本發(fā)明涉及核酸領(lǐng)域，具體涉及一種circrna及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：環(huán)形rna是一類單鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。真核生物中有一類源自于mrna前體反向剪接(back-splicing)(lasdaandparker,2014)的環(huán)形rna，被稱作circrna。據(jù)報(bào)道，早在20多年前，circrna就已經(jīng)被鑒定出(cocquerelleetal.,1993；nigroetal.,1991；pasmanetal.,1996)，但大多數(shù)被認(rèn)為是異常剪接的產(chǎn)物，其存在和潛在功能均未被重視。近年來，隨著二代高通量測序技術(shù)以及生物信息技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)circrna在各類真核生物中廣泛存在(hansenetal.,2011；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2013；salzmanetal.,2012；wangetal.,2014)。目前，在真核生物中發(fā)現(xiàn)的大部分circrna的豐度均非常低，說明其可能是一些rna剪接的副產(chǎn)物，具有重要生理功能的可能性較低(bachmayr-heydaetal.,2015；guoetal.,2014；salzmanetal.,2013；zhangetal.,2014)。然而，研究也發(fā)現(xiàn)了許多高豐度的circrna，暗示其具有重要的生理功能(hansenetal.,2011；jecketal.,2013；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2013；salzmanetal.,2012)。circrna較線性rna穩(wěn)定，并多定位于細(xì)胞質(zhì)中(jecketal.,2013；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2012)。此外，circrna的環(huán)化具有保守性，其表達(dá)模式往往具有時(shí)空特異性(jecketal.,2013；memczaketal.,2013；salzmanetal.,2013；szaboetal.,2015；venoetal.,2015)。circrna的生物合成受順式元件(cis-element)和反式因子(trans-actingfactor)調(diào)控(chen,2016；salzman,2016)。反向剪接位點(diǎn)(back-splicingsite)兩側(cè)內(nèi)含子中的互補(bǔ)序列或反向重復(fù)序列可通過形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)的方式促進(jìn)circrna的生成(jecketal.,2013；krameretal.,2015；liangandwilusz,2014；zhangetal.,2014)。有些外顯子的側(cè)翼內(nèi)含子序列中含有多對互補(bǔ)序列，可通過形成不同的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生多種circrna，該過程被稱作選擇性環(huán)化(alternativecircularization)(zhangetal.,2014)。然而，有許多circrna的側(cè)翼序列并不含互補(bǔ)序列，說明可能存在其他順式元件如一些rna結(jié)合蛋白(rna-bindingprotein,rbp)識別序列參與環(huán)化過程(ashwal-flussetal.,2014；connetal.,2015；wangandwang,2015)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生環(huán)化的外顯子可能有一定的長度要求，且其側(cè)翼內(nèi)含子序列也往往比普通內(nèi)含子序列長(krameretal.,2015；szaboetal.,2015；westholmetal.,2014；zhangetal.,2014)。外顯子環(huán)化可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平(ashwal-flussetal.,2014；krameretal.,2015)，也可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平(liangandwilusz,2014)。一些反式剪接因子如rbp可參與circrna的環(huán)化。剪接因子muscleblind(mbl)(ashwal-flussetal.,2014)和quaking(qki)(connetal.,2015)均可通過與rna結(jié)合而形成復(fù)合物的方式促進(jìn)環(huán)化反應(yīng)。作用于rna的腺苷脫氨酶1(adenosinedeaminaseiactingonrna,adar1)也是一種rna結(jié)合蛋白，其可通過解開rna二級結(jié)構(gòu)的方式抑制circrna的生成(ivanovetal.,2015；rybak-wolfetal.,2015)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不均一核糖核蛋白(heterogeneousnuclearribonucleoprotein,hnrnp)和精氨酸-絲氨酸富集蛋白(serine-arginineprotein,srprotein)可以共同參與circrna的生物合成調(diào)控(krameretal.,2015)。目前關(guān)于circrna的生物學(xué)功能的研究還非常少。近期的研究表明，該類rna可參與基因的表達(dá)調(diào)控。首先，一些circrna可通過結(jié)合mirna的方式參與基因表達(dá)調(diào)控(gengetal.,2016；hansenetal.,2013；memczaketal.,2013；wangetal.,2016；zhengetal.,2016)。然而，很多高豐度的circrna并不含有mirna結(jié)合位點(diǎn)，而且有些生物體甚至沒有sirna調(diào)控通路，這都說明通過抑制mirna的方式調(diào)控基因表達(dá)可能不是circrna的普遍功能(guoetal.,2014；jeckandsharpless,2014；luetal.,2015；wangetal.,2014)。第二，circrna可調(diào)控基因的剪接。例如，果蠅circrnacircmbl的合成可通過結(jié)合剪接因子mbl與其pre-mrna的剪接相競爭(ashwal-flussetal.,2014)。第三，circrna可直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程。有一類circrna含有“保留內(nèi)含子(retainedintrons)”，主要定位于細(xì)胞核，該類circrna被稱作elcirna，可通過與u1snrnp互作促進(jìn)其來源基因的轉(zhuǎn)錄(lietal.,2015b)。最后,研究表明，有些circrna可在體內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)(abeetal.,2015；legninietal.,2017；pamudurtietal.,2017；yangetal.,2017)。此外，circrna可能在細(xì)胞通訊中起作用，也可能作為生物標(biāo)記物(biomarker)(alhasanetal.,2016)(lasdaandparker,2016；lietal.,2015a)。當(dāng)前，circrna的研究尚處于初始階段，近年來的主要工作仍是圍繞circrna的存在性鑒定，且主要集中在人和動物中，植物中很少，目前只有擬南芥、水稻和番茄中的circrna有鑒定(luetal.,2015；wangetal.,2014；yeetal.,2015；zuoetal.,2016)。circrna的主要生物學(xué)功能尚不明朗，該領(lǐng)域的研究非常少。類胡蘿卜素在生物體內(nèi)通過異戊二烯途徑合成，是呈現(xiàn)紅色、橙色和黃色等顏色的一大類色素物質(zhì)的總稱。類胡蘿卜素主要存在于植物的葉綠體以及許多花和果實(shí)的有色體中，不僅可以使植物器官顯示各種顏色，還可參與光合作用中的光吸收過程，并可清除光合作用產(chǎn)生的葉綠素三線態(tài)和單線態(tài)及超氧陰離子等自由基。類胡蘿卜素(番茄紅素)的生物合成途徑現(xiàn)在已有廣泛的研究，但是其各合成基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不甚清楚。八氫番茄紅素合成酶(phytoenesynthase，psy)是植物類胡蘿卜素(或番茄紅素)生物合成過程中的重要限速酶，其催化兩分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(ggpp)轉(zhuǎn)化為八氫番茄紅素。該轉(zhuǎn)化是異戊烯基二磷酸生物合成類胡蘿卜素的關(guān)鍵步驟之一。因此，八氫番茄紅素合成酶的編碼基因psy是植物基因工程調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物花、果實(shí)顏色以及類胡蘿卜素含量的重要靶基因。鑒于上述類胡蘿卜素的各種有益效果，因此亟需找到以類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵基因例如八氫番茄紅素合成酶(phytoenesynthase，psy)基因?yàn)榘袠?biāo)的物質(zhì)，通過對該基因表達(dá)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對植物中類胡蘿卜素含量的調(diào)控以及對植物花、果實(shí)顏色發(fā)育的調(diào)控。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種circrna，其可以調(diào)控植物中八氫番茄紅素合成酶1基因(psy1)的表達(dá)，由此調(diào)控植物中類胡蘿卜素含量以及植物果實(shí)顏色發(fā)育。在第一方面，本發(fā)明提供了一種circrnapsy1-circ1，其序列示于seqidno:1。在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的引物對；優(yōu)選地，所述引物對為seqidno:2和seqidno:3，或者seqidno:4和seqidno:5。在第三方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。在第四方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物八氫番茄紅素合成酶1基因(psy1)表達(dá)的方法，所述方法包括在所述植物中過表達(dá)本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1或者抑制本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的表達(dá)。在第五方面，本發(fā)明提供一種調(diào)控植物類胡蘿卜素含量的方法，所述方法包括通過在所述植物中過表達(dá)本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。在第六方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控番茄果實(shí)顏色發(fā)育的方法，包括在番茄中過表達(dá)本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。藉由本發(fā)明的circrnapsy1-circ1的過表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)對植物八氫番茄紅素合成酶1基因、植物類胡蘿卜素含量和番茄果實(shí)顏色發(fā)育的調(diào)控。具體地，circrnapsy1-circ1的過表達(dá)可以抑制植物八氫番茄紅素合成酶1基因的表達(dá)并且由此降低植物中的類胡蘿卜素含量；抑制circrnapsy1-circ1的表達(dá)可以提高植物八氫番茄紅素合成酶1基因的表達(dá)并且增加植物的類胡蘿卜素含量。另外，藉由circrnapsy1-circ1，可以實(shí)現(xiàn)對番茄果實(shí)顏色發(fā)育的調(diào)控：circrnapsy1-circ1的過表達(dá)可以使番茄結(jié)出黃色果實(shí)。還需要指出的是，circrna比較穩(wěn)定，相較于其他rna，更有利于遺傳調(diào)控。附圖說明下面對本發(fā)明的附圖進(jìn)行簡單介紹。圖1是示出rt-pcr方法驗(yàn)證circrna的引物設(shè)計(jì)示意圖，其中exon7和exon8為psy1-circ1的兩個(gè)外顯子，離散引物(標(biāo)注在外顯子旁邊的箭頭)用于擴(kuò)增circrnapsy1-circ1。圖2是示出采用rnaser耐受性實(shí)驗(yàn)檢測circrna存在的流程圖，并且在流程圖示出了rnaser耐受性實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的檢測結(jié)果，即若是circrna，則可以耐受rnaser的消化，若是線性rna，則會被rnaser消化掉。圖3示出對番茄果實(shí)中psy1-circ1的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果。圖4為用于實(shí)時(shí)pcr鑒定circrna表達(dá)量的引物設(shè)計(jì)示意圖，其中一個(gè)引物(如正向引物)需跨越反向剪接位點(diǎn)，且跨位點(diǎn)后的3’端序列為3-6bp，保證能準(zhǔn)確擴(kuò)增出相應(yīng)的circrna，且不能擴(kuò)增線性rna和其他反向剪接位點(diǎn)位于相近區(qū)域的非特異circrna。圖5為不同成熟期番茄果實(shí)中的circrnapsy1-circ1及其來源基因的表達(dá)分析結(jié)果。圖6為構(gòu)建psy1-circ1過表達(dá)載體的示意圖。圖7為轉(zhuǎn)基因番茄(ac)中psy1-circ1及其來源基因psy1的相對表達(dá)量分析，其中oe3和oe28(黑色柱)表示過表達(dá)circrnapsy1-circ1的紅色果實(shí)株系，oe21和oe26(灰色柱)表示過表達(dá)circrnapsy1-circ1的黃色果實(shí)株系。圖8示出不同轉(zhuǎn)基因株系中psy1-circ1的表達(dá)模式，其中oe3和oe28(黑色柱)為紅色果實(shí)株系，oe21和oe26(灰色柱)為黃色果實(shí)株系。圖9示出轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的顏色變化表現(xiàn)在多個(gè)水平，其中a1、a2和a3為同一株系有多種顏色的果實(shí)；b為同一果穗中含不同顏色果實(shí)；c1和c2為同一個(gè)果實(shí)含不同顏色區(qū)域。圖10示出轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的顏色，其中oe3、oe28為紅色果實(shí)株系；oe21、oe26為黃色果實(shí)株系。圖11示出psy1-circ1轉(zhuǎn)基因番茄中番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量分析(初提物)，其中oe3、oe4和oe28(黑色柱)為紅色果實(shí)株系，oe5、oe21和oe26(灰色柱)為黃色果實(shí)株系。具體實(shí)施方式下面對本發(fā)明的具體實(shí)施方案作進(jìn)一步清楚和完整的描述。需要理解的是，本文中具體描述的實(shí)施方案僅用于示例目的，無意于以任何方式對本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行限制。在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行修改。本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書來進(jìn)行限定。如上所述，當(dāng)前對circrna的研究非常有限，基本都是對該類rna的生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方面的鑒定，而且主要集中在人和動物中，植物中非常少，目前只有擬南芥、水稻和番茄中的circrna有相關(guān)鑒定。另外，circrna的功能研究目前剛起步，且植物領(lǐng)域內(nèi)基本無相關(guān)報(bào)道。因此，對植物circrna的鑒定和生物學(xué)功能進(jìn)行研究意義非常重大。另外，如前文所述，類胡蘿卜素例如番茄紅素是植物花色素的重要組成部分，且具有重要的營養(yǎng)價(jià)值，對其合成調(diào)控的研究具有重要的應(yīng)用意義。綜上，植物中是否存在這樣的circrna，其對植物例如番茄中類胡蘿卜素生物合成過程中的關(guān)鍵酶例如八氫番茄紅素合成酶1(psy1)的基因表達(dá)會產(chǎn)生影響，成了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的一個(gè)技術(shù)問題。本發(fā)明人以番茄(solanumlycopersicum)為研究對象，通過高通量測序?qū)Σ煌墒炱诘墓麑?shí)進(jìn)行了circrna檢測，結(jié)果在其中檢測到大量的來源于不同基因的circrna位點(diǎn)。在這些circrna當(dāng)中，本發(fā)明人進(jìn)一步對來源于psy1基因的circrna(psy1-circ1)的生物學(xué)功能進(jìn)行了分析，意外地發(fā)現(xiàn)該circrna可調(diào)控例如抑制其來源基因psy1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控番茄紅素等類胡蘿卜素的生物合成。基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種circrnapsy1-circ1，其序列示于seqidno:1。seqidno:1的序列為：agttctttgatgaggcagagaaaggcgtgacagaattgagctcagctagtagattccct^ccattcagagatatgattgaaggaatgcgtatggacttgagaaaatcgagatacaaaaacttcgacgaactatacctttattgttattatgttgctggtacggttgggttgatgagtgttccaattatgggtatcgcccctgaatcaaaggcaacaacagagagcgtatataatgctgctttggctctggggatcgcaaatcaattaactaacatactcagagatgttggagaagatgccagaagaggaagagtctacttgcctcaagatgaattagcacaggcaggtctatccgatgaagatatatttgctggaagggtgaccgataaatggagaatctttatgaagaaacaaatacatagggcaagaa。該circrnapsy1-circ1來源于psy1基因，共429個(gè)堿基，包含psy1的外顯子7和8，其第59-60位(即符號“^”所示位置)之間為反向剪接位點(diǎn)。過表達(dá)circrnapsy1-circ1能夠抑制八氫番茄紅素合成酶(psy1)的基因表達(dá)。由于psy1是類胡蘿卜素生物合成中的重要限速酶，因此該circrnapsy1-circ1的過表達(dá)可以影響類胡蘿卜素的生物合成，即影響植物中類胡蘿卜素的含量。另外，由于類胡蘿卜素是一種天然色素，因此在植物例如番茄中，對類胡蘿卜素例如番茄紅素的影響也會影響到果實(shí)的顏色發(fā)育。再者，相對而言，circrna更為穩(wěn)定，因此相比于其他rna，可以更好地實(shí)現(xiàn)遺傳調(diào)控。在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的引物對。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述引物對為seqidno:2和seqidno:3，或者seqidno：4和seqidno：5，其中seqidno:2的序列為：gttgggttgatgagtgttcc，seqidno:3的序列為：caagtccatacgcattcc，seqidno：4的序列為gttggagaagatgccagaag，seqidno：5的序列為ccatacgcattccttcaatc。在第三方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，其包含本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為pcambia1301載體。在第四方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物八氫番茄紅素合成酶1基因(psy1)表達(dá)的方法，所述方法包括在所述植物中過表達(dá)本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1或者抑制本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1的表達(dá)。具體地，在植物中過表達(dá)circrnapsy1-circ1可以抑制或者下調(diào)八氫番茄紅素合成酶1基因的表達(dá)，抑制該circrnapsy1-circ1的表達(dá)則可以促進(jìn)或者上調(diào)八氫番茄紅素1基因的表達(dá)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述植物可以是番茄。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述類胡蘿卜素可以是番茄紅素和/或β-胡蘿卜素。在第五方面，本發(fā)明提供一種調(diào)控植物類胡蘿卜素含量的方法，所述方法包括通過在所述植物中過表達(dá)本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。更具體地，在植物中過表達(dá)circrnapsy1-circ1可以抑制八氫番茄紅素合成酶1基因的表達(dá)，由此降低植物類胡蘿卜素含量。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述植物可以是番茄。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述類胡蘿卜素為番茄紅素和/或β-胡蘿卜素。在第六方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控番茄果實(shí)顏色發(fā)育的方法，包括在番茄中過表達(dá)本發(fā)明第一方面的circrnapsy1-circ1。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那樣，番茄果實(shí)的色素成分主要是類胡蘿卜素。不同的類胡蘿卜素使番茄呈現(xiàn)不同的顏色，例如番茄紅素會使番茄果實(shí)呈現(xiàn)紅色。因此，影響類胡蘿卜素的合成途徑將導(dǎo)致番茄果實(shí)的顏色發(fā)生變化。如上所述，psy1-circ1的過表達(dá)會抑制psy1的表達(dá)，而psy1是植物類胡蘿卜素(或番茄紅素)生物合成過程中的重要限速酶。psy1的表達(dá)被抑制導(dǎo)致番茄果實(shí)中的番茄紅素含量降低，由此使番茄果實(shí)呈現(xiàn)例如黃色。簡言之，circrnapsy1-circ1的過表達(dá)可以使番茄結(jié)出黃色果實(shí)。下面參照附圖對本發(fā)明示例性實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。對示例性實(shí)施方式的描述僅僅是出于示范目的，而絕不是對本發(fā)明及其應(yīng)用或用法的限制。實(shí)施例實(shí)施例1.circrnapsy1-circ1的生物信息學(xué)與分子生物學(xué)鑒定番茄果實(shí)中環(huán)形rna的深度測序：采用trizol(lifetechnologies)提取野生型番茄(solanumlycopersicum)品種(ailsacraig，下文簡稱ac)綠熟期(mg)、破色期(br)和紅熟期(br+6)果實(shí)的總rna，再利用dnasei(fermentas)消化，以去除殘留基因組dna。之后，利用ribo-zeromagnetickit-plantleaf(epicentre)去除核糖體rna，再利用rnaser(epicentre)于37℃處理1小時(shí)，以消化線性rna。circrna建庫用illumina公司的rnaltsampleprepkitv2，插入片段長度為120-250bp；雙向測序用hiseq2500測序儀(2*100bp)，采用100bp的雙末端讀段(晶能生物技術(shù)(上海)有限公司)，每個(gè)樣品有效數(shù)據(jù)量4gbase以上。circrna位點(diǎn)的提取與分析：深度測序數(shù)據(jù)去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，用segemehl(v.0.1.7)軟件提取反向剪接位點(diǎn)信息。利用rnaser耐受性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行部分位點(diǎn)的分子生物學(xué)驗(yàn)證。rnaser耐受性實(shí)驗(yàn)具體如下：利用trizol(lifetechnologies)分離總rna，然后使用dnasei(fermentas)去除殘留基因組dna。在采用rnaclean&concentratorkit(zymoresearch)純化之后，將rna樣本分為兩等份，一份用rnaser(epicentre)于37℃消化1小時(shí)(r+)，另一部分做mock處理(r-，即利用水代替rnaser，其余與r+處理完全相同)。將r+rna和r-rna用隨機(jī)引物(randomhexamerprimer，fermentas)逆轉(zhuǎn)錄為cdna(m-mlvreverasetranscriptase，promega)，并用作rt-pcr鑒定的模板。利用聚合引物(用于擴(kuò)增普通線性mrna)和離散引物(用于擴(kuò)增circrna)分別對r+模板和r-模板(cdna)進(jìn)行特異性pcr擴(kuò)增(圖1)。還將基因組dna用作模板，以確保該位點(diǎn)不存在于基因組中。圖2示出了上述流程，以及可能的結(jié)果。從該圖中可以看出，若是circrna，則其將表現(xiàn)對rnaser的耐受性，若是線性rna，則其將表現(xiàn)出對rnaser的敏感性。結(jié)果：本發(fā)明人通過上述實(shí)驗(yàn)鑒定出部分circrna，由此證明這些生物信息學(xué)方式檢測到的circrna位點(diǎn)的確存在。對circrnapsy1-circ1的鑒定結(jié)果示于圖3。circrnapsy1-circ1是采用離散引物seqidno:2(gttgggttgatgagtgttcc，正向引物)和seqidno:3(caagtccatacgcattcc，反向引物)進(jìn)行特異性pcr擴(kuò)增的，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)其序列為：agttctttgatgaggcagagaaaggcgtgacagaattgagctcagctagtagattccct^ccattcagagatatgattgaaggaatgcgtatggacttgagaaaatcgagatacaaaaacttcgacgaactatacctttattgttattatgttgctggtacggttgggttgatgagtgttccaattatgggtatcgcccctgaatcaaaggcaacaacagagagcgtatataatgctgctttggctctggggatcgcaaatcaattaactaacatactcagagatgttggagaagatgccagaagaggaagagtctacttgcctcaagatgaattagcacaggcaggtctatccgatgaagatatatttgctggaagggtgaccgataaatggagaatctttatgaagaaacaaatacatagggcaagaa。這段序列在本文中標(biāo)注為seqidno:1，其中第59-60位(即符號“^”所示位置)之間為反向剪接位點(diǎn)。psy1-circ1共429個(gè)堿基，包含psy1的外顯子7和8。psy1是采用聚合引物seqidno:6(ttggtttgcctgtctgtg，正向引物)和seqidno:7(tgtatcggacaaagcacc，反向引物)進(jìn)行特異性pcr擴(kuò)增的。實(shí)施例2.circrnapsy1-circ1及其來源基因在不同成熟期番茄果實(shí)中的表達(dá)模式分析鑒定circrna的特殊引物設(shè)計(jì)(實(shí)時(shí)pcr方法)：由于選擇性環(huán)化現(xiàn)象的存在，同一個(gè)基因可產(chǎn)生多個(gè)有重疊區(qū)域的circrna，因此設(shè)計(jì)鑒定circrna的離散引物(正向引物或者反向引物)跨越反向剪接位點(diǎn)(引物跨過位點(diǎn)的3’端長度為3-6bp)，以保證擴(kuò)增的特異性，具體見示意圖(圖4)。其余設(shè)計(jì)理念同普通實(shí)時(shí)pcr。由此設(shè)計(jì)理念獲得的用于實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增circrnapsy1-circ1的引物為離散引物，其中正向引物為tcagctagtagattccctccattc(seqidno:8)，反向引物為cctttgattcaggggcgatac(seqidno:9)。另外，用于實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增circrnapsy1-circ1的來源基因psy1的引物是聚合引物，其中正向引物為ggacaagtttcatggaatcagt(seqidno:10)，反向引物為tggagtagccaaaatagcagac(seqidno:11)。表達(dá)模式鑒定分析：提取野生型番茄(ac)綠熟期(mg)、破色期(br)和紅熟期(br+6)番茄果實(shí)的總rna，去除基因組dna殘留，之后用隨機(jī)引物(randomhexamerprimer，fermentas)將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，再利用實(shí)時(shí)pcr(sybrgreen)的方式分析各時(shí)期circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1的相對表達(dá)量。該實(shí)時(shí)pcr所采用的引物如上所述。結(jié)果：對于circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1在各時(shí)期的表達(dá)模式鑒定分析結(jié)果示于圖5中。從該圖中可以看出，circrnapsy1-circ1的表達(dá)趨勢與其來源基因psy1的表達(dá)趨勢是相類似的。具體地，從綠熟期(mg)到破色期(br)再到紅熟期(br+6)，psy1-circ1和psy1的表達(dá)量均逐漸上升。psy1-circ1的表達(dá)量在熟化期間增加表明psy1-circ1可能參與果實(shí)熟化。實(shí)施例3.circrnapsy1-circ1過表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化circrna過表達(dá)載體的構(gòu)建：以野生型番茄(ac)的基因組dna為模板，擴(kuò)增包含待環(huán)化外顯子和側(cè)翼序列(上游281bp和下游681bp)的片段(片段a)，擴(kuò)增部分下游序列(517bp，片段b)。然后將片段a和片段b以相反的方向連接并構(gòu)建到pcambia1301載體的表達(dá)框中(圖6)。該載體中片段a和片段b因部分序列互補(bǔ)而形成二級結(jié)構(gòu)，是促進(jìn)circrna大量生成的關(guān)鍵。此外，該載體保留了待環(huán)化外顯子兩側(cè)的剪接位點(diǎn)和部分側(cè)翼序列，保證了精確剪接的進(jìn)行。遺傳轉(zhuǎn)化：將上文制備獲得的載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(a.tumefaciens)eha105中，隨后將此經(jīng)轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化野生型番茄(ac)，轉(zhuǎn)化方法按照子葉穿刺轉(zhuǎn)化法(rai,g.k.etal.,2012)。結(jié)果：從圖7和圖8可以看出，與對照即野生型ac相比，在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的不同時(shí)期，psy1-circ1均高度表達(dá)，這表明本發(fā)明人成功地構(gòu)建了circrnapsy1-circ1過表達(dá)載體，且成功地在番茄中過表達(dá)了circrnapsy1-circ1，說明了circrna過表達(dá)系統(tǒng)的高效性。實(shí)施例4.轉(zhuǎn)基因番茄(ac)中circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1的表達(dá)如實(shí)施例3所述來制備本實(shí)施例所需轉(zhuǎn)基因番茄，并對處于不同時(shí)期(綠熟期(mg)、破色期(br)和紅熟期(br+6))的野生型和轉(zhuǎn)基因番茄中的circrnapsy1-circ1及其來源基因psy1的表達(dá)量進(jìn)行檢測，采用實(shí)時(shí)pcr(sybrgreen)，其中所用引物如實(shí)施例2所述。不同時(shí)期的番茄果實(shí)中psy1-circ1及psy1的相對表達(dá)量結(jié)果示于圖7。圖7中的左列圖示出psy1-circ1在不同時(shí)期番茄果實(shí)中的表達(dá)情況，右列圖示出psy1在不同時(shí)期番茄果實(shí)中的表達(dá)情況。從圖中可見，在綠熟期、破色期和紅熟期，psy1在黃色果實(shí)株系(oe21和oe26)中的表達(dá)下調(diào)，但其在紅色果實(shí)株系(oe3和oe28)中的表達(dá)更高。psy-circ1在紅色果實(shí)株系和黃色果實(shí)株系之間的表達(dá)模式不同。從綠熟期到破色期再到紅熟期，psy1-circ1在黃色果實(shí)株系中的表達(dá)呈上升趨勢，并且在紅熟期，其在黃色果實(shí)株系中的表達(dá)較其在紅色果實(shí)株系中的表達(dá)豐度更高。相反，從破色期到紅熟期，psy1-circ1在紅色果實(shí)株系中的表達(dá)下降。這些結(jié)果提示，psy-circ1的高表達(dá)可能在抑制其來源mrna累積方面發(fā)揮作用。不同果實(shí)株系中的psy1-circ1及psy1的相對表達(dá)量結(jié)果示于圖8。從該圖中可以看出，從綠熟期到破色期再到紅熟期，psy1-circ1和psy1在黃色果實(shí)株系(oe21和oe26)中均呈上升的趨勢，而在兩個(gè)紅色果實(shí)株系(oe3和oe28)中，psy1-circ1在破色期后表現(xiàn)下調(diào)趨勢，psy1呈增加的趨勢。由以上結(jié)果可知，在番茄中過表達(dá)circrnapsy1-circ1影響到了其來源基因psy1的表達(dá)。更具體地，果實(shí)成熟期連續(xù)高表達(dá)circrnapsy1-circ1可抑制其來源基因psy1的表達(dá)?？紤]到psy1基因是類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵酶，因此發(fā)明人進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)基因番茄中與番茄果實(shí)顏色發(fā)育緊密相關(guān)的類胡蘿卜素番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量是否會發(fā)生變化，參見實(shí)施例5。實(shí)施例5.轉(zhuǎn)基因番茄(ac)中番茄紅素和β-類胡蘿卜素含量分析如實(shí)施例3所述來制備本實(shí)施例所需轉(zhuǎn)基因番茄。切下番茄果實(shí)組織樣本(br+10時(shí)期)，液氮冷凍并保存在-80℃。將冷凍樣本用液氮研磨成粉末，稱取約0.2克用1.8ml提取液(丙酮：正己烷＝2：3)于室溫下提取1小時(shí)。3000rpm離心10min，取上清液置于新的離心管中。使用uv-1800分光光度計(jì)(shimadzu)測定上清液在663nm、645nm、505nm及453nm處的光密度。使用以下公式計(jì)算番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量：番茄紅素(100mg/100ml)＝-0.0458a663+0.204a645+0.372a505-0.0806a453，β-胡蘿卜素(100mg/100ml)＝0.216a663-1.22a645-0.304a505+0.452a453(參見nagataandyamashita,1992)。psy1-circ1過表達(dá)ac番茄表現(xiàn)出不同的表型。具體地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因ac番茄果實(shí)的顏色變化表現(xiàn)在多個(gè)水平，例如同一株系結(jié)出多種顏色的果實(shí)(參見圖9中的a1、a2和a3)，同一果穗中含不同顏色的果實(shí)(參見圖9中的b)，同一個(gè)果實(shí)含不同的顏色區(qū)域(參見圖9中的c1和c2)。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因ac番茄單一株系可以結(jié)出單獨(dú)的紅色或者黃色的果實(shí)。在我們的實(shí)驗(yàn)中，有八個(gè)株系結(jié)出紅色果實(shí)，七個(gè)株系結(jié)出黃色果實(shí)(表1和圖10)。與果實(shí)顏色相一致，黃色轉(zhuǎn)基因果實(shí)(oe5、oe21和oe26)中的番茄紅素和β-胡蘿卜素相對于對照ac顯著下降(p<0.01)，在一些紅色轉(zhuǎn)基因果實(shí)中的含量略有下降(參見圖11)。β-胡蘿卜素含量的下降稍遜于番茄紅素含量的下降，這一結(jié)果可能是由于β-胡蘿卜素在熟化啟動之前就開始累積。簡言之，circrnapsy1-circ1在類胡蘿卜素番茄紅素和β-類胡蘿卜素的生物合成中起到負(fù)調(diào)節(jié)的作用。表1.psy1-circ1過表達(dá)株系的果實(shí)顏色(ac,t0代)果實(shí)顏色oe株系總計(jì)黃色oe5、oe8、oe11、oe19、oe21、oe23、oe267紅色oe3、oe4、oe7、oe12、oe13、oe14、oe15、oe288小結(jié)：本發(fā)明人在番茄中首次發(fā)現(xiàn)了一種來源于psy1的circrna，其被命名為psy1-circ1，該circrna可以負(fù)調(diào)控其來源基因psy1的表達(dá)。由于psy1是類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵酶基因，因此該circrna可以間接地調(diào)控番茄中類胡蘿卜素如番茄紅素和β-胡蘿卜素的含量，進(jìn)而調(diào)控番茄果實(shí)的顏色發(fā)育。在本說明書中，每當(dāng)提及“示例性實(shí)施方式”、“優(yōu)選實(shí)施方式”、“一個(gè)實(shí)施方式”等時(shí)意味著針對該實(shí)施方式描述的具體的特征、結(jié)構(gòu)或特點(diǎn)包括在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式中。這些用詞在本說明書中不同地方的出現(xiàn)不一定都指代同一實(shí)施方式。此外，當(dāng)針對任一實(shí)施方式/實(shí)施方式描述具體的特征、結(jié)構(gòu)或特點(diǎn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠在所有所述實(shí)施方式中的其它實(shí)施方式中實(shí)現(xiàn)這種特征、結(jié)構(gòu)或特點(diǎn)。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施方式。然而，本發(fā)明的方面不限于上述實(shí)施方式。在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，各種改型和替換均可以應(yīng)用到上述實(shí)施方式中。參考文獻(xiàn)abe,n.,matsumoto,k.,nishihara,m.,nakano,y.,shibata,a.,maruyama,h.,shuto,s.,matsuda,a.,yoshida,m.,ito,y.,etal.(2015).rollingcircletranslationofcircularrnainlivinghumancells.scirep5,16435.alhasan,a.a.,izuogu,o.g.,al-balool,h.h.,steyn,j.s.,evans,a.,colzani,m.,ghevaert,c.,mountford,j.c.,marenah,l.,elliott,d.j.,etal.(2016).circularrnaenrichmentinplateletsisasignatureoftranscriptomedegradation.blood127,e1-e11.ashwal-fluss,r.,meyer,m.,pamudurti,n.r.,ivanov,a.,bartok,o.,hanan,m.,evantal,n.,memczak,s.,rajewsky,n.,andkadener,s.(2014).circrnabiogenesiscompeteswithpre-mrnasplicing.molecularcell56,55-56.bachmayr-heyda,a.,reiner,a.t.,auer,k.,sukhbaatar,n.,aust,s.,bachleitner-hofmann,t.,mesteri,i.,grunt,t.w.,zeillinger,r.,andpils,d.(2015).correlationofcircularrnaabundancewithproliferation-exemplifiedwithcolorectalandovariancancer,idiopathiclungfibrosis,andnormalhumantissues.scientificreports5.chen,l.-l.(2016).thebiogenesisandemergingrolesofcircularrnas.naturereviewsmolecularcellbiology.cocquerelle,c.,mascrez,b.,hetuin,d.,andbailleul,b.(1993).mis-splicingyieldscircularrnamolecules.fasebjournal:officialpublicationofthefederationofamericansocietiesforexperimentalbiology7,155-160.conn,s.j.,pillman,k.a.,toubia,j.,conn,v.m.,salmanidis,m.,phillips,c.a.,roslan,s.,schreiber,a.w.,gregory,p.a.,andgoodall,g.j.(2015).thernabindingproteinquakingregulatesformationofcircrnas.cell160,1125-1134.geng,h.h.,li,r.,su,y.m.,xiao,j.,pan,m.,cai,x.x.,andji,x.p.(2016).thecircularrnacdr1aspromotesmyocardialinfarctionbymediatingtheregulationofmir-7aonitstargetgenesexpression.plosone11,e0151753.guo,j.u.,agarwal,v.,guo,h.,andbartel,d.p.(2014).expandedidentificationandcharacterizationofmammaliancircularrnas.genomebiology15,409(401-414).hansen,t.b.,jensen,t.i.,clausen,b.h.,bramsen,j.b.,finsen,b.,damgaard,c.k.,andkjems,j.(2013).naturalrnacirclesfunctionasefficientmicrornasponges.nature495,384-388.hansen,t.b.,wiklund,e.d.,bramsen,j.b.,villadsen,s.b.,statham,a.l.,clark,s.j.,andkjems,j.(2011).mirna-dependentgenesilencinginvolvingago2-mediatedcleavageofacircularantisenserna.theembojournal30,4414-4422.ivanov,a.,memczak,s.,wyler,e.,torti,f.,porath,h.t.,orejuela,m.r.,piechotta,m.,levanon,e.y.,landthaler,m.,anddieterich,c.(2015).analysisofintronsequencesrevealshallmarksofcircularrnabiogenesisinanimals.cellreports10,170-177.jeck,w.r.,andsharpless,n.e.(2014).detectingandcharacterizingcircularrnas.naturebiotechnology32,453-461.jeck,w.r.,sorrentino,j.a.,wang,k.,slevin,m.k.,burd,c.e.,liu,j.,marzluff,w.f.,andsharpless,n.e.(2013).circularrnasareabundant,conserved,andassociatedwithalurepeats.rna(newyork,ny)19,141-157.kramer,m.c.,liang,d.,tatomer,d.c.,gold,b.,march,z.m.,cherry,s.,andwilusz,j.e.(2015).combinatorialcontrolofdrosophilacircularrnaexpressionbyintronicrepeats,hnrnps,andsrproteins.genes&development29,2168-2182.lasda,e.,andparker,r.(2014).circularrnas:diversityofformandfunction.rna(newyork,ny)20,1829-1842.lasda,e.,andparker,r.(2016).circularrnasco-precipitatewithextracellularvesicles:apossiblemechanismforcircrnaclearance.plosone11,e0148407.legnini,i.,ditimoteo,g.,rossi,f.,morlando,m.,briganti,f.,sthandier,o.,fatica,a.,santini,t.,andronache,a.,wade,m.,etal.(2017).circ-znf609isacircularrnathatcanbetranslatedandfunctionsinmyogenesis.molcell66.li,y.,zheng,q.,bao,c.,li,s.,guo,w.,zhao,j.,chen,d.,gu,j.,he,x.,andhuang,s.(2015a).circularrnaisenrichedandstableinexosomes:apromisingbiomarkerforcancerdiagnosis.cel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8<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7tgtatcggacaaagcacc18<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<400>8tcagctagtagattccctccattc24<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9cctttgattcaggggcgatac21<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10ggacaagtttcatggaatcagt22<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11tggagtagccaaaatagcagac22當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12