本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域,更具體地說,涉及一種特異性結合cd3的核酸適配體及其篩選方法和應用。
背景技術:
cd3是一種重要的白細胞分化抗原,幾乎在所有t細胞表面均存在。cd3抗原由6條肽鏈組成,常與tcr緊密結合形成含有8條肽鏈的tcr-cd3復合體。其通過鹽橋與t細胞抗原受體(tcellreceptor,tcr)相連,參與t細胞的信號轉導,主要用于標記胸腺細胞、t淋巴細胞及t細胞淋巴瘤。t淋巴細胞介導的細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要機制,t細胞經特異抗原刺激后,tcr特異性識別結合抗原呈遞細胞(apc)表面mhc-ⅱ類分子/抗原肽,產生第一信號;t細胞與apc表面多對共刺激分子(如cd28、ctla-4和cd80、cd86等)相互作用產生t細胞活化的第二信號,并分泌il-2、tnf-α、tnf-β、ifn-γ和il-4等多種細胞因子,產生特異性的細胞毒作用,發(fā)揮抗腫瘤效應。
核酸適配體(aptamer)是一類通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,selex)從大容量的核酸文庫中篩選獲得能與靶分子高特異性高親和力結合的單鏈dna或rna序列,因其類似于抗體的高親和力而被稱為“化學抗體”。適配體有許多獨特的優(yōu)勢,如靶分子范圍廣泛、無免疫原性、分子量小、穩(wěn)定性好等。這些特性使它在識別靶標時相較抗體或其他類型配體有較大的優(yōu)勢。
近來,越來越多的研究使用cell-selex技術篩選出具有較好的親和力和特異性的核酸適配體,并進一步探究其功能。目前有部分適配體已用于腫瘤相關的診治當中,適配體在腫瘤靶向診斷及治療方面具有十分廣泛的應用前景。
然而,目前缺少以cd3分子為靶標能夠有效特異性結合t細胞的核酸適 配體。
技術實現(xiàn)要素:
針對以上現(xiàn)狀,本發(fā)明提供了一種特異性結合cd3的核酸適配體及其篩選方法和應用。
本發(fā)明所提供的特異性結合cd3的核酸適配體,具體為如下(a)或(b):
(a)序列表中序列1所示的單鏈dna片段;
(b)將序列表中序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的單鏈dna片段,且與(a)中所述單鏈dna片段具有相同功能。
將所述單鏈dna片段進行修飾或改造得到的核酸適配體衍生物也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述核酸適配體衍生物可為如下任意一種:
1)將所述核酸適配體刪除部分或增加部分核苷酸,得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物;
2)將所述核酸適配體進行核苷酸取代或部分修飾,得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物;
3)將所述核酸適配體的骨架改造為硫代磷酸脂骨架,得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物;
4)將所述核酸適配體改為肽核酸,得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物;
5)將所述核酸適配體的任一端或中間或兩端接上信號分子(如熒光素fitc、fam、羅丹明b、或放射性分子)、活性分子(如生物素、氨基、羧基、酶)或其它功能基團后,得到與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物。
本發(fā)明還提供一種核酸探針。
本發(fā)明所提供的核酸探針,具體為如下(c)或(d):
(c)序列表中序列1所示的單鏈dna片段,且在3’或5′末端標記有熒 光報告基團;
(d)將序列表中序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的單鏈dna片段,且與序列1所示的單鏈dna片段具有相同功能,并在3’或5′末端標記有熒光報告基團。其中,所述熒光報告基團具體可為異硫氰酸熒光素(fitc)、羅丹明b、羧基熒光素(fam)(如6-fam)、四甲基羅丹明(tamra)、cy3或cy5。
含有所述特異性結合cd3的核酸適配體或所述核酸探針的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。
所述特異性結合cd3的核酸適配體或所述核酸探針或所述試劑盒在如下(a1)-(a4)任一中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
(a1)鑒定或輔助鑒定cd3;
(a2)制備鑒定或輔助鑒定cd3的產品;
(a3)檢測待測物質中cd3的濃度;
(a4)分離和/或富集cd3。
其中,(a1)所述的鑒定或輔助鑒定cd3具體可為檢測待測物質是否為或候選為cd3、檢測待測物質是否含有或候選含有cd3等。
本發(fā)明還保護了特異性結合cd3的核酸適配體在特異性結合cd3領域的應用。
其中,所述特異性結合cd3核酸適配體在如下(b1)-(b2)任一中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
(b1)利用上述(a)或(b)及其衍生物激發(fā)t細胞活化的信號轉導。
(b2)利用上述(a)或(b)及其衍生物阻斷t細胞活化的信號轉導。
所述特異性結合cd3核酸適配體在如下(c1)-(c4)任一中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:
(c1)制備用于檢測cd3的分子探針;
(c2)制備以cd3分子作為靶點的靶向t細胞的藥品或制劑;
(c3)制備以cd3分子作為靶點的促進t細胞活化的藥品或制劑。
(c4)制備以cd3分子作為靶點的抑制t細胞活化的藥品或制劑。
本發(fā)明還提供一種如上所述的特異性結合cd3的核酸適配體的篩選方法。
本發(fā)明所提供的特異性結合cd3的核酸適配體的篩選方法,具體可包括如下步驟:
(1)以如下核酸文庫為起始核酸文庫:
5’-tctcggacgcgtgtggtcgg-n45-ctcgctgcctggccctagagtg-3’,其中n45表示45個連續(xù)的n,n為a、t、c或g;
(2)采用基于細胞的指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化技術對步驟(1)得到的起始核酸文庫進行多輪篩選,其中采用293t細胞進行反篩和采用293t-cd3細胞進行正篩。所述293t-cd3細胞為穩(wěn)定表達cd3的293t細胞。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中,可以對步驟(1)得到的起始核酸文庫進行15輪篩選,其中前兩輪采用正篩,第3-15輪中每輪順次完成反篩和正篩;
所述反篩為:將上輪正篩產物的溶液加入到貼壁生長的293t細胞中,0~5℃孵育30~60min后,收集上清液,記為上清液1作為本輪反篩產物;
所述正篩為:將起始核酸文庫或者本輪反篩產物加入到貼壁生長的293t-cd3細胞中,0~5℃孵育1~2h,洗滌后棄上清,收集細胞,95~100℃變性5~10min,離心(如14000rpm離心5min)后收集上清液,記為上清液2;以所得上清液2為模板進行2次pcr擴增(除第1輪篩選的2次pcr擴增均用無標記的引物外,第2-15輪篩選的第一次pcr擴增采用無標記的引物,第二次pcr擴增采用帶熒光標記的引物),并用鏈霉親和素微球從第二次pcr產物中分離得到fitc標記的單鏈dna序列作為本輪正篩產物。
(3)從步驟(2)篩選后得到的篩選產物中分離獲得特異性結合cd3的核酸適配體。
在所述方法的步驟(2)的正篩中,第2-15輪篩選中利用所述上清液2進行pcr擴增并獲得本輪正篩產物的步驟具體包括如下步驟:
(4-1)以所述上清液2作為模板,采用無標記的引物進行pcr擴增,得到第一次pcr產物;以所述第一次pcr產物作為模板,采用帶標記的引物進 行pcr擴增,得到第二次pcr產物;上述兩次pcr擴增時使用的上游引物fp和下游引物rp分別為:
所述上游引物fp的核苷酸序列為:5’-tctcggacgcgtgtggtcgg-3’,其中第一次pcr擴增時使用的該引物不帶標記,第二次pcr擴增時5’端經fitc標記;
所述下游引物rp的核苷酸序列為:5’-cactctagggccaggcagcgag-3’,其中第一次pcr擴增時使用的該引物不帶標記,第二次pcr擴增時5’端經生物素標記。
(4-2)利用生物素與鏈霉親合素之間的親和力,從所述第二次pcr產物中分離獲得fitc標記的單鏈dna序列。
上述方法中,可每一輪篩選逐步增加篩選壓力,以增進所述核酸適配體的富集程度。所述增加篩選壓力可通過以下方式實現(xiàn):減少核酸文庫的物質的量,減少正篩時293t-cd3細胞用量及核酸文庫與正篩細胞的孵育時間,增加反篩時293t細胞用量及核酸文庫與反篩細胞的孵育時間。例如,每一輪篩選中線性減少核酸文庫的物質的量,線性減少正篩時所述293t-cd3細胞的用量,線性減少所述核酸文庫與所述293t-cd3細胞的孵育時間,以及相應線性增加所述293t細胞的用量,線性增加所述核酸文庫與所述293t細胞的孵育時間。此外,還可以增加篩選過程中洗滌次數(shù)和洗滌緩沖液的用量。
在本發(fā)明優(yōu)選實施例中,與本發(fā)明核酸適配體特異性結合的cd3為序列表中序列3所示的蛋白質。
本發(fā)明以穩(wěn)定表達cd3分子的293t-cd3細胞為正篩靶標,以不表達cd3分子的293t細胞為反篩靶標,經體外篩選技術,獲得具有特異結合293t-cd3的核酸適配體序列,以該序列與cd3分子結合的基礎,進一步用于靶向t細胞的藥物設計、制備藥物或其他制品;該序列可作為靶向t細胞的分子探針。本發(fā)明為t細胞的活化及腫瘤的靶向診斷與治療提供新思路與新工具,具有重要的臨床價值。
附圖說明
下面將結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明,附圖中:
圖1為根據本發(fā)明優(yōu)選實施例的特異性結合cd3的核酸適配體的篩選cell-selex技術流程圖;
圖2為根據本發(fā)明優(yōu)選實施例的特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)二級結構模擬圖;
圖3a和3b為根據本發(fā)明優(yōu)選實施例的特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)分別與293t-cd3細胞及293t細胞結合情況的流式結果;
圖4為根據本發(fā)明優(yōu)選實施例的特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)平衡解離常數(shù)(kd值)測定結果圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白,以下結合附圖及實施例,對本發(fā)明進行進一步詳細說明。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
實施例1、特異性結合cd3的核酸適配體的篩選及克隆
一、隨機核酸文庫的設計與合成
設計合成兩端包括若干個固定核苷酸、中間包括45個核苷酸的隨機文庫如下:
5’-tctcggacgcgtgtggtcgg-n45-ctcgctgcctggccctagagtg-3’,其中n45表示45個連續(xù)的隨機核苷酸,即n為a、t、c或g。
二、核酸適配體的篩選
1、文庫預處理
將步驟一設計合成的隨機核酸文庫粉末5od使用500μl結合緩沖液(配方:pbs中含有4.5g/l葡萄糖,5mm氯化鎂,2mg/mlbsa及0.2mg/ml酵母trna)溶解,均勻混合并加熱至95~100℃變性5min,之后立即置于冰上冷卻十分鐘,使其形成較為穩(wěn)定的二級結構,再加入500μl~1ml結合緩沖 液(配方見上文)補足篩選所需的1ml體積,得到起始核酸文庫的溶液。
2、反篩和正篩
采用cell-selex技術對起始核酸文庫進行多輪篩選,其中采用293t細胞進行反篩和采用293t-cd3細胞進行正篩,篩選出特異性結合cd3的核酸適配體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中,針對在cd3分子在傳統(tǒng)的篩選方法的基礎上進行了優(yōu)化。具體地,對預處理后的隨機核酸文庫進行15輪篩選,其中第1-2輪僅進行正篩,第3-15輪中順次完成一次反篩和一次正篩為一輪篩選。本發(fā)明選擇前兩輪只進行正篩,是為了使特異性結合的核酸序列富集到一定程度,隨后再進行反篩操作,去除非特異性結合的核酸序列。本發(fā)明中特異性結合cd3的核酸適配體的篩選cell-selex技術流程圖具體如圖1所示。
(1)反篩
自第三輪篩選開始,在每輪正篩之前進行反篩操作。向單層生長的293t細胞培養(yǎng)皿中加入上輪正篩產物,將細胞培養(yǎng)皿置于0~5℃震蕩孵育30~60min后取出培養(yǎng)皿,收集上清液,并標記為上清液1,作為本輪反篩產物。隨后進行正篩操作。前述293t細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(atcc),編號為
(2)正篩
將起始核酸文庫或者本輪反篩產物加入單層生長的293t-cd3細胞中,0~5℃震蕩孵育1-2h,用洗滌緩沖液(配方:pbs中含有4.5g/l葡萄糖,5mm氯化鎂)洗滌293t-cd3細胞后棄去上清;用細胞刮刀刮下細胞并收集至ep管之中,95~100℃變性5-10min,14000rpm離心5min;保留上清液,記為上清液2。所述293t-cd3細胞為穩(wěn)定表達cd3的293t細胞。在本實施例中優(yōu)選采用本實驗室構建的過表達目的基因cd3epsilon(ncbiaccessionno.:nm_000733.3)的293t穩(wěn)定細胞株。以所述上清液2作為模板進行2次pcr擴增,并用鏈霉親和素微球從第二次pcr產物中分離得到fitc標記的單鏈dna序列作為本輪正篩產物。除第1輪篩選的2次pcr擴增均用無標記的引物外,第2-15輪篩選的第一次pcr擴增采用無標記的引物,第二次pcr擴增采用帶熒光標記的引物。因此,從第2輪篩選開始,可以測定上清液的熒光 強度(除第1輪篩選沒有進行熒光標記外,自第2輪之后的產物均是用帶熒光標記的引物進行pcr得到,即產物均帶熒光標記)。
具體地,第2-15輪篩選時以所得上清液2為模板進行2次pcr擴增的引物序列為:
fp:5’-tctcggacgcgtgtggtcgg-3’;其中第一次pcr擴增時使用的該引物不帶標記,第二次pcr擴增時5’端經fitc標記;
rp:5’-cactctagggccaggcagcgag-3’,其中第一次pcr擴增時使用的該引物不帶標記,第二次pcr擴增時5’端經生物素標記。第一輪篩選中2次pcr擴增則均采用上述不帶標記的fp和rp。
下面對本發(fā)明中正篩時2次pcr擴增的具體過程進行描述:
配制第一次pcr體系(總體積1500μl):10×pcrbuffer150μl,dntpmixture120μl,fp37.5μl,rp37.5μl,模板(上清液)1000μl,rtaq5μl。
按如下條件在pcr儀上進行擴增:94℃預變性5min;94℃變性30sec,53℃退火30sec,72℃延伸30sec,共計10個循環(huán);72℃延伸5min,最后永久保溫在4℃環(huán)境當中。
配制第二次pcr體系(總體積2000μl):10×pcrbuffer200μl,dntpmixture160μl,fp50μl,rp50μl,模板(第一次pcr產物)200μl,rtaq10μl。
按如下條件在pcr儀上進行擴增:94℃預變性5min;94℃變性30sec,53℃退火30sec,72℃延伸30sec,共計10個循環(huán)(該循環(huán)數(shù)是經過優(yōu)化后確定的);72℃延伸5min,最后永久保溫在4℃環(huán)境當中。
用鏈霉親和素微球從第二次pcr產物中分離得到fitc標記的單鏈dna(ssdna)序列(用鏈霉親和素球可以除去biotin標記的互補鏈,從而得到fitc標記的目標鏈,即2-15輪富集的隨機核苷酸文庫)。具體為:取50μl鏈霉親和素微球,使用100μlpbs清洗3次。將洗好的微球加入到2ml第二次pcr產物中,37℃搖床震蕩30min,之后短暫離心,收集上清,上清中即含有fitc標記的ssdna。將得到的ssdna加入濃度為0.2mnaoh溶液用nap-5柱子(通用電氣醫(yī)療集團,瑞典)脫鹽,收集后真空干燥,用于下一輪的篩選。
為了提高核酸適配體的親和力和特異性,在篩選過程中每一輪篩選逐步增加篩選壓力。所述增加篩選壓力可通過以下一種或多種方式實現(xiàn):減少核酸文庫的物質的量,減少正篩時293t-cd3細胞用量,減少正篩時核酸文庫孵育時間,增加反篩時293t細胞用量,增加反篩時核酸文庫孵育時間。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中,可以線性減少核酸文庫的物質的量,和/或線性減少正篩時所述293t-cd3細胞的用量,和/或線性減少所述核酸文庫與所述293t-cd3細胞的孵育時間,和/或相應線性增加所述293t細胞的用量,和/或線性增加所述核酸文庫與所述293t細胞的孵育時間。此外,還可以逐步增加篩選過程中正篩的洗滌次數(shù)和洗滌緩沖液的用量。
在本發(fā)明的前述實施例1中,也可以同時采用以下方式增加篩選壓力:
1)自第1輪篩選開始,逐步減少核酸文庫的用量,到第10輪減至200pmol時,維持該用量,直至篩選結束。
2)正篩細胞293t-cd3用量自第5輪篩選開始,由直徑為10cm的培養(yǎng)皿減至直徑為6cm的培養(yǎng)皿進行篩選;反篩細胞293t用量自第5輪開始,由直徑為6cm的培養(yǎng)皿增至直徑為10cm的培養(yǎng)皿進行篩選。
3)正篩細胞293t-cd3與核酸文庫孵育時間自第1輪至第7輪篩選,由60min逐步線性減至30min;反篩細胞293t-cd3與核酸文庫孵育時間自第1輪至第7輪篩選,由30min逐步線性增至60min。
4)如第1輪篩選在正篩時洗滌孵育后的核酸文庫與293t-cd3細胞的洗滌次數(shù)為1次,洗滌緩沖液的用量為2ml;直至第6-15輪篩選,該洗滌次數(shù)增至3次,洗滌緩沖液的用量增至5ml。本申請經過大量的實驗與經驗總結,通過上述對篩選程序以及篩選壓力的優(yōu)化,成功篩選出了后續(xù)證明與cd3分子親和力非常高的核酸適配體。
3、特異性結合cd3的核酸適配體的獲得
經15輪篩選后,以篩選產物為模板通過引物(5’-tctcggacgcgtgtggtcgg-3’和5’-cactctagggccaggcagcgag-3’)進行pcr擴增,將pcr產物進行克隆ta克隆,隨機挑取100個克隆進行測序。
將所有100條測序結果進行匯總,對其一級結構與二級結構進行考察,選 擇具有最高富集程度以及二級結構有所差異的5條核酸適配體序列進行了驗證與考察,并選取其中與cd3結合時親和力最高的核酸適配體命名為cd3-4。該特異性結合cd3的核酸適配體cd3-4的二級結構模擬圖見圖2。
本發(fā)明獲得的特異性結合cd3的核酸適配體cd3-4的核苷酸序列如下:
5’-tctcggacgcgtgtggtcggccgagtggcccacggtagaagggttagaactgctggttggtgaatctcgctgcctggccctagagtg-3’(即序列1)。該核酸適配體cd3-4為單鏈dna,由87個核苷酸組成,拓撲學結構為直鏈狀;預測的二極結構具有突出的環(huán)和莖。
本發(fā)明實施例中所采用的293t-cd3細胞中插入的序列為序列表中序列2所示:
atgcagtcgggcactcactggagagttctgggcctctgcctcttatcagttggcgtttgggggcaagatggtaatgaagaaatgggtggtattacacagacaccatataaagtctccatctctggaaccacagtaatattgacatgccctcagtatcctggatctgaaatactatggcaacacaatgataaaaacataggcggtgatgaggatgataaaaacataggcagtgatgaggatcacctgtcactgaaggaattttcagaattggagcaaagtggttattatgtctgctaccccagaggaagcaaaccagaagatgcgaacttttatctctacctgagggcaagagtgtgtgagaactgcatggagatggatgtgatgtcggtggccacaattgtcatagtggacatctgcatcactgggggcttgctgctgctggtttactactggagcaagaatagaaaggccaaggccaagcctgtgacacgaggagcgggtgctggcggcaggcaaaggggacaaaacaaggagaggccaccacctgttcccaacccagactatgagcccatccggaaaggccagcgggacctgtattctggcctgaatcagagacgcatctga
相應地,本發(fā)明中針對的cd3分子具體為序列表中序列3所示的蛋白質。該序列3為:
mqsgthwrvlglcllsvgvwgqdgneemggitqtpykvsisgttviltcpqypgseilwq60
hndkniggdeddknigsdedhlslkefseleqsgyyvcyp rgskpedanfylylrarvce120
ncmemdvmsvativivdicitggllllvyywsknrkakakpvtrgagaggrqrgqnkerp180
ppvpnpdyepirkgqrdlys200
4、特異性結合cd3的核酸適配體結合能力的測定
將本發(fā)明中人工合成的特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)的3’或5’末端標記上熒光報告基團fitc,分別用洗滌緩沖液溶解制成250nm濃度工作液,再分別與1×106個t細胞0~5℃孵育30~50min,用500μl洗滌緩沖液充分洗滌2~3次,每次均使用1000rpm離心3min。細胞沉淀用500μl磷酸鹽緩沖液重懸后,用流式細胞儀檢測,計數(shù)細胞數(shù)量10000個。
圖3a和圖3b分別為本發(fā)明的特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)分別與293t-cd3細胞及293t細胞結合情況的流式結果。結果顯示,該特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)能較好地特異性結合于293t-cd3細胞,而不與293t細胞結合,證實了該適配體序列對cd3分子具有較好的靶向性及較強的結合能力。
實施例1篩選獲得的特異性結合cd3的核酸適配體結合能力考察
對實施例1獲得的特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)進行結合能力的考察。具體操作如下:
將人工合成的特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)的3’或5’末端標記上熒光報告基團fitc,然后用洗滌緩沖液(配方見上文)溶解,分別制備成0nm、10nm、20nm、50nm、100nm、200nm濃度工作液。取上述各個濃度的dna文庫溶液分別與1×105個293t-cd3細胞在冰上震蕩孵育30min。用500μl洗滌緩沖液(配方見上文)充分洗滌2-3次,每次均使用1000rpm離心3min。使用結合緩沖液(配方見上文)對細胞沉淀進行重懸,之后進行流式細胞儀上機檢測,計數(shù)細胞數(shù)量10000個。
所得的結果使用sigmaplot軟件分析,遵循單點吸附模型公式進行非線性擬合,計算特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)與293t-cd3細胞的平衡 解離常數(shù)(kd值),1/kd即可表示核酸適配體cd3-4與cd3分子的親和力大小。具體公式如下:y=bmaxx/(kd+x))。
結果顯示,該特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)與293t-cd3細胞的kd值僅為18.56±1.49nm,說明該特異性結合cd3的核酸適配體(cd3-4)與cd3分子具有很強的親和力。具體結構參見圖4。
綜上所述,本發(fā)明以t細胞表面表達的cd3分子為靶標進行適配體篩選,獲得的核酸適配體能特異性地結合t細胞,為t細胞的活化和腫瘤靶向治療提供了新思路,具有重要的臨床價值。
本發(fā)明是根據特定實施例進行描述的,但本領域的技術人員應明白在不脫離本發(fā)明范圍時,可進行各種變化和等同替換。此外,為適應本發(fā)明技術的特定場合或材料,可對本發(fā)明進行諸多修改而不脫離其保護范圍。因此,本發(fā)明并不限于在此公開的特定實施例,而包括所有落入到權利要求保護范圍的實施例。