豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬源衣原體(C.cuis)Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法。本方法根據(jù)靶序列上MOMP的1個區(qū)域設(shè)計2條引物和一條MGB探針，可特異性的擴增豬源衣原體。該試劑盒包括擴增反應(yīng)液管、陽性對照、陰性對照和滅菌去離子水。本發(fā)明只需兩步擴增反應(yīng)及信號收集就可快速、高效、特異、靈敏地檢測目的靶序列，且操作簡便，不需要昂貴的儀器和試劑，對操作人員沒有技術(shù)上的要求，檢測成本低，檢測時間短。
【專利說明】豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物疫病分子生物學(xué)檢測方法及檢測試劑領(lǐng)域，具體涉及一種豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]動物衣原體病ipilamydiosis)是由各類衣原體{Chlamydia)感染哺乳動物、禽類等動物所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行，常造成很大危害及經(jīng)濟損失。衣原體科的最新分類研究表明，衣原體科分為衣原體屬{Chlamydia )和嗜衣原體屬iChlamydophila)，包括沙眼衣原本{ChlamydiatracAoffiaiis)、豬源衣原體{Chlamydia Swi1S)、鼠沙眼衣原體OiuridarumsKH產(chǎn)嗜衣原體 iChlamydophila aAoriws)、貓嗜衣原體{Chlamydophilafelis~)、家畜靖灰盾、體 ipilamydophila pecorum)、肺炎衣原體{Chlamydophila pneumoniae)和鶴踏熱衣原體{Chlamydophila psittaci) 0感染動物的衣原體主要有6種:豬源衣原體、貓衣原體、家畜衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體。豬源衣原體是屬于衣原體屬的一個種，豬是豬源衣原體的天然宿主。目前只是從豬中分離得到，在豬的腸道樣品中分離率最高。豬源衣原體對養(yǎng)豬業(yè)有著很大的影響。各種品系的豬都能感染豬源衣原體，并導(dǎo)致豬的結(jié)膜炎、肺炎或無癥狀亞臨床感染，本病對四環(huán)素敏感。從美國愛荷華州和內(nèi)布拉斯加州、意大利和比利時的農(nóng)場分離出對四環(huán)素不敏感的豬源衣原體，這種穩(wěn)定的耐四環(huán)素表現(xiàn)型與染色體中存在耐藥基因有關(guān)。由此可見豬源衣原體的防控對養(yǎng)豬業(yè)尤為重要。從而也可以通過檢測豬肉食品中是否含有豬源衣原體來進一步降低感染的可能性。
[0003]TaqMan探針是一種募核昔酸探針，突光基團鏈接在探針的5’末端,洋滅基團則在3，端。當(dāng)探針與靶序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就會伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷的積累。因此TaqMan探針檢測的是積累熒光。目前，水解探針已被用于基因檢測、病毒定量、癌細胞基因微突變檢測、細胞因子基因定量等，其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性。
[0004]TaqMan-MGB探針是近年來的一種新型探針，它的淬滅基團是一種非熒光的淬滅基團，本身不會發(fā)生熒光，這樣就降低了 PCR反應(yīng)熒光本底信號的強度，進一步提高了其敏感性。
[0005]中國發(fā)明專利(申請?zhí)枮?200910103457.4、200910094278、200480005196.8、201310009019.8、20 1 1800 15 187.7、20 11 10143186.2、20 1 1 10279330.5、200910200396.3,200910200393.X ,200910094272.1,200910094279.3 等)分別公開了采
用熒光定量PCR擴增技術(shù)檢測病菌和動物疫病的方法。但是，目前尚無利用TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR擴增技術(shù)檢測豬源衣原體{C.cuis)的試劑盒及檢測方法的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的是提供一種豬源衣原體TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，第二個目的是提供使用該引物的檢測試劑盒，第三個目的是提供使用上述檢測用引物和試劑盒檢測肉制品的檢測方法。
[0007]為了實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明提供的豬源衣原體TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，包括豬源衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1;豬源衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ;豬源衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.3。
[0008]為了實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒包括擴增反應(yīng)液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中:
所述擴增反應(yīng)液管，管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成:
DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的豬源衣原體上游引物0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的豬源衣原體下游引物0.4 μ L ;
DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的豬源衣原體MGB探針0.4 μ L ;
2X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ;
滅菌去尚子水7.8 μ L ;
合計19 μ L,為單次反應(yīng)的用量。
[0009]所述陽性對照管，管內(nèi)為豬源衣原體陽性重組質(zhì)粒DNA，體積為20 μ L ;
核苷酸序列為SEQ ID N0.4的PCR上游引物和核苷酸序列為SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常規(guī)PCR進行擴增，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進行連接反應(yīng)獲得所述陽性重組質(zhì)粒 DNA。
[0010]所述陰性對照管，管內(nèi)為無豬源衣原體感染豬的血液基因組DNA，體積為20 μ Lo
[0011]所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
[0012]為了實現(xiàn)上述第三個目的，提供一種豬源衣原體熒光定量PCR擴增技術(shù)快速檢測方法:包括如下步驟:
O制備待檢模板DNA:采用商品化的DNA提取試劑盒，提取待測樣品中的DNA，獲得待檢模板DNA ；
2)擴增反應(yīng)體系為:19μ L擴增反應(yīng)液；I μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L;
3)豬源衣原體實時熒光定量PCR擴增:將步驟2)配制好的擴增反應(yīng)體系進行PCR擴增，反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環(huán)；在60°C 30s進行熒光信號的采集。
[0013]4)結(jié)果判定:將擴增反應(yīng)在35個循環(huán)以內(nèi)及擴增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0014]本發(fā)明的原理是:針對一段1000bp左右的靶序列上MOMP保守區(qū)域設(shè)計2條引物和一條MGB探針，利用探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合的位點在兩條引物之間。探針的5’端標記有報告基團FAM, 3’端標記有非淬滅基團,本身不產(chǎn)生突光,可以大大降低本低信號的強度。同時探針上還連接有MGB修飾基團，可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，可以將MGB探針設(shè)計的更短，既降低了合成車成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。這種實驗方法所使用的儀器比較簡單，同時克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本等缺點、此外，該檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實際操作極為簡單，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。
[0015]TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴增技術(shù)是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增方法。將此基因擴增技術(shù)與普通PCR或普通的TaqMan探針技術(shù)進行比較，可發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上優(yōu)于上面的技術(shù)，且不依賴于任何專門的儀器設(shè)備即可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。現(xiàn)有的豬源衣原體的檢測周期較長，約I天，操作繁瑣，而本發(fā)明的試劑盒僅需50min左右。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點是(I)、不需要特殊試劑與設(shè)備；(2)、高特異性:應(yīng)用MOMP的保守區(qū)段，2條引物及一條MGB探針，根據(jù)是否擴增就能判斷靶標物質(zhì)的存在與否，陽性率可達于99.5%，假陽性率小于0.1% ; (3)、快速、高效擴增:檢測時間50min左右；(4)、靈敏度高:最低檢測極限達到1.7 X IO2拷貝/ μ L，比普通的PCR高100倍，其所建立的標準曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴增效率為達到104.6%，由此可見所建立的標準曲線的擴增效率是比較好的，其熒光曲線與所檢測的靶基因濃度之間的相關(guān)性比較好，準確度比較高，標本的檢出率達到98.8% ; (5)、鑒定簡便:通過最后的擴增曲線就可以進行結(jié)果的精確的，無需電泳等其他任何分析步驟；(6)、用途:可用于豬及其相關(guān)產(chǎn)品的快速檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1特異性試驗結(jié)果；
圖2靈敏度試驗結(jié)果；
圖3穩(wěn)定性試驗結(jié)果；
圖4標準曲線的建立；
圖1中:分別采用了豬源衣原體菌株VR-1474，肺炎衣原體菌株53592，流產(chǎn)衣原體菌株VR-656,鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對照。
【具體實施方式】
[0018]實施例1，引物的設(shè)計及篩選
豬源衣原體熒光定量PCR擴增引物及探針，其設(shè)計是根據(jù)GenBank公布的豬源衣原體MOMP基因的參考序列，用MEGA5進行比對，分析序列并在其保守區(qū)域進行引物與探針的設(shè)計。采用探針設(shè)計軟件Primer Express 3.0,設(shè)計4套突光定量引物，由英駿(上海)有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR儀對反應(yīng)進程中的擴增情況進行實時監(jiān)控，對不同引物組擴增的起始時間、進入最大擴增速率的時間、最大擴增速率及達到平臺期所需時間等參數(shù)進行分析，篩選出擴增速率最高、特異性好的一組熒光定量PCR擴增引物，分別標記為SEQID N0.1~SEQ ID N0.3。其中豬源衣原體引物組中引物上游:SEQ ID N0.1 ;引物下游:SEQ ID N0.2 ;探針:SEQ ID N0.3 ；SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.3 的濃度分別為 10 μ mol/L，10 ymol/L ,10 μ mol/L，體積比為1:1:1。同時，利用PCR引物軟件設(shè)計陽性重組質(zhì)粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分別為=PCR上游引物:SEQ ID N0.4 ；PCR下游引物:SEQ IDN0.5 ;它們的體積比為1:1。[0019]SEQ ID N0.1 代表的序列為:5’ -CGTCTCCATGCAAATCAA-3’。
[0020]SEQ ID N0.2 代表的序列為:5’ -TCGTCGATTAAGCGAGTC-3’。
[0021]SEQ ID N0.3 代表的序列為:5’ FAM-CAACAGTAACTGCGTATT-MGB3’。
[0022]SEQ ID N0.4 代表的序列為:5’ -CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’。
[0023]SEQ ID N0.5 代表的序列為:5’ -GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’。
[0024]實施例2，陽性對照品的制備
采用商品化的試劑盒提取豬源衣原體細胞培養(yǎng)物的核酸，將其核酸進行PCR及電泳鑒定，采用PCR上游引物SEQ ID N0.4和PCR下游引物SEQ ID N0.5進行擴增，并使用膠回收試劑盒回收擴增的條帶。按照1:10的比例和PMD19-T載體進行連接反應(yīng)，4°C連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5 α菌，經(jīng)抗性選擇和PCR鑒定陽性后，再測序驗證，利用分光光度計測定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之間。從而獲得陽性重組質(zhì)粒DNA。
[0025]實施例3，陰性對照品的制備
采用商品化的試劑盒提取無豬源衣原體感染的豬血液基因組DNA，進行PCR及電泳鑒定。
[0026]實施例4，豬源衣原體實時熒光定量PCR擴增快速檢測方法:包括如下步驟: O制備待檢模板DNA:采用商品化的DNA提取試劑盒，提取待測樣品中的DNA，獲得待檢模板DNA ；
2)擴增反應(yīng)體系為:19μ L試劑盒擴增管中的擴增反應(yīng)液；1 μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L;
3)豬源衣原體熒光定量PCR擴增:將步驟2)配制好的擴增反應(yīng)體系進行PCR擴增，反應(yīng)條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s (使用ABI 7500建議采用34s) 40個循環(huán)；在60°C 30s進行熒光信號的采集。
[0027]4)結(jié)果判定:將擴增反應(yīng)在35個循環(huán)以內(nèi)及擴增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
[0028]實施例5，豬源衣原體實時熒光定量PCR擴增的特異性試驗
采用實施例4中步驟3)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行特異性的試驗，所采用的模板分別是豬源衣原體菌株VR-1474，肺炎衣原體菌株53592，流產(chǎn)衣原體菌株VR-656，鸚鵡熱衣原體，沙眼衣原體菌株VR-878，小鼠衣原體VR-123，貓衣原體，陰性對照。
[0029]參見圖1的結(jié)果顯示:只有豬源衣原體菌株VR-1474有擴增曲線。(圖中兩條曲線均表示VR-1474株豬源衣原體菌擴增結(jié)果。)
實施例6，豬源衣原體熒光定量PCR擴增的靈敏度試驗
將所建立的豬源衣原體質(zhì)控標準品(即前面構(gòu)建的陽性質(zhì)粒)進行10倍倍比稀釋(1.7 X IO8拷貝/ μ L~l.7 X 10拷貝/ μ L)，采用實施例4中步驟3)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行靈敏度試驗，結(jié)果顯示出，本發(fā)明建立的方法最低能夠檢測出1.7X IO2拷貝/ μ L的DNA樣品。
[0030]參見圖2的結(jié)果顯示；圖中的曲線從左到右分別表示倍比稀釋后的模板濃度，依次分別為 1.7X IO8 拷貝 /μ L、l.7X IO7 拷貝 /μ L、l.7X IO6 拷貝 /μ L、1.7X IO5 拷貝 /μ L、1.7 X IO4 拷貝 / μ L、1.7 X IO3 拷貝 / μ L、1.7 X IO2 拷貝 / μ L、1.7 X IO1 拷貝 / μ L、l.7拷貝/ μ L。[0031]實施例7，豬源衣原體實時熒光定量PCR擴增的重復(fù)性試驗
以重組質(zhì)粒標準品1.7 X IO7拷貝/ μ L與1.7 X IO6拷貝/ μ L為模板，采用實施例4中步驟3)的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行重復(fù)性試驗，組內(nèi)與組間重復(fù)試驗變異系數(shù)為0.458%~1.174%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。參見圖3的結(jié)果顯示。
[0032]實施例8，豬源衣原體熒光定量PCR擴增的標準曲線的建立
把重組質(zhì)粒的標準品進行五個倍比稀釋，進行標準曲線的制作，以熒光強度的對數(shù)值為橫坐標，循環(huán)數(shù)為縱坐標作圖，得到標準曲線，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴增效率達到104.6%, Υ=3.2147Χ+41.218。由此可見本實驗所建立的標準曲線的擴增效率是比較好的，其熒光曲線與所檢測的靶基因濃度之間的相關(guān)性比較好，準確度比較高。參見圖4的結(jié)果顯示。
【權(quán)利要求】
1.豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，其特征在于:包括豬源衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.1; 豬源衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ ID N0.2 ； 豬源衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ ID N0.3。
2.豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:包括擴增反應(yīng)液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中: 所述擴增反應(yīng)液管，管內(nèi)由以下反應(yīng)液組成: DNA序列為SEQ ID N0.1的10 μ mo I/L的豬源衣原體上游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的豬源衣原體下游引物0.4 μ L ; DNA序列為SEQ ID N0.3的10 μ mo I/L的豬源衣原體MGB探針0.4 μ L ;
2 X Premix Ex Taq 緩沖液 10 μ L ; 滅菌去尚子水7.8 μ L ; 合計19 μ L,為單次反應(yīng)的用量； 所述陽性對照管，管內(nèi)為豬源衣原體陽性重組質(zhì)粒DNA，體積為20μ L ; 所述陰性對照管，管內(nèi) 為無豬源衣原體感染豬的血液基因組DNA，體積為20yL; 所述滅菌去離子水管ImL~2mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:所述陽性重組質(zhì)粒DNA由如下反應(yīng)獲得； 核苷酸序列為SEQ ID N0.4的PCR上游引物和核苷酸序列為SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常規(guī)PCR進行擴增，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體進行連接反應(yīng)獲得陽性重組質(zhì)粒DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于:所述DNA序列為SEQ ID N0.3的豬源衣原體MGB探針的5’端標記有報告基團FAM，3’端標記有非淬滅基團，同時探針上還連接有MGB修飾基團。
5.利用權(quán)利要求2所述試劑盒進行豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法:包括如下步驟: O制備待檢模板DNA:采用商品化的細胞培養(yǎng)液DNA提取試劑盒，提取待測樣品中的DNA,獲得待檢模板DNA ； 2)擴增反應(yīng)體系為:19μ L擴增反應(yīng)液；I μ L待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應(yīng)體系的總體積為20 μ L; 3)豬源衣原體實時熒光定量PCR擴增:將配制好的步驟2)中的擴增反應(yīng)體系進行PCR管反應(yīng)，條件:預(yù)變性95°C 30s ；95°C 5s, 60°C 30s~34s 40個循環(huán)；在60°C 30s進行熒光信號的米集； 4)結(jié)果判定:將擴增反應(yīng)在35個循環(huán)以內(nèi)及擴增曲線良好的反應(yīng)直接判定為陽性，35個循環(huán)以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。
【文檔編號】C12N15/11GK103525944SQ201310540683
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】李應(yīng)國, 王昱, 聶福平, 楊俊 , 肖進文, 王國民, 袁曾壯 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心