本發(fā)明涉及生物化學(xué)檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定方法。
背景技術(shù)：
：計量是實現(xiàn)單位統(tǒng)一、量值準(zhǔn)確可靠的活動，研究建立高準(zhǔn)確度的測量方法是計量學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。基準(zhǔn)測量方法是一種具有最高計量學(xué)品質(zhì)的測量方法，其操作可以被完全地描述和理解，最終不確定度可以用si單位表述，測量結(jié)果不依賴被測量的測量標(biāo)準(zhǔn)?；鶞?zhǔn)方法是形成量值源頭的依據(jù)。隨著生命科學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)已經(jīng)經(jīng)歷了從“描述生物學(xué)”向“實驗生物學(xué)”再向“創(chuàng)造生物學(xué)”發(fā)展的過程，當(dāng)今的生物學(xué)已經(jīng)成為精準(zhǔn)定量的科學(xué)。沒有對生命體各類生命現(xiàn)象的精確測量，便難以對生命過程進(jìn)行全方位的調(diào)控與干預(yù)。蛋白質(zhì)作為一類重要的生物大分子，是生命活動的主要承擔(dān)者，在體內(nèi)各個生命活動如營養(yǎng)代謝、酶催化、激素、免疫、遺傳、變異等過程中均離不開蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮。鑒于蛋白質(zhì)生物體內(nèi)的重要作用，它已經(jīng)成為眾多領(lǐng)域的檢測靶標(biāo)。例如在體外診斷中，常見的體外診斷項目中有一半以上檢測對象為蛋白質(zhì)；在食品安全中，160多種食品含有可以導(dǎo)致過敏反應(yīng)的食品過敏原，其中大于90％的過敏原都是蛋白質(zhì)，根據(jù)國內(nèi)食品標(biāo)簽標(biāo)識管理規(guī)定，相應(yīng)的蛋白質(zhì)過敏原均應(yīng)被檢測并被標(biāo)識；在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，目前已經(jīng)批準(zhǔn)150多個蛋白質(zhì)藥物上市，400多種蛋白質(zhì)藥物處于臨床研究階段，3000多種處于臨床前研究階段。不論是體外診斷，還是食品安全與用藥安全，這些都關(guān)乎大眾健康與國計民生，相關(guān)領(lǐng)域蛋白質(zhì)檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可比則是保證大眾健康與安全的基石。通過建立量值溯源傳遞體系來保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確一致已經(jīng)成為共識，是計量界的通行做法并在傳統(tǒng)的物理計量與化學(xué)計量領(lǐng)域得到廣泛和成功的應(yīng)用。量值溯源傳遞體系的建立一是要有量值的源頭，二是要有量值傳遞方法，尤其是要有具有較高測量準(zhǔn)確度的“基標(biāo)準(zhǔn)”方法，才能保證國家基準(zhǔn)復(fù)現(xiàn)的量值能夠準(zhǔn)確的傳遞到下一級的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或工作計量器具上。高準(zhǔn)確度量值傳遞方法的缺乏將導(dǎo)致即使國家基準(zhǔn)能夠復(fù)現(xiàn)出量值，也無法準(zhǔn)確的傳遞下去，從而使得保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可比成為空談。因此，高準(zhǔn)確度的計量方法研究在計量及量值溯源傳遞中具有舉足輕重的作用。蛋白質(zhì)含量是蛋白質(zhì)的基本屬性，它描述了被定義的“蛋白質(zhì)分子”數(shù)量的多少，是蛋白質(zhì)測量的基本量值，在各類蛋白質(zhì)檢測項目中占到了80％以上。因此，要保證蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可比，必須研究建立高準(zhǔn)確度的蛋白質(zhì)含量計量方法，才能實現(xiàn)蛋白質(zhì)量值的準(zhǔn)確傳遞，從而達(dá)到檢測結(jié)果準(zhǔn)確可比、實現(xiàn)檢測結(jié)果的互通與互認(rèn)、保證貿(mào)易公平、保護(hù)人民大眾健康的目的。蛋白質(zhì)含量測量方法按照測量準(zhǔn)確度可以分為常規(guī)測量方法和高準(zhǔn)確度的計量(潛)基準(zhǔn)測量方法，常用的計量(潛)基準(zhǔn)方法包括同位素稀釋質(zhì)譜法、質(zhì)量平衡法和定量核磁法。按照測量原理可以分為滴定法、光譜法、色譜法、質(zhì)譜法、電泳法、波譜法、綜合法等，例如，常用的凱氏定氮、微量凱氏定氮等屬于滴定法；雙縮脲法、folin-酚法(lowry法)、考馬斯亮藍(lán)法等屬于比色光譜法。按照測量過程中是否需要上一級標(biāo)準(zhǔn)，可以分為蛋白質(zhì)含量絕對測量方法和相對測量方法兩類。蛋白質(zhì)含量絕對測量方法在測量過程中不需要同樣的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，而相對測量方法在測量過程中需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或者通過括弧法或單點(diǎn)法進(jìn)行定量。質(zhì)量平衡法、定量核磁法、凱氏定氮法屬于絕對測量方法，而同位素稀釋質(zhì)譜法、液相色譜法、比色法等大多數(shù)蛋白質(zhì)含量測量方法都屬于相對測量方法。idms是應(yīng)用穩(wěn)定同位素進(jìn)行化學(xué)分析的一種方法，在測定蛋白質(zhì)含量時，該方法將一定量的同位素標(biāo)記化合物添加到樣品中，這些同位素標(biāo)記化合物可以是同位素標(biāo)記的元素、氨基酸、肽段或蛋白質(zhì)。待同位素與樣品混合均勻后進(jìn)行水解或酶解的操作，再通過質(zhì)譜技術(shù)檢測反應(yīng)后非標(biāo)記物和標(biāo)記物的比例，由此對蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。由于該方法所采用的內(nèi)標(biāo)物與待測物具有幾乎相同的物理化學(xué)性質(zhì)，在分離和分析過程中始終在一起，因此能夠消除掉前處理過程和分析過程中的系統(tǒng)誤差。通過對非標(biāo)記物和標(biāo)記物比例的精確測量及所加入稀釋劑的準(zhǔn)確稱量，有效地保證了高精度和高準(zhǔn)確度。一旦稀釋劑與樣品反應(yīng)平衡，同位素比值恒定，在保證測量操作正確的情況下檢測結(jié)果很難受到影響，具有很高的穩(wěn)定性。而高靈敏度的質(zhì)譜可以提高idms的檢測水平，進(jìn)行微量、痕量以及超痕量的分析。質(zhì)量平衡法(massbalancemethod)是一種高純固體蛋白含量絕對測量方法，其測量結(jié)果具有很小的不確定度。它將主成分的含量作為1，然后采用各種技術(shù)對其中含有的無機(jī)成分、有機(jī)雜質(zhì)、揮發(fā)性成分、水分等逐一進(jìn)行測定并扣除，從而對物質(zhì)進(jìn)行絕對定量。該方法在有機(jī)高純小分子的純度測定中應(yīng)用廣泛，在蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量中，僅用于肽段或小蛋白的測定，總的來說，由于蛋白質(zhì)組成復(fù)雜，該方法在蛋白質(zhì)含量準(zhǔn)確測定中的應(yīng)用還十分有限。定量核磁共振技術(shù)(qnmr)是近些年提出的在核磁共振技術(shù)的基礎(chǔ)上，向樣品中加入定量已知的標(biāo)記物，后根據(jù)被測物的分子量、選定的定量積分信號以及產(chǎn)生該信號的質(zhì)子數(shù)，代入計算公式邊可以定量研究。此外，作為新型的定量技術(shù)，qnmr有分析速度快、預(yù)處理簡單等特點(diǎn)。受到譜峰重疊的干擾，定量核磁技術(shù)也只能用于小的肽段或蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量。上述這些方法在進(jìn)行蛋白質(zhì)定量時，同樣需要使用一種化學(xué)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來做標(biāo)準(zhǔn)，其量值不是直接溯源到si單位的；同時，上述測定方法蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果是基于其一級序列的蛋白質(zhì)濃度，不能反映出蛋白質(zhì)的活性；另外，同位素稀釋質(zhì)譜測定過程中需要將蛋白質(zhì)分解成小分子如氨基酸或者肽段以后進(jìn)行測定，在水解或者酶解過程中，可能引入一定的不確定度。因此，建立一種能夠不依賴任何標(biāo)準(zhǔn)品直接對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量的基準(zhǔn)方法，尤其是能夠直接測定蛋白質(zhì)活性濃度的基準(zhǔn)方法是十分必要和迫切的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明建立了一種采用數(shù)字pcr技術(shù)對蛋白質(zhì)活性濃度進(jìn)行直接測定的基準(zhǔn)技術(shù)，在測定過程中不必依賴任何標(biāo)準(zhǔn)品，測定結(jié)果為能夠與抗體結(jié)合的免疫活性濃度，同時測定結(jié)果可以直接溯源到si單位，符合計量基準(zhǔn)方法的定義。一種基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，包括如下步驟：(1)準(zhǔn)備待測目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體，如果是多克隆抗體，準(zhǔn)備一種即可；如果是單克隆抗體，需要準(zhǔn)備針對不同表位的兩種單克隆抗體；(2)將獲得的抗體用生物素進(jìn)行標(biāo)記；(3)合成三段單鏈寡聚核苷酸，其中兩段寡聚核苷酸連接后可與第三段形成具有100～200bp的互補(bǔ)序列，可形成雙鏈dna；(4)分別將兩段寡聚核苷酸的5’端和3’端用親和素進(jìn)行標(biāo)記；(5)針對寡聚核苷酸形成的雙鏈片段，設(shè)計taqman探針和對應(yīng)的引物；(6)利用生物素-親和素之間的放大親和反應(yīng)，用寡聚核苷酸標(biāo)記抗體；如果采用的是多克隆抗體，將多克隆抗體分成兩個部分，每個部分分別與一種寡聚核苷酸混合，形成兩種寡聚核苷酸標(biāo)記的多克隆抗體；如果是單克隆抗體，每種單克隆抗體分別與一種寡聚核苷酸混合，形成兩種寡聚核苷酸標(biāo)記的單克隆抗體；(7)將待測目標(biāo)蛋白用緩沖溶液稀釋至5000分子/μl以下的濃度，在其中加入寡聚核酸標(biāo)記的兩種抗體、第三條寡聚核酸片段及dna連接酶，形成抗原-抗體復(fù)合物；然后在其中加入擴(kuò)增緩沖液、4種dntp混合物、抗原-抗體復(fù)合物、taqman探針及引物、taqdna聚合酶、mg2+，進(jìn)行數(shù)字pcr擴(kuò)增反應(yīng)，得到的拷貝數(shù)記為濃度c0；(8)在(7)的條件下，除了目標(biāo)蛋白溶液用雙蒸水替代，其它條件與(7)的條件一致，再次進(jìn)行數(shù)字pcr擴(kuò)增反應(yīng)，得到的拷貝數(shù)記為c1；(9)待測目標(biāo)蛋白的濃度為c0-c1，單位為分子數(shù)/μl；如果需要，將分子數(shù)濃度除以阿伏伽德羅常數(shù)后即得到摩爾濃度。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(1)中：所用抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體；所用抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有一定的親和性和特異性；當(dāng)選用的抗體是單克隆抗體時，需要兩種針對兩個不同表位的單克隆抗體，且兩個表位在空間上應(yīng)當(dāng)相距一定的距離，不能存在空間位阻；當(dāng)選用的抗體是多克隆抗體時，只需要一種即可。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(2)中：用生物素標(biāo)記抗體，可以自行標(biāo)記，也可以選用商品化的生物素抗體標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(3)中：單鏈寡聚核酸可形成200bp以下的雙鏈dna結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)不進(jìn)一步形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)；也可以選擇商品化的試劑盒作為標(biāo)記用的寡聚核苷酸標(biāo)記探針。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(4)中：親和素標(biāo)記寡聚核苷酸，可以自行標(biāo)記；也可以選用商品化的試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(5)中：設(shè)計taqman探針和引物，根據(jù)兩個單鏈dna形成的雙鏈dna片段，采用軟件設(shè)計該區(qū)間擴(kuò)增所用的taqman探針和引物，其中引物的設(shè)計應(yīng)當(dāng)遵循下面的原則：(1)引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性；(2)擴(kuò)增產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)；(3)引物長度一般在15～30堿基之間；(4)g+c含量在40％～60％之間；(5)堿基要隨機(jī)分布；(6)引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)；(7)引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)；(8)引物5′端可以修飾；(9)引物3′端不可修飾；(10)引物3′端要避開密碼子的第3位；taqman探針的設(shè)計遵循以下原則：(1)探針的長度25～32bp之間，且tm值在68～72℃之間，最好為70℃，確保探針的tm值要比引物的tm值高出10℃，保證探針在煺火時先于引物與目的片段結(jié)合；(2)探針的tm值可用oligo或primerpreiemer軟件計算，確保探針中g(shù)c含量在30～-80％，應(yīng)避免探針中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個或超過4個的g堿基出現(xiàn)；(3)探針的5’端不能為g，否則g堿基與fam熒光報告基團(tuán)相連時，g可以淬滅fam基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)；(4)taqman探針應(yīng)靠近上游引物，兩者的距離最好是探針的5’端離上游引物的3’有一個堿基，但也可以重疊，要保證taqman探針的5’端離上游引物的5’端至少有4bp；也可以選用商品化試劑盒中與上一步兩對寡聚核酸配套使用的引物和taqman探針。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(6)中：抗體的寡聚核酸標(biāo)記，在磷酸鹽、碳酸鹽或硼酸鹽的緩沖體系中都可以進(jìn)行，直接將生物素標(biāo)記好的抗體與親和素標(biāo)記好的dna探針等比例混合，標(biāo)記完成后對標(biāo)記好dna的抗體進(jìn)行純化。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(7)中：數(shù)字pcr擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增體系包括上下游引物、探針、mg2+、taq聚合酶、dntp、和抗原-抗體復(fù)合物，用蒸餾水補(bǔ)足剩余體積；采用數(shù)字pcr或微滴數(shù)碼pcr對起始拷貝數(shù)進(jìn)行測定。本發(fā)明所述的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法，其中，所述步驟(8)中：采用數(shù)字pcr或微滴數(shù)碼pcr對背景拷貝數(shù)進(jìn)行測定。本發(fā)明的基于數(shù)字pcr的蛋白質(zhì)活性濃度測定基準(zhǔn)方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，其突出效果在于：(1)本發(fā)明建立的基于數(shù)字pcr的蛋白活性濃度測定基準(zhǔn)方法在測定過程中不依賴任何標(biāo)準(zhǔn)品，直接對蛋白質(zhì)樣品的濃度進(jìn)行測定；(2)本發(fā)明建立的方法蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果可以直接溯源到si單位；(3)本發(fā)明建立的方法測定的蛋白質(zhì)含量為目標(biāo)蛋白中能夠與指定抗體結(jié)合的活性蛋白濃度，而非蛋白質(zhì)一級序列濃度。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的基于數(shù)字pcr的蛋白活性濃度測定基準(zhǔn)方法作進(jìn)一步說明。具體實施方式實施例一種基于數(shù)字pcr的蛋白活性濃度測定基準(zhǔn)方法：針對脂肪酸結(jié)合蛋白fabp，從abcam公司購買其多抗，用nanodrop對抗體的濃度進(jìn)行定量，0.1mol/l碳酸氫鈉緩沖液(ph8.0)或0.5mol/l硼酸緩沖液(ph8.6)稀釋到1mg/ml，體積為1～2.5ml；按照下述方法對抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記：(1)交互用0.1mol/l碳酸氫鈉緩沖液(ph8.0)或0.5mol/l硼酸緩沖液(ph8.6)，對抗體充分透析；(2)用1mldmso溶解nhsb1mg；(3)向1ml抗體溶液(即含抗體1mg)加入120μlnhsb溶液(即含nhsb120μg)；(4)在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2～4小時；(5)加入9.6μl1mol/lnh4cl(每25μgnhsb加1μl)，在室溫下攪拌10分鐘；(6)在4℃，對pbs充分透析，以除去游離的生物素；(7)將樣品上1ml的分子篩柱，以pbs緩慢洗脫，收集1ml/管，抗體在1～3ml之間洗下，置于-20℃保存。委托生物技術(shù)服務(wù)公司合成3’和5’寡聚核酸片段，引物和taqman探針，經(jīng)高效液相色譜純化并脫鹽，其純度達(dá)到99％，引物和探針信息如下：引物/探針5’->3’序列正向引物tgcgctgtatgccggtatg反向引物gttgttcgggtcaatccagttc探針6-fam-cctcaacggcattatggcggtcctt–tamra采用商品化的鏈霉親和素標(biāo)記試劑盒對純化號的兩對寡聚核酸片段進(jìn)行鏈霉親和素的標(biāo)記。取稀釋好的待測fabp溶液1μl，在其中加入兩種寡聚核酸標(biāo)記抗體各10μl，第三條寡聚核酸鏈2μl，dna連接酶2μl，在37℃孵育形成抗原抗體復(fù)合物。配制熒光實時定量pcr擴(kuò)增體系，包括上下游引物各0.25μl(50μmol/l)，探針2μl(5μmol/l)，10×buffer(mg2+)2.5μl，taq聚合酶0.25μl(5u/μl)，dntp0.5μl(10mmol/l)，待測抗原抗體復(fù)合物1μl，用蒸餾水補(bǔ)足剩余體積。擴(kuò)增條件50℃2min，95℃10min，1個循環(huán)；95℃20s，60℃40s，40個循環(huán)。采用lifetechnologies的quantstudiotm3ddigitalpcr對起始拷貝數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果為1785copies/μl。將上述擴(kuò)增體系中的模板用水替代，再次進(jìn)行數(shù)字pcr的分析，結(jié)果為485copies/μl，因此fabp的最終測量結(jié)果為1300copies/μl。根據(jù)稀釋倍數(shù)，計算出脂肪酸結(jié)合蛋白fabp母液的活性濃度為0.17mg/g。為突出本發(fā)明實施例的突出效果，還進(jìn)行了同位素稀釋質(zhì)譜法的對比試驗：對比例(1)采用最小分度為0.001mg的天平稱取20μl脂肪酸結(jié)合蛋白fabp母液，加到2ml安瓿瓶中，再加入20μl標(biāo)記氨基酸混標(biāo)溶液。加入500μl6mol/l鹽酸，通氮2min除氧后密封，在(110.0±0.5)℃的烘箱中進(jìn)行水解。水解后氮?dú)獯蹈?，?00μl水(含0.1mol/l鹽酸)復(fù)溶，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行質(zhì)譜分析。(2)所用液相色譜-質(zhì)譜分析條件為：色譜柱：agilentsb-aq(2.1×150mm)；流速：0.2ml/min。質(zhì)譜條件：離子對質(zhì)荷比：脯氨酸：116->70(pro)和121->74(標(biāo)記pro)；纈氨酸：118->72(val)和123->76(標(biāo)記val)；苯丙氨酸：166->120(phe)和174->128(標(biāo)記phe)。fabphplc-idms純度測定流動相及梯度(3)根據(jù)下述公式計算fabp蛋白的濃度式中：cfabp——fabp的蛋白質(zhì)含量，g/g；cl-aa——通過hplc-idms測定的氨基酸的含量，g/g；mfabp——fabp的分子量；wtotal——稱量的fabp的質(zhì)量，g；ml-aa——氨基酸的分子量；對12個fabp樣品的測定結(jié)果如下表所示：fabp樣品hplc-idms定量結(jié)果g/g通過以上對比例和實施例的試驗結(jié)果對比，可以得出以下結(jié)論：(1)現(xiàn)有的同位素稀釋質(zhì)譜方法作為基準(zhǔn)方法，測定蛋白質(zhì)濃度為基于一級序列的蛋白總濃度，不是蛋白質(zhì)的活性濃度，其濃度大于采用實施例測定的fabp的活性濃度；(2)同位素稀釋質(zhì)譜實時過程中，同樣需要氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為測量標(biāo)準(zhǔn)，不是直接對樣品中的fabp進(jìn)行定量，而實施例在測定過程中不依賴任何標(biāo)準(zhǔn)品即可對樣品中的fabp濃度進(jìn)行測定。以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12