本發(fā)明屬于地質(zhì)勘探領(lǐng)域，具體涉及一種根據(jù)丁烷氧化菌確定候選勘探區(qū)和候選井位的技術(shù)。特別涉及一種將微生物培養(yǎng)結(jié)果和微生物分子檢測技術(shù)相結(jié)合勘探油氣資源的方法。

背景技術(shù)：

油氣微生物勘探法源于前蘇聯(lián)。早在1937年，前蘇聯(lián)地質(zhì)微生物學(xué)家mogilewskii發(fā)現(xiàn)由于細菌繁殖引起的近地表土壤中烴氣發(fā)生季節(jié)性的變化，進而提出了石油和天然氣的微生物勘探方法，并在實踐中運用甲烷氧化菌作為地下氣藏的指示菌。50年代晚期，美國地質(zhì)微生物學(xué)家hitzman博士為phillips石油公司開發(fā)了一種油氣微生物勘測技術(shù)most(microbialoilsurveytechnique)技術(shù)。該技術(shù)利用丁烷氧化菌的高丁醇的特性來探測烴微滲漏現(xiàn)象。自1956年以來，德國m.wagner博士獨立地開發(fā)了一項新型的地表勘探技術(shù)—油氣微生物勘探技術(shù)mpog(microbialprospectionforoilandgas)，該技術(shù)利用甲烷氧化菌和丁烷氧化菌來探測烴微滲漏現(xiàn)象。90年代初，該技術(shù)應(yīng)用開始從西北歐陸地拓展到北海區(qū)域內(nèi)。到90年代末期，mpog技術(shù)的物理-化學(xué)和微生物學(xué)理論基礎(chǔ)、方法技術(shù)和應(yīng)用進入成熟階段，形成了現(xiàn)代油氣微生物勘探技術(shù)。我國從1955年開始，由中國科學(xué)院菌種保藏委員會(微生物研究所前身之一)與石油工業(yè)部合作進行了氣態(tài)烴氧化菌和油氣田微生物學(xué)勘探法的研究。

油氣微生物勘探技術(shù)經(jīng)歷了半個多世紀(jì)的發(fā)展，進行了大量的現(xiàn)場應(yīng)用，取得了很好的應(yīng)用效果，在提供烴富集的直接證據(jù)方面，展示出了其他技術(shù)不具備的優(yōu)勢，已經(jīng)成為一項被廣泛認可的油氣勘探技術(shù)。

現(xiàn)有的油氣微生物勘探技術(shù)，主要包括以下幾種：

1.微生物石油調(diào)查技術(shù)(microbialoilsurveytechnology，most)：由美國hitzman博士開發(fā)(hitzmando.prospectingforpetroleumdeposits:unitedstatespatent.1959,2,880142)。該技術(shù)使用選擇性培養(yǎng)基作為烴氧化菌檢測計數(shù)培養(yǎng)基，這種選擇性培養(yǎng)基只有烴氧化菌才能在其中生長，對非烴氧化菌具有毒害和抑制作用，所以克服了微生物的馴化這一干擾，得到的結(jié)果相對更為可靠。該技術(shù)主要在常規(guī)微生物培養(yǎng)方法上進行了一定的改進，使得培養(yǎng)出來的烴氧化菌的數(shù)值更為可靠。

2.油氣微生物勘探技術(shù)mpog(microbialprospectionforoilandgas，mpog)：德國wanger博士開發(fā)，其檢測方法主要以微生物細胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)(wagnermanfred,wagnermartin,joachimpiske,etal.casehistoriesofmicrobialprospectionforoilandgasonshoreandoffshoreinnorth-westeurope//schumacherd,leschackla.aapgstudiesingeology,surfaceexplorationcasehistories:applicationsofgeochemistry,magnetic,andremotesensing.tulsa,ok:aapg,2002,48:453-479)。2000年，長江大學(xué)將該技術(shù)引入至中國，在華北油田做了先導(dǎo)性試驗。在中國實踐的mpog技術(shù)的檢測方法主要為：利用氣態(tài)烷烴作為碳源對烴氧化菌進行培養(yǎng)計數(shù)，并綜合一些其他指標(biāo)最后得出烴氧化菌的評價指標(biāo)——mu值(measurementunit)。

3.微生物地球化學(xué)勘探技術(shù)(mgce)，由盎億泰地質(zhì)微生物技術(shù)(北京)有限公司開發(fā)(郝純等.微生物地球化學(xué)勘探技術(shù)及其在南海深水勘探中的應(yīng)用.中國石油勘探,2015,20(5):54-61)。該技術(shù)是在most檢測基礎(chǔ)上進行了一些調(diào)整，也是基于微生物細胞培養(yǎng)方法的檢測實現(xiàn)的。

4.丁烷氧化菌定量技術(shù)(cn201510400854.3)：以丁烷氧化菌的總菌和活菌異常為指標(biāo)進行石油勘探、油藏表征和異常判識的方法，通過定量檢測石油勘探區(qū)和/或油藏區(qū)上方表層土壤和/或沉積物中丁烷氧化菌的總菌和活菌來獲得丁烷氧化菌的總菌數(shù)量，或同時獲得丁烷氧化菌的總菌異常和活菌數(shù)量。

現(xiàn)有的油氣微生物勘探技術(shù)以單一的微生物培養(yǎng)技術(shù)或微生物分子定量技術(shù)為主，通過相對定量或者部分絕對定量某一類烴氧化菌的檢測形式，實現(xiàn)對微生物異常的識別。

具體而言，微生物培養(yǎng)技術(shù)雖然相對成熟，但信息量低，分辨率有限，不能完全反映微生物對烴富集的響應(yīng)過程和響應(yīng)程度，難以真實反應(yīng)該區(qū)域的烴氧化菌的數(shù)量；另外，在相等微生物異常區(qū)域面積大小或菌落群數(shù)相等情況下，無法區(qū)進一步區(qū)分兩個相同微生物異常區(qū)域的等級和優(yōu)劣。分子定量技術(shù)雖然在檢測精度上有較大提升，但不能真實的反應(yīng)所有烴烷氧化菌的狀況，難以全面評估微生物對烴滲漏的響應(yīng)特征；另外，分子定量技術(shù)成本高，大規(guī)模采樣實施推廣難度較大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明將微生物對低級烷烴滲漏響應(yīng)特性和分子檢測手段相結(jié)合，提供一種烴氧化菌覆蓋面廣、兼顧微生物可培養(yǎng)性和分子標(biāo)記、成本可控、定位準(zhǔn)確的油氣資源勘探方法。

具體而言，本發(fā)明提供一種油氣微生物勘探方法，其特征在于包括以下步驟：其包括：(1)設(shè)計采樣點平面矩陣；(2)采集樣品；(3)微生物培養(yǎng)法檢測丁烷氧化菌含量；(4)熒光定量pcr檢測低級烴氧化菌含量；(5)選擇候選勘探區(qū)；(6)確定候選井位。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于包括：

(1)在勘探區(qū)內(nèi)設(shè)置采樣點平面矩陣，結(jié)合勘探區(qū)地形和平面矩陣確定采樣點的坐標(biāo)；

(2)采集樣品，樣品的采樣量為10-100g，采樣深度為20-60cm，所采集的樣品在0至-20℃保存和運輸；

(3)利用選擇性培養(yǎng)基通過微生物培養(yǎng)法檢測丁烷氧化菌的含量，繪制等值線，確定丁烷氧化菌培養(yǎng)異常區(qū)；

(4)對丁烷氧化菌培養(yǎng)異常區(qū)的樣本進行實時熒光定量pcr檢測，所述實時熒光定量pcr針對低級烴氧化菌特異性保守區(qū)進行檢測，所述低級烴氧化菌包括甲烷氧化菌、乙烷氧化菌和丙烷氧化菌；

(5)根據(jù)實時熒光定量pcr的結(jié)果，選擇候選勘探區(qū)；

(6)在微生物培養(yǎng)結(jié)果、熒光定量pcr結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合地表溫度、土壤巖性、土壤ph值、土壤鹽度、地表植被等因素，確定井位候選點。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于步驟(1)中勘探區(qū)域內(nèi)平面矩陣的網(wǎng)格密度為200-500m×100-250m。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于步驟(2)中樣品采樣量為50g，采樣深度為40cm，所采集的樣品在-20℃保存和運輸。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于步驟(3)中通過選擇培養(yǎng)法檢測丁烷氧化菌的含量，先采用以丁烷為唯一碳源的液體培養(yǎng)基進行富集，再以丁醇為唯一碳源的固體平板通過平板稀釋法檢測樣本中丁烷氧化菌的含量。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于所述以丁烷為唯一碳源的富集方法如下：在無菌操作臺上稱取1g土壤樣品置于盛有50ml液體培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，向培養(yǎng)基液面以下充入丁烷氣使培養(yǎng)液中丁烷氣達到飽和，并使三角瓶中的氣體空間充滿丁烷氣，封口，180rpm28℃震蕩培養(yǎng)7d。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于所述以丁醇為唯一碳源的固體平板中含有5％的丁醇作為碳源。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中包括k2hpo41.75g，kh2po40.96g，nano32.0g，mgcl20.1g，(nh4)2so40.1g，微量元素0.2ml，ph為7.2；其中每升微量元素中含有cacl25.54g，zncl25.3g，mncl25.06g，feso44.99g，(nh4)6mo7o241.10g，cuso41.57g，cocl21.61g。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于步驟(4)中熒光定量pcr檢測針對的靶基因為低級烷氧化酶基因。

本發(fā)明所述油氣微生物勘探方法，其特征在于檢索genbank數(shù)據(jù)庫中各低級烴氧化菌中低級烷氧化酶基因序列，進行多重比對，針對保守區(qū)序列設(shè)計熒光定量pcr引物。

本發(fā)明所述低級烷氧化酶基因包括烷烴單加氧酶基因、烷烴雙加氧酶基因，所述烷烴單加氧酶基因甲烷單加氧酶基因、乙烷單加氧酶基因、丙烷單加氧酶基因。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得了以下有益的技術(shù)效果：

(1)信息量全面。傳統(tǒng)的微生物細胞培養(yǎng)方法只是對可培養(yǎng)烴氧化菌的半定量，而分子生物學(xué)檢測方法是在分子級別對代謝低級烷烴的基因進行定量的技術(shù)。微生物培養(yǎng)和分子檢測相結(jié)合，檢測范圍不僅包括了通過微生物培養(yǎng)方法獲得烴氧化菌菌種庫，而且還包括了相關(guān)文獻提到的功能基因，因此在信息量方面更加全面，從而提高了油氣勘探區(qū)及候選井位的精度和準(zhǔn)確度。

(2)涉及了幾乎所有的可揮發(fā)性烷烴。本申請的勘探方法不僅考慮單一功能的丁烷氧化菌或甲烷氧化菌。微生物培養(yǎng)法涉及對丁烷的響應(yīng)，分子檢測法涉及對其它可揮發(fā)性低級烷烴的響應(yīng)。另外，本發(fā)明微生物培養(yǎng)法采用了丁烷富集、丁醇檢測，相較于現(xiàn)有的丁烷培養(yǎng)法或丁醇培養(yǎng)法，即確保了微生物對丁烷的響應(yīng)，又方便了固體平板檢測。

(3)分階段定位，實現(xiàn)了微生物培養(yǎng)法和分子檢測方法的優(yōu)勢互補。首先利用微生物培養(yǎng)方法對工區(qū)內(nèi)丁烷氧化菌豐度進行判別，識別出微生物異常發(fā)育的構(gòu)造，然后對識別出的微生物異常用分子檢測技術(shù)對烴氧化菌的絕對數(shù)量進行精確定量。這種分批分指標(biāo)的檢測方式，大幅度減少了分子檢測的樣品量，在滿足檢測精度和檢測信息量的基礎(chǔ)上降低了檢測成本。

附圖說明

圖1：勘探區(qū)采樣平面矩陣設(shè)計圖。

圖2：微生物培養(yǎng)法獲得的丁烷氧化菌評價指標(biāo)等值線圖。

圖3：常規(guī)微生物培養(yǎng)法鑒定的三個微生物培養(yǎng)異常區(qū)。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例

針對一個陸域勘探新區(qū)。主要的地質(zhì)任務(wù)：在前期地質(zhì)勘探的基礎(chǔ)上，對識別出的有利圈閉應(yīng)用微生物油氣勘探技術(shù)進行含油氣性評價，優(yōu)選勘探目標(biāo)，充分發(fā)揮綜合勘探的優(yōu)勢，對勘探目標(biāo)進行鉆前風(fēng)險評估，為預(yù)探井的井位優(yōu)選和布設(shè)，發(fā)現(xiàn)油氣藏提供可靠依據(jù)，并為圈閉勘探后期的評價井部署、油氣藏擴展和滾動勘探提供技術(shù)支撐。具體的操作步如下：

1.方案設(shè)計：本工區(qū)以勘探區(qū)域地質(zhì)背景及前期研究成果為基礎(chǔ)，針對勘探現(xiàn)狀中存在的問題和難點進行技術(shù)服務(wù)方案定制。本工區(qū)為圈閉勘探，根據(jù)識別出的不同層位的圈閉設(shè)計樣點間距，確定的網(wǎng)格密度為200-500m×100-250m。采樣點195個。平面矩陣設(shè)計圖如圖1所示。

2.根據(jù)設(shè)計方案，測繪人員計算出各個站點的坐標(biāo)。

3.根據(jù)勘探區(qū)域的地表特征及人類活動情況，確定樣品的采集深度。確定的采樣深度40cm。

4.根據(jù)需要檢測的指標(biāo)確定樣品的采集量。確定的采樣量為10g。

5.根據(jù)需要檢測的指標(biāo)確定樣品的保存和運輸方式，將樣品-20℃保存，冷藏運輸。

6.用常規(guī)微生物細胞培養(yǎng)法通過貧營養(yǎng)的培養(yǎng)基檢測丁烷氧化菌的總量，得出丁烷氧化菌的評價指標(biāo)。具體而言，先采用以丁烷為唯一碳源的液體培養(yǎng)基進行富集，再以丁醇為唯一碳源的固體平板通過平板稀釋法檢測樣本中丁烷氧化菌的含量。具體數(shù)據(jù)見表1。

以丁烷為唯一碳源的富集方法如下：在無菌操作臺上稱取1g土壤樣品置于盛有50ml液體培養(yǎng)基的150ml三角瓶中，向培養(yǎng)基液面以下充入丁烷氣使培養(yǎng)液中丁烷氣達到飽和，并使三角瓶中的氣體空間充滿丁烷氣，封口，180rpm28℃震蕩培養(yǎng)7d。

以丁醇為唯一碳源的固體平板中含有5％的丁醇作為碳源。

所述貧營養(yǎng)的培養(yǎng)基中包括k2hpo41.75g，kh2po40.96g，nano32.0g，mgcl20.1g，(nh4)2so40.1g，微量元素0.2ml，ph為7.2；其中每升微量元素中含有cacl25.54g，zncl25.3g，mncl25.06g，feso44.99g，(nh4)6mo7o241.10g，cuso41.57g，cocl21.61g。

7.將獲得的丁烷氧化菌的評價指標(biāo)與采樣點坐標(biāo)繪在地質(zhì)圖上，并用地質(zhì)軟件繪制成等值線，初步判別微生物異常。見圖2。

8.在常規(guī)微生物培養(yǎng)方法中識別出了三個異常區(qū)，分別為ⅰ號異常區(qū)，ⅱ號異常區(qū)，ⅲ號異常區(qū)。見圖3。

9.在ⅰ號異常區(qū)，ⅱ號異常區(qū)，ⅲ號異常區(qū)的樣品進行熒光定量pcr檢測，對烴氧化菌的絕對數(shù)量進行精確定量。

檢索genbank數(shù)據(jù)庫中各低級烴氧化菌中低級烷氧化酶基因序列，進行多重比對，針對保守區(qū)序列設(shè)計熒光定量pcr引物，采用sybrgreeni熒光染料進行定量。設(shè)計并合成的引物序列如下：

p1：5’-ggngactgggacttctgg-3’

p2:5’-ccggmgcaacgtcyttacc-3’

對于ⅰ號異常區(qū)內(nèi)異常點14個，ⅱ號異常區(qū)異常點19個，ⅲ號異常區(qū)異常點7個，共對40個樣品進行熒光定量pcr檢測。數(shù)據(jù)表見表2。

10.結(jié)合微生物，地球物理和石油地質(zhì)等資料，多學(xué)科、多領(lǐng)域的技術(shù)研究表明，三個異常區(qū)的微生物異常評級為ⅰ號異常區(qū)>ⅱ號異常區(qū)>ⅲ號異常區(qū)。

這種綜合評價方法，能夠?qū)崿F(xiàn)微生物異常構(gòu)造的高分辨率微生物勘探評價，為圈閉優(yōu)選和井位建議提供有效支撐。

表1：平面矩陣中各點位的丁烷氧化菌評價指標(biāo)

表2：三個異常區(qū)內(nèi)各點位分子定量檢測結(jié)果

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。