本發(fā)明屬于基因工程及分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及與綿羊羊毛細度相關(guān)的遺傳標記及其應用。
背景技術(shù)：
：：羊毛指羊身上的毛，是天然纖維的一種，是主要紡織原料之一。羊毛是人類利用最早的天然纖維之一，其歷史可以追溯到新石器時代。羊毛由于具有柔軟、彈性好、隔熱、阻燃和透氣性好等優(yōu)良特性而受到人們的青睞(leeder，1984)。但是隨著其他紡織纖維特別是合成纖維的出現(xiàn)，羊毛的市場地位受到了激勵的競爭。從1994至2004年，羊毛在整個紡織纖維中的比重下降了近30％(cottle，2010)。為了應對這種窘境，羊毛產(chǎn)業(yè)需提高個體產(chǎn)量和質(zhì)量，提高其市場競爭力。在畜牧業(yè)生產(chǎn)貢獻率中，遺傳的影響因素(品種)占40％，飼養(yǎng)管理占20％，疾病防治占15％，其它環(huán)境因素占5％。因此，品種改良和培育是提高羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量的最直接有效的措施。與傳統(tǒng)的育種工作相比，分子育種可以加快育種進程，大大縮短育種所需年限，同時還能克服性別、年齡和環(huán)境因素的影響，使得在分子水平對遺傳物質(zhì)進行操作成為可能，從而實現(xiàn)動物不同的生產(chǎn)性狀的選擇。目前已發(fā)現(xiàn)一些與家畜生產(chǎn)性能及抗病性密切相關(guān)的基因，如顯著影響綿羊產(chǎn)肉性能的callipyge(clpg)和mstn基因(wang等，2015；othman等，2016)，其中clpg主要促使綿羊后臀肌肉過度發(fā)育，從而提高產(chǎn)肉量和屠體等級。新西蘭林肯大學將檢測dqa2基因作為綿羊抗腐蹄病選種的依據(jù)，并進入商業(yè)化服務階段。一些養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達的國家，已經(jīng)研發(fā)了有關(guān)種公牛的遺傳缺陷基因的分子檢測技術(shù)和配套的育種方案，應用于種公牛的選種、選配工作，有效降低了隱性有害基因的不良影響(李艷華等，2007)。傳統(tǒng)育種方法若結(jié)合分子育種技術(shù)，可提高選擇的準確度，縮短選育時間。動物分子育種方法之一是以分子標記為基礎(chǔ)進行標記輔助選擇。分子標記輔助選擇(marker—assistedselection，mas)是利用分子標記與目標性狀基因緊密連鎖的特點，通過分子標記檢測，即可檢測到目的基因的存在，達到選擇目標性狀的目的。對于羊毛性狀分子標記而言，一方面其產(chǎn)量和細度等屬于高遺傳力性狀，另一方面羊毛的組成成分復雜，其發(fā)育受多基因調(diào)控(石等，2011；safari等，2007)。因此，羊毛分子標記輔助選擇的前提是找到羊毛重要經(jīng)濟性狀座位或與之連鎖的dna標記。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于以上問題，本發(fā)明提供了與綿羊羊毛細度相關(guān)的遺傳標記，遺傳標記位于krtap26-1上，可用于綿羊細度的分子選育。本發(fā)明提供與綿羊羊毛細度相關(guān)的遺傳標記，其位于krtap26-1基因上，具體的核苷酸序列為序列表中seqidno.1；當?shù)任换驗閏時，羊毛較細，當?shù)任换驗閎時，羊毛較粗；所述等位基因c為：在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，第102bp處的堿基為c，第141bp處的堿基為t，第153bp處的堿基為c，第245處的堿基為g，第307處的堿基為g，第366處的堿基為g，第579處的堿基為c；所述等位基因b為：在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，第102bp處的堿基為t，第141bp處的堿基為c，第153bp處的堿基為g，第245處的堿基為a，第307處的堿基為a，第366處的堿基為g，第579處的堿基為t。本發(fā)明還提供用于檢測上述的與綿羊羊毛細度相關(guān)的遺傳標記的引物對，所述引物對為：上游引物：5’-cagacgacaacctgctcctg-3’；下游引物：5’-gtctgggatcttcagcgtg-3’。本發(fā)明還提供上述遺傳標記在鑒定綿羊羊毛細度中的應用，所述應用包括以下步驟：(1)提取待測羊的基因組dna；(2)以待測羊的基因組dna為模板，利用權(quán)利要求2中所述的引物對進行pcr擴增；(3)檢測pcr擴增產(chǎn)物，如果擴增序列中，等位基因為c，羊毛較細；等位基因為b，羊毛較粗；所述等位基因c為：在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，第102bp處的堿基為c，第141bp處的堿基為t，第153bp處的堿基為c，第245處的堿基為g，第307處的堿基為g，第366處的堿基為g，第579處的堿基為c；所述等位基因b為：在序列表seqidno.1的核苷酸序列中，第102bp處的堿基為t，第141bp處的堿基為c，第153bp處的堿基為g，第245處的堿基為a，第307處的堿基為a，第366處的堿基為g，第579處的堿基為t。作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述pcr反應使用的擴增體系以15μl計為：1.2mmdnadisk模板1個，1.5μl10×buffer緩沖液，1.5μl5×q溶液，0.6μl2.5mmmgcl2，0.9μl150μmdntps，上下游引物各0.4μl，0.06μl0.5utaq聚合酶和9.64μlddh2o。作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述pcr反應的條件為：94℃預變性2分鐘，94℃變性30秒，61℃退火30s，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，最后延伸5分鐘，4℃保存。作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述檢測pcr擴增產(chǎn)物采用sscp檢測，同時設(shè)置陽性對照，凝膠電泳后染色，得到sscp電泳帶型圖，根據(jù)圖譜中條帶的類型和陽性對照結(jié)果對待測樣本的羊毛細度性狀進行判斷。本發(fā)明還提供含有上述引物對的用于檢測綿羊羊毛細度的試劑盒。作為優(yōu)選，所述試劑盒中還包括pcr反應試劑，所述pcr反應試劑以15μl計為：1.2mmdnadisk模板1個，1.5μl10×buffer緩沖液，1.5μl5×q溶液，0.6μl2.5mmmgcl2，0.9μl150μmdntps，上下游引物各0.4μl，0.06μl0.5utaq聚合酶和9.64μlddh2o。本發(fā)明還提供上述與綿羊羊毛細度相關(guān)的遺傳標記在綿羊分子標記輔助育種中的應用。本發(fā)明以綿羊為研究對象，首先利用生物信息學技術(shù)鑒定綿羊的krtap26-1基因，進而利用pcr-sscp方法研究該基因的核苷酸序列變異和氨基酸特征，最后探討了基因多態(tài)性對綿羊羊毛性狀的影響，以期為綿羊的遺傳改良提供理論基礎(chǔ)和指導。附圖說明附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：圖1為綿羊krtap26-1pcr–sscp檢測帶型結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。實施例11試驗材料1.1樣品來源1.1.1檢測基因多態(tài)性和相關(guān)性樣本美利奴羊(merino)383只。羔羊出生12小時之內(nèi)佩戴耳號并記錄，標注記錄母羊耳號、出生日期、性別、出生等級(羔羊是單羔、雙羔或三胞胎)，同時用fta卡收集每只羔羊的血液樣本，用于后續(xù)基因組dna的試驗分析。1.1.2羊毛相關(guān)性狀的測定于綿羊12月齡時，在綿羊體側(cè)中間位置采集羊毛樣品。羊毛平均纖維直徑(meanfibrediameter，細度)送由新西蘭羊毛檢測有限公司(newzealandwooltestingauthorityltd，ahuriri，napier，nz)測定。1.2試驗主要試劑1.2.1試驗所用主要分子生物學試劑相關(guān)試驗所選用的主要分子生物學試劑見表1。表1試驗所用主要分子生物學試劑1.2.2其它試劑硼酸、tris堿、edta、氫氧化鈉(naoh)、硝酸銀(agno3)、無水乙醇、甲醛、去離子甲酰胺、溴酚藍、二甲苯青、乙酸、過硫酸銨和甘油三酯。1.2.3試驗中主要溶液配方10×tbe：216gtris，110g硼酸，14.8gedta完全溶于2l蒸餾水中，高壓滅菌。1×tbe：滅菌制備的10×tbe與蒸餾水按1：9配置。0.5×tbe：滅菌制備的10×tbe與蒸餾水按1：9配置。1mtris-hcl(ph＝8.0)：tris121.1g，濃鹽酸42ml，滅菌超純水800ml。20mmnaoh溶液：0.8gnaoh溶于600ml蒸餾水中，完全溶解后定容至1000ml，高壓滅菌。1×te(10mmtris-hcl，0.1mmedta)：5ml1mtris-hcl，0.1ml0.5medta，蒸餾水定容至500ml，高壓滅菌備用。10％過硫酸銨溶液：0.1g過硫酸銨溶于1ml蒸餾水中，4℃保存?zhèn)溆谩scp變性緩沖液：980μl去離子甲酰胺，20μl0.5medta，少量二甲苯青和溴酚藍(一般為7-8μl)，充分混勻，4℃保存?zhèn)溆?。固定液?00ml無水乙醇，5ml冰乙酸，溶于蒸餾水中并定容至1000ml，保存?zhèn)溆?。染色液?g硝酸銀溶于1l固定液中，保存至棕色瓶中避光備用。顯色液：30gnaoh溶于1l蒸餾水中，加熱至45℃左右，加入1ml甲醛，現(xiàn)制現(xiàn)用。14％聚丙烯酰胺凝膠(30ml)：10.5ml40％pa溶液，1.5ml10×tbe，160ml10％aps，16mltemed，蒸餾水補至30ml。12％聚丙烯酰胺凝膠(30ml)：9ml40％pa溶液，1.5ml10×tbe，160ml10％aps，16mltemed，蒸餾水補至30ml。10％聚丙烯酰胺凝膠(30ml)：7.5ml40％pa溶液，1.5ml10×tbe，160ml10％aps，16mltemed，蒸餾水補至30ml。1.2.4試驗中主要儀器設(shè)備試驗所用主要相關(guān)儀器見表2。表2試驗所用的主要儀器設(shè)備2試驗方法2.1血液基因組dna提取刺破綿羊耳朵，將血液滴于fta卡上(whatmanbioscience，middlesex，uk)，自然涼干后置于陰涼處保存待用。用于擴增pcr的基因組dna提取采用zhou等所描述的兩步法提取。從fta上打孔取樣(孔徑1.2mm)置于pcr管中，加入200μl20mmnaoh，60℃加熱30min左右(以fta變?yōu)榘咨珵闇?，吸凈管內(nèi)液體，加入200μl1×te，室溫靜置5分鐘，吸凈te液體隔夜后用于相關(guān)基因的pcr擴增。2.2pcr擴增2.2.1pcr引物設(shè)計上游引物：up5’-cagacgacaacctgctcctg-3’下游引物：dn5’-gtctgggatcttcagcgtg-3’。引物由integrateddnatechnologies(coralville,ia,usa)合成。2.2.2pcr擴增體系及條件本試驗中所有基因pcr片段擴增采用15μl體系。包括1.2mmdnadisk模板1個，1.5μl10×buffer緩沖液，1.5μl5×q溶液，0.6μl2.5mmmgcl2，0.9μl150μmdntps，上下游引物各0.4μl，0.06μl0.5utaq聚合酶和9.64μlddh2o。pcr擴增條件：94℃預變性2分鐘，94℃變性30秒，61℃退火30s，72℃延伸30秒，共35個循環(huán)，最后延伸5分鐘，4℃保存。2.2.3pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測將0.3g瓊脂糖溶于30ml1×tbe中，加熱至完全溶解，待冷卻至60-70℃時加入200ng/mleb溶液，配制成1％瓊脂糖凝膠。待瓊脂糖完全凝固后，取2μlpcr產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后將樣品上樣至膠孔內(nèi)，電壓110v電泳15min，結(jié)束后采用紫外凝膠成像儀對pcr擴增產(chǎn)物結(jié)果進行檢測。2.3sscp凝膠分析2.3.1sscp電泳在15μl的pcr產(chǎn)物中加入100μlsscp變性劑(10mmedta、98％甲酰胺、0.025％甲酰胺和0.025％二甲苯青)。將樣品于105℃變性5min后立即置于冰水混合物中冰浴5min，然后將8-10μl變性產(chǎn)物上樣于不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠中，在垂直板電泳槽中加入0.5×tbe對樣品進行電泳。sscp條件：14％聚丙烯酰胺凝膠+1％甘油，32.5℃，290v，19h。2.3.2銀染根據(jù)byun等的方法和步驟對電泳結(jié)束聚丙烯酰胺凝膠銀染。首先將聚丙烯酰胺凝膠置于染色液中染色8min，再用蒸餾水浸泡2min，然后置于顯影液中直至凝膠中的條帶清晰為止，再將凝膠置于固定液中固定2min，將凝膠置于a4紙上并判定基因型，最后用干膠儀干燥后保存。2.4等位基因序列測序等位基因的測序分為兩類：純合型等位基因和雜合型等位基因。若sscp分型判定為純合型的樣本，將該樣本pcr產(chǎn)物純化直接送至林肯大學dna序列分析室(lincolnuniversitydnasequencingfacility)進行測序。若sscp分型為雜合型而所有樣本中都沒有該等位基因的純合型，則根據(jù)gong等描述的方法進行切膠測序。簡而言之，該方法首先切取聚丙烯酰胺凝膠上濃度較高的單條帶，置于1.5mlpcr管中，用60μl蒸餾水沖洗2遍，吸盡蒸餾水后用槍頭將膠研碎，然后加入60μl蒸餾水，置于70℃水浴鍋中水浴2-3h，結(jié)束后置于離心機中離心1min，將上清液作為待測等位基因pcr模板進行pcr擴增，將擴增產(chǎn)物進行sscp檢測確認其為待測帶型，最后將該pcr產(chǎn)物純化后送測序室測序。2.4.1pcr產(chǎn)物純化將所需測序的pcr產(chǎn)物用minelute@pcrpurificationkit純化試劑盒純化后作為測序pcr模板，進行特異上下游單鏈pcr擴增。pcr擴增反應體系見表3。表3測序pcr反應體系pcr反應擴增程序為：95℃預變性2分鐘，95℃變性20秒，50℃退火5秒，60℃延伸3min，共29個循環(huán)，10℃延伸。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析2.5.1核苷酸序列分析利用danman軟件進行引物設(shè)計，比對分析等位基因序列突變位點及氨基酸變異信息；用genbank在線查找變異序列信息及blast功能(http://www.ncbi.nlm.nih.goc/)比對目的片段信息。2.5.2基因頻率和基因型頻率基因頻率指某一等位基因在群體中所有該等位基因所在的特定基因座中所占百分比。設(shè)某一基因有a和b兩個等位基因，其各自的頻率為p和q，計算結(jié)果的統(tǒng)計模型如下：p＝(2x+z)/2nq＝(2y+z)/2np+q＝1其中，x為aa型個體數(shù)，y為bb型個體數(shù)，z為ab型個體數(shù)，n為總樣本數(shù)?；蛐皖l率是指群體中某一基因型所占的百分比?；蛐皖l率＝某一基因型個體數(shù)/所測群體的總數(shù)量。2.6基因變異與羊毛性狀相關(guān)性分析應用mintable(version17，minitabinc.，pennsylavania)一般線性混合效應模型(generallinermixed-effectmodels，glmms)評估特定等位基因的存在/缺失、基因型是否對羊毛性狀存在相關(guān)。在分析基因型對性狀的影響時，只對頻率大于5％的基因型進行分析。所有分析結(jié)果均用“平均值±標準誤”表示，p<0.05為顯著水平，p<0.2為有影響趨勢，p>0.2為無影響。3結(jié)果3.1綿羊krtap26-1多態(tài)性分析3.1.1綿羊krtap26-1變異檢測綿羊krtap26-1共檢測到4種條帶構(gòu)成10種帶型(圖1)。測序表明這些pcr-sscp條帶代表4種不同的核苷酸序列(a、b、c和d)(表4)。將這些序列提交至ncbi獲得以下序列號：kx644903-644906。序列比對發(fā)現(xiàn)有7個snps。所有snp均位于編碼區(qū)，其中2個為非同義突變。圖1為綿羊krtap26-1pcr–sscp檢測帶型結(jié)果。表4綿羊krtap26-1序列變異當?shù)任换驗楸?中的a時，擴增片段的核苷酸序列為：cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaactacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgtcgcctcctccgtcggcctctacactccgagtgtgagcgtaggagatggtctctgcttgcccagcagctgtcaggaccgaacctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagccaactgcgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgccaagacccagccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctctcagtgtcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctcccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtgtccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtgttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggcctgtagcttctttattccgggcaatgatcacgctgaagatcccagac當?shù)任换驗楸?中的b時，擴增片段的核苷酸序列為：cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaactacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgttgcctcctccgtcggcctctacactccgagtgtgagcgtcggagatggtctgtgcttgcccagcagctgtcaggaccgaacctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagccaactacgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgccaagacccagccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctctcagtgtcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctcccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtgtccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtgttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggtctgtagcttctttattccgggcaatgatcacgctgaagatcccagac當?shù)任换驗楸?中的c時，擴增片段的核苷酸序列為：cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaactacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgtcgcctcctccgtcggcctctacactccgagtgtgagcgttggagatggtctctgcttgcccagcagctgtcaggaccgaacctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagccaactgcgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgccaagacccggccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctctcagtgtcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctcccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtgtccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtgttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggcctgtagcttctttattccgggcaatgatcacgctgaagatcccagac當?shù)任换驗楸?中的d時，擴增片段的核苷酸序列為：cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaactacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgtcgcctcctccgtcggcctctacactccgagtgtgagcgtaggagatggtctctgcttgcccagcagctgtcaggaccgaacctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagccaactgcgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgccaagacccagccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctctcagtatcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctcccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtgtccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtgttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggcctgtagcttctttattccgggcaatgatcacgctgaagatcccagac其中，下劃線標注部分為等位基因中發(fā)生的snps。3.2krtap26-1基因多態(tài)性與羊毛性狀的相關(guān)性在美利奴雜種羊群體中，共檢測到krtap26-1基因的4種等位基因，等位基因d在群體中的比例很低，不能進行相關(guān)型分析。故只對其余3個等位基因進行相關(guān)性分析。在缺失/存在模型中，等位基因b存在時，細度會提高，但將等位基因c引入分析時，b對這些性狀的影響減弱，但是對細度(p＝0.081)影響趨勢依舊明顯。在等位基因存在缺失分析中，等位基因c存在會引起細度降低，多變量模型分析時，對細度的影響依舊存在。對五種頻率較高的基因型(aa、ab、ac、bb和bc)與羊毛性狀進行相關(guān)性分析?；蛐蜑閍b和bb的羔羊細度比ac和bc的高5.8％至11.2％(p<0.01)。詳見表5。表54krtap26-1等位基因缺失存在對羊毛細度的影響表6krtap26-1基因型對羊毛細度的影響4討論在美利奴雜種羊群體中，krtap26-1檢測到7個snps形成的4個等位基因。在這7個snps中，有2個為非同義突變引起了氨基酸的改變，分別是b:c.245g/a(p.72c/y)和c:c.307a/g(p.93s/g)。等位基因b引起了半胱氨酸的數(shù)量改變，這可能影響該蛋白與中間纖維或其它kap蛋白的交聯(lián)。等位基因c引起了絲氨酸的數(shù)量改變，進而可能影響該蛋白的磷酸化。這些突變引起的氨基酸的改變可能最終影響羊毛的特性。綿羊krtap26-1的變異與細度相關(guān)，并且基因缺失存在模型分析結(jié)果與基因型分析結(jié)果一致。從分析結(jié)果來看，含有等位基因c的綿羊其羊毛質(zhì)量較其它綿羊的更好，這些綿羊的細度較低。等位基因b對羊毛性狀的影響與等位基因c相反，含有等位基因b的綿羊表現(xiàn)為較高的細度，而含有等位基因a的綿羊其性狀介于等位基因b和c之間。5結(jié)論綿羊krtap26-1檢測到7個snps形成的4個等位基因，有2個為非同義突變引起了氨基酸的改變。綿羊krtap26-1的變異與細度相關(guān)。含有等位基因c的綿羊表現(xiàn)為較低的細度。含有等位基因b的綿羊表現(xiàn)為較高的細度。提示，在育種工作中，若提高等位基因c和降低b在綿羊群體中的含量，可改良細度相關(guān)性狀。實施例2綿羊羊毛細度檢測試劑盒，包括：1、引物對：上游引物：up5’-cagacgacaacctgctcctg-3’；下游引物：dn5’-gtctgggatcttcagcgtg-3’。2、pcr檢測試劑pcr擴增采用15μl體系。包括1.2mmdnadisk模板1個，1.5μl10×buffer緩沖液，1.5μl5×q溶液，0.6μl2.5mmmgcl2，0.9μl150μmdntps，上下游引物各0.4μl，0.06μl0.5utaq聚合酶和9.64μlddh2o。3、陽性對照陽性對照a：其核苷酸序列為序列表seqidno.1；陽性對照b：其核苷酸序列為序列表seqidno.2；陽性對照c：其核苷酸序列為序列表seqidno.3；陽性對照d：其核苷酸序列為序列表seqidno.4。4、sscp工作試劑：包括sscp變性劑和顯影液等。該試劑盒的使用方法參照實施例1。最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。序列表<110>甘肅農(nóng)業(yè)大學<120>與綿羊羊毛細度相關(guān)的遺傳標記及其應用<170>patentinversion3.5<210>1<211>626<212>dna<213>綿羊krtap26-1的等位基因a<400>1cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaac60tacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgtcgcctcctccgtcggcctc120tacactccgagtgtgagcgtaggagatggtctctgcttgcccagcagctgtcaggaccga180acctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagcc240aactgcgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgcca300agacccagccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctc360tcagtgtcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctc420ccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtg480tccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtg540ttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggcctgtagcttctttattccggg600caatgatcacgctgaagatcccagac626<210>2<211>626<212>dna<213>綿羊krtap26-1的等位基因b<400>2cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaac60tacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgttgcctcctccgtcggcctc120tacactccgagtgtgagcgtcggagatggtctgtgcttgcccagcagctgtcaggaccga180acctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagcc240aactacgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgcca300agacccagccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctc360tcagtgtcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctc420ccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtg480tccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtg540ttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggtctgtagcttctttattccggg600caatgatcacgctgaagatcccagac626<210>3<211>626<212>dna<213>綿羊krtap26-1的等位基因c<400>3cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaac60tacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgtcgcctcctccgtcggcctc120tacactccgagtgtgagcgttggagatggtctctgcttgcccagcagctgtcaggaccga180acctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagcc240aactgcgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgcca300agacccggccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctc360tcagtgtcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctc420ccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtg480tccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtg540ttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggcctgtagcttctttattccggg600caatgatcacgctgaagatcccagac626<210>4<211>626<212>dna<213>綿羊krtap26-1的等位基因d<400>4cagacgacaacctgctcctgaaacctcaccatgtcttgccacaactactgctccggaaac60tacaccttggggtctctcaggagtccctgtcacattcccgtcgcctcctccgtcggcctc120tacactccgagtgtgagcgtaggagatggtctctgcttgcccagcagctgtcaggaccga180acctggatcctgagcaatggccaggagacctgcagtgaacctaccagctgccagccagcc240aactgcgagcccagcagctgtgaaacttccagctacccttcttctggttgctatgtgcca300agacccagccaaggaacgagttttcttcccgcttcttcttacctctctggatcctgcctc360tcagtatcttatagaccgctggcctatgtgtccagcagctcgcgacccttgagccttctc420ccttgtggatatcgcccctcgggttctttgccctgtggtcttcaacccatcagcattgtg480tccagcggcctcagacctctacgccctgtcttcagtggatgccaaactctgccttatgtg540ttcagtccttaccgtccatcttactctacctgcggaggcctgtagcttctttattccggg600caatgatcacgctgaagatcccagac626當前第1頁12當前第1頁12