，納米顆粒用另外的多核苷酸功能化。在相關(guān)實(shí)施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是dna。在一些實(shí)施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是rna。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，多核苷酸和/或另外的多核苷酸是sirna。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞是原核細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，細(xì)胞是真核細(xì)胞。在相關(guān)實(shí)施例中，真核細(xì)胞是人細(xì)胞。

在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容還提供了方法，其中所述多核苷酸包含與靶多核苷酸序列充分互補(bǔ)的序列，以在合適的條件下與靶多核苷酸序列雜交。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，另外的多核苷酸包含與靶多核苷酸序列充分互補(bǔ)的序列，以在合適的條件下與靶多核苷酸序列雜交。在相關(guān)實(shí)施例中，雜交導(dǎo)致靶多核苷酸的檢測(cè)。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，雜交導(dǎo)致靶基因表達(dá)的抑制。

附圖說(shuō)明

圖1a-1b顯示了sna的表征。1a)該表列出了使用基于熒光的測(cè)定在10nm金納米顆粒上負(fù)載寡核苷酸。聚tsna在所有核堿基類型中含有最高負(fù)載，而聚asna具有最低負(fù)載。1b)通過(guò)乙酸雙氧鈾染色sna清楚地描繪了通過(guò)tem成像在金納米顆粒核(黑色)周圍的dna寡核苷酸殼(白色)。殼的厚度與從基于熒光的測(cè)定獲得的寡核苷酸負(fù)載數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。比例尺＝50nm。

圖2描繪了動(dòng)態(tài)光散射分析。由不同核堿基類型組成的寡核苷酸鏈共價(jià)附著到10nmaunp的表面上使流體動(dòng)力學(xué)直徑增加了10-15nm，指示寡核苷酸殼的厚度為5-8nm。

圖3顯示了sna的uv-vis吸收光譜。dna寡核苷酸殼與aunp核的共價(jià)附著導(dǎo)致表面等離子體峰中的紅移，從對(duì)于未經(jīng)修飾的檸檬酸鹽封端的aunp的519nm到524nm，與殼包含的核堿基類型無(wú)關(guān)。

圖4a-4b描繪了寡核苷酸負(fù)載的測(cè)量。4a)cy5標(biāo)記的sna用于定量聚a、聚t、聚c和聚gsna的負(fù)載。通過(guò)添加1m二硫蘇糖醇(dtt)還原au-硫醇鍵從aunp的表面釋放cy5標(biāo)記的單鏈dna(cy5-ssdna)，并且允許通過(guò)cy5熒光的定量。4b)cy5部分附著到組成成分寡核苷酸的5′末端。

圖5a-5c描繪了sna的細(xì)胞攝取。5a)聚gsna顯示與c166細(xì)胞的最高結(jié)合，是由其他核堿基類型組成的sna的4-10倍。5b)通過(guò)tem成像，聚gsna顯示出在c166細(xì)胞內(nèi)的最高累積，如其作為大簇(＞100/簇)在細(xì)胞溶質(zhì)各處廣泛分布所證明的。相比之下，由其他核堿基類型組成的sna或者在細(xì)胞溶質(zhì)的較為局限的區(qū)域中累積，或者出現(xiàn)在包含較少顆粒的簇(＜20個(gè)顆粒/簇)中。底行顯示頂行的加框區(qū)域的放大圖像。5c)聚gsna還證明除c166之外的其他三種細(xì)胞系的最高結(jié)合，以sr-a的表達(dá)水平的遞減次序包括hacat(永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞)、3t3(小鼠成纖維細(xì)胞)和a549(人肺上皮腺癌)。對(duì)于所有細(xì)胞類型，與其他核堿基類型的sna相比，聚gsna顯示出3-5倍高的與細(xì)胞結(jié)合。聚gsna與細(xì)胞的結(jié)合對(duì)于相同細(xì)胞類型與sr-a表達(dá)水平正相關(guān)。誤差條指示來(lái)自一式三份測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖6a-6b顯示了攝取對(duì)聚g殼的依賴性。6a)通過(guò)共聚焦顯微鏡檢查，與富含t的qd-sna相比，聚gqd-sna(紅色)顯示c166細(xì)胞中的更高累積。比例尺＝10μm。6b)用富含t的aunp-sna和聚gqd-sna以及富含t的qd-sna和聚gaunp-sna處理的c166細(xì)胞中的金和鎘含量的icp-ms分析顯示，聚gaunp-sna與富含t的qd-sna相比優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞，并且聚gqd-sna與富含t的aunp-sna相比優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞。誤差條指示來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖7a-7d描述了寡核苷酸鏈的長(zhǎng)度影響sna的細(xì)胞攝取。7a)在組成成分寡核苷酸的5′末端處增加的鳥苷酸(g)含量增加sna與c166細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合。當(dāng)與聚t(t30)sna相比時(shí)，需要最少四個(gè)ggt重復(fù)單元來(lái)增強(qiáng)sna的細(xì)胞結(jié)合。7b)在組成成分寡核苷酸的中間中的ggt重復(fù)單元的包埋取消了細(xì)胞結(jié)合的增強(qiáng)。由空心正方形所示的序列是seqidno：27。由空心三角形所示的序列是seqidno：28。所有其他序列在本文中描述。7c)在組成成分dna寡核苷酸的5′末端處增加dspacer單元(其不具有核堿基)使sna的細(xì)胞結(jié)合降低高達(dá)75％。7d)在組成成分dna寡核苷酸的5′末端處增加c3spacer單元(其既沒有核堿基也沒有核糖)使sna的細(xì)胞結(jié)合降低高達(dá)75％。誤差條指示來(lái)自一式三份測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖8a-8f描繪了使用cpt-sna的喜樹堿分子的遞送。8a)通過(guò)文獻(xiàn)先例，喜樹堿分子(cpt)的-oh基團(tuán)通過(guò)短雙功能接頭修飾，以形成喜樹堿疊氮化物(cpt-n3)[parrish等人，bioconjugatechem.18：263-267(2006)]。然后通過(guò)無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)(clickchemistry)將cpt-n3偶聯(lián)到二苯并環(huán)辛基-dna-硫醇(dbco-dna-sh)，以形成喜樹堿-dna-硫醇(cpt-dna-sh)。dcc＝n′n′-二環(huán)己基碳二亞胺，dmap＝4-二甲基氨基吡啶，＝二氯甲烷，dmso＝二甲基亞砜。8b)基于cpt在440nm的熒光發(fā)射的測(cè)量揭示，所有四種核堿基類型的cpt-sna均含有55±15個(gè)cpt分子/顆粒。8c)通過(guò)用cpt-sna處理的a549細(xì)胞的金含量的icp-ms分析，cpt-聚gsna可在所有測(cè)試的核堿基類型中以最高數(shù)量進(jìn)入細(xì)胞。cpt-sna(至少aunp核)在處理后看起來(lái)不離開細(xì)胞。誤差條指示來(lái)自一式三份測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差。8d)通過(guò)共焦成像，cpt-聚gsna可在所有測(cè)試的核堿基類型的cpt-sna中以最高數(shù)量將cpt分子(綠色)遞送到a549細(xì)胞內(nèi)。藍(lán)色＝細(xì)胞核。比例尺＝20μm。通過(guò)mtt測(cè)定(8e)和由碘化丙啶染色支持的流式細(xì)胞術(shù)分析(8f)，cpt-聚gsna在所有測(cè)試的核堿基類型的cpt-sna中也是最細(xì)胞毒性的。誤差條指示來(lái)自四次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖9a-9d描繪了cpt-dna-sh的合成。9a)喜樹堿-疊氮化物(cpt-n3)的¹hnmr。9b)通過(guò)maldi-tof分析，在用二苯并環(huán)辛基四甘醇接頭(dbco-teg；f.w.：570.6；glenresearch)修飾后，dna鏈的分子量增加預(yù)期的量。在通過(guò)無(wú)銅點(diǎn)擊偶聯(lián)與cpt-n3(f.w.：487.5)反應(yīng)以形成cpt-dna-sh后，dbco-dna-sh的分子量進(jìn)一步增加預(yù)期的量。此處顯示的是a30dna與dbco和cpt的綴合的代表性光譜。9c)通過(guò)maldi-tofms測(cè)量的分子量與預(yù)期分子量一致。9d)四種類型的cpt-dna-sh鏈的序列信息(也顯示于表4中)。

圖10顯示了通過(guò)mtt測(cè)定的細(xì)胞活力。在沒有cpt分子的情況下，通過(guò)對(duì)用20nmsna處理的a549細(xì)胞的mtt測(cè)定，4-7天后聚asna、聚tsna、聚csna和聚gsna未顯示明顯的細(xì)胞毒性。這種陰性對(duì)照顯示通過(guò)cpt-sna引起的任何可觀察到的細(xì)胞毒性源于cpt分子，而不是sna體系結(jié)構(gòu)。報(bào)告的值表示來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的平均值±se。

圖11顯示了用于檢測(cè)活化的半胱天冬酶3的elisa結(jié)果。在用各種類型的cpt-sna處理a549細(xì)胞時(shí)，cpt-(ggt)10sna比cpt-a30sna、cpt-t30sna和cpt-(cct)10sna誘導(dǎo)顯著更高的半胱天冬酶3的活化，半胱天冬酶3是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)蛋白。報(bào)告的值表示來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的平均值±se。

圖12顯示了與聚a、聚t和聚csna相比，聚gsna顯示更高的與c166細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合。

圖13顯示了sna的細(xì)胞攝取。

具體實(shí)施方式

由附著至納米顆粒表面的密集填充的高度取向的寡核苷酸鏈組成的球形核酸(sna)能夠克服核酸遞送的典型挑戰(zhàn)。sna已顯示有效地進(jìn)入50種不同的細(xì)胞類型，而無(wú)需使用輔助轉(zhuǎn)染試劑并顯示出最低限度的細(xì)胞毒性。最近，這些結(jié)構(gòu)的胞吞機(jī)制顯示依賴于a類清道夫受體(sr-a)。本公開內(nèi)容涉及通過(guò)構(gòu)建其組成成分寡核苷酸鏈富含鳥苷酸(g)的sna，利用sr-a與聚(鳥苷酸)寡核苷酸鏈的相互作用使sna進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的攝取達(dá)到最大。

相應(yīng)地，本公開內(nèi)容證明了寡核苷酸功能化的納米顆粒的效用，其中寡核苷酸還包含調(diào)節(jié)細(xì)胞攝取的結(jié)構(gòu)域。如本文使用的，“結(jié)構(gòu)域”被理解為核堿基序列。如本文定義的經(jīng)修飾的核堿基也預(yù)期構(gòu)成如本文提供的結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，結(jié)構(gòu)域與在納米顆粒上功能化的寡核苷酸共線。在另一個(gè)方面，結(jié)構(gòu)域與納米顆粒直接結(jié)合，而不與在納米顆粒上功能化的寡核苷酸結(jié)合。在另外一個(gè)方面，結(jié)構(gòu)域通過(guò)間隔物與納米顆粒結(jié)合，而不與在納米顆粒上功能化的寡核苷酸結(jié)合。換言之，在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域通過(guò)間隔物與納米顆粒結(jié)合，與和寡核苷酸的任何結(jié)合相分離(因此在此類實(shí)施例中，間隔物不包含核堿基)。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”采取其在本領(lǐng)域中的普通含義。因此，例如“a”＝腺苷酸，“t”＝胸苷酸，“c”＝胞苷酸，“g”＝鳥苷酸，并且“u”＝尿苷酸。

此處注意到，如本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確規(guī)定。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”(在sna上功能化或作為靶分子)可與術(shù)語(yǔ)寡核苷酸互換使用，并且該術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義。

還應(yīng)注意術(shù)語(yǔ)“附著的”、“綴合的”和“功能化的”在本文中也可互換使用，并且指寡核苷酸或結(jié)構(gòu)域與納米顆粒的結(jié)合。

“雜交”意指按照沃森-克里克dna互補(bǔ)性、hoogstein結(jié)合或本領(lǐng)域已知的其他序列特異性結(jié)合的規(guī)則，通過(guò)氫鍵在兩條或三條核酸鏈之間的相互作用。雜交可在本領(lǐng)域已知的不同嚴(yán)格條件下進(jìn)行。

如本文使用的，“聚x”結(jié)構(gòu)域(其中“x”是核苷酸，例如鳥苷酸)是在其長(zhǎng)度上包含大于50％但小于100％的“x”的序列。例如，長(zhǎng)度為30個(gè)核苷酸的聚鳥苷酸(聚g)結(jié)構(gòu)域由至少15個(gè)(但小于30個(gè))鳥苷酸核苷酸組成。因此，如本文使用的，“聚x”結(jié)構(gòu)域不是均聚物序列。

納米顆粒

本發(fā)明提供了納米顆粒，其被功能化以具有與其附著的多核苷酸。一般而言，考慮的納米顆粒包括對(duì)如本文所述的多核苷酸具有高負(fù)載能力的任何化合物或物質(zhì)，包括例如且不限于金屬、半導(dǎo)體、脂質(zhì)體顆粒、絕緣體顆粒組合物和樹枝狀聚合物(有機(jī)相對(duì)于無(wú)機(jī))。

因此，本發(fā)明考慮了納米顆粒，其包含各種無(wú)機(jī)材料，包括但不限于金屬、半導(dǎo)體材料或陶瓷，如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030147966中所述。例如，基于金屬的納米顆粒包括本文所述的那些。陶瓷納米顆粒材料包括但不限于：透鈣磷石、磷酸三鈣、氧化鋁、二氧化硅和氧化鋯。納米顆粒由其生產(chǎn)的有機(jī)材料包括碳。納米顆粒聚合物包括聚苯乙烯、硅酮橡膠、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚酯、聚醚和聚乙烯。生物可降解的生物聚合物(例如多肽，如bsa、多糖等)、其他生物材料(例如碳水化合物)和/或聚合物化合物也考慮用于生產(chǎn)納米顆粒。還考慮了例如如pct/us2014/068429(其以引用的方式全文并入本文)中公開的脂質(zhì)體顆粒。本文還考慮了例如如美國(guó)專利公開號(hào)2012/0282186(其以引用的方式全文并入本文)中描述的空心顆粒。

在一個(gè)實(shí)施例中，納米顆粒是金屬的，并且在各個(gè)方面，納米顆粒是膠體金屬。因此，在各種實(shí)施例中，可用于實(shí)踐該方法的納米顆粒包括金屬(包括例如且不限于金、銀、鉑、鋁、鈀、銅、鈷、銦、鎳或順應(yīng)納米顆粒形成的任何其他金屬)、半導(dǎo)體(包括例如且但不限于cdse、cds和由zns涂布的cds或cdse)和磁性(例如鐵磁體)膠體材料?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)踐的其他納米顆粒還包括但不限于zns、zno、ti、tio2、sn、sno2、si、sio2、fe、fe⁺⁴、ag、cu、ni、al、鋼、鈷鉻合金、cd、鈦合金、agi、agbr、hgi2、pbs、pbse、znte、cdte、in2s3、in2se3、cd3p2、cd3as2、inas和gaas。制備zns、zno、tio2、agi、agbr、hgi2、pbs、pbse、znte、cdte、in2s3、in2se3、cd3p2、cd3as2、inas和gaas納米顆粒的方法也是本領(lǐng)域已知的。參見例如weller，angew.chem.int.ed.engl.，32，41(1993)；henglein，top.curr.chem.，143，113(1988)；henglein，chem.rev.，89，1861(1989)；brus，appl.phys.a.，53，465(1991)；bahncmann，在photochemicalconversionandstorageofsolarenergy(pelizetti和schiavello編輯1991)中，第251頁(yè)；wang和herron，j.phys.chem.，95，525(1991)；olshavsky，等人，j.am.chem.soc.，112，9438(1990)；ushida等人，j.phys.chem.，95，5382(1992)。

在實(shí)踐中，提供了使用具有與其附著的寡核苷酸的任何合適的顆粒來(lái)增加細(xì)胞攝取且抑制基因表達(dá)的方法，所述寡核苷酸不干擾復(fù)合物形成，即與靶多核苷酸的雜交。顆粒的尺寸、形狀和化學(xué)組成有助于所得到的寡核苷酸功能化的納米顆粒的性質(zhì)。這些性質(zhì)包括例如光學(xué)性質(zhì)、光電性能、電化學(xué)性質(zhì)、電子性質(zhì)、各種溶液中的穩(wěn)定性、磁性、以及孔和通道尺寸變化?？紤]具有不同尺寸、形狀和/或化學(xué)組成的顆?；旌衔锏氖褂?，以及具有均勻尺寸、形狀和化學(xué)組成的納米顆粒的使用。合適的顆粒的例子包括但不限于納米粒子顆粒、聚集物顆粒、各向同性顆粒(例如球形顆粒)和各向異性顆粒(例如非球形桿、四面體、棱柱體)和核-殼顆粒，例如于2002年12月28日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/034,451和于2002年12月28日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us01/50825中所述的顆粒，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入。

制備金屬、半導(dǎo)體和磁性納米顆粒的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如，schmid，g.(編輯)clustersandcolloids(vch，weinheim，1994)；hayat，m.a.(編輯)colloidalgold：principles，methods，andapplications(academicpress，sandiego，1991)；massart，r.，ieeetransactionsonmagnetics，17，1247(1981)；ahmadi，t.s.等人，science，272，1924(1996)；henglein，a.等人，j.phys.chem.，99，14129(1995)；curtis，a.c.，等人，angew.chem.int.ed.engl.，27，1530(1988)。所制備的聚氰基丙烯酸烷基酯納米顆粒的制備在fattal等人，j.controlledrelease(1998)53：137-143和美國(guó)專利號(hào)4,489,055中描述。用于制備包含聚(d-glucaramidoamine)的納米顆粒的方法在liu等人，j.am.chem.soc.(2004)126：7422-7423中描述。包含聚合的甲基丙烯酸甲酯(mma)的納米顆粒的制備描述在tondelli等人，nucl.acidsres.(1998)26：5425-5431中描述，并且樹枝狀聚合物納米顆粒的制備在例如kukowska-latallo等人，proc.natl.acad.sci.usa(1996)93：4897-4902(starburst聚酰胺-胺樹枝狀聚合物)中描述。

合適的納米顆粒也從例如tedpella，inc.(金)、amershamcorporation(金)和nanoprobes，inc.(金)商購(gòu)可得。

還如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030147966中所述的，包含本文所述材料的納米顆粒是商購(gòu)可得的，或它們可由溶液中的逐步成核(例如通過(guò)膠體反應(yīng))，或者通過(guò)各種物理和化學(xué)氣相沉積工藝?yán)鐬R射沉積來(lái)產(chǎn)生。參見例如havashi，(1987)vac.sci.technol.july/august1987，a5(4)：1375-84；hayashi，(1987)physicstoday，december1987，第44-60頁(yè)；mrsbulletin，january1990，第16-47頁(yè)。

如在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0030147966中進(jìn)一步描述的，使用本領(lǐng)域已知的方法，使用haucl4和檸檬酸還原劑產(chǎn)生考慮的納米顆粒。參見例如marinakos等人，(1999)adv.mater.11：34-37；marinakos等人，(1998)chem.mater.10：1214-19；enustun&turkevich，(1963)j.am.chem.soc.85：3317。具有約140nm的分散聚集物粒徑的氧化錫納米顆粒從日本chiba的vacuummetallurgicalco.，ltd.商購(gòu)可得。各種組成和尺寸范圍的其他商購(gòu)可得的納米顆?？衫绲米詁urlingame，calif的vectorlaboratories，inc.。

納米顆粒的尺寸范圍可為平均直徑約1nm至約250nm、平均直徑約1nm至約240nm、平均直徑約1nm至約230nm、平均直徑約1nm至約220nm、平均直徑約1nm至約210nm、平均直徑約1nm至約200nm、平均直徑約1nm至約190nm、平均直徑約1nm至約180nm、平均直徑約1nm至約170nm、平均直徑約1nm至約160nm、平均直徑約1nm至約150nm、平均直徑約1nm至約140nm、平均直徑約1nm至約130nm、平均直徑約1nm至約120nm、平均直徑約1nm至約110nm、平均直徑約1nm至約100nm、平均直徑約1nm至約90nm、平均直徑約1nm至約80nm、平均直徑約1nm至約70nm、平均直徑約1nm至約60nm、平均直徑約1nm至約50nm、平均直徑約1nm至約40nm、平均直徑約1nm至約30nm、或平均直徑約1nm至約20nm、平均直徑約1nm至約10nm。在其他方面，納米顆粒的尺寸為約5nm至約150nm(平均直徑)、約5至約50nm、約10至約30nm、約10至150nm、約10至約100nm、或約10至約50nm。納米顆粒的尺寸為約5nm至約150nm(平均直徑)、約30至約100nm、約40至約80nm。在方法中使用的納米顆粒的尺寸如通過(guò)其特定用途或應(yīng)用的要求而變。尺寸的變化有利地用于優(yōu)化納米顆粒的某些物理特征，例如光學(xué)性質(zhì)或可如本文所述功能化的表面積的量。

寡核苷酸

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”或其復(fù)數(shù)與本文所討論的和本領(lǐng)域另外已知的修飾形式是可互換的。在某些情況下，本領(lǐng)域使用術(shù)語(yǔ)“核堿基”，其包含天然存在的核苷酸和包括經(jīng)修飾的核苷酸的非天然存在的核苷酸。因此，核苷酸或核堿基意指天然存在的核堿基a、g、c、t和u。非天然存在的核堿基包括例如且不限于黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-n6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、n4，n4-乙醇基胞嘧啶、n′，n′-乙醇基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mc)、5-(c3-c6)-炔基-胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥氨酸、肌苷以及在benner等人，美國(guó)專利號(hào)5,432,272以及susanm.freier和karl-heinzaltmann，1997，nucleicacidsresearch，第25卷：第4429-4443頁(yè)中描述的“非天然存在的”核堿基。術(shù)語(yǔ)“核堿基”還不僅包括已知的嘌呤和嘧啶雜環(huán)，還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。進(jìn)一步的天然和非天然存在的核堿基包括下述中公開的那些核堿基：美國(guó)專利號(hào)3,687,808(merigan等人)，sanghvi在antisenseresearchandapplication的第15章中，s.t.crooke和b.lebleu編輯，crcpress，1993，以及englisch等人，1991，angewandtechemie，國(guó)際版本，30：613-722(尤其參見第622和623頁(yè)，以及conciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering，j.i.kroschwitzed.，johnwiley&sons，1990，第858-859頁(yè)，cook，anti-cancerdrugdesign1991，6，585-607中，所述參考文獻(xiàn)各自以引用的方式全文并入本文)。在各個(gè)方面，多核苷酸還包括一種或多種“核苷堿基”或“堿基單元”，其是一類非天然存在的核苷酸，其包括化合物例如可如核堿基起作用的雜環(huán)化合物，包括在最經(jīng)典意義上并非核苷堿基，但充當(dāng)核苷堿基的某些“通用堿基”。通用堿基包括3-硝基吡咯，任選取代的吲哚(例如5-硝基吲哚)和任選取代的次黃嘌呤。其他期望的通用堿基包括吡咯、二唑或三唑衍生物，包括本領(lǐng)域已知的那些通用堿基。

經(jīng)修飾的核苷酸在ep1072679和wo97/12896中描述，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。經(jīng)修飾的核堿基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶堿基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵素、特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-f-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。進(jìn)一步的經(jīng)修飾的堿基包括三環(huán)嘧啶例如吩噁嗪胞苷(1h-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噻嗪-2(3h)-酮)、g夾例如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并[5，4-b][1，4]苯并噁嗪-(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并[3′，2′:4，5]吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-酮)。經(jīng)修飾的堿基還可包括其中嘌呤或嘧啶堿被其他雜環(huán)替代的那些堿基，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核堿基包括美國(guó)專利號(hào)3,687,808中公開的那些核堿基，theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering，第858-859頁(yè)，kroschwitz，j.i.，編輯johnwiley&sons，1990中公開的那些核堿基，由englisch等人，1991，angewandtechemie，國(guó)際版本，30：613公開的那些核堿基，以及由sanghvi，y.s.，第15章，antisenseresearchandapplications，第289-302頁(yè)，crooke，s.t.和lebleu，b.，編輯，crcpress，1993公開的那些核堿基。這些堿基中的某些堿基可用于增加結(jié)合親和力，并且包括5-取代嘧啶，6-氮雜嘧啶以及n-2、n-6和o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示使核酸雙鏈體穩(wěn)定性提高0.6-1.2℃，并且在某些方面與2′-o-甲氧基乙基糖修飾相結(jié)合。參見美國(guó)專利號(hào)3,687,808，美國(guó)專利號(hào)4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,750,692和5,681,941，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

制備預(yù)定序列的多核苷酸的方法是眾所周知的。參見例如sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual(第2版1989)和f.eckstein(編輯)oligonucleotidesandanalogues，第1版(oxforduniversitypress，newyork，1991)。固相合成方法對(duì)于聚核糖核苷酸和聚脫氧核糖核苷酸兩者均為優(yōu)選的(合成dna的眾所周知的方法也可用于合成rna)。聚核糖核苷酸也可酶促制備。非天然存在的核堿基也可摻入多核苷酸內(nèi)。參見例如美國(guó)專利號(hào)7,223,833；katz，j.am.chem.soc.，74：2238(1951)；yamane等人，j.am.chem.soc.，83：2599(1961)；kosturko等人，biochemistry，13：3949(1974)；thomas，j.am.chem.soc.，76：6032(1954)；zhang等人，j.am.chem.soc.，127：74-75(2005)；和zimmermann等人，j.am.chem.soc.，124：13684-13685(2002)。

所提供的如本文定義的用多核苷酸或其修飾形式和結(jié)構(gòu)域功能化的納米顆粒一般包含長(zhǎng)度約5個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸的多核苷酸。更具體而言，納米顆粒用多核苷酸功能化，所述多核苷酸長(zhǎng)度約5至約90個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約80個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約70個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約60個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約50個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約45個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約40個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約35個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約30個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約25個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約20個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約15個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度約5至約10個(gè)核苷酸，以及具體公開至多核苷酸能夠?qū)崿F(xiàn)所需結(jié)果的尺寸長(zhǎng)度的所有多核苷酸中間體。相應(yīng)地，考慮了長(zhǎng)度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500個(gè)或更多個(gè)核苷酸的多核苷酸。

在一些實(shí)施例中，附著到納米顆粒的多核苷酸是dna。當(dāng)dna附著到納米顆粒時(shí)，在一些實(shí)施例中，dna由這樣的序列組成，所述序列與多核苷酸的靶區(qū)域充分互補(bǔ)，使得附著到納米顆粒的dna寡核苷酸與靶多核苷酸發(fā)生雜交，由此將靶多核苷酸與納米顆粒結(jié)合。在各個(gè)方面，dna是單鏈或雙鏈的，只要雙鏈分子還包括與靶多核苷酸的單鏈區(qū)域雜交的單鏈區(qū)域。在一些方面，在納米顆粒上功能化的寡核苷酸的雜交可與雙鏈靶多核苷酸形成三鏈體結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)方面，可通過(guò)將在納米顆粒上功能化的雙鏈寡核苷酸與單鏈靶多核苷酸雜交來(lái)形成三鏈體結(jié)構(gòu)。

在一些實(shí)施例中，本公開內(nèi)容考慮附著至納米顆粒的多核苷酸是rna。在一些方面，rna是小干擾rna(sirna)。

如本文定義的，寡核苷酸還包括適體。一般而言，適體是能夠與靶配體緊密結(jié)合并且謹(jǐn)慎區(qū)分靶配體的核酸或肽結(jié)合種類[yan等人，rnabiol.6(3)316-320(2009)，其以引用的方式全文并入本文]。在一些實(shí)施例中，適體可通過(guò)稱為通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(selex)方法的技術(shù)獲得[tuerk等人，science249：505-10(1990)，美國(guó)專利號(hào)5,270,163和美國(guó)專利號(hào)5,637,459，所述參考文獻(xiàn)各自以引用的方式全文并入本文]。核酸適體的一般討論在例如且不限于nucleicacidandpeptideaptamers：methodsandprotocols(mayer編輯，humanapress，2009)和crawford等人，briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics2(1)：72-79(2003)中發(fā)現(xiàn)。適體的另外討論，包括但不限于rna適體的選擇、dna適體的選擇、能夠共價(jià)連接到靶蛋白的適體的選擇、經(jīng)修飾的適體文庫(kù)的使用、以及適體作為診斷劑和治療劑的用途在由molekulyarnayabiologiya，第34卷，no.6，2000，第1097-1113頁(yè)翻譯的kopylov等人，molecularbiology34(6)：940-954(2000)中提供，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式全文并入本文。在各個(gè)方面，適體為長(zhǎng)度約10至約100個(gè)核苷酸、或長(zhǎng)度約100至約500個(gè)核苷酸。適體的生產(chǎn)和使用是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。

在一些方面，多個(gè)寡核苷酸被功能化至納米顆粒。在各個(gè)方面，多個(gè)寡核苷酸各自具有相同的序列，而在其他方面，一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸具有不同的序列。在進(jìn)一步的方面，多個(gè)寡核苷酸串聯(lián)排列并且由間隔物分離。間隔物在本文下文中更詳細(xì)地描述。

考慮用于附著至納米顆粒的多核苷酸包括調(diào)節(jié)從靶多核苷酸表達(dá)的基因產(chǎn)物的表達(dá)的多核苷酸。這樣的多核苷酸包括如本文下文定義的dna、rna及其修飾形式。相應(yīng)地，在多個(gè)方面而非限制性地，考慮了與靶多核苷酸雜交并且引發(fā)靶多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯降低的多核苷酸，與雙鏈多核苷酸雜交并抑制轉(zhuǎn)錄的三螺旋形成多核苷酸，以及與靶多核苷酸雜交且抑制翻譯的核酶。

在各個(gè)方面，如果靶向特異性多核苷酸，則單一功能化寡核苷酸-納米顆粒組合物具有結(jié)合相同轉(zhuǎn)錄物的多個(gè)拷貝的能力。在一個(gè)方面，提供了用相同的多核苷酸功能化的納米顆粒，即每個(gè)多核苷酸具有相同的長(zhǎng)度和相同的序列。在其他方面，納米顆粒用兩個(gè)或更多個(gè)不相同的多核苷酸進(jìn)行功能化，即所附著的多核苷酸中的至少一個(gè)與至少一個(gè)其他附著的多核苷酸不同之處在于它具有不同的長(zhǎng)度和/或不同的序列。在其中不同的多核苷酸附著到納米顆粒的方面，這些不同的多核苷酸結(jié)合相同的單個(gè)靶多核苷酸但在不同的位置處，或結(jié)合編碼不同基因產(chǎn)物的不同靶多核苷酸。

結(jié)構(gòu)域

如本文所述，其為寡核苷酸功能化的納米顆粒的部分的結(jié)構(gòu)域顯示影響納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率。相應(yīng)地，結(jié)構(gòu)域增加或(通過(guò)結(jié)構(gòu)域的缺乏)降低效率。如本文使用的，“效率”指細(xì)胞中/通過(guò)細(xì)胞的納米顆粒攝取的數(shù)目、量或速率。因?yàn)檫M(jìn)入和離開細(xì)胞的納米顆粒的過(guò)程是動(dòng)態(tài)過(guò)程，所以可通過(guò)攝取更多的納米顆粒或通過(guò)保留進(jìn)入細(xì)胞的那些納米顆粒更長(zhǎng)的時(shí)間段來(lái)提高效率。類似地，可通過(guò)攝取更少的納米顆?；蛲ㄟ^(guò)保留進(jìn)入細(xì)胞的那些納米顆粒更短的時(shí)間段來(lái)降低效率。

在一些方面，結(jié)構(gòu)域位于寡核苷酸的末端處。在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于寡核苷酸的5′末端處，并且在進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于寡核苷酸的3′末端處。

在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于未功能化至納米顆粒的寡核苷酸的末端處。換言之，在這些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于對(duì)于納米顆粒表面遠(yuǎn)側(cè)的寡核苷酸的末端處。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域位于對(duì)于納米顆粒表面遠(yuǎn)側(cè)的寡核苷酸的末端處，并且結(jié)構(gòu)域也不與任何其他分子附著。

在一些方面，結(jié)構(gòu)域與寡核苷酸連續(xù)/共線。在一些方面，結(jié)構(gòu)域位于寡核苷酸內(nèi)的內(nèi)部區(qū)域處。在進(jìn)一步的方面，結(jié)構(gòu)域位于附著至納米顆粒的第二寡核苷酸上。在一個(gè)方面，在功能化至納米顆粒的寡核苷酸中存在多于一個(gè)結(jié)構(gòu)域。相應(yīng)地，在一些方面，多于一個(gè)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)或個(gè)別地存在于寡核苷酸的5′末端處、和/或3′末端處、和/或內(nèi)部區(qū)域處。

在另一個(gè)方面，在一些實(shí)施例中，考慮將結(jié)構(gòu)域作為與寡核苷酸分開的實(shí)體附著至納米顆粒，即在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域直接附著到納米顆粒，與寡核苷酸分開。

進(jìn)一步考慮，在一些實(shí)施例中，寡核苷酸包含位于本文所述位置中的一個(gè)或多個(gè)處的多于一個(gè)結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域提高了寡核苷酸功能化的納米顆粒通過(guò)細(xì)胞的攝取效率。在各種實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域?yàn)殚L(zhǎng)度約2至約1000、約2至約500、約2至約100、約2至約50、約2至約30、約2至約20、約2至約10、約5至約100、約5至約50、約5至約30、約5至約20、約5至約10、約10至約100、約10至約50、約10至約30、約10至約20、約10至約15、約20至約100、約20至約50、約20至約40、約20至約30個(gè)核苷酸。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域?yàn)殚L(zhǎng)度小于100、小于80、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、或小于5個(gè)核苷酸。如本文公開的，該結(jié)構(gòu)域包含鳥苷酸核苷酸(聚g)序列。在各個(gè)方面，結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)鳥苷酸。在進(jìn)一步的方面，結(jié)構(gòu)域包含至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)、至少19個(gè)、至少20個(gè)、至少21個(gè)、至少22個(gè)、至少23個(gè)、至少24個(gè)、至少25個(gè)、至少26個(gè)、至少27個(gè)、至少28個(gè)、至少29個(gè)、至少30個(gè)、至少31個(gè)、至少32個(gè)、至少33個(gè)、至少34個(gè)、至少35個(gè)、至少36個(gè)、至少37個(gè)、至少38個(gè)、至少39個(gè)、至少40個(gè)、至少41個(gè)、至少42個(gè)、至少43個(gè)、至少44個(gè)、至少45個(gè)、至少46個(gè)、至少47個(gè)、至少48個(gè)、至少49個(gè)、至少50個(gè)、至少55個(gè)、至少60個(gè)、至少65個(gè)、至少70個(gè)、至少75個(gè)、至少80個(gè)、至少85個(gè)、至少90個(gè)、至少95個(gè)、至少100個(gè)、至少125個(gè)、至少150個(gè)、至少175個(gè)、至少200個(gè)、至少250個(gè)、至少300個(gè)、至少350個(gè)、至少400個(gè)、至少450個(gè)、至少500個(gè)或更多個(gè)鳥苷酸核苷酸。

在本公開內(nèi)容的各個(gè)方面和實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含為至少約50％但小于100％鳥苷酸核苷酸的序列。因此，在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含為至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％鳥苷酸核苷酸的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％、或小于95％鳥苷酸核苷酸的序列。在再進(jìn)一步的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含約50％至99％、約60％至99％、約65％至99％、約70％至99％、約75％至95％、約80％至99％、約85％至99％、約90％至約99％或約95％至約99％鳥苷酸核苷酸的序列。在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域包含為99％鳥苷酸核苷酸的序列。均聚鳥苷酸序列，即為100％鳥苷酸的序列，未被考慮用作本文的結(jié)構(gòu)域。

因此，鑒于結(jié)構(gòu)域的潛在的核苷酸長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)域中存在的各種百分比的鳥苷酸核苷酸，各自如上所述，考慮到結(jié)構(gòu)域的剩余核苷酸序列(即，并非鳥苷酸但是結(jié)構(gòu)域的部分的核苷酸序列)是任何核苷酸或其修飾形式。例如且不限于，一些實(shí)施例中的結(jié)構(gòu)域是(ggx)n序列，其中x是腺苷酸、胸苷酸、尿苷酸，胞苷酸(或其修飾形式)，并且n是約1至約500。在一些實(shí)施例中，x是鳥苷酸(條件是在這樣的實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域不是均聚的鳥苷酸序列)。在一些實(shí)施例中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在一些實(shí)施例中，考慮用寡核苷酸和結(jié)構(gòu)域功能化的納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率高于用相同寡核苷酸功能化但缺乏結(jié)構(gòu)域的納米顆粒。在一些方面，用寡核苷酸和結(jié)構(gòu)域功能化的納米顆粒被細(xì)胞攝取比用相同寡核苷酸功能化但缺乏結(jié)構(gòu)域的納米顆粒更有效1％。在各個(gè)方面，用寡核苷酸和結(jié)構(gòu)域功能化的納米顆粒被細(xì)胞攝取比用相同寡核苷酸功能化但缺乏結(jié)構(gòu)域的納米顆粒更有效2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。或是約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約l0倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約350倍、約400倍、約450倍、約500倍、約550倍、約600倍、約650倍、約700倍、約750倍、約800倍、約850倍、約900倍、約950倍、約1000倍、約1500倍、約2000倍、約2500倍、約3000倍、約3500倍、約4000倍、約4500倍、約5000倍、約5500倍、約6000倍、約6500倍、約7000倍、約7500倍、約8000倍、約8500倍、約9000倍、約9500倍、約10000倍高或更高。

在一些實(shí)施例中，結(jié)構(gòu)域的缺乏降低寡核苷酸功能化的納米顆粒通過(guò)細(xì)胞的攝取效率。在一些實(shí)施例中，考慮用寡核苷酸功能化但缺乏結(jié)構(gòu)域的納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率低于具有比用包含結(jié)構(gòu)域的相同寡核苷酸功能化的納米顆粒。在一些方面，用寡核苷酸功能化但缺乏結(jié)構(gòu)域的納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率比用包含該結(jié)構(gòu)域的相同寡核苷酸功能化的納米顆粒低1％。在各個(gè)方面，用寡核苷酸功能化但缺乏結(jié)構(gòu)域的納米顆粒被細(xì)胞攝取的效率比用包含該結(jié)構(gòu)域的相同寡核苷酸功能化的納米顆粒低2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或是約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約350倍、約400倍、約450倍、約500倍、約550倍、約600倍、約650倍、約700倍、約750倍、約800倍、約850倍、約900倍、約950倍、約1000倍、約1500倍、約2000倍、約2500倍、約3000倍、約3500倍、約4000倍、約4500倍、約5000倍、約5500倍、約6000倍、約6500倍、約7000倍、約7500倍、約8000倍、約8500倍、約9000倍、約9500倍、約10000倍低或更低。

經(jīng)修飾的寡核苷酸

如上文討論的，經(jīng)修飾的寡核苷酸被考慮用于功能化納米顆粒。在各個(gè)方面，在納米顆粒上功能化的寡核苷酸被完全修飾或部分修飾。因此，在各個(gè)方面，多核苷酸中的核苷酸單元的一個(gè)或多個(gè)或所有糖和/或一個(gè)或多個(gè)或所有核苷酸間鍵合被“非天然存在的”基團(tuán)替代。

在一個(gè)方面，該實(shí)施例考慮了肽核酸(pna)。在pna化合物中，多核苷酸的糖主鏈被含酰胺的主鏈替代。參見例如美國(guó)專利號(hào)5,539,082；5,714,331；和5，719，262，以及nielsen等人，science，1991，254，1497-1500，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

對(duì)于所公開的多核苷酸考慮的核苷酸和非天然核苷酸之間的其他鍵合包括下述中所述的那些鍵合：美國(guó)專利號(hào)4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920；美國(guó)專利公開號(hào)20040219565；國(guó)際專利公開號(hào)wo98/39352和wo99/14226；mesmaeker等人，currentopinioninstructuralbiology5：343-355(1995)以及susanm.freier和karl-heinzaltmann，nucleicacidsresearch，25：4429-4443(1997)，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

寡核苷酸的具體例子包括含有經(jīng)修飾的主鏈或非天然核苷間鍵合的那些寡核苷酸。具有經(jīng)修飾的主鏈的寡核苷酸包括在主鏈中保留磷原子的那些寡核苷酸和在主鏈中不具有磷原子的那些寡核苷酸。在其核苷間主鏈中不具有磷原子的經(jīng)修飾的寡核苷酸視為在“寡核苷酸”的含義內(nèi)。

含有磷原子的經(jīng)修飾的寡核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-亞烷基膦酸酯、5′-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正常3′-5′鍵合的硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯、這些的2′-5′鍵合的類似物、以及具有反轉(zhuǎn)極性的那些，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵合為3′至3′、5′至5′或2′至2′鍵合。還考慮的是具有反轉(zhuǎn)極性的多核苷酸，其包含在最3′核苷酸間鍵合處的單個(gè)3′至3′鍵合，即可為無(wú)堿基(核苷酸缺失或在其位置中具有羥基)的單個(gè)反轉(zhuǎn)核苷殘基。還考慮了鹽、混合鹽和游離酸形式。

教導(dǎo)上述含磷鍵合的制備的代表性美國(guó)專利包括美國(guó)專利號(hào)3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

不包括磷原子的經(jīng)修飾的多核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵合、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵合形成的主鏈。這些包括具有下述的那些：?jiǎn)徇I合；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰乙?；土虼柞Ｒ阴；麈湥粊喖谆柞Ｒ阴；土虼柞Ｒ阴；麈?；核糖乙?；麈?；含烯烴主鏈；氨基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸鹽和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈；以及具有混合的n、o、s和ch2組分部分的其他。在另外其他實(shí)施例中，提供了具有硫代磷酸酯主鏈的多核苷酸和具有雜原子主鏈的寡核苷酸，并且該寡核苷酸包括美國(guó)專利號(hào)5,489,677和5,602,240中所述的-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-。參見例如美國(guó)專利號(hào)5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

在各種形式中，寡核苷酸中的兩個(gè)連續(xù)單體之間的鍵合由選自-ch2-、-o-、-s-、-nrh-、＞c＝o、＞c＝nrh、＞c＝s、-si(r″)2-、-so-、-s(o)2-、-p(o)2-、-po(bh3)-、-p(o，s)-、-p(s)2-、-po(r″)-、-po(och3)-和-po(nhrh)-的2至4個(gè)，優(yōu)選3個(gè)基團(tuán)/原子組成，其中rh選自氫和c1-4-烷基，并且r″選自c1-6-烷基和苯基。這些鍵合的舉例說(shuō)明性例子是-ch2-ch2-ch2-、-ch2-co-ch2-、-ch2-choh-ch2-、-o-ch2-o-、-o-ch2-ch2-、-o-ch2-ch＝(當(dāng)用作與連續(xù)單體的鍵合時(shí)包括r5)、-ch2-ch2-o-、-nrh-ch2-ch2-、-ch2-ch2-nrh-、-ch2-nrh-ch2--、-o-ch2-ch2-nrh-、-nrh-co-o-、-nrh-co-nrh-、-nrh-cs-nrh-、-nrh-c(＝nrh)-nrh-、-nrh-co-ch2-nrh-o-co-o-、-o-co-ch2-o-、-o-ch2-co-o-、-ch2-co-nrh-、-o-co-nrh-、-nrh-co-ch2-、-o-ch2-co-nrh-、-o-ch2-ch2-nrh-、-ch＝n-o-、-ch2-nrh-o-、-ch2-o-n＝(當(dāng)用作與連續(xù)單體的鍵合時(shí)包括r5)、-ch2-o-nrh-、-co-nrh-ch2-、-ch2-nrh-o-、-ch2-nrh-co-、-o-nrh-ch2-、-o-nrh、-o-ch2-s-、-s-ch2-o-、-ch2-ch2-s-、-o-ch2-ch2-s-、-s-ch2-ch＝(當(dāng)用作與連續(xù)單體的鍵合時(shí)包括r5)、-s-ch2-ch2-、-s-ch2-ch2--o-、-s-ch2-ch2-s-、-ch2-s-ch2-、-ch2-so-ch2-、-ch2-so2-ch2-、-o-so-o-、-o-s(o)2-o-、-o-s(o)2-ch2-、-o-s(o)2-nrh-、-nrh-s(o)2-ch2-；-o-s(o)2-ch2-、-o-p(o)2-o-、-o-p(o，s)-o-、-o-p(s)2-o-、-s-p(o)2-o-、-s-p(o，s)-o-、-s-p(s)2-o-、-o-p(o)2-s-、-o-p(o，s)-s-、-o-p(s)2-s-、-s-p(o)2-s-、-s-p(o，s)-s-、-s-p(s)2-s-、-o-po(r″)-o-、-o-po(och3)-o-、-o-po(och2ch3)-o-、-o-po(och2ch2s-r)-o-、-o-po(bh3)-o-、-o-po(nhrn)-o-、-o-p(o)2-nrhh-、-nrh-p(o)2-o-、-o-p(o，nrh)-o-、-ch2-p(o)2-o-、-o-p(o)2-ch2-和-o-si(r″)2-o-；在其中考慮了-ch2-co-nrh-、-ch2-nrh-o-、-s-ch2-o-、-o-p(o)2-o-o-p(-o，s)-o-、-o-p(s)2-o-、-nrhp(o)2-o-、-o-p(o，nrh)-o-、-o-po(r″)-o-、-o-po(ch3)-o-和-o-po(nhrn)-o-，其中rh選自氫和c1-4-烷基，并且r″選自c1-6-烷基和苯基。進(jìn)一步的舉例說(shuō)明性實(shí)例在mesmaeker等人，1995，currentopinioninstructuralbiology，5：343-355以及susanm.freier和karl-heinzaltmann，1997，nucleicacidsresearch，第25卷：第4429-4443頁(yè)中給出。

多核苷酸的另外其他修飾形式在美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0040219565中詳細(xì)描述，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

經(jīng)修飾的多核苷酸還可含有一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。在某些方面，多核苷酸在2′位置處包含下述之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可為取代或未取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。其他實(shí)施例包括o[(ch2)no]mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2)non[(ch2)nch3]2，其中n和m為1至約10。其他多核苷酸在2′位置處包含下述之一：c1至c10低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基團(tuán)、報(bào)道基團(tuán)、嵌入劑、用于改善多核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、或用于改善多核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、以及具有相似性質(zhì)的其他取代基。在一個(gè)方面，修飾包括2′-甲氧基乙氧基(2′-o-ch2ch2och3，也稱為2′-o-(2-甲氧基乙基)或2′-moe)(martin等人，1995，helv.chim.acta，78：486-504)即烷氧基烷氧基。其他修飾包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基團(tuán)，也稱為2′-dmaoe，以及2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為2′-o-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2′-dmaeoe)，即2′-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2。

另外其他的修飾包括2′-甲氧基(2′-o-ch3)、2′-氨基丙氧基(2′-och2ch2ch2nh2)、2′-烯丙基(2′-ch2-ch＝ch2)、2′-o-烯丙基(2′-o-ch2-ch＝ch2)和2′-氟(2′-f)。2′-修飾可在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置中。在一個(gè)方面，2′-阿拉伯糖修飾是2′-f。類似的修飾也可在多核苷酸上的其他位置處作出，例如在3′末端核苷酸上的糖的3′位置處或2′-5′連接的多核苷酸中和在5′末端核苷酸的5′位置處。多核苷酸還可具有糖模擬物，例如環(huán)丁基部分代替戊呋糖基糖。參見例如美國(guó)專利號(hào)4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。

在一個(gè)方面，糖的修飾包括鎖核酸(lna)，其中2′-羥基連接到糖環(huán)的3′或4′碳原子，由此形成雙環(huán)糖部分。該鍵合在某些方面是橋接2′氧原子和4′碳原子的亞甲基(-ch2-)n基團(tuán)，其中n為1或2。lna及其制備在wo98/39352和wo99/14226中描述，所述專利的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。

與納米顆粒的寡核苷酸附著

考慮用于該方法的寡核苷酸包括通過(guò)任何方式與納米顆粒結(jié)合的寡核苷酸。不管寡核苷酸通過(guò)其與納米顆粒附著的方式，通過(guò)5′鍵合、3′鍵合、某種類型的內(nèi)部鍵合或這些附著的任何組合來(lái)實(shí)現(xiàn)在各個(gè)方面的附著。

附著方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且在美國(guó)公開號(hào)2009/0209629中描述，所述專利以引用的方式全文并入本文。將rna附著到納米顆粒的方法一般在pct/us2009/65822中描述，所述專利以引用的方式全文并入本文。

因此提供了具有與其附著的寡核苷酸的納米顆粒，其中進(jìn)一步包含結(jié)構(gòu)域的寡核苷酸與納米顆粒結(jié)合。

間隔物

在某些方面，考慮了功能化納米顆粒，其包括其中寡核苷酸和結(jié)構(gòu)域通過(guò)間隔物附著到納米顆粒的那些納米顆粒。如本文使用的，“間隔物”意指這樣的部分，其不參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)本身，但作用于增加納米顆粒和功能性寡核苷酸之間的距離，或者當(dāng)以多個(gè)拷貝附著至納米顆粒時(shí)增加各個(gè)寡核苷酸之間的距離。因此，考慮將間隔物串聯(lián)定位在各個(gè)寡核苷酸之間，無(wú)論寡核苷酸具有相同的序列還是具有不同的序列。在其中結(jié)構(gòu)域直接附著到納米顆粒的本發(fā)明的方面，結(jié)構(gòu)域任選地通過(guò)間隔物功能化至納米顆粒。在另一個(gè)方面，結(jié)構(gòu)域在與間隔物末端相對(duì)的寡核苷酸末端上。在其中串聯(lián)的結(jié)構(gòu)域功能化至納米顆粒的方面，間隔物任選地在串聯(lián)結(jié)構(gòu)中的一些或全部結(jié)構(gòu)域單元之間。在一個(gè)方面，當(dāng)存在時(shí)，間隔物是有機(jī)部分。在另一個(gè)方面，間隔物是聚合物，包括但不限于水溶性聚合物、核酸、多肽、寡糖、碳水化合物、脂質(zhì)、乙二醇或其組合。

在某些方面，多核苷酸具有它通過(guò)其與納米顆粒共價(jià)結(jié)合的間隔物。這些多核苷酸是與上文描述相同的多核苷酸。由于間隔物與納米顆粒的結(jié)合，多核苷酸與納米顆粒的表面間隔開，并且對(duì)于與其靶的雜交更容易接近。在間隔物是多核苷酸的情況下，在各種實(shí)施例中，間隔物的長(zhǎng)度至少約10個(gè)核苷酸、10-30個(gè)核苷酸或甚至大于30個(gè)核苷酸。間隔物可具有不干擾多核苷酸變得與納米顆?；虬卸嗪塑账峤Y(jié)合的能力的任何序列。在某些方面，多核苷酸間隔物的堿基全部是腺苷酸、全部是胸苷酸、全部是胞苷酸、全部是鳥苷酸、全部是尿苷酸、或全部是一些其他經(jīng)修飾的堿基。相應(yīng)地，在其中間隔物由所有鳥苷酸組成的一些方面，考慮間隔物可如本文所述充當(dāng)結(jié)構(gòu)域。

表面密度

本文提供的納米顆粒具有在納米顆粒的表面上的多核苷酸的填充密度，其在各個(gè)方面都足以導(dǎo)致納米顆粒之間和單個(gè)納米顆粒上的多核苷酸鏈之間的協(xié)同行為。在另一個(gè)方面，在納米顆粒之間的協(xié)同行為增加了多核苷酸對(duì)核酸酶降解的抗性。在另外一個(gè)方面，通過(guò)細(xì)胞的納米顆粒攝取受與納米顆粒結(jié)合的多核苷酸密度的影響。如以引用的方式全文并入本文的美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2008/0306016中所述，在納米顆粒的表面上較高密度的多核苷酸與通過(guò)細(xì)胞的納米顆粒的增加攝取有關(guān)。本公開內(nèi)容提供了其中由于納米顆粒表面上更高密度的多核苷酸而增加的納米顆粒攝取與本文所述的結(jié)構(gòu)域的存在組合起作用的實(shí)施例。例如且不限于，在納米顆粒表面上具有給定密度的多核苷酸的納米顆粒(其中納米顆粒還包含如本文公開的聚g結(jié)構(gòu)域)，將證明相對(duì)于在納米顆粒表面上具有相同密度的多核苷酸的納米顆粒(其中納米顆粒缺乏聚g結(jié)構(gòu)域)通過(guò)細(xì)胞的功能化納米顆粒的攝取增加。在各個(gè)方面，還包含聚g結(jié)構(gòu)域的功能化納米顆粒通過(guò)細(xì)胞的攝取增加相對(duì)于缺乏聚g結(jié)構(gòu)域的功能化納米顆粒為1％。在進(jìn)一步的方面，還包含聚g結(jié)構(gòu)域的功能化納米顆粒通過(guò)細(xì)胞的攝取增加相對(duì)于缺乏聚g結(jié)構(gòu)域的功能化納米顆粒為2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或是約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約100倍、約150倍、約200倍、約250倍、約300倍、約350倍、約400倍、約450倍、約500倍、約550倍、約600倍、約650倍、約700倍、約750倍、約800倍、約850倍、約900倍、約950倍、約1000倍、約1500倍、約2000倍、約2500倍、約3000倍、約3500倍、約4000倍、約4500倍、約5000倍、約5500倍、約6000倍、約6500倍、約7000倍、約7500倍、約8000倍、約8500倍、約9000倍、約9500倍、約10000倍高或更高。

足以使納米顆粒穩(wěn)定的表面密度和對(duì)于納米顆粒和多核苷酸的所需組合獲得它必要的條件可憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。一般地，至少約2pmole/cm²的表面密度將足以提供穩(wěn)定的納米顆粒-寡核苷酸組合物。在一些方面，表面密度為至少15pmole/cm²。還提供了其中多核苷酸以下述表面密度與納米顆粒結(jié)合的方法：至少2pmol/cm²、至少3pmol/cm²、至少4pmol/cm²、至少5pmol/cm²、至少6pmol/cm²、至少7pmol/cm²、至少8pmol/cm²、至少9pmol/cm²、至少10pmol/cm²、至少約15pmol/cm²、至少約19pmol/cm²、至少約20pmol/cm²、至少約25pmol/cm²、至少約30pmol/cm²、至少約35pmol/cm²、至少約40pmol/cm²、至少約45pmol/cm²、至少約50pmol/cm²、至少約55pmol/cm²、至少約60pmol/cm²、至少約65pmol/cm²、至少約70pmol/cm²、至少約75pmol/cm²、至少約80pmol/cm²、至少約85pmol/cm²、至少約90pmol/cm²、至少約95pmol/cm²、至少約100pmol/cm²、至少約125pmol/cm²、至少約150pmol/cm²、至少約175pmol/cm²、至少約200pmol/cm²、至少約250pmol/cm²、至少約300pmol/cm²、至少約350pmol/cm²、至少約400pmol/cm²、至少約450pmol/cm²、至少約500pmol/cm²、至少約550pmol/cm²、至少約600pmol/cm²、至少約650pmol/cm²、至少約700pmol/cm²、至少約750pmol/cm²、至少約800pmol/cm²、至少約850pmol/cm²、至少約900pmol/cm²、至少約950pmol/cm²、至少約1000pmol/cm²或更多。

寡核苷酸靶序列和雜交

在一些方面，本公開內(nèi)容提供了靶向特異性核酸的方法?？砂邢蛉魏晤愋偷暮怂?，并且所述方法可用于例如基因表達(dá)的治療性調(diào)節(jié)(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2009/0209629，其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文)?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法靶向的核酸的例子包括但不限于基因(例如，與特定疾病相關(guān)的基因)、細(xì)菌rna或dna、病毒rna、或mrna、rna或單鏈核酸。

術(shù)語(yǔ)“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”指包含從翻譯起始密碼子開始的在任一方向(即5′或3′)上的連續(xù)核苷酸的mrna或基因的一部分。類似地，術(shù)語(yǔ)“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”指包含從翻譯終止密碼子開始的在任一方向(即，5′或3′)上的連續(xù)核苷酸的這種mrna或基因的一部分。因此，“起始密碼子區(qū)域”(或“翻譯起始密碼子區(qū)域”)和“終止密碼子區(qū)域”(或“翻譯終止密碼子區(qū)域”)都是可用功能化納米顆粒上的寡核苷酸有效靶向的區(qū)域。

其他靶區(qū)域包括5′非翻譯區(qū)(5′utr)，從翻譯起始密碼子開始的在5′方向上的mrna的一部分，包括5′帽位點(diǎn)和mrna的翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的相應(yīng)核苷酸)，以及3′非翻譯區(qū)(3′utr)，從翻譯終止密碼子開始的在3′方向上的mrna的一部分，包括翻譯終止密碼子和mrna的3′末端之間的核苷酸(或基因上的相應(yīng)核苷酸)。mrna的5′帽位點(diǎn)包含經(jīng)由5′-5′三磷酸鍵合連接到mrna的最5′殘基的n7-甲基化鳥苷殘基。mrna的5′帽區(qū)域被認(rèn)為包括5′帽結(jié)構(gòu)本身以及與帽位點(diǎn)相鄰的前50個(gè)核苷酸。

對(duì)于原核靶核酸，在各個(gè)方面，核酸是由基因組dna轉(zhuǎn)錄的rna。對(duì)于真核靶核酸，核酸是動(dòng)物核酸、植物核酸、真菌核酸包括酵母核酸。如上文，靶核酸是由基因組dna序列轉(zhuǎn)錄的rna。在某些方面，靶核酸是線粒體核酸。對(duì)于病毒靶核酸，核酸是病毒基因組rna或由病毒基因組dna轉(zhuǎn)錄的rna。

所提供的用于抑制基因產(chǎn)物表達(dá)的方法包括這樣的方法，其中與不存在寡核苷酸功能化的納米顆粒的基因產(chǎn)物表達(dá)相比，靶基因產(chǎn)物的表達(dá)被抑制至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或100％。換言之，所提供的方法包括導(dǎo)致靶基因產(chǎn)物表達(dá)的基本上任何程度的抑制的那些方法。

抑制程度從體液樣品或活組織檢查樣品或通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的成像技術(shù)在體內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。可替代地，在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中測(cè)定抑制程度，一般作為來(lái)源于使用特定類型的納米顆粒和特定寡核苷酸在體內(nèi)可預(yù)期的抑制程度的可預(yù)測(cè)量度。

實(shí)例

調(diào)查了球形核酸納米顆粒綴合物(sna)的序列依賴性細(xì)胞攝取。該過(guò)程通過(guò)與a類清道夫受體(sr-a)相互作用和質(zhì)膜微囊介導(dǎo)的胞吞作用而發(fā)生。已知線型聚(鳥苷酸)(聚g)是sr-a的天然配體。下文描述的實(shí)例測(cè)試了具有較高g含量的sna是否能夠以比由其他核苷酸組成的sna更大的量進(jìn)入細(xì)胞，并且像這樣根據(jù)組成成分寡核苷酸序列測(cè)量sna的細(xì)胞內(nèi)化。如下所示，具有富集g含量的sna顯示最高的細(xì)胞攝取。接下來(lái)，將小分子(喜樹堿)與sna化學(xué)綴合，以產(chǎn)生藥物-sna綴合物，并且觀察到聚gsna將大多數(shù)喜樹堿遞送至細(xì)胞，并且在癌細(xì)胞中具有最高的細(xì)胞毒性。本文提供的數(shù)據(jù)闡明了用于增強(qiáng)球形核酸的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要設(shè)計(jì)考慮。

在四種細(xì)胞類型a549(人肺腺癌上皮)、nih-3t3(小鼠成纖維細(xì)胞)、c166(小鼠內(nèi)皮)和hacat(人角質(zhì)形成細(xì)胞)中調(diào)查富含g的sna的增強(qiáng)的細(xì)胞攝取。另外，通過(guò)設(shè)計(jì)負(fù)載有dna-化學(xué)治療綴合物的sna，研究了序列依賴性細(xì)胞攝取的后果，并且與富含a、t、s的sna相比，用富含g的sna增加了喜樹堿化學(xué)治療分子遞送至a549細(xì)胞和后續(xù)細(xì)胞毒性。

實(shí)例1

sna上的核堿基類型決定了金納米顆粒的表面上的dna寡核苷酸殼的負(fù)載和厚度。

首先，通過(guò)將相同量的不同核堿基類型的烷基硫醇修飾的30-堿基對(duì)長(zhǎng)的單鏈dna寡核苷酸(ssdna)(圖1a；關(guān)于序列信息參見下表1)加入檸檬酸鹽封端的10納米(nm)直徑金納米顆粒(aunp)的水性懸浮液內(nèi)，來(lái)制備由不同核堿基類型(a、t、c或g)組成的sna。為了制備富含c(聚csna)和g(聚gsna)的sna，沿著c和g的線型聚合物以規(guī)律間隔有意地插入t，分別獲得(cct)10和(ggt)10的序列。對(duì)于聚csna和聚gsna，這些設(shè)計(jì)特征減弱了由于i-基序[gehring等人，nature363：561-565(1993)]和g-四鏈體[sen等人，nature334：364-366(1988)]形成而難以合成的合成聚c和聚g序列的挑戰(zhàn)。相反，a和t的線型聚合物不會(huì)自然地折疊成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，當(dāng)制備富含a(聚asna)和t(聚tsna)的sna時(shí)，不需要用另一種核堿基稀釋a和t的線型聚合物。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量，所有sna均具有22±4nm的流體動(dòng)力學(xué)直徑，提示關(guān)于寡核苷酸殼5-8nm的厚度(圖2)。厚度的變化可能是由于負(fù)載的變化(參見下文)。通過(guò)uv-vis光譜法，所有的sna一般在大小上是單分散的，并且與未經(jīng)修飾的aunp相比(524nm相對(duì)于520nm)，顯示出在表面等離子體峰中大約4nm的紅移，這是由于在寡核苷酸殼的共價(jià)附著后的局部折射率的變化[kumar等人，natprotoc3：314-320(2008)](圖3)。然后通過(guò)制備其寡核苷酸在其5′末端處含有cy5熒光團(tuán)的sna，根據(jù)核堿基類型測(cè)量寡核苷酸負(fù)載(圖4)。鑒于30個(gè)堿基的恒定寡核苷酸長(zhǎng)度，富含嘧啶堿基(即c和t)的sna具有顯著更高的寡核苷酸負(fù)載，由此聚tsna和聚csna分別具有大約180個(gè)ssdna和大約140個(gè)ssdna/aunp。相比之下，富含嘌呤堿基的sna具有較低的寡核苷酸負(fù)載：聚gsna和聚asna分別只有大約75個(gè)ssdna和大約45個(gè)ssdna/aunp(圖1a)。

表1.sna納米顆粒綴合物及其dna寡核苷酸序列的列表。制備由表1中列出的dna寡核苷酸組成的sna，以分別使用icp-ms和tem檢查核堿基類型對(duì)其細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分布的作用(圖5)。圖2和圖3呈現(xiàn)了這些sna的流體動(dòng)力學(xué)尺寸和吸收光譜的dls和uv-vis光譜數(shù)據(jù)。圖1中的tem成像數(shù)據(jù)揭示了sna的形態(tài)。

為了通過(guò)透射電子顯微鏡檢查(tem)直接顯現(xiàn)寡核苷酸殼，利用了用于sna的乙酸雙氧鈾染色方案[huxley等人，jbiophysbiochemcytol11：273-296(1961)]。與負(fù)載數(shù)據(jù)一致，聚tsna的寡核苷酸覆蓋率在所有測(cè)試的核堿基類型中最密集，如在aunp的整個(gè)圓周上通過(guò)其干燥厚度為4-6nm的均勻寡核苷酸殼證明的(圖1b)。chen等人使用單分子fret(smfret)和小角度x射線散射(saxs)，以證明在生理水平的鹽(150mmnacl)的存在下，40個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈聚tdna(t40)的端對(duì)端距離為大約6.6nm[chen等人，procnatlacadsciu.s.a.109：799-804(2012)]。因此，如通過(guò)tem圖像揭示的聚tsna的干燥殼厚度提示，當(dāng)它們徑向延伸遠(yuǎn)離aunp的中心時(shí)，聚tdna鏈接近由aunp的彎曲表面提供的最大負(fù)載。聚asna具有厚度僅1-2nm的最薄的寡核苷酸殼，但它們的殼仍是均勻的。鑒于其中等寡核苷酸負(fù)載，聚csna和聚gsna具有2-4nm厚的寡核苷酸殼，但是它們的殼不像聚tsna和聚asna那樣均勻。盡管這種技術(shù)受到干燥影響，但數(shù)據(jù)與來(lái)自寡核苷酸負(fù)載研究的結(jié)果一致(圖1a)。簡(jiǎn)言之，寡核苷酸負(fù)載和tem成像數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)先例一致，即嘧啶堿基(c和t)比其嘌呤配對(duì)物(a和g)更不強(qiáng)烈地吸附至金表面demers等人，jamchemsoc124：11248-11249(2002)；hurst等人，78，8313-8318(2006)；storhoff等人，langmuir18：6666-6670(2002)；kimura-suda等人，journaloftheamericanchemicalsociety125：9014-9015(2003)；opdahl等人，procnatlacadsciu.s.a.104：9-14(2007)]，支持了前者延伸遠(yuǎn)離金表面而后者與表面相互作用的觀點(diǎn)。

實(shí)例2

聚gsna在所有測(cè)試的核堿基類型中以最高量進(jìn)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型。

接下來(lái)，通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜法(icp-ms)監(jiān)測(cè)不同核堿基類型的sna的細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)。選擇c166細(xì)胞是因?yàn)槠浔磉_(dá)sr-a[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]，sr-a是介導(dǎo)sna的細(xì)胞攝取的關(guān)鍵受體(圖5a)。在兩小時(shí)溫育后，聚gsna顯示出在所有測(cè)試的核堿基類型中最高水平的細(xì)胞結(jié)合，累積5×10⁵個(gè)顆粒/細(xì)胞。與聚gsna形成對(duì)比，聚tsna顯示超過(guò)5倍低的細(xì)胞結(jié)合，是所有核堿基類型中細(xì)胞結(jié)合的最低水平。與聚tsna和聚gsna相比，聚a和聚csna顯示出中等水平的細(xì)胞結(jié)合。類似的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于圖13中。還參見圖12，其證明了聚gsna顯示比聚a、聚t和聚csna更高的與c166細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合。經(jīng)修飾的elisa測(cè)定顯示聚gsna證明與重組a類清道夫受體(sr-a)的最高結(jié)合，sr-a負(fù)責(zé)聚gsna增加的細(xì)胞結(jié)合。

然而，icp-ms，允許敏感定量與細(xì)胞結(jié)合的金的大量含量的技術(shù)，不提供關(guān)于sna的細(xì)胞內(nèi)分布的任何信息。因此，tem用于確定sna是進(jìn)入細(xì)胞還是僅與細(xì)胞膜結(jié)合(圖5b)。與細(xì)胞一起溫育2小時(shí)后，由所有核堿基類型組成的sna可進(jìn)入c166細(xì)胞，如通過(guò)其在細(xì)胞溶質(zhì)或初級(jí)內(nèi)體內(nèi)的累積所證明的。與icp-ms數(shù)據(jù)一致，代表性tem圖像顯示聚gsna在所有核堿基類型中是細(xì)胞中最豐富的，在顆粒簇?cái)?shù)目/細(xì)胞的橫截面積和顆粒數(shù)目/簇(通常＞100個(gè)sna/簇)兩個(gè)方面。相比之下，盡管tem圖像不允許精確定量細(xì)胞中的顆粒，但聚asna、聚csna和聚tsna以比聚gsna顯著更小的量(＜20個(gè)sna/簇)進(jìn)入細(xì)胞。

總之，當(dāng)組成成分寡核苷酸鏈保持恒定在30個(gè)堿基長(zhǎng)時(shí)，比其他核堿基類型(即a、c、t)更高部分的g的摻入使sna對(duì)c166細(xì)胞的遞送達(dá)到最大。為了確定這種g依賴性攝取是否僅適用于c166細(xì)胞，對(duì)于三種其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型，即hacat、3t3和a549，進(jìn)一步跟蹤sna的細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)(圖5c)。這些細(xì)胞系連同c166，具有一系列的sr-a的表達(dá)水平；以表達(dá)水平的遞減次序，它們是hacat、c166、3t3和a549[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]。與c166細(xì)胞的攝取數(shù)據(jù)一致，聚gsna證明對(duì)于這些細(xì)胞類型的最大的結(jié)合程度，顯示出比由其他核堿基類型組成的sna的4-10倍高的細(xì)胞結(jié)合。值得注意的是，聚gsna的細(xì)胞結(jié)合也與sr-a的表達(dá)水平正相關(guān)；當(dāng)與相同濃度的聚gsna一起溫育時(shí)，hacat、3t3和a549細(xì)胞分別顯示出最高、中等和最低的細(xì)胞結(jié)合。因此，g的摻入以與sr-a的表達(dá)水平相關(guān)的方式使sna對(duì)多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的遞送達(dá)到最大。另外，這些數(shù)據(jù)顯示當(dāng)核堿基類型不保持恒定時(shí)，寡核苷酸負(fù)載不決定細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)；盡管它們的寡核苷酸負(fù)載較低，但聚gsna以比聚tsna更高的量進(jìn)入細(xì)胞。

實(shí)例3

不管核組成如何，聚g殼使細(xì)胞內(nèi)遞送達(dá)到最大。

為了證明與聚a、聚t和聚csna相比，聚gsna的聚g殼促進(jìn)了增加的細(xì)胞攝取，合成了具有不同核組成的富含t的sna和聚gsna，5nmaunp或硒化鎘(cdse)量子點(diǎn)(qd)(關(guān)于序列信息參見表2)。制備由表2中列出的寡核苷酸組成的5納米aunp-sna和qd-sna，以研究聚g殼對(duì)不同核組成的sna的細(xì)胞攝取的作用(圖6)。所有序列均為28個(gè)堿基長(zhǎng)，并且以二苯并環(huán)辛基(dbco)基團(tuán)封端。使用先前描述的策略合成aunp-sna和qd-sna[zhang等人，natmater12：741-746(2013)，其以引用的方式全文并入本文]。在一組實(shí)驗(yàn)中，用等濃度的富含t的qd-sna和聚gaunp-sna處理c166細(xì)胞。在另一組實(shí)驗(yàn)中，用等濃度的富含t的aunp-sna和聚gqd-sna處理細(xì)胞。然后使用共聚焦顯微鏡檢查來(lái)跟蹤進(jìn)入細(xì)胞的qd的熒光信號(hào)。用富含t的qd-sna和聚gaunp-sna處理的c166細(xì)胞顯示非常少的細(xì)胞內(nèi)熒光。然而，用富含t的aunp-sna和聚gqd-sna處理的c166細(xì)胞顯示顯著更高的細(xì)胞內(nèi)熒光(圖6a)，指示具有聚g殼的sna進(jìn)入c166細(xì)胞內(nèi)的更高攝取。為了進(jìn)一步證實(shí)，icp-ms用于分析用單獨(dú)的富含t的aunp-sna或qd-sna、單獨(dú)的聚gaunp-sna或qd-sna、富含t的aunp-sna和聚gqd-sna的組合、以及富含t的qd-sna和聚gaunp-sna的組合處理的c166細(xì)胞中的au含量和cd含量。用聚gaunp-sna處理的c166細(xì)胞具有的au含量是用富含t的aunp-sna處理的細(xì)胞的3倍。相比之下，用聚gqd-sna處理的細(xì)胞顯示的cd含量是用富含t的qd-sna處理的細(xì)胞的三倍(圖6b)。用聚gaunp-sna和富含t的qd-sna處理的細(xì)胞具有與cd含量相比更高的au含量，并且對(duì)于用富含t的aunp-sna和聚gqd-sna處理的細(xì)胞，這種趨勢(shì)是相反的(圖6b)。這種競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)胞攝取測(cè)定顯示，具有聚g殼的sna優(yōu)先進(jìn)入細(xì)胞，而不管核組成如何，指示聚g殼對(duì)細(xì)胞表面受體具有更大的親和力。

表2.sna納米顆粒綴合物及其dna寡核苷酸序列的列表。

實(shí)例4

寡核苷酸的最外周大約10個(gè)堿基決定了sna的細(xì)胞攝取。

為了從幾何角度來(lái)表征細(xì)胞攝取性質(zhì)，調(diào)查了顯著促成sna的細(xì)胞攝取的dna寡核苷酸的部分。再次，比較了當(dāng)所有組成成分寡核苷酸保持恒定在30個(gè)堿基時(shí)sna的細(xì)胞結(jié)合(關(guān)于序列信息參見表3)。制備由表3中列出的寡核苷酸組成的sna，以探測(cè)核苷酸位置對(duì)sna的細(xì)胞攝取的作用(圖7)。所有序列均為30個(gè)堿基長(zhǎng)，并且在3′末端處含有最少6個(gè)胸苷酸(t)殘基。在3′末端處的聚(t)基序允許寡核苷酸在aunp的表面上幾乎恒定的負(fù)載，而不依賴于序列。寡核苷酸的部分不含任何核堿基；通過(guò)使用dspacerce亞磷酰胺(d；具有核糖單元和磷酸鹽主鏈兩者)或spacer亞磷酰胺c3(c；僅具有磷酸鹽主鏈)來(lái)制備這些無(wú)堿基區(qū)域。

首先，通過(guò)icp-ms比較了聚tsna以及含有不同量的在5′末端處的g(以重復(fù)ggt單元的形式)和在3′末端處的t的sna之間的細(xì)胞結(jié)合。在dna寡核苷酸的3′末端處的聚t區(qū)段允許在aunp的表面上幾乎恒定的寡核苷酸負(fù)載。一般而言，sna的細(xì)胞結(jié)合隨著在組成成分寡核苷酸的5′末端處的g含量增加而增加(圖7a)?？雌饋?lái)需要在組成成分寡核苷酸的5′末端處的最少四個(gè)ggt重復(fù)，以顯著增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)合；與聚tsna相比，兩個(gè)ggt重復(fù)的添加并不顯著增加細(xì)胞結(jié)合。

d＝具有核糖單元和磷酸鹽主鏈兩者的無(wú)堿基位點(diǎn)

c＝僅具有磷酸鹽主鏈的無(wú)堿基位點(diǎn)

表3.sna納米顆粒綴合物及其dna寡核苷酸序列的列表

還比較了由ggt重復(fù)在5′末端處暴露或埋在鏈中間的寡核苷酸組成的sna的細(xì)胞結(jié)合(參見表3中的序列信息)。當(dāng)與其中g(shù)gt重復(fù)在5′末端處暴露的情況相比時(shí)，在5′末端上放置t12基序以將ggt重復(fù)埋在dna寡核苷酸鏈的中間使細(xì)胞結(jié)合降低大約70％，有效地遏制了ggt重復(fù)對(duì)sna的細(xì)胞攝取的優(yōu)異作用(圖7b)。這些觀察顯示在30個(gè)堿基長(zhǎng)的組成成分dna寡核苷酸的5′末端處的大約10個(gè)堿基主要決定了sna的細(xì)胞攝取性質(zhì)。除了經(jīng)由引入更多的g增加聚tsna的細(xì)胞攝取之外，還探測(cè)了與聚tsna的細(xì)胞攝取最相關(guān)的sna納米結(jié)構(gòu)的一部分。為此，構(gòu)建了在組成成分dna寡核苷酸的5′末端處含有不同長(zhǎng)度的無(wú)堿基間隔物的sna(參見表3中的序列信息)。這些無(wú)堿基間隔物包括不包含核堿基的dspacer(glenresearch)和既不具有核堿基也不具有環(huán)結(jié)構(gòu)的c3間隔物(glenresearch)。具有較高無(wú)堿基間隔物含量的sna顯示與聚tsna相比低大約75％的細(xì)胞結(jié)合(圖7c和7d)，當(dāng)將多于10個(gè)無(wú)堿基間隔物單元添加到5′末端時(shí)其被拉平。再次，這些數(shù)據(jù)證明在sna納米顆粒的最外圍部分處暴露的組成成分寡核苷酸鏈的大約三分之一(在5′末端處的總共30個(gè)堿基中的10個(gè))在確定其細(xì)胞結(jié)合中是幾何學(xué)上最必需的。它們還再次肯定核堿基而不是磷酸鹽主鏈或核糖單元是決定sna的細(xì)胞結(jié)合的生化活性組分。

實(shí)例5

聚gsna可使小分子化學(xué)治療劑(例如喜樹堿)對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)遞送達(dá)到最大。

除通過(guò)icp-ms測(cè)量和tem成像提供的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)之外，還通過(guò)證明含有藥物的sna的細(xì)胞攝取的增加對(duì)應(yīng)于其針對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性的增加，來(lái)提供聚gsna在所有核堿基類型中最有效地進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的功能證據(jù)。作為概念證明，通過(guò)將喜樹堿(cpt)(小分子化學(xué)治療劑)共價(jià)附著到其組成成分寡核苷酸的最外圍位置，并且隨后根據(jù)核堿基類型檢查其殺死癌細(xì)胞的能力，制備了含有喜樹堿的sna(cpt-sna)。選擇a549人肺腺癌上皮細(xì)胞(如圖5c中討論的)作為模型細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈兊膕r-a和窖蛋白-1的低表達(dá)，這兩者都是sna的細(xì)胞攝取的必需蛋白質(zhì)[choi等人，procnatlacadsciu.s.a.110：7625-7630(2013)]。鑒于通過(guò)a549細(xì)胞的sna細(xì)胞攝取的適度程度，任何可觀察到的細(xì)胞毒性都突出了根據(jù)核堿基類型的cpt-sna效力。為了將cpt分子附著到dna鏈上，遵循文獻(xiàn)先例以使cpt的-oh基團(tuán)與含有疊氮化物的接頭反應(yīng)，以合成喜樹堿-疊氮化物(cpt-n3)[parrish等人，bioconjugchem18：263-267(2007)]。無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)用于將cpt-n3直接偶聯(lián)到雙功能單鏈dna(ssdna)上，所述雙功能單鏈dna具有在一個(gè)末端上的二苯并環(huán)辛基(dbco)基團(tuán)以及在另一個(gè)末端上的硫醇基團(tuán)。然后所得的綴合物喜樹堿-dna-硫醇(cpt-dna-sh)可如先前所述共價(jià)附著到aunp的表面，獲得cpt-sna(圖8a和9)。

表4.序列如圖9d所示。

使用該方法制備了cpt-聚asna、cpt-聚tsna、cpt-聚csna和cpt-聚gsna。鑒于聚tsna和聚csna的寡核苷酸負(fù)載顯著高于聚asna和聚gsna的寡核苷酸負(fù)載量，用未經(jīng)修飾的t30-sh鏈有意地稀釋cpt-t30-sh鏈，并且用未經(jīng)修飾的(cct)10-sh鏈稀釋cpt-(cct)10-sh鏈，因?yàn)殒湵还δ芑絘unp上，以便獲得在由所有核堿基類型組成的sna上的cpt分子的類似負(fù)載，這允許直接比較聚gsna的增強(qiáng)的細(xì)胞攝取對(duì)cpt遞送的作用。實(shí)際上，喜樹堿分子/顆粒的負(fù)載被確定為大致相等(大約55±15個(gè)cpt分子/aunp)(圖8b)。接下來(lái)通過(guò)使用icp-ms測(cè)量與細(xì)胞結(jié)合的金含量來(lái)研究核堿基類型對(duì)通過(guò)a549細(xì)胞的cpt-sna攝取的作用。在溫育9小時(shí)和18小時(shí)后，與由其他核堿基類型組成的cpt-sna相比，cpt-聚gsna顯示與a549細(xì)胞6-9倍高的結(jié)合。這一觀察加強(qiáng)了下述結(jié)論：在aunp的表面上共價(jià)功能化的dna寡核苷酸的10個(gè)最外圍堿基在決定sna的細(xì)胞攝取性質(zhì)方面是最顯著的。即，放置在sna外周處的小分子藥物并不顯著干擾dna寡核苷酸與細(xì)胞表面sr-a之間的相互作用。使cpt-sna與a549細(xì)胞進(jìn)一步溫育18小時(shí)，用新鮮的無(wú)納米顆粒培養(yǎng)基補(bǔ)充，并且允許生長(zhǎng)另外54小時(shí)。在72小時(shí)后，與細(xì)胞結(jié)合的金含量類似于在18小時(shí)后與細(xì)胞結(jié)合的金含量，暗示cpt-sna幾乎沒有明顯的胞吐作用(圖8c)。除了通過(guò)icp-ms跟蹤cpt-sna的aunp核之外，通過(guò)共聚焦成像顯現(xiàn)a549細(xì)胞中的cpt分布，利用了在440nm處cpt分子的熒光發(fā)射[zamai等人，molcancerther2：29-40(2003)]。在使cpt-sna與a549細(xì)胞一起溫育18小時(shí)后，去除顆粒，用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充，并且在處理后3和5天成像。在3天后，cpt-聚gsna顯示在所有測(cè)試的核堿基類型中最高的cpt細(xì)胞內(nèi)累積。在5天后，用cpt-聚gsna處理的細(xì)胞仍然顯示最高的熒光，但熒光更為擴(kuò)散(圖8d)?；趇cp-ms和共聚焦成像數(shù)據(jù)，并且不受理論的束縛，考慮cpt-sna在細(xì)胞中持續(xù)足夠的時(shí)間段，以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用逐漸釋放cpt分子并且發(fā)揮細(xì)胞毒性效應(yīng)[cheng等人，bioconjugchem14：1007-1017(2003)]。為了測(cè)試這點(diǎn)，將20nmcpt-sna(或等價(jià)地，大約1.1μmcpt分子)與不同的序列和a549細(xì)胞一起溫育18小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充細(xì)胞，并且在幾天后通過(guò)使用經(jīng)修飾的mtt測(cè)定來(lái)測(cè)量其活力。在cpt-sna處理后4至7天之間，cpt-聚gsna比由其他核堿基類型組成的cpt-sna明顯更細(xì)胞毒性。在7天后，與用由其他核堿基類型組成的cpt-sna處理的細(xì)胞的80-100％存活率相比，用cpt-聚gsna處理的細(xì)胞僅顯示大約20％的細(xì)胞存活率(圖8e)。作為陰性對(duì)照，a549細(xì)胞也與由所有核堿基類型組成的20nm無(wú)cpt的sna一起溫育18小時(shí)，并且在處理后7天未觀察到明顯的細(xì)胞毒性(圖10)，證實(shí)了所觀察到的通過(guò)cpt-sna處理誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性源于所附著的cpt分子，而不是sna體系結(jié)構(gòu)本身。

另外，在用cpt-sna處理后6天，用碘化丙啶染色細(xì)胞以檢測(cè)cpt誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。染色細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)揭示cpt-(ggt)10sna是最細(xì)胞毒性的(圖8f)。為了進(jìn)一步確保cpt在細(xì)胞中是活性的，活化的半胱天冬酶3(已知由cpt活化的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)蛋白)[stefanis等人，jneurosci19：6235-6247(1999)]的量在5天后通過(guò)elisa在細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)量。用cpt-聚gsna處理的細(xì)胞顯示比用cpt-a30、cpt-t30和cpt-(cct)10sna處理的細(xì)胞更高量的活化的半胱天冬酶3(圖11)?？傊?，cpt-聚gsna比由其他核堿基類型組成的cpt-sna明顯更有效，如通過(guò)聚gsna增加的cpt對(duì)癌細(xì)胞的遞送和增加的細(xì)胞毒性所證明的。這個(gè)實(shí)例強(qiáng)調(diào)了g依賴性遞送的功能優(yōu)點(diǎn)，并且證明了以更高效率遞送其他治療實(shí)體的潛力。

結(jié)論

由上述非限制性實(shí)例證明的是用于增加sna納米顆粒綴合物進(jìn)入細(xì)胞的攝取的方法。具有含有高g含量的三維寡核苷酸殼的sna以比主要由a、t和c組成的sna更高的量通過(guò)細(xì)胞內(nèi)化。此外，富含g的sna可用于增強(qiáng)核酸和小分子藥物兩者的細(xì)胞內(nèi)遞送。這指示序列組成是除濃度之外的另一種可調(diào)諧性質(zhì)，其可用于定制sna的細(xì)胞內(nèi)遞送。這種定制序列組成的策略是用于基于納米顆粒的診斷和治療應(yīng)用的強(qiáng)大工具，因?yàn)樗沟媚軌蚝侠碓O(shè)計(jì)具有所需細(xì)胞攝取性質(zhì)的納米顆粒構(gòu)建體。

實(shí)例6

材料和方法

下述材料和方法用于生成前述實(shí)例中所述的數(shù)據(jù)。

dna寡核苷酸的合成。使用標(biāo)準(zhǔn)固相合成和試劑(glenresearch)在mm48寡核苷酸合成儀(bioautomation)上合成dna。除非另有說(shuō)明，否則所有dna均使用具有microsorbc18柱(varian)的prostarhplc(varian)進(jìn)行純化。表1含有dna的詳細(xì)序列信息。

球形核酸(sna)納米綴合物的制備。將硫醇化dna以1oddna/ml補(bǔ)充有0.1％tween20的10nmaunp的濃度加入10nm檸檬酸鹽加帽的aunp中。在室溫下攪拌1小時(shí)后，伴隨nacl的逐漸加入經(jīng)過(guò)6小時(shí)使溶液老化，以使最終的nacl濃度達(dá)到0.5m。使用50-kdaamiconmwco膜(millipore)，經(jīng)由針對(duì)nanopure水的透析，使功能化的aunp與游離dna鏈分離。通過(guò)在cary5000uv-vis分光光度計(jì)(agilent)上分別測(cè)量其在524nm和260nm處的消光來(lái)測(cè)定aunp和dna濃度。為了制備含有喜樹堿的sna(cpt-sna)，溶液用nacl經(jīng)過(guò)5小時(shí)老化，以使最終的nacl濃度達(dá)到0.3m。

寡核苷酸負(fù)載的測(cè)量。將10微升(μl)10nmcy5標(biāo)記的不同核堿基類型的sna加入100μl的1mdtt內(nèi)。將混合物在40℃下伴隨振蕩溫育15分鐘，隨后為以14000×g的離心，以去除任何金沉淀物。將100μl上清液置于96孔板中，并且使用synergyh4multimodemicroplatereader(biotek)測(cè)量熒光信號(hào)(激發(fā)：633nm；發(fā)射濾光片：660-710nm)。通過(guò)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來(lái)確定寡核苷酸的濃度。將寡核苷酸濃度除以aunp濃度(通過(guò)uv-vis光譜法在520nm處測(cè)量的)獲得寡核苷酸負(fù)載。

寡核苷酸殼的顯現(xiàn)。將20μl100nmsna滴鑄到涂布有碳和formvar(electronmicroscopysciences)的每個(gè)輝光放電的200目銅網(wǎng)格上。干燥后，將20μl的2％乙酸雙氧鈾添加到網(wǎng)格上，以染色寡核苷酸殼1分鐘。使用一張濾紙將過(guò)量的乙酸雙氧鈾吸掉。使用hd-2300(hitachi)顯微鏡在tem模式下在80kv的束電壓下使干燥的網(wǎng)格成像。oriussc1000ccd相機(jī)(gatan)用于記錄圖像。

細(xì)胞攝取動(dòng)力學(xué)。提前12小時(shí)以5×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔的群接種在24孔板中，將c166(小鼠內(nèi)皮)、3t3(小鼠成纖維細(xì)胞)、hacat(人角質(zhì)形成細(xì)胞)或a549(人肺腺癌上皮)細(xì)胞在37℃和5％co2下與0.3mlsna(在optimem中10nm)/孔一起溫育。在不同的時(shí)間點(diǎn)取出sna，隨后為optimem沖洗，受胰蛋白酶作用用于使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并且以8000rpm離心5分鐘以形成團(tuán)塊。細(xì)胞團(tuán)塊在室溫(rt)下用0.3ml濃hno3中的3％hcl消化過(guò)夜，用于后續(xù)icp-ms分析。

icp-ms。在加入5μl5ppm銦(內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))和5ml基質(zhì)溶液(2％hcl和2％hno3)后，在扣除未經(jīng)處理的細(xì)胞的本底金含量后，通過(guò)xseriesiiicp-ms(thermofisher)測(cè)量所得溶液的au-197含量。報(bào)告的值表示來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的平均值±se。

tem。將細(xì)胞團(tuán)塊在0.2ml在50mm磷酸鈉緩沖液(ph＝8)中的熔融2％瓊脂糖中在40℃下混合5分鐘。細(xì)胞-瓊脂糖混合物在rt下使用玻璃移液管輕輕地清除到水中，以形成包覆的面條形果凍。在該瓊脂糖果凍中埋入，將細(xì)胞固定在100mm二甲胂酸鈉緩沖液(ph＝7.4)中的2.5％戊二醛中，用1％oso4以及0.9％oso4和0.3％k4fe(cn)6染色，其中所有步驟均在4℃下進(jìn)行2小時(shí)。在用乙醇和環(huán)氧丙烷逐漸脫水后，將細(xì)胞團(tuán)塊包埋在epon812樹脂(electronmicroscopysciences)中。將80納米厚的切片沉積到200目銅網(wǎng)格(ems)上，并且用2％乙酸雙氧鈾(spisupplies)和reynolds檸檬酸鉛染色，用于使用80kv的束電壓在jem1230顯微鏡(jeol)下顯現(xiàn)。oriussc1000ccd相機(jī)(gatan)用于記錄圖像。

量子點(diǎn)和金納米顆粒sna的合成。代替將dna鏈直接共價(jià)附著到納米顆粒表面，首先用具有疊氮化物的兩親性聚合物涂布cdse量子點(diǎn)和5nm金納米顆粒，然后使用應(yīng)變促進(jìn)的疊氮化物-炔環(huán)加成將dna偶聯(lián)到聚合物涂布的顆粒。簡(jiǎn)言之，商購(gòu)可得的疏水-配體加帽的納米顆粒首先用含有疏水性烷基鏈和親水性羧酸鹽和疊氮化物修飾的乙二醇基團(tuán)兩者的兩親聚合物功能化，以將顆粒溶解在水性溶劑中。然后通過(guò)疊氮化物-炔點(diǎn)擊化學(xué)用二苯并環(huán)辛基(dbco)-封端的dna鏈功能化顆粒，以在納米顆粒周圍產(chǎn)生致密的dna殼。

喜樹堿-疊氮化物的制備。喜樹堿-疊氮化物(cpt-n3)的制備由先前公開的程序修改和修飾[parrish等人，bioconjugatechem.18：263-267(2006)]。向具有攪拌器的經(jīng)烘干的50ml圓底燒瓶中加入喜樹堿(200mg，0.54mmol)、6-疊氮基己酸(170mg，1.08mmol)、4-二甲基氨基吡啶(8mg)和干燥二氯甲烷(10ml)。將懸浮液冷卻至0℃，并且加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(220mg，1.08mmol)。將反應(yīng)混合物在惰性大氣下攪拌12小時(shí)，加熱至rt，然后傾入100ml乙醚內(nèi)。將醚懸浮液冷卻至0℃以沉淀二環(huán)己基脲(dcu)，并且通過(guò)真空過(guò)濾去除固體。將濾液冷卻至-40℃，并且收集所得到的黃色沉淀物，并且由甲醇重結(jié)晶，以得到20-o-(6-疊氮基己酰)喜樹堿(108mg)?；厥盏膁cu用甲醇反復(fù)洗滌，獲得另外一批產(chǎn)物(120mg；總得率228mg，87％)。

喜樹堿-dna-硫醇(cpt-dna-sh)綴合物的制備。通過(guò)使用dbco-teg亞磷酰胺(glenresearch，10-1941)的固態(tài)合成，制備在其5′末端處全部具有二苯并環(huán)辛基(dbco)基團(tuán)的各種序列的單鏈dna(圖9d)。通過(guò)收集在310nm處具有dbco吸收峰的級(jí)分，使用1200serieshplc(agilent)進(jìn)行dna-dbco綴合物的純化。為了通過(guò)無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)將cpt部分附著到dna，將80nmol的dna-dbco和3mg的cpt-疊氮化物(大約100倍過(guò)量)溶解于1.5ml的無(wú)水二甲基亞砜中。將反應(yīng)在40℃下連續(xù)振蕩18小時(shí)。這之后，向混合物中加入3.5ml去離子水以沉淀出過(guò)量的cpt，隨后加入5ml乙酸乙酯以去除cpt。液-液萃取過(guò)程再重復(fù)四次。將水相(dmso/水中的dna-cpt)冷凍干燥，以回收產(chǎn)物，其化學(xué)種類通過(guò)maldi-tof證實(shí)。

共焦顯微鏡檢查。接種在35mmfluorodish(worldprecisioninstruments)中，將a549細(xì)胞與20nm在optimem中的cpt-sna一起溫育18小時(shí)。從細(xì)胞中取出cpt-sna，并且替換為完全dmem(補(bǔ)充有10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的dmem)共3或5天。經(jīng)處理的細(xì)胞用pbs沖洗，在pbs中的3.7％多聚甲醛中固定15分鐘，并且用hoechst核染劑染色，用于在zeisslsm510倒置共焦掃描顯微鏡下成像。cpt的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為370nm和440nm。

mtt測(cè)定。以10⁴個(gè)細(xì)胞/孔的群接種在24孔板中，將a549細(xì)胞與0.3mlsna(在optimem中20nm)一起溫育18小時(shí)。這之后，從細(xì)胞中取出sna，然后將其與1ml完全dmem一起溫育。在不同持續(xù)時(shí)間后，將20μlmtt原液(pbs中的5mg/mlmtt；molecularprobes)加入與300μl完全dmem預(yù)溫育的細(xì)胞的每個(gè)孔內(nèi)。在2小時(shí)后，向每孔中還加入300μlsds溶液(在50％二甲基甲酰胺中200mg/ml)，隨后為充分抽吸以使細(xì)胞重懸浮。在溫育過(guò)夜后，將細(xì)胞裂解產(chǎn)物以14000×g離心10分鐘，以去除任何金聚集物。使用synergyh4multimodemicroplatereader(biotek)，測(cè)定從細(xì)胞裂解產(chǎn)物收集的上清液級(jí)分在620nm處的吸光度。報(bào)告的值表示來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值的平均值±se。

流式細(xì)胞術(shù)。接種在6孔板中，a549細(xì)胞與1mlsna(在optimem中20nm)一起溫育18小時(shí)。在處理后，去除cpt-sna，并且使細(xì)胞在完全dmem上生長(zhǎng)126小時(shí)。然后使細(xì)胞受胰蛋白酶作用，洗滌并且懸浮于0.5mlpbs中。將0.5ml3.7％多聚甲醛加入來(lái)自每個(gè)孔的細(xì)胞懸浮液中15分鐘。在兩次pbs沖洗后，使用1ml在pbs工作溶液(50mg/ml)中的碘化丙啶(santacruzbiotechnology，sc-3541)染色溶液來(lái)染色細(xì)胞。染色樣品在4℃下貯存，并且在流式細(xì)胞術(shù)分析前保護(hù)免受光照。使用bdlsrii流式細(xì)胞儀測(cè)量10,000個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

化學(xué)品。6-疊氮基己酸購(gòu)自emdmillipore(billerica，ma)。cdse量子點(diǎn)購(gòu)自oceannanotech。十二烷基硫醇功能化的金納米顆粒購(gòu)自nanoprobes。dbco-nhs酯購(gòu)自clickchemistrytools。所有其他試劑購(gòu)自sigma-aldrich(st.louis，mo)，并且按原樣使用。

動(dòng)態(tài)光散射。使用nanozetasizer(malverninstruments)進(jìn)行測(cè)量，使用0.47作為aunp的折射率。流體動(dòng)力學(xué)直徑(hd)測(cè)量從數(shù)量平均值得出。每個(gè)直方圖表示六次重復(fù)測(cè)量后aunp的尺寸分布。

maldi-tofms。在采用2，5-二羥基苯乙酮(dhap)作為基質(zhì)材料的brukerautoflexiiimaldi-tof質(zhì)譜儀上，收集基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(maldi-tof)數(shù)據(jù)。

¹hnmr。在brukeravance400mhznmr光譜儀上記錄¹hnmr光譜。¹hnmr光譜內(nèi)部參考氘代溶劑中的殘留質(zhì)子信號(hào)。

活化的半胱天冬酶3的檢測(cè)。將a549細(xì)胞以100,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度在6孔板中鋪平板，并且用在optimem中的20nmcpt-sna處理。在18小時(shí)后，用pbs洗滌細(xì)胞，并且還與完全dmem(補(bǔ)充有10％胎牛血清和1％鏈霉素/青霉素)一起溫育。在6天后，將細(xì)胞裂解并提取蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(cellsignaling7190s)，通過(guò)elisa檢測(cè)活化的半胱天冬酶3的相對(duì)水平。