本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種taqman探針熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體的試劑盒。

背景技術(shù)：

鴿支原體(mycoplasmacolumbinum)病又稱慢性呼吸道疾病，是由支原體引起的一種以呼吸器官炎癥為特征的慢性傳染病。鴿支原體屬于非糖酵解型支原體，可以從出現(xiàn)異常呼吸音、流鼻涕、打噴嚏、張口呼吸等慢性呼吸道病癥狀的鴿氣管、口咽、氣囊、肺等部位分離出。鴿支原體可通過(guò)接觸、飛沫、飼料、飲水、器具等水平傳播，也可經(jīng)蛋垂直傳播，在寒冷、多雨、衛(wèi)生惡劣、通風(fēng)不良、鴿舍擁擠、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)惹闆r下更易感染。肉鴿感染后生長(zhǎng)發(fā)育受阻，飼養(yǎng)期延長(zhǎng)，胴體等級(jí)下降，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。

鴿支原體最早由shimizu等于1978年分離并鑒定；1984年，keymer等分別從活鴿和死鴿中分離到鴿支原體，并發(fā)現(xiàn)無(wú)論是有呼吸道癥狀的鴿體內(nèi)，或是外表健康的鴿體內(nèi)都可以分離到鴿支原體且分離率較高。我國(guó)學(xué)者畢丁仁(1997年)對(duì)某養(yǎng)鴿專業(yè)戶及市場(chǎng)食用鴿采集口腔咽部粘膜拭子及其氣管、氣囊和肺等材料進(jìn)行了支原體的分離鑒定，對(duì)已純化的34個(gè)分離物中的19個(gè)進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)5株為鴿支原體。盡管分離到鴿支原體菌株，但對(duì)于鴿支原體的致病性目前仍無(wú)定論，但有學(xué)者指出鴿支原體與鴿呼吸道疾病有直接關(guān)系。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于鴿支原體的相關(guān)研究仍較少，但就現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，鴿支原體感染在我國(guó)的持續(xù)時(shí)間已經(jīng)很久，并且給養(yǎng)鴿業(yè)造成了很大的危害和經(jīng)濟(jì)損失。

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鴿支原體的方法包括：支原體的分離培養(yǎng)、分子基因診斷、抗血清代謝實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)抗體檢測(cè)試驗(yàn)，其中分離培養(yǎng)是診斷支原體感染性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但支原體對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要求高，生長(zhǎng)緩慢，分離難度大，只適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；抗血清代謝實(shí)驗(yàn)，不僅需要用分離的菌株制備高免血清，且特異性低；血清學(xué)檢測(cè)如平板凝集試驗(yàn)(spa)，存在不同分離株制備的抗原反應(yīng)差異，因此特異性低，而血凝抑制試驗(yàn)(hi)需多次采樣，更適合群體水平的檢測(cè)。常規(guī)pcr及16srrna測(cè)序雖然避免了上述方法的缺陷，但存在操作步驟多，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，限制了在快速檢測(cè)診斷中的推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種快速、敏感、準(zhǔn)確以及定量地taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，選取鴿支原體rpob基因的一段為目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，利用taqman探針技術(shù)建立檢測(cè)鴿支原體的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法。

本發(fā)明提供用于檢測(cè)鴿支原體的taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物和探針序列分別為：

上游引物columbxw-f：5′-gttctttctcgtgataaaggcg-3′，

下游引物columbxw-r：5′-caagatatggcatatcttcttccgg-3′；

探針columbxw-probe：5′-f-caaagtcggagataaaatggctg-q-3′。

其中，f為熒光報(bào)告基團(tuán)，q為熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選地，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為fam，所述熒光淬滅基團(tuán)為tamra。

所述擴(kuò)增序列(169bp)為：

gttctttctcgtgataaaggcgatgttttagaggatggaattgataaaatcgttaaagtttcaattgctcaaaaacgtaaaatcaaagtcggagataaaatggctggtcgtcatggaaacaaaggggttatctctattgttcttccggaagaagatatgccatatcttg

本發(fā)明還提供鴿支原體taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒包括2×aceqqpcrprobemastermix，50×roxreferencedye2，columbxw-f，columbxw-r，columbxw-probe和無(wú)rna酶水。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照：pmd-19t-169質(zhì)粒。所述陽(yáng)性對(duì)照為構(gòu)建的pmd-19t-169陽(yáng)性質(zhì)粒及通過(guò)其所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該質(zhì)粒引物columbxw-f和columbxw-r擴(kuò)增的鴿支原體rpob基因部分序列，長(zhǎng)度為169bp，克隆至pmd-19t載體，篩選鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pmd-19t-169。

本發(fā)明在上述試劑盒的基礎(chǔ)上，提供了taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體的方法。

上述方法包括以下實(shí)驗(yàn)步驟：

1、提取樣品中的dna，選用商品化的病原菌dna提取試劑盒提取樣本dna。

2、以步驟1中的dna為模板，columbxw-f和columbxw-r為引物，columbxw-probe為探針，進(jìn)行taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)。

3、標(biāo)準(zhǔn)品的制備；

4、質(zhì)粒濃度換算拷貝數(shù)；

5、反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)的選定；

6、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；

7、對(duì)具體的樣品進(jìn)行檢測(cè)。

pcr反應(yīng)體系為25μl：包括2×aceqqpcrprobemastermix：12μl；50×roxreferencedye2：0.5μl；columbxw-f：1μl，columbxw-r:1μl；columbxw-probe：2.5μl；無(wú)rna酶水：3μl；模板dna：5μl。

taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；68℃30s。

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在ntc(陰性對(duì)照)沒(méi)有ct(循環(huán)數(shù))值的情況下，ct值<35.5為陽(yáng)性；ct值介于35.5～36.5為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品ct值<35.5為陽(yáng)性，ct值≥35.5為陰性。

本發(fā)明應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研制和開(kāi)發(fā)出的鴿支原體taqman探針熒光定量pcr試劑盒的優(yōu)點(diǎn)在于：(1)不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)高特異性：利用鴿支原體特異性基因設(shè)計(jì)出的引物和探針進(jìn)行探針?lè)╬cr擴(kuò)增，只有當(dāng)探針引物特異的結(jié)合到擴(kuò)增的靶序列并能被taqman酶降解時(shí)才會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否；(3)快速、高效擴(kuò)增：檢測(cè)時(shí)間58min左右；(4)靈敏度高：最低檢測(cè)出10個(gè)拷貝數(shù)的目的基因；(5)鑒定簡(jiǎn)便：通過(guò)最后的擴(kuò)增曲線就可以得到精確的結(jié)果，且可以計(jì)算待檢樣品的拷貝數(shù)，無(wú)需電泳等其他任何分析步驟；(6)安全無(wú)污染：使用過(guò)程中無(wú)需電泳技術(shù)檢測(cè)，避免了接觸溴化乙錠的危險(xiǎn)，有利于檢測(cè)人員的健康。閉管操作的實(shí)時(shí)檢測(cè)可以有效防止反應(yīng)產(chǎn)物的污染。本發(fā)明適用于待測(cè)鴿的氣管、氣囊、泄殖腔、肺等樣品，所述方法適用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場(chǎng)等。

附圖說(shuō)明

圖1：taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)不同濃度梯度鴿支原體質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)擴(kuò)增曲線。

圖2：taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3：taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體的特異性曲線。

(從左至右依次為：鴿支原體、家禽支原體、雞支原體、雞滑液囊支原體、泄殖腔支原體、鴨支原體、泛黃天膽甾支原體、牛支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種和綿羊肺炎支原體)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1.設(shè)計(jì)、合成引物和taqman探針

從genbank中獲取鴿支原體rpob基因序列，經(jīng)序列比對(duì)尋找序列上保守的區(qū)域，應(yīng)用在線primer-blast軟件分析基因序列，根據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)原則，在序列保守區(qū)域篩選到能擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為169bp的一對(duì)引物，并在該引物的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)1條熒光探針，序列如下：

上游引物columbxw-f：5′-gttctttctcgtgataaaggcg-3′，

下游引物columbxw-r：5′-caagatatggcatatcttcttccgg-3′；

探針columbxw-probe：5′-f-caaagtcggagataaaatggctg-q-3′。

其中，f為熒光報(bào)告基團(tuán)，q為熒光淬滅基團(tuán)。

優(yōu)選地，探針的熒光報(bào)告基團(tuán)是fam，熒光淬滅基團(tuán)是tamra。

上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.主要儀器設(shè)備與試劑

安捷倫mx3005p熒光定量pcr儀、臺(tái)式高速離心機(jī)eppendorfcentrifuge5804r、核酸濃度測(cè)定儀nanodrop-2000。pmd-19tcloningkit購(gòu)自寶生物公司、taqqpcrprobemastermix購(gòu)自諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程技術(shù)有限公司。

3.標(biāo)準(zhǔn)品制備

以columbxw-f和columbxw-r為引物，鴿支原體dna為模板，擴(kuò)增得到大小為169bp的目的基因片段。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，62℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃5min。pcr產(chǎn)物于10g/l的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，pcr產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后與pmd-19t克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞jm109，涂布于含100mg/l氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h。篩選出陽(yáng)性單菌落到含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，取菌液2ml，提取質(zhì)粒，序列測(cè)定為陽(yáng)性的質(zhì)粒命名為pmd-19t-169。

4.質(zhì)粒濃度換算拷貝數(shù)

測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒pmd-19t-169的濃度為177.8ng/μl，pmd-19t載體的堿基數(shù)為2692bp，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為169bp，每個(gè)堿基的平均分子量為660道爾頓/bp，每μl樣品中檢測(cè)基因拷貝數(shù)按照公式計(jì)算：樣本拷貝數(shù)(copies/μl)＝阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×10²³)×質(zhì)粒濃度ng/μl×10^-9/(660×重組質(zhì)粒堿基數(shù))，其中，重組質(zhì)粒堿基數(shù)＝載體序列堿基數(shù)+插入序列堿基數(shù)，那么計(jì)算得出的拷貝數(shù)為5.67×10¹⁰copies/μl。

5.根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)構(gòu)建其標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其為：5.67×10¹⁰～10⁰，每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行定量pcr。反應(yīng)體系為25μl，分別為稀釋好的模板5μl；2×aceqqpcrprobemastermix：12μl；50×roxreferencedye2：0.5μl；columbxw-f：1μl，columbxw-r:1μl；columbxw-probe：2.5μl；無(wú)rna酶水：3μl。熒光定量pcr擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃3s，退火溫度60℃30s，40個(gè)循環(huán)；68℃30s。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)taqman探針熒光定量pcr擴(kuò)增情況選取6個(gè)點(diǎn)，生成不同梯度鴿支原體質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)擴(kuò)增曲線(圖1所示)，并利用分析軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2所示)。結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)粒濃度在5.67×10⁷拷貝/μl～5.67×10²拷貝/μl范圍內(nèi)時(shí)，質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值與ct值具有非常好的線性相關(guān)性，回歸曲線：y＝-3.23×log(x)+47.51，eff.＝104.0％，相關(guān)系數(shù)r²＝0.999，其中，y為ct值，x為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

6.結(jié)果分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在ntc(陰性對(duì)照)沒(méi)有ct(循環(huán)數(shù))值的情況下，ct值<35.50判為陽(yáng)性；ct值介于35.50～36.50為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品ct值<35.50為陽(yáng)性，ct值≥35.50為陰性。

7.特異性試驗(yàn)

以鴿支原體標(biāo)準(zhǔn)品的dna為陽(yáng)性對(duì)照，以家禽支原體、雞支原體、雞滑液囊支原體、泄殖腔支原體、鴨支原體、泛黃天膽甾支原體、牛支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種和綿羊肺炎支原體的dna為陰性對(duì)照，無(wú)rna酶水為空白對(duì)照，反應(yīng)體系及pcr擴(kuò)增條件同上，對(duì)上述幾種細(xì)菌的dna進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)。從圖3可以看出，在無(wú)rna酶水為陰性對(duì)照的前提下，利用建立的熒光定量pcr方法對(duì)鴿支原體、家禽支原體、雞支原體、雞滑液囊支原體、泄殖腔支原體、鴨支原體、泛黃天膽甾支原體、牛支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種和綿羊肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果只有鴿支原體反應(yīng)處理中檢測(cè)到特異性擴(kuò)增信號(hào)，其它反應(yīng)處理中均無(wú)熒光信號(hào)積累，表明該方法具有良好的特異性。

8.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法提供的試劑盒體系加樣，以pmd-19t-169標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(5.67×10²拷貝/μl～5.67×10⁷拷貝/μl)為模板進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。在同一次定量pcr反應(yīng)中，每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做3個(gè)重復(fù)孔，以分析組內(nèi)差異；用上述相同條件分別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析組間差異，計(jì)算其變異系數(shù)，變異系數(shù)(cv)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)/平均數(shù)(x)。采用spss19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差分析用于比較不同樣本之間的差異，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

分析結(jié)果表明：組內(nèi)各孔之間cv值在0.31％～0.92％之間，組間重復(fù)測(cè)定cv值在0.74％～0.98％之間，均小于1％(表1)。

表1taqman探針熒光定量檢測(cè)鴿支原體組內(nèi)和組間重復(fù)性

注：表中為平均值，s為標(biāo)準(zhǔn)差，cv為變異系數(shù)。

實(shí)施例2：

taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體與支原體傳統(tǒng)分離純化鑒定的對(duì)比

對(duì)從山東肉鴿場(chǎng)采集的30份氣管棉拭子和30份氣囊棉拭子進(jìn)行檢測(cè)。分別利用支原體傳統(tǒng)分離鑒定方法和建立的taqman探針熒光定量pcr方法檢測(cè)鴿支原體。

1.支原體的傳統(tǒng)分離純化鑒定方法

樣品中支原體的分離：用無(wú)菌棉拭子分別從鴿的喉支氣管或氣囊取樣，直接放入3-5ml改良的frey液體培養(yǎng)基中，攪動(dòng)擠壓并丟棄棉簽，將上述培養(yǎng)基置于37℃溫箱培養(yǎng)，盲傳3～4代后，轉(zhuǎn)接到固體平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-7d后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，可以在顯微鏡下觀察到“油煎蛋”樣的典型支原體單菌落，直徑1-3mm不等。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好且均一的單菌落，再次接種于改良的frey液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，再轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基中分離單菌落，連續(xù)重復(fù)三次，純化出支原體；并取200μl已純化好的菌液提取dna。

采用16srrna通用引物：上游引物16srrna-f為5′-actcctacgggaggcagcag-3′，下游引物16srrna-r為5′-tacggytaccttgttacgactt-3′，對(duì)提取出的樣品dna進(jìn)行普通pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃5min；擴(kuò)增體系為25μl：2×pcrtaqmix12.5μl，無(wú)rna酶水8.5μl，引物16srrna-f0.5μl，16srrna-r0.5μl，dna3μl。擴(kuò)增后獲得740bp大小的16srrna序列，將獲得的16srrna序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，確定是否為鴿支原體。

2.taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法

樣品中菌體基因組dna的提?。河脽o(wú)菌棉拭子分別從鴿的喉支氣管或氣囊取樣，直接放入1ml的pbs(0.1m，ph＝7.4)中，充分?jǐn)噭?dòng)擠壓并丟棄棉簽，吸取200μl上述液體，利用qiagenpathogenminikit(凱杰公司病原dna提取試劑盒)提取細(xì)菌基因組dna，并以此為模板進(jìn)行taqman探針熒光定量pcr檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2tqman探針熒光定量pcr與支原體傳統(tǒng)分離純化鑒定方法的結(jié)果對(duì)比

表2結(jié)果顯示本發(fā)明建立的taqman探針熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體方法的檢出率為48.33％，而支原體傳統(tǒng)分離純化鑒定方法的檢出率為18.33％，表明taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體的方法具有更高的檢出率，并且大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

與傳統(tǒng)支原體分離鑒定和pcr測(cè)序相比，本發(fā)明建立的檢測(cè)鴿支原體taqman探針熒光定量pcr技術(shù)，通過(guò)對(duì)支原體不同種屬、分離株的基因序列比對(duì)，在常規(guī)pcr方法的基礎(chǔ)上，額外增加了一條探針引物，只有在探針引物的有效結(jié)合下，才能產(chǎn)生有效擴(kuò)增，大大提高了檢測(cè)靶標(biāo)核苷酸的敏感性和特異性；通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)以及引物濃度和探針濃度的優(yōu)化，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r²大于0.98；斜率位于-3～-3.5之間；pcr擴(kuò)增效率e位于0.9～1.2之間，符合線性關(guān)系及擴(kuò)增效率要求。不僅實(shí)現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，能有效避免實(shí)驗(yàn)室污染和臨床樣品中pcr存在抑制物造成假陰性等問(wèn)題、并以其快速、靈敏、特異、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作時(shí)間短及自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)優(yōu)于普通pcr方法。

序列表

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120>一種taqman探針熒光定量pcr檢測(cè)鴿支原體的試劑盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

gttctttctcgtgataaaggcg22

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

caagatatggcatatcttcttccgg25

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

caaagtcggagataaaatggctg23

<210>4

<211>169

<212>dna

<213>鴿支原體（mycoplasmacolumbinum）

<400>4

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