技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新抗體和使用抗體的方法。
背景技術(shù)：
：本領(lǐng)域中仍存在對(duì)新的抗體及其在治療中應(yīng)用的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及特異性針對(duì)CD38的分離的抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含：(i)SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR3區(qū)，或者(ii)與SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR3區(qū)具有至少60％同一性的H-CDR3區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述特異性針對(duì)CD38的分離的抗原結(jié)合區(qū)還可包含：(i)SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR2區(qū)，或者(ii)與SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR2區(qū)具有至少60％同一性的H-CDR2區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述特異性針對(duì)CD38的分離的抗原結(jié)合區(qū)還可包含：(i)SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR1區(qū)，或者(ii)與SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的H-CDR1區(qū)具有至少60％同一性的H-CDR1區(qū)。本發(fā)明還涉及特異性針對(duì)CD38的分離的抗體或其功能性片段，其包含：(i)SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的可變重鏈，或者(ii)與SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的可變重鏈具有至少60％同一性的可變重鏈。另外，本發(fā)明涉及特異性針對(duì)CD38的分離的抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含：(i)SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR3區(qū)，或(ii)與SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR3區(qū)具有至少60％同一性的L-CDR3區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述分離的抗原結(jié)合區(qū)還可包含：(i)SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR2區(qū)，或(ii)與SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR2區(qū)具有至少60％同一性的L-CDR2區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述分離的抗原結(jié)合區(qū)還可包含：(i)SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR1區(qū)，或(ii)與SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的L-CDR1區(qū)具有至少60％同一性的L-CDR1區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述分離的抗原結(jié)合區(qū)可包含(i)SEQIDNO:51或52中描述的L-CDR3區(qū)或(ii)與所述L-CDR3區(qū)具有至少60％同一性的L-CDR3區(qū)；并且其特異性針對(duì)人CD38和狨猴CD38。在一些實(shí)施方案中，在所述分離的抗原結(jié)合區(qū)中，所述序列同一性可為至少80％。而且，本發(fā)明涉及分離的抗體或其功能性片段，其包含(i)SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的可變輕鏈，或(ii)與SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的可變輕鏈具有至少60％同一性的可變輕鏈。在一些實(shí)施方案中，所述分離的抗體或其功能性片段可以是IgG。在一些實(shí)施方案中，所述分離的抗體或其功能性片段可以是IgG1。本發(fā)明還涉及一種診斷組合物，其包含上述抗體或其功能性片段；和可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明又涉及一種分離的抗原結(jié)合區(qū)的可變重鏈，其由如下序列編碼：(i)包含SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的核酸序列，或(ii)與SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列，其中所述抗原結(jié)合區(qū)特異性針對(duì)CD38。在一些實(shí)施方案中，所述可變重鏈可由(i)包含SEQIDNO:6或7的核酸序列或(ii)在高嚴(yán)緊性條件下與其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼，其抗原結(jié)合區(qū)特異性針對(duì)人CD38和狨猴CD38。本發(fā)明又涉及分離的抗原結(jié)合區(qū)的可變輕鏈，其由下述序列編碼：(i)包含SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的核酸序列，或者(ii)與SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列，其中所述抗體或其功能性片段特異性針對(duì)CD38。在一些實(shí)施方案中，所述可變輕鏈可由由(i)包含SEQIDNO:36或37的核酸序列或(ii)在高嚴(yán)緊性條件下與其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼，其抗原結(jié)合區(qū)特異性針對(duì)人CD38和狨猴CD38。本發(fā)明又涉及編碼特異性針對(duì)CD38的人抗體或其功能性片段的抗原結(jié)合區(qū)的分離的核酸序列。本發(fā)明又涉及編碼分離的抗原結(jié)合區(qū)的可變重鏈的核酸序列，所述核酸序列包含：(i)選自SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90和91的序列，或(ii)與SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列，其中所述抗原結(jié)合區(qū)特異性針對(duì)CD38。本發(fā)明又涉及編碼分離的抗原結(jié)合區(qū)的可變輕鏈的核酸序列，所述核酸序列包含：(i)選自SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107和108的序列，或(ii)與SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列，其中所述抗原結(jié)合區(qū)特異性針對(duì)CD38。本發(fā)明還涉及包含上述核酸序列的載體。本發(fā)明還涉及包含上述載體的分離的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含上述抗體或其功能性片段以及為此使用的藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還涉及一種用于治療與不希望的CD38+細(xì)胞存在相關(guān)聯(lián)的病癥或疾患的方法，該方法包括為需要其的患者施用有效量的上述藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述病癥或疾患可以是血液疾病。在一些實(shí)施方案中，所述血液疾病可選自多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病和急性淋巴細(xì)胞性白血病。在一些實(shí)施方案中，所述病癥或疾患可以是炎性疾病。在一些實(shí)施方案中，所述炎性疾病可選自類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。本發(fā)明進(jìn)一步涉及誘導(dǎo)特異性殺傷表達(dá)CD38的腫瘤細(xì)胞的方法，其中所述特異性殺傷通過(guò)CD38交聯(lián)而發(fā)生，所述方法包括在足量分離的人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟，其中所述人或人源化抗CD38抗體包含：(i)編碼SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重鏈的核酸序列，或(ii)與SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列，其中所述抗體或其功能性片段特異性針對(duì)CD38。本發(fā)明又涉及誘導(dǎo)特異性殺傷表達(dá)CD38的腫瘤細(xì)胞的方法，其中所述特異性殺傷通過(guò)CD38交聯(lián)而發(fā)生，所述方法包括在足量分離的人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟，其中所述人或人源化抗CD38抗體包含：(i)編碼SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的輕鏈的核酸序列，或(ii)與SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108的互補(bǔ)鏈在高嚴(yán)緊條件下雜交的核酸序列，其中所述抗體或其功能性片段特異性針對(duì)CD38。本發(fā)明又涉及誘導(dǎo)特異性殺傷表達(dá)CD38的腫瘤細(xì)胞的方法，其中所述特異性殺傷通過(guò)CD38交聯(lián)而發(fā)生，所述方法包括在足量分離的人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟，其中所述人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段包含：(i)SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的重鏈氨基酸序列，或(ii)與SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的可變重鏈具有至少60％同一性的可變重鏈。本發(fā)明又涉及誘導(dǎo)特異性殺傷表達(dá)CD38的腫瘤細(xì)胞的方法，其中所述特異性殺傷通過(guò)CD38交聯(lián)而發(fā)生，所述方法包括在足量分離的人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟，其中所述人或人源化抗CD38抗體包含：(i)和/或SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的輕鏈氨基酸序列，或(ii)與SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的可變輕鏈具有至少60％同一性的可變輕鏈。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及檢測(cè)通過(guò)CD38交聯(lián)特異性殺傷表達(dá)CD38的腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包括如下步驟：(i)為需要其的患者施用有效量的人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段，和(ii)檢測(cè)所述人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段的特異性殺傷活性。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞可以是人、迷你豬或兔來(lái)源的。本發(fā)明又涉及檢測(cè)迷你豬來(lái)源的組織或細(xì)胞中CD38存在的方法，所述方法包括如下步驟：(i)使人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段與所述CD38形成接觸，和(ii)檢測(cè)所述人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段與所述CD38迷你豬細(xì)胞的特異性結(jié)合，其中所述抗體或其功能性片段還能特異性結(jié)合人來(lái)源的CD38。在一些實(shí)施方案中，所述迷你豬來(lái)源的CD38可包括在選自下述組的分離的細(xì)胞類(lèi)型中：外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、小腦細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、扁桃體細(xì)胞、脾細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和視網(wǎng)膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段可包含：(i)編碼SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重鏈的核酸序列和/或編碼SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的輕鏈的核酸序列，或者(ii)與SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重鏈區(qū)具有至少60％同一性的序列和/或與SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的輕鏈區(qū)具有至少60％同一性的序列。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及檢測(cè)表達(dá)CD38的紅細(xì)胞中CD38的方法，所述方法包括如下步驟：(i)使人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段與所述表達(dá)CD38的紅細(xì)胞相接觸，和(ii)檢測(cè)所述人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段與所述表達(dá)CD38的紅細(xì)胞的特異性結(jié)合，其中所述抗體或其功能性片段還能特異性結(jié)合來(lái)自不同于人紅細(xì)胞的細(xì)胞或組織的人CD38。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或其功能性片段還能特異性結(jié)合來(lái)自人類(lèi)淋巴細(xì)胞的人CD38。在一些實(shí)施方案中，所述人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段可包含：(i)編碼SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重鏈的核酸序列和/或編碼SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的輕鏈的核酸序列，或者(ii)與SEQIDNO:1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90或91中描述的重鏈區(qū)具有至少60％同一性的序列和與SEQIDNO:31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,107或108中描述的輕鏈區(qū)具有至少60％同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，所述人或人源化抗CD38抗體或其功能性片段可包含：(i)SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的重鏈氨基酸序列，和/或SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的輕鏈氨基酸序列；或(ii)與SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105或106中描述的重鏈區(qū)具有至少60％同一性的序列，和與SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109或110中描述的輕鏈區(qū)具有至少60％同一性的序列。本發(fā)明又涉及根據(jù)本發(fā)明的分離的抗體或其功能性片段，其包含：(i)SEQIDNO:21或22中描述的H-CDR3區(qū)，或(ii)與所述H-CDR3區(qū)具有至少60％同一性的H-CDR3區(qū)；并且其特異性針對(duì)人CD38和狨猴CD38。附圖簡(jiǎn)述圖1a提供了用于本發(fā)明的各種抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列。圖1b提供了用于本發(fā)明的各種抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。CDR區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3從N端至C端加粗顯示。圖2a提供了用于本發(fā)明的各種抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列。圖2b提供了用于本發(fā)明的各種抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。CDR區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3從N端至C端加粗顯示。圖3提供了各種基于共有的HuCAL抗體主基因序列的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。CDR區(qū)HCDR1、HCDR2和HCDR3從N端至C端加粗顯示。圖4提供了各種基于共有的HuCAL抗體主基因序列的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。CDR區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3從N端至C端加粗顯示。圖5提供了CD38(SWISS-PROT原始登錄號(hào)P28907)的氨基酸序列。圖6提供了嵌合OKT10的重鏈和輕鏈的核苷酸序列。圖7提供了_h_IgG1_1(bp601-2100)(SEQIDNO:74)的DNA序列：該載體是基于pcDNA3.1+載體(Invitrogen)。VH-填充序列的氨基酸序列加粗顯示，而VH-前導(dǎo)序列和恒定區(qū)基因的最終閱讀框非加粗打印。在所述序列上方指出限制位點(diǎn)。測(cè)序引物的引發(fā)位點(diǎn)加下劃線(xiàn)。圖8提供了Igκ輕鏈表達(dá)載體_h_Igκ_1(bp601-1400)(SEQIDNO:75)的DNA序列：該載體基于pcDNA3.1+載體(Invitrogen)。Vκ-填充序列的氨基酸序列加粗顯示，而Vκ-前導(dǎo)序列和恒定區(qū)基因的最終閱讀框非加粗打印。在所述序列上方指出限制位點(diǎn)。測(cè)序引物的引發(fā)位點(diǎn)加下劃線(xiàn)。圖9提供了HuCALIgλ輕鏈載體_h_Igλ_1(bp601-1400)(SEQIDNO:76)的DNA序列：Vλ-填充序列的氨基酸序列加粗顯示，而Vλ-前導(dǎo)序列和恒定區(qū)基因的最終閱讀框非加粗打印。在所述序列上方指出限制位點(diǎn)。測(cè)序引物的引發(fā)位點(diǎn)加下劃線(xiàn)。圖10提供了用于本發(fā)明的Fab/IgG樣式(format)中重鏈和輕鏈的不同組合。圖11提供了通過(guò)FACS獲得的淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞的CD38表達(dá)分析。PBMC和紅細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心從短尾猴、獼猴和狨猴的全血分離，隨后使用抗CD38Fab抗體MOR03087(A,直方圖右側(cè),淡色箭頭)和MOR03088(B,直方圖右側(cè)；淡色箭頭)進(jìn)行FACS分析。使用不相關(guān)的Fab-抗體(A&B,直方圖左側(cè)；黑色箭頭)作為陰性對(duì)照。圖12提供了通過(guò)FACS獲得的淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞的CD38表達(dá)分析。PBMC和紅細(xì)胞通過(guò)密度梯度離心從人、短尾猴和狨猴的全血分離，隨后使用抗CD38IgG1MOR03087(直方圖右側(cè)；白色箭頭)進(jìn)行FACS分析。使用不相關(guān)的IgG1對(duì)照抗體(A&B,直方圖左側(cè)；黑色箭頭)作為陰性對(duì)照。圖13提供了不同抗CD38抗體的交叉反應(yīng)性對(duì)比概況。圖14(a)和14(b)描繪了用于本發(fā)明的某些抗體的CDR區(qū)和FR區(qū)，并比較了彼此和相應(yīng)共有序列的給定位置的氨基酸。發(fā)明詳述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了新抗體和使用抗體的方法，所述抗體對(duì)CD38具有特異性或高親和力，并能夠?yàn)榛颊邘?lái)治療益處?？梢允侨说幕蛉嗽椿乃隹贵w可用于本文更全面描述的許多情況中。用于本發(fā)明的適當(dāng)抗體公開(kāi)于US60/614,471，其通過(guò)引用結(jié)合入本文。“人”抗體或功能性人抗體片段在這里定義為不是嵌合的(例如，非“人源化的”)且不是全部或部分來(lái)自非人類(lèi)物種。人抗體或功能性抗體片段可源自人，或者可以是合成的人抗體?！昂铣傻娜丝贵w”在本文定義為序列全部或部分電子(insilico)衍生自合成序列的抗體，所述合成序列基于已知的人抗體序列分析?？梢詫?shí)現(xiàn)人抗體序列或其片段的電子設(shè)計(jì)，例如，通過(guò)分析人抗體或抗體片段序列的數(shù)據(jù)庫(kù)并利用從中獲得的數(shù)據(jù)來(lái)設(shè)計(jì)多肽序列。人抗體或功能性抗體片段的另一實(shí)例是從人源抗體序列庫(kù)(即，基于取自人固有來(lái)源的抗體的文庫(kù))分離的核酸所編碼的人抗體或功能性抗體片段?！叭嗽椿贵w”或功能性人源化抗體片段在本文定義為：(i)衍生自非人類(lèi)來(lái)源(例如，具有異源免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠)的，其抗體基于人種系序列；或者(ii)嵌合的，其中可變區(qū)衍生自非人類(lèi)來(lái)源，而恒定區(qū)衍生自人類(lèi)來(lái)源；或者(iii)CDR移植的，其中可變區(qū)的CDR來(lái)自非人類(lèi)來(lái)源，而可變區(qū)的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架是人類(lèi)來(lái)源的，并且恒定區(qū)(如果有)是人類(lèi)來(lái)源的。如本文所使用的，抗體“特異性結(jié)合”是“特異性針對(duì)”或“特異性識(shí)別”抗原(這里指CD38)，假設(shè)這種抗體能夠區(qū)別所述抗原和一種或多種參考抗原，因?yàn)榻Y(jié)合特異性不是絕對(duì)而是相對(duì)的性質(zhì)。最普遍形式(當(dāng)沒(méi)有提及確定的參考時(shí))的“特異性結(jié)合”是指抗體區(qū)別目標(biāo)抗原和無(wú)關(guān)抗原的能力，例如根據(jù)下述方法之一所測(cè)定的。所述方法包括但不限于Western印跡、ELISA檢測(cè)、RIA檢測(cè)、ECL檢測(cè)、IRMA檢測(cè)、FACS、IHC和肽掃描。例如，可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測(cè)定?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)顯色(例如，帶有辣根過(guò)氧化物的第二抗體和帶有過(guò)氧化氫的四甲基聯(lián)苯胺)進(jìn)行評(píng)分。某些孔中的反應(yīng)通過(guò)例如在450nm的光密度評(píng)分。典型背景(＝陰性反應(yīng))可以是0.1OD；典型的陽(yáng)性反應(yīng)可以是1OD。這表示陽(yáng)性/陰性差異可以大于10倍。通常，結(jié)合特異性的測(cè)定使用的不是單個(gè)參考抗原，而是約3至5個(gè)無(wú)關(guān)的一組抗原，例如奶粉、BSA、轉(zhuǎn)鐵蛋白等?？贵w有可能“特異性針對(duì)”2種或更多種細(xì)胞/組織和/或2個(gè)或更多物種的抗原，條件是例如所述抗體滿(mǎn)足所述細(xì)胞/組織和物種中每一種的結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)。因此，抗體可以特異性結(jié)合各種細(xì)胞類(lèi)型和/或組織(例如，紅細(xì)胞、從外周血液分離的淋巴細(xì)胞、脾或淋巴結(jié))上的靶抗原CD38。另外，抗體還可以特異性針對(duì)一個(gè)物種的CD38和另一物種的CD38。“特異性結(jié)合”還可以指抗體區(qū)別靶抗原和作為參考點(diǎn)的一種或多種密切相關(guān)抗原的能力，例如區(qū)別CD38和CD157的能力。另外，“特異性結(jié)合”可以涉及抗體區(qū)別其靶抗原不同部分(例如CD38的不同結(jié)構(gòu)域或區(qū)域，例如CD38的N端或C端區(qū)域中的表位)的能力，或者區(qū)別CD38的氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基或氨基酸殘基序列(stretch)。而且，如本文所使用的“免疫球蛋白”(Ig)在本文定義為屬于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD類(lèi)(或其任何亞類(lèi))的蛋白質(zhì)，并且包括所有常規(guī)已知的抗體和其功能性片段?？贵w/免疫球蛋白的“功能性片段”在本文定義為保留了抗原結(jié)合區(qū)的抗體/免疫球蛋白的片段(例如，IgG的可變區(qū))?？贵w的“抗原結(jié)合區(qū)”通常位于抗體的一個(gè)或多個(gè)超變區(qū)，即CDR-1、-2和/或-3區(qū)；但是，可變的“框架”區(qū)也能在抗原結(jié)合中起重要作用，例如為CDR提供支架。優(yōu)選地，“抗原結(jié)合區(qū)”至少包含可變輕(VL)鏈的氨基酸殘基4至103以及可變重(VH)鏈的5至109，更優(yōu)選VL的氨基酸殘基3至107以及VH的4至111，特別優(yōu)選的是完整的VL和VH鏈(VL的氨基酸位置1至109和VH的1至113；根據(jù)WO97/08320編號(hào))。用于本發(fā)明的優(yōu)選的免疫球蛋白類(lèi)別是IgG。本發(fā)明的“功能性片段”包括F(ab')2片段、Fab片段和scFv的結(jié)構(gòu)域。F(ab')2或Fab可以設(shè)計(jì)為最小化或完全除去發(fā)生在CH1和CL結(jié)構(gòu)域之間的分子間二硫化物相互作用。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“親本結(jié)合劑”指未經(jīng)歷優(yōu)化過(guò)程的任何結(jié)合劑。優(yōu)化過(guò)程在本說(shuō)明書(shū)其他地方描述。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)合劑”可以與術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白”或“抗體”同義的方式使用。用于本發(fā)明的抗體可以衍生自基于氨基酸序列的重組抗體庫(kù)，所述氨基酸序列經(jīng)電子設(shè)計(jì)并由合成產(chǎn)生的核酸編碼。例如，通過(guò)分析人類(lèi)序列數(shù)據(jù)庫(kù)并使用從中獲得的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)多肽序列來(lái)實(shí)現(xiàn)抗體序列的電子設(shè)計(jì)。用于設(shè)計(jì)和獲得電子生成序列的方法描述于例如Knappik等,J.Mol.Biol.(2000)296:57；Krebs等,J.Immunol.Methods.(2001)254:67；和授予Knappik等的美國(guó)專(zhuān)利6,300,064號(hào)，其通過(guò)引用整體結(jié)合入本文。用于本發(fā)明的抗體整個(gè)該文件中，提到了下述用于本發(fā)明的代表性抗體："抗體號(hào)"或"LACS"或"MOR"3076或03076,3078或03078,3081或03081,3085或03085,3086或03086,3087或03087,3088或03088,3089或03089,3101或03101,3102或03102,3127或03127,3128或03128,3129或03129,3130或03130,3131或03131,6183或06183,6184或06184,6185或06185,6186或06186,6187或06187,6188或06188,6189或06189,6190或06190,6192或06192,6195或06195,6197或06197,6200或06200,6201或06201,6204或06204,6214或06214,6278或06278,6279或06279。LAC3076表示具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1(DNA)/SEQIDNO:16(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:31(DNA)/SEQIDNO:46(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3078代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:2(DNA)/SEQIDNO:17(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:32(DNA)/SEQIDNO:47(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3081代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:3(DNA)/SEQIDNO:18(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:33(DNA)/SEQIDNO:48(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3085代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:4(DNA)/SEQIDNO:19(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:34(DNA)/SEQIDNO:49(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3086代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:5(DNA)/SEQIDNO:20(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:35(DNA)/SEQIDNO:50(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3087代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:6(DNA)/SEQIDNO:21(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:36(DNA)/SEQIDNO:51(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3088代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:7(DNA)/SEQIDNO:22(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:37(DNA)/SEQIDNO:52(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3089代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:8(DNA)/SEQIDNO:23(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:38(DNA)/SEQIDNO:53(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3101代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:9(DNA)/SEQIDNO:24(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:39(DNA)/SEQIDNO:54(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3102代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:10(DNA)/SEQIDNO:25(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:40(DNA)/SEQIDNO:55(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3127代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:11(DNA)/SEQIDNO:26(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:41(DNA)/SEQIDNO:56(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3128代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:12(DNA)/SEQIDNO:27(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:42(DNA)/SEQIDNO:57(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3129代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:13(DNA)/SEQIDNO:28(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:43(DNA)/SEQIDNO:58(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3130代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:14(DNA)/SEQIDNO:29(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:44(DNA)/SEQIDNO:59(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。LAC3131代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:15(DNA)/SEQIDNO:30(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)和對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:45(DNA)/SEQIDNO:60(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。進(jìn)一步地，衍生自親本結(jié)合劑MOR03087和MOR03088的優(yōu)化克隆包括：MOR06183代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:77(DNA)/SEQIDNO:92(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06184代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:78(DNA)/SEQIDNO:93(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06185代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:79(DNA)/SEQIDNO:94(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06186代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:80(DNA)/SEQIDNO:95(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06187代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:81(DNA)/SEQIDNO:96(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06188代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:82(DNA)/SEQIDNO:97(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06189代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:83(DNA)/SEQIDNO:98(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06190代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:84(DNA)/SEQIDNO:99(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06192代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:85(DNA)/SEQIDNO:100(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06195代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:86(DNA)/SEQIDNO:101(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06197代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:87(DNA)/SEQIDNO:102(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06200代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:88(DNA)/SEQIDNO:103(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06201代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:89(DNA)/SEQIDNO:104(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06204代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:90(DNA)/SEQIDNO:105(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06214代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:91(DNA)/SEQIDNO:106(蛋白質(zhì))的重鏈可變區(qū)的抗體。MOR06278代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:107(DNA)/SEQIDNO:109(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。MOR06279代表具有對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:108(DNA)/SEQIDNO:110(蛋白質(zhì))的輕鏈可變區(qū)的抗體。本發(fā)明的抗體特征在于Fab和/或IgG樣式，并包括優(yōu)化結(jié)合劑和親本結(jié)合劑的輕鏈和重鏈的各種組合。圖10顯示了可用于本發(fā)明的幾種非限制性組合。一方面，本發(fā)明提供了使用具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體的方法，所述抗原結(jié)合區(qū)能夠特異性結(jié)合CD38的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，或者對(duì)CD38的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域具有高親和力，所述CD38的氨基酸序列描述為SEQIDNO:71。據(jù)說(shuō)，如果抗體的親和力測(cè)量值為至少100nM(Fab片段的單價(jià)親和力)，則該抗體具有對(duì)抗原的“高親和力”。用于本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合區(qū)優(yōu)選能以約小于600nM的親和力與CD38結(jié)合。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合區(qū)能以約小于100nM的親和力與CD38結(jié)合，更優(yōu)選小于約60nM，更優(yōu)選小于約30nM。更優(yōu)選的是使用以小于約10nM、更優(yōu)選小于約3nM的親和力與CD38結(jié)合的抗體。例如，用于本發(fā)明的抗體對(duì)CD38的親和力可以是約10.0nM或2.4nM(Fab片段的單價(jià)親和力)。表1總結(jié)了代表性抗體的親和力，通過(guò)表面等離子體共振(Biacore)和FACSScatchard分析測(cè)定：表1：抗體親和力a:Fab樣式；對(duì)人類(lèi)CD38Fc融合aa45-300的分析b:IgG1樣式；Raji細(xì)胞分析c:標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)d:標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝4)參考表1，LACs親和力的測(cè)量通過(guò)對(duì)人類(lèi)CD38Fc融合的表面等離子體共振(Biacore)和使用表達(dá)CD38的人類(lèi)Raji細(xì)胞系的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行。Biacore研究直接在固定抗原(CD38-Fc融合蛋白)上進(jìn)行。Fab樣式的LACs對(duì)固定CD38-Fc融合蛋白表現(xiàn)出范圍約30nM至596nM的單價(jià)親和力。IgG1樣式用于基于細(xì)胞的親和力測(cè)定(FACSScatchard)。表1右欄指示了該樣式的LACS的結(jié)合強(qiáng)度。用于本發(fā)明的優(yōu)選抗體的另一優(yōu)選特征是其對(duì)CD38的N端區(qū)的特異性。例如，本發(fā)明LACs可以特異性結(jié)合CD38的N端區(qū)。本發(fā)明優(yōu)化抗體的進(jìn)一步特征如表2和3所示。提供了通過(guò)表面等離子體共振(Biacore)和FACSScatchard分析測(cè)定的親和力概況。另外，還確定了對(duì)人類(lèi)紅細(xì)胞的FACS結(jié)合以及對(duì)CD38Fc融合蛋白的ELISA結(jié)合研究。鑒定表明，與親本克隆相比較，幾種優(yōu)化結(jié)合劑顯示了減弱的對(duì)人類(lèi)紅細(xì)胞的結(jié)合以及更高的ELISA信號(hào)。另外，F(xiàn)ACSScatchards和親和力測(cè)定所顯示，MOR03088衍生物具有提高的親和力。表2：親和力成熟克隆的總體表征：a:Fab樣式b:IgG樣式c:人類(lèi)效應(yīng)細(xì)胞&RPMI8226靶細(xì)胞(E:T比＝30:1)+:以ADCC殺傷RPMI8226細(xì)胞n.d.:未測(cè)定*:不同的實(shí)驗(yàn)表3：FACSScatchard、ADCC和CDC中的EC50a:單次測(cè)量b:兩次測(cè)量平均用于本發(fā)明的抗體所結(jié)合的表位類(lèi)型可以是線(xiàn)性的(即，一個(gè)連續(xù)的氨基酸序列)或構(gòu)象的(即，多個(gè)氨基酸序列)。為了測(cè)定特定抗體的表位是線(xiàn)性的還是構(gòu)象的，技術(shù)人員可以分析抗體與覆蓋不同的CD38區(qū)域的重疊肽(例如，具有11個(gè)氨基酸重疊的13-mer肽)的結(jié)合。LACS可以識(shí)別CD38的N端區(qū)中不連續(xù)或線(xiàn)性的表位。結(jié)合本文提供的知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何使用一個(gè)或多個(gè)分離的CD38表位，來(lái)生成具有特異性針對(duì)所述表位的抗原結(jié)合區(qū)的抗體(例如使用CD38的表位的合成肽或者表達(dá)CD38表位的細(xì)胞)。用于本發(fā)明的抗體優(yōu)選是與人類(lèi)和至少一種其他非人類(lèi)物種具有物種交叉反應(yīng)性的。非人類(lèi)物種可以是非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)，例如獼猴、狒狒和/或短尾猴。其他非人類(lèi)物種可以是迷你豬、兔、小鼠、大鼠和/或倉(cāng)鼠。與至少一種除人類(lèi)外的其他物種具有交叉反應(yīng)性的抗體可以提供比已知抗CD38抗體更大的靈活性和益處，用于在多個(gè)物種中對(duì)相同抗體進(jìn)行體內(nèi)研究。例如，與迷你豬和/或兔具有交叉反應(yīng)性的抗體可以是毒理學(xué)和安全性研究的候選物。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的抗體不僅能夠結(jié)合CD38，而且能夠介導(dǎo)殺傷表達(dá)CD38的細(xì)胞。更具體地，用于本發(fā)明的抗體能夠通過(guò)抗體-效應(yīng)子功能清除CD38陽(yáng)性(例如，惡性)細(xì)胞，從而介導(dǎo)其治療作用。這些功能包括抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(CDC)。但是，CD38表達(dá)不僅存在于骨髓(例如，單核細(xì)胞、粒細(xì)胞)和淋巴譜系(例如，活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞；漿細(xì)胞)中的免疫細(xì)胞，而且存在于各自的前體細(xì)胞。因?yàn)殛P(guān)鍵是這些細(xì)胞不受抗體介導(dǎo)殺傷惡性細(xì)胞的影響，所以本發(fā)明抗體優(yōu)選對(duì)前體細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。除了作為環(huán)狀A(yù)DP核糖環(huán)化酶和水解酶的催化活性外，CD38還具有轉(zhuǎn)導(dǎo)生物相關(guān)信號(hào)的能力(Hoshino等,1997；Ausiello等,2000)。這些功能可以在體內(nèi)誘導(dǎo)，例如，通過(guò)受體-配體相互作用或者通過(guò)與激發(fā)型抗CD38抗體的交聯(lián)，導(dǎo)致例如鈣動(dòng)員、淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子釋放。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體是非激發(fā)型抗體。肽變體用于本發(fā)明的抗體不限于本文提供的特定肽序列。進(jìn)一步地，本發(fā)明還實(shí)現(xiàn)了這些多肽的變體的使用。參考本發(fā)明和常規(guī)可用的技術(shù)和參考文獻(xiàn)，技術(shù)人員能夠制備、測(cè)試和使用本文公開(kāi)的抗體的功能性變體，同時(shí)理解，具有介導(dǎo)殺傷CD38+靶細(xì)胞的能力的變體落入本發(fā)明范圍內(nèi)。這里使用的“介導(dǎo)殺傷CD38+靶細(xì)胞的能力”指用于本發(fā)明的抗CD38抗體的功能性特征。因此，介導(dǎo)殺傷CD38+靶細(xì)胞的能力包括例如通過(guò)ADCC和/或CDC，或者通過(guò)與用于本發(fā)明的抗體軛合的毒性構(gòu)建體來(lái)介導(dǎo)殺傷CD38+靶細(xì)胞的能力。例如，變體可以包括具有至少一個(gè)改變的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(超變)和/或框架(FR)(可變)結(jié)構(gòu)域/位置，相對(duì)于(vis-à-vis)本文公開(kāi)的肽序列的抗體。為更好地描述這個(gè)概念，下面簡(jiǎn)要描述了抗體結(jié)構(gòu)?？贵w的組成為兩條肽鏈，每條肽鏈含有一個(gè)(輕鏈)或三個(gè)(重鏈)恒定區(qū)和一個(gè)可變區(qū)(VL,VH)，每個(gè)可變區(qū)組成為四個(gè)FR區(qū)和三個(gè)間隔的CDR。抗原結(jié)合位點(diǎn)由一個(gè)或多個(gè)CDR形成，而FR區(qū)為CDR提供了結(jié)構(gòu)框架并因此在抗原結(jié)合中起重要作用。通過(guò)改變CDR或FR區(qū)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，技術(shù)人員通?？僧a(chǎn)生突變或多變的抗體序列，從中可根據(jù)抗原篩選例如具有新性質(zhì)或改良性質(zhì)的抗體序列。圖14a(VH)和14b(VL)描繪了用于本發(fā)明的某些抗體的CDR區(qū)和FR區(qū)，并彼此以及與相應(yīng)的共有或“主基因”序列比較了給定位置的氨基酸(如美國(guó)專(zhuān)利6,300,064號(hào)所描述的)。技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)肽變體，其用途落入本發(fā)明范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，通過(guò)改變一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的氨基酸來(lái)構(gòu)建變體；變體還可以具有一個(gè)或多個(gè)改變的框架區(qū)。也可以在框架區(qū)內(nèi)作出改變。例如，可以改變肽FR區(qū)，此時(shí)與種系序列相比較存在殘基差異。進(jìn)一步地，可以使用一個(gè)LAC作為起始點(diǎn)來(lái)獲得變體以實(shí)現(xiàn)優(yōu)化，通過(guò)改變LAC中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基、優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)CDR中的氨基酸殘基，并從得到的抗體變體混合物篩選具有改良性質(zhì)的變體。特別優(yōu)選的是改變VL的CDR-3、VH的CDR-3、VL的CDR-1和/或VH的CDR-2中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^(guò)合成DNA分子混合物來(lái)進(jìn)行改變，使用三核苷酸誘變(TRIM)技術(shù)(B.,Ge,L.,Plückthun,A.,Schneider,K.C.,Wellnhofer,G.,和MoroneyS.E.(1994)Trinucleotidephosphoramidites:idealreagentsforthesynthesisofmixedoligonucleotidesforrandommutagenesis(三核苷酸亞磷酰胺：用于合成混合的寡核苷酸以隨機(jī)誘變的理想試劑)Nucl.AcidsRes.22,5600)。保守氨基酸變體多肽變體可以制成保留本文描述的抗體肽序列的整體分子結(jié)構(gòu)?；趩蝹€(gè)氨基酸的性質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解一些合理的置換?？梢岳绺鶕?jù)有關(guān)殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)做出氨基酸置換，即“保守置換”。例如，(a)非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)帶正電的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸；(d)帶負(fù)電的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸。置換通常發(fā)生在組(a)-(d)中。另外，甘氨酸和脯氨酸可以根據(jù)其破壞α-螺旋的能力而相互置換。類(lèi)似地，某些氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和賴(lài)氨酸，更常見(jiàn)于α-螺旋，而纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和蘇氨酸更常見(jiàn)于β-折疊片。甘氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸常見(jiàn)于轉(zhuǎn)角。一些優(yōu)選的置換可以發(fā)生在下述組中：(i)S和T；(ii)P和G；和(iii)A、V、L和I。基于已知的遺傳密碼和重組及合成DNA技術(shù)，技術(shù)人員可以容易構(gòu)建編碼保守氨基酸變體的DNA。在一個(gè)特定實(shí)施例中，SEQIDNO:5,6,7,和/或8的3位氨基酸可以從Q變?yōu)镋。如本文使用的，兩個(gè)多肽序列之間的“序列同一性”表示序列間相同的氨基酸的百分比?！靶蛄邢嗨菩浴北硎鞠嗤蛘叽肀Ｊ匕被嶂脫Q的氨基酸的百分比。本發(fā)明優(yōu)選的多肽序列的CDR區(qū)的序列同一性為至少60％，更優(yōu)選至少70％或80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％。而且優(yōu)選抗體的CDR區(qū)的序列相似性為至少80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％。本發(fā)明優(yōu)選多肽序列的可變區(qū)序列同一性為至少60％，更優(yōu)選至少70％或80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％。而且優(yōu)選抗體的可變區(qū)序列相似性為至少80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％。本發(fā)明的DNA分子本發(fā)明還涉及編碼用于本發(fā)明的抗體的DNA分子的用途。這些序列包括但不限于圖1a和2a所列的那些DNA分子。本發(fā)明的DNA分子不限于本文公開(kāi)的序列，而是還包括其變體。本發(fā)明的DNA變體可以參考其在雜交中的物理性質(zhì)來(lái)描述。技術(shù)人員將理解，使用核酸雜交技術(shù)，DNA可用來(lái)鑒定其互補(bǔ)體(因?yàn)镈NA是雙鏈結(jié)構(gòu))、其等同物或同系物。還理解，雜交可以以小于100％互補(bǔ)性發(fā)生。但是，基于適當(dāng)?shù)臈l件選擇，可以根據(jù)DNA序列與特定探針的結(jié)構(gòu)親緣關(guān)系，使用雜交技術(shù)來(lái)區(qū)別所述DNA序列。有關(guān)所述條件的指導(dǎo)，參見(jiàn)Sambrook等,1989(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,USA)以及Ausubel等,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).CurrentProtocolsinMolecularBiology.NewYork:JohnWiley和Sons)。兩個(gè)多核苷酸序列之間的結(jié)構(gòu)相似性可以表示為這兩個(gè)序列能相互雜交的條件下的“嚴(yán)緊性”的函數(shù)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊性”指不利于雜交的條件的程度。嚴(yán)緊的條件非常不利于雜交，因此只有結(jié)構(gòu)上最相關(guān)的分子在這種條件下相互雜交。相反，非嚴(yán)緊的條件有利于結(jié)構(gòu)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的分子的雜交。因此，雜交嚴(yán)緊性與兩個(gè)核酸序列的結(jié)構(gòu)關(guān)系直接相關(guān)。下述關(guān)系式用于聯(lián)系雜交和親緣性(其中Tm是核酸雙鏈體的解鏈溫度)：a.Tm＝69.3+0.41(G+C)％b.錯(cuò)配堿基對(duì)的數(shù)目每增加1％，則雙鏈DNA的Tm下降1℃。c.(Tm)μ2-(Tm)μ1＝18.5log10μ2/μ1，其中μ1和μ2是兩種溶液的離子強(qiáng)度。雜交嚴(yán)緊性是許多因素的函數(shù)，所述因素包括DNA總濃度、離子強(qiáng)度、溫度、探針大小和破壞氫鍵的物質(zhì)的存在。促進(jìn)雜交的因素包括高DNA濃度、高離子強(qiáng)度、低溫、更長(zhǎng)的探針和不存在破壞氫鍵的物質(zhì)。雜交通常以?xún)蓚€(gè)階段進(jìn)行：“結(jié)合”階段和“洗滌”階段。首先，在結(jié)合階段，探針在有利于雜交的條件下與靶結(jié)合。通常在該階段通過(guò)改變溫度來(lái)控制嚴(yán)緊性。為了高嚴(yán)緊性，溫度通常為65℃至70℃，除非使用短的(<20nt)寡核苷酸探針。代表性的雜交溶液包含6XSSC、0.5％SDS、5XDenhardt's溶液和100μg非特異性載體DNA。參見(jiàn)Ausubel等，section2.9,supplement27(1994)。當(dāng)然，已知許多不同但功能等價(jià)的緩沖液條件。當(dāng)親緣關(guān)系較低時(shí)，可以選擇較低的溫度。低嚴(yán)緊性結(jié)合溫度為約25℃至40℃。中等嚴(yán)緊性為至少約40℃到小于約65℃。高嚴(yán)緊性為至少約65℃。然后，通過(guò)洗滌除去過(guò)量探針。在該階段，通常使用更嚴(yán)緊的條件。因此，該“洗滌”階段在通過(guò)雜交確定親緣關(guān)系中是最重要的。洗滌溶液通常含有較低的鹽濃度。一種示例性中等嚴(yán)緊性溶液含有2XSSC和0.1％SDS。高嚴(yán)緊性洗滌溶液含有小于約0.2XSSC的等價(jià)物(在離子強(qiáng)度上等價(jià))，且優(yōu)選的嚴(yán)緊溶液含有約0.1XSSC。與各種嚴(yán)緊性相關(guān)的溫度與上述“結(jié)合”的溫度相同。而且洗滌溶液通常在洗滌過(guò)程中更換數(shù)次。例如，通常的高嚴(yán)緊性洗滌條件包括在55℃洗滌兩次持續(xù)30分鐘和在60℃洗滌3次持續(xù)15分鐘。因此，本發(fā)明包括與圖1a和2a所列分子在高嚴(yán)緊性結(jié)合和洗滌條件下雜交的核酸分子的用途，其中所述核酸分子編碼如本文使用的抗體或其功能性片段。優(yōu)選的分子(就mRNA而言)是與本文描述的DNA分子之一具有至少75％或80％(優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％)的同源性或序列同一性的那些。功能等價(jià)變體另一類(lèi)DNA變體可參考它們的編碼產(chǎn)物(見(jiàn)圖1b和2b所列的肽)來(lái)描述，所述DNA變體的用途在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些功能等價(jià)基因特征為，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，它們編碼與圖1b和2b中相同的肽序列。已知本文提供的DNA分子的變體能夠以幾種不同的方式構(gòu)建。例如，它們可以構(gòu)建為完全合成的DNA。有效合成范圍為20至約150個(gè)核苷酸的寡核苷酸的方法是普遍可用的。參見(jiàn)Ausubel等,section2.11,Supplement21(1993)。重疊的寡核苷酸可以以Khorana等,J.Mol.Biol.72:209-217(1971)首次報(bào)道的方式合成并組裝；還參見(jiàn)Ausubel等,同上,Section8.2。合成的DNA優(yōu)選設(shè)計(jì)為具有設(shè)置在基因5'端和3'端的常規(guī)的限制位點(diǎn)，以利于克隆至適當(dāng)?shù)妮d體。如表明的，生成變體的方法開(kāi)始于本文公開(kāi)的DNA之一，然后進(jìn)行定向位點(diǎn)誘變。參見(jiàn)Ausubel等,同上,chapter8,Supplement37(1997)。在一種通常方法中，靶DNA被克隆入單鏈DNA噬菌體載體。單鏈DNA經(jīng)分離后與含有所需核苷酸改變的寡核苷酸雜交。合成互補(bǔ)鏈并將雙鏈?zhǔn)删w導(dǎo)入宿主。得到的一些子代將含有需要的突變體，所述突變體可以使用DNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。另外，各種方法可用于提高子代噬菌體為所需突變體的可能性。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，并且可商業(yè)途徑獲得用于產(chǎn)生這種噬菌體的試劑盒。重組DNA構(gòu)建體和表達(dá)本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有一種或多種本發(fā)明核苷酸序列的重組DNA構(gòu)建體的用途。所述重組構(gòu)建體用于連接載體，例如質(zhì)?；虿《据d體，其中插入編碼用于本發(fā)明的抗體的DNA分子。編碼基因可以通過(guò)Sambrook等,1989和Ausubel等,1989描述的技術(shù)生成?；蛘?，DNA序列可以使用例如合成儀化學(xué)合成。參見(jiàn)，例如OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS(1984,Gait,ed.,IRLPress,Oxford)中描述的技術(shù)，其通過(guò)引用整體結(jié)合入本文。本發(fā)明的重組構(gòu)建體包含能夠表達(dá)編碼DNA的RNA和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)載體。所述載體可以進(jìn)一步包含調(diào)控序列，包括可操作連接至開(kāi)放閱讀框(ORF)的啟動(dòng)子。所述載體可以進(jìn)一步包含選擇性標(biāo)記序列。還可能需要特定的起始和細(xì)菌分泌信號(hào)，以有效翻譯被插入的編碼序列的靶基因。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有至少一種本文公開(kāi)的DNA的宿主細(xì)胞的用途。所述宿主細(xì)胞可以實(shí)際為可應(yīng)用表達(dá)載體的任何細(xì)胞。例如，它可以是高級(jí)真核宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)、低級(jí)真核宿主細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞)，但優(yōu)選是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。重組構(gòu)建體至宿主細(xì)胞的引入可以通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE、右旋糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔或噬菌體感染來(lái)實(shí)現(xiàn)。細(xì)菌表達(dá)細(xì)菌使用的有效表達(dá)載體如下構(gòu)建：在帶有功能性啟動(dòng)子的可操作閱讀框中插入編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性DNA序列以及適當(dāng)?shù)姆g起始和終止信號(hào)。所述載體將包含一種或多種表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起始點(diǎn)，復(fù)制起始點(diǎn)保證載體維持并且按需要提供在宿主內(nèi)的擴(kuò)增。用于轉(zhuǎn)化的適當(dāng)?shù)脑怂拗靼ù竽c桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌以及假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬內(nèi)的各個(gè)種。細(xì)菌載體可以是例如基于噬菌體、質(zhì)粒或噬菌粒的。這些載體可以含有選擇性標(biāo)記和衍生自可商業(yè)途徑獲得的質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)，所述質(zhì)粒通常含有公知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的元件。在轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主菌株且所述宿主菌株生長(zhǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度之后，通過(guò)適當(dāng)方式(例如，變溫或化學(xué)誘導(dǎo))去抑制/誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，并培養(yǎng)細(xì)胞額外的時(shí)期。細(xì)胞通常經(jīng)離心收集，通過(guò)物理或化學(xué)方式破碎，得到的粗提取液留待進(jìn)一步純化。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)表達(dá)蛋白質(zhì)的預(yù)期用途而有利地篩選許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)生成大量的所述蛋白質(zhì)以產(chǎn)生抗體或篩選肽文庫(kù)時(shí)，可能需要引導(dǎo)高水平的容易純化的融合蛋白產(chǎn)物的表達(dá)的載體。治療方法治療方法涉及為需要治療的患者施用治療有效量的本發(fā)明涵蓋的抗體。“治療有效量”定義為：作為單次劑量或者根據(jù)多次劑量方案單獨(dú)或與緩解不利疾患的其他物質(zhì)聯(lián)合使用，足以清除患者受治療區(qū)域中CD38陽(yáng)性細(xì)胞但在毒理學(xué)上耐受的抗體量。所述患者可以是人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物(例如，兔、大鼠、小鼠、猴或其他低等靈長(zhǎng)類(lèi))。用于本發(fā)明的抗體可以與已知藥物共同給藥，并且所述抗體在一些情況下自身被改變。例如，抗體可以軛合至免疫毒素或放射性同位素，可能進(jìn)一步提高效力。特別適合用抗體治療的病癥和疾患是多發(fā)性骨髓瘤(MM)和其他血液疾病，例如慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)?？贵w還可以用于治療炎性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。為了治療任何前述疾患，可以使用一種或多種生理學(xué)可接受的載體或賦形劑，以常規(guī)方式配制根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物。用于本發(fā)明的抗體可以通過(guò)任何適當(dāng)方式給藥，這可以根據(jù)受治療疾患的類(lèi)型而變化。可能的給藥途徑包括胃腸外(例如，肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，如果需要局部免疫抑制治療，則局部給藥。另外，用于本發(fā)明的抗體可以通過(guò)例如使用逐步降低的抗體劑量脈沖輸注給藥。優(yōu)選地，劑量給藥通過(guò)注射進(jìn)行，最優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)或皮下注射，部分取決于所述給藥是短期的還是長(zhǎng)期的。給藥量將取決于多種因素，例如臨床癥狀、個(gè)體體重、是否施用其他藥物。技術(shù)人員將理解，給藥途徑將根據(jù)受治療病癥或疾患而變化。確定根據(jù)本發(fā)明的新型多肽的治療有效量將主要取決于特定患者特點(diǎn)、給藥途徑和受治療疾患的性質(zhì)。一般原則可以參考例如InternationalConferenceonHarmonisation出版物和REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,chapters27and28,pp.484-528(18thed.,AlfonsoR.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:MackPub.Co.,1990)。更具體地，確定治療有效量將根據(jù)例如毒性和藥物療效等因素。毒性可以使用現(xiàn)有技術(shù)公知的和前述參考文獻(xiàn)記載的方法來(lái)測(cè)定。療效可以使用下述實(shí)施例中有關(guān)方法的相同指導(dǎo)來(lái)測(cè)定。診斷方法CD38在某些惡性腫瘤中血液細(xì)胞上高度表達(dá)；因此，用于本發(fā)明的抗CD38抗體可用以使患者中可能的惡性細(xì)胞聚集位點(diǎn)成像或顯影。在這方面，抗體可通過(guò)使用放射性同位素、親和標(biāo)記(例如生物素、卵白素等)、熒光標(biāo)記、順磁原子等進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。實(shí)現(xiàn)所述標(biāo)記的方法是本領(lǐng)域公知的?？贵w在診斷成像中的臨床應(yīng)用綜述為Grossman,H.B.,Urol.Clin.NorthAmer.13:465-474(1986)),Unger,E.C.等,Invest.Radiol.20:693-700(1985)),和Khaw,B.A.等,Science209:295-297(1980))。用作診斷化合物的本發(fā)明優(yōu)選的抗體或抗原結(jié)合區(qū)包含：重鏈可變區(qū)序列，選自SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105和106；和/或輕鏈可變區(qū)序列，選自SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109和110。這種可檢測(cè)標(biāo)記抗體的聚集的檢測(cè)可以指示腫瘤進(jìn)展部位，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，這種檢驗(yàn)通過(guò)取出組織或血液樣品并在所述可檢測(cè)標(biāo)記抗體存在下培養(yǎng)所述樣品來(lái)進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該技術(shù)以非侵入方式進(jìn)行，通過(guò)使用磁成像、熒光照相等。這種診斷測(cè)定可以用于監(jiān)測(cè)疾病治療的成功，其中CD38陽(yáng)性細(xì)胞的存在或不存在是相關(guān)指示。本發(fā)明還包括抗CD38抗體的用途，如本文描述的，用于體外環(huán)境的診斷。治療和診斷組合物用于本發(fā)明的抗體可根據(jù)已知方法配制，以制備藥學(xué)有用的組合物，其中用于本發(fā)明的抗體(包括其任何功能性片段)以混合物形式與藥學(xué)可接受的載體結(jié)合。例如，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES(18thed.,AlfonsoR.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:MackPub.Co.,1990)中描述了適當(dāng)?shù)妮d體及其制劑。為了生成適合有效給藥的藥學(xué)可接受的組合物，所述組合物將含有有效量的一種或多種用于本發(fā)明的抗體以及適當(dāng)量的載體。本發(fā)明優(yōu)選的用作診斷化合物的抗體或抗原結(jié)合區(qū)包含：重鏈可變區(qū)序列，選自SEQIDNO:16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105和106；和/或輕鏈可變區(qū)序列，選自SEQIDNO:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,109和110。制劑可適當(dāng)?shù)嘏渲埔援a(chǎn)生控制釋放的活性化合物?？墒褂镁酆衔镆詮?fù)合或吸收抗CD38抗體實(shí)現(xiàn)控釋制劑。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)拇蠓肿?例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚(yú)精蛋白)和大分子濃度以及為控制釋放的摻入方法，可以實(shí)施控制給藥?？刂瓶蒯屩苿┳饔贸掷m(xù)時(shí)間的另一可能方法是將抗CD38抗體摻入聚合物材料顆粒，所述聚合物材料例如聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚乳酸或乙烯乙酸乙烯酯共聚物?；蛘?，除了將這些物質(zhì)摻入聚合物顆粒，還可能將這些物質(zhì)包入微膠囊或膠體藥物遞送系統(tǒng)或粗乳液中，所述微膠囊例如通過(guò)凝聚技術(shù)制備的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和例如通過(guò)界面聚合法制備的聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊，所述膠體藥物遞送系統(tǒng)例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊。這些技術(shù)公開(kāi)于Remington'sPharmaceuticalSciences(1980)?；衔锟膳渲瞥捎糜谕ㄟ^(guò)注射胃腸外給藥，例如通過(guò)快速濃注或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以添加有防腐劑的單位劑量形式存在，例如安瓿或多劑量容器中。組合物可以采用例如于油或水載體中的混懸劑、溶液劑或乳劑形式，并且可以包含配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以為粉末形式，在使用前用適當(dāng)載體例如無(wú)菌無(wú)熱原水配制。組合物可以按需要以包裝或分配器裝置提供，所述包裝或分配器裝置可以包含一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑量形式。所述包裝可以例如包括金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。所述包裝或分配器裝置可以附帶給藥說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明通過(guò)參考下述工作實(shí)施例進(jìn)一步得到理解，所述實(shí)施例意在描述而非限制本發(fā)明。實(shí)施例細(xì)胞系下述細(xì)胞系獲自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)、德國(guó)微生物保藏中心(DSMZ)或美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)：產(chǎn)生CD38小鼠IgG1單克隆抗體OKT10的雜交瘤細(xì)胞系(ECACC,#87021903)、Jurkat細(xì)胞(DSMZ,ACC282)、LP-1(DSMZ,ACC41)、RPMI8226(ATCC,CCL-155)、HEK293(ATCC,CRL-1573)、CHO-K1(ATCC,CRL-61)、Raji(ATCC,CCL-86)和OPM2(DSMZ,ACC50)。細(xì)胞和培養(yǎng)條件所有細(xì)胞于加濕培養(yǎng)箱中在37℃和5％CO2標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。細(xì)胞系LP-1、RPMI8226、Jurkat和Raji培養(yǎng)于添加了10％FCS(PANbiotechGmbH,#P30-3302)、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素(Gibco,#15140-122)和2mM谷氨酰胺(Gibco,#25030-024)的RPMI1640(PanbiotechGmbH,#P04-16500)中，在Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞的情況中，額外添加了10mMHepes(PanbiotechGmbH,#P05-01100)和1mM丙酮酸鈉(PanbiotechGmbH,#P04-43100)。CHO-K1和HEK293生長(zhǎng)于添加了2mM谷氨酰胺和10％FCS的DMEM(Gibco,#10938-025)中。穩(wěn)定的CD38CHO-K1轉(zhuǎn)染子在G418(PAAGmbH,P11-012)存在下維持，而對(duì)于HEK293必須添加1mM丙酮酸鈉。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293后，用超低IgGFCS(Invitrogen,#16250-078)替換10％FCS。細(xì)胞系OKT10培養(yǎng)于添加了2mM谷氨酰胺和20％FCS的IDMEM(Gibco,#31980-022)中。從外周血液制備單細(xì)胞混懸液所有血液樣品在征得同意后采集。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)通過(guò)(Sigma)從健康供體分離外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)。通過(guò)在RT下于A(yíng)CK裂解緩沖液(0.15MNH4Cl,10mMKHCO3,0.1MEDTA)或商業(yè)誘導(dǎo)劑(Bioscience,#00-4333)中培養(yǎng)5分鐘，從這些細(xì)胞混懸液中清除紅細(xì)胞。細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后進(jìn)一步處理，用于流式細(xì)胞計(jì)量或ADCC(見(jiàn)下文)。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)("FACS")所有染色在圓底96孔培養(yǎng)板(NalgeNunc)中進(jìn)行，每孔2x105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞在4℃下的50μlFACS緩沖液(PBS,3％FCS,0.02％NaN3)中用指定濃度的Fab或IgG抗體培養(yǎng)40分鐘。細(xì)胞經(jīng)兩次洗滌，然后在4℃下用1:200稀釋于FACS緩沖液中的R-藻紅蛋白(PE)軛合的山羊抗人或山羊抗小鼠IgG(H+L)F(ab')2(JacksonImmunoResearch)培養(yǎng)30分鐘。細(xì)胞經(jīng)再次洗滌，重懸于0.3mlFACS緩沖液，然后在FACSCalibur(BectonDickinson,SanDiego,CA)中進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析。對(duì)于基于FACS的Scatchard分析，RPMI8226細(xì)胞以12個(gè)不同的稀釋液(1:2n)染色，所述稀釋液開(kāi)始于12.5μg/ml(IgG)的終濃度。每個(gè)濃度進(jìn)行至少兩次獨(dú)立測(cè)量，根據(jù)Chamow等(1994)從中位熒光強(qiáng)度外推出KD值。表面等離子體共振使用BIAcore3000儀器(Biacore,Uppsala,Sweden)測(cè)定各自Fab的系列稀釋液動(dòng)力學(xué)常數(shù)kon和koff，所述Fab與共價(jià)固定的CD38-Fc融合蛋白結(jié)合。對(duì)于共價(jià)抗原固定，使用了標(biāo)準(zhǔn)EDC-NHS胺偶聯(lián)化學(xué)。對(duì)于CD38Fc融合蛋白的直接偶聯(lián)，CM5傳感器(senor)芯片(Biacore)用10mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中的～600-700RU涂布。對(duì)于參考流動(dòng)細(xì)胞，使用各自量的HSA(人血清白蛋白)。使用1.5-500nM的Fab濃度范圍在流速為20μl/min的PBS(136mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.76mMKH2PO4pH7.4)中進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)量。每個(gè)濃度的注射時(shí)間為1分鐘，隨后是2分鐘的解離期。使用5μl10mMHCl進(jìn)行再生。使用BIA評(píng)價(jià)軟件3.1(Biacore)局部擬合所有sensograms。實(shí)施例1:從HuCAL文庫(kù)生成抗體為產(chǎn)生抗CD38的治療性抗體，進(jìn)行了對(duì)MorphoSysHuCAL噬菌體展示文庫(kù)的篩選。HuCAL是基于概念(Knappik等,2000；Krebs等,2001)的Fab文庫(kù)，其中全部六個(gè)CDR是不同的，并且采用了CysDisplayTM技術(shù)將Fab片段連接至噬菌體表面(2001)。A.噬菌粒提取、噬菌體擴(kuò)增與純化HuCAL噬菌粒文庫(kù)在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的2xTY培養(yǎng)基(2xTY-CG)中擴(kuò)增。在輔助噬菌體(VCSM13)以0.5的OD600感染(37℃下30分鐘，無(wú)振搖；37℃下30分鐘，以250rpm振搖)后，細(xì)胞經(jīng)離心沉淀(4120g；5min；4℃)，重懸于2xTY/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素并在22℃生長(zhǎng)過(guò)夜。噬菌體從上清液PEG沉淀，重懸于PBS/20％甘油并于-80℃保存。在兩次淘選之間的噬菌體擴(kuò)增如下進(jìn)行：對(duì)數(shù)期TG1細(xì)胞用洗脫的噬菌體感染并涂板于添加了1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB瓊脂(LB-CG)上。在30℃過(guò)夜培養(yǎng)后，菌落被刮去并調(diào)為0.5的OD600，然后如上添加輔助噬菌體。B.用HuCAL淘選為了選擇，HuCAL抗體-噬菌體被分成與不同VH主基因相對(duì)應(yīng)的三個(gè)池(池1:VH1/5λκ，池2:VH3λκ，池3:VH2/4/6λκ)。這些池各自在表達(dá)CD38的CHO-K1細(xì)胞上進(jìn)行3輪全細(xì)胞淘選，隨后進(jìn)行pH洗脫和在CD38陰性CHO-K1細(xì)胞上后吸附步驟，用于清除無(wú)關(guān)的抗體-噬菌體。最后，使用剩余的抗體噬菌體來(lái)感染大腸桿菌TG1細(xì)胞。離心后，細(xì)菌沉淀(pellet)重懸于2xTY培養(yǎng)基，涂布于瓊脂平板并在30℃過(guò)夜培養(yǎng)。然后，從所述平板刮取選定的菌落，提取噬菌體并進(jìn)行擴(kuò)增。如首輪篩選一樣進(jìn)行第二輪和第三輪篩選。將選定HuCAL噬菌體的編碼Fab的插入物亞克隆入表達(dá)載體x9_Fab_FS(Rauchenberger等,2003)，以促進(jìn)可溶性Fab的快速表達(dá)。選定克隆的DNA用XbaI和EcoRI消化，由此切出編碼Fab的插入物(ompA-VLCL和phoA-Fd)，并克隆入經(jīng)XbaI/EcoRI切割的載體x9_Fab_FS。在該載體中表達(dá)的Fab具有用于檢測(cè)和純化的兩個(gè)C端標(biāo)簽(FLAGTM和II)。實(shí)施例2:生物測(cè)定根據(jù)基于流式細(xì)胞計(jì)量分析(Naundorf等,2002)的公開(kāi)方案測(cè)定抗體依賴(lài)型細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴(lài)型細(xì)胞毒性如下：ADCC：對(duì)于A(yíng)DCC測(cè)定，靶細(xì)胞(T)被調(diào)節(jié)為2.0E+05細(xì)胞/ml并在RPMI1640培養(yǎng)基(PanbiotechGmbH)中用100ng/ml鈣黃綠素AM(MolecularProbes,C-3099)室溫標(biāo)記2分鐘。通過(guò)在RPMI1640培養(yǎng)基中洗滌3次來(lái)去除殘留的鈣黃綠素。與此同時(shí)，PBMC作為(自然殺傷)效應(yīng)細(xì)胞(E)的來(lái)源被制備，調(diào)節(jié)至1.0E+07，并與標(biāo)記的靶細(xì)胞混合，以根據(jù)測(cè)定條件產(chǎn)生最終50:1或更小的E:T比。細(xì)胞洗滌一次，細(xì)胞混合物重新懸浮于200μl含有各種不同稀釋抗體的RPMI1640培養(yǎng)基。平板在標(biāo)準(zhǔn)化條件下于37℃、5％CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。在FACS分析之前，細(xì)胞用碘化丙錠(PI)標(biāo)記并通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x(Becton-Dickinson)分析。每次測(cè)定計(jì)數(shù)50.000至150.000。下述方程式給出殺傷活性[％]：其中EDA＝死亡細(xì)胞數(shù)目(鈣黃綠素+PI染色的細(xì)胞)，且ELA＝活細(xì)胞數(shù)目(鈣黃綠素染色的細(xì)胞)CDC:對(duì)于CDC測(cè)定，將5.0E+04CD38CHO-K1轉(zhuǎn)染子以及人類(lèi)血清(Sigma,#S-1764)的1:4稀釋液與各抗體添加至微量滴定孔板(Nunc)。所有試劑和細(xì)胞稀釋于添加了10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基(PanbiotechGmbH)。反應(yīng)混合物在標(biāo)準(zhǔn)化條件下于37℃、5％CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。熱滅活的補(bǔ)體或無(wú)抗體的CD38轉(zhuǎn)染子用作陰性對(duì)照。細(xì)胞用PI標(biāo)記并進(jìn)行FACS分析?？偣灿?jì)數(shù)5000，不同抗體濃度下的死亡細(xì)胞數(shù)目用于確定EC50值。下述方程式給出了殺傷活性[％]:其中EDC＝死亡細(xì)胞數(shù)目(PI染色的細(xì)胞)，且ELC＝活細(xì)胞數(shù)目(未被染色的)針對(duì)每種抗體，來(lái)自共12個(gè)不同的抗體稀釋液(1:2n)的細(xì)胞毒性值在A(yíng)DCC中采用三次實(shí)驗(yàn)，而在CDC采用兩次實(shí)驗(yàn)，以使用標(biāo)準(zhǔn)分析軟件(GraphPadSoftware)獲得EC-50值。實(shí)施例3:穩(wěn)定CD38-轉(zhuǎn)染子和CD38Fc融合蛋白的產(chǎn)生為了產(chǎn)生供淘選和篩選的CD38蛋白，必須建立兩個(gè)不同的表達(dá)系統(tǒng)。第一種策略包括產(chǎn)生CD38-Fc融合蛋白，該蛋白在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞之后從上清液純化。第二種策略包括產(chǎn)生供高CD38表面表達(dá)的穩(wěn)定的CHO-K1細(xì)胞系，用以通過(guò)全細(xì)胞淘選來(lái)選擇抗體-噬菌體。作為起始步驟，Jurkat細(xì)胞(DSMZACC282)用于產(chǎn)生cDNA(Invitrogen)，隨后使用分別互補(bǔ)于CD38的前7個(gè)和后9個(gè)密碼子的引物(引物MTE001&MTE002rev；表4)擴(kuò)增整個(gè)CD38編碼序列。CD38插入物的序列分析證實(shí)了Jackson等(1990)公開(kāi)的氨基酸序列，除了如Nata等(1997)所描述的，49位顯示谷氨酰胺取代了酪氨酸。為了引入限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)并克隆入表達(dá)載體pcDNA3.1(Stratagene)的不同衍生物，經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物用作整個(gè)基因(引物MTE006&MTE007rev,表4)或其部分(引物MTE004&MTE009rev,表4)再擴(kuò)增的模板。在后一情況中，編碼細(xì)胞外域(aa45至300)的片段經(jīng)擴(kuò)增后克隆入人Vκ前導(dǎo)序列和人Fc-γ1序列之間的框架。該載體作為產(chǎn)生可溶性CD38-Fc融合蛋白的表達(dá)載體。另一種沒(méi)有前導(dǎo)序列的pcDNA3.1衍生物用來(lái)插入CD38全長(zhǎng)基因。這種情況下，F(xiàn)c編碼區(qū)前面的終止密碼子和缺失的前導(dǎo)序列產(chǎn)生CD38表面表達(dá)。HEK293細(xì)胞用Fc融合蛋白載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生可溶性CD38Fc融合蛋白，如果是全長(zhǎng)衍生物，則轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞以產(chǎn)生穩(wěn)定的CD38表達(dá)細(xì)胞系。表4：引物#序列(5’-＞3’)MTE001ATGGCCAACTGCGAGTTCAGC(SEQIDNO：123)MTE002revTCAGATCTCAGATGTGCAAGATGAATC(SEQIDNO：124)MTE004TTGGTACCAGGTGGCGCCAGCAGTG(SEQIDNO：125)MTE006TTGGTACCATGGCCAACTGCGAG(SEQIDNO：126)MTE007revCCGATATCA＊GATCTCAGATGTGCAAGATG(SEQIDNO：127)MTE009revCCGATATCGATCTCAGATGTGCAAGATG(SEQIDNO：128)*在有義方向形成終止密碼子(TGA)實(shí)施例4：IgG1的克隆、表達(dá)和純化：為了表達(dá)全長(zhǎng)IgG，重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)片段從Fab表達(dá)載體亞克隆入適當(dāng)?shù)腳hIg載體(參見(jiàn)圖7至9)。使用限制性?xún)?nèi)切核酸酶對(duì)BlpI/MfeI(插入物制備)和BlpI/EcoRI(載體制備)將VH結(jié)構(gòu)域片段亞克隆入_hIgG1。使用酶對(duì)EcoRV/HpaI(λ-插入物)和EcoRV/BsiWI(κ-插入物)將VL結(jié)構(gòu)域片段亞克隆入各自的_hIgκ1或_h_Igλ_1載體。得到的IgG構(gòu)建體通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在HEK293細(xì)胞(ATCCCRL-1573)中表達(dá)，使用了標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣-DNA共沉淀技術(shù)。通過(guò)經(jīng)由蛋白質(zhì)A瓊脂糖柱的親和層析，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化IgG。進(jìn)一步的下游加工包括凝膠過(guò)濾交換緩沖液和無(wú)菌過(guò)濾經(jīng)純化的IgG。質(zhì)量控制顯示經(jīng)由還原SDS-PAGE的＞90％的純度，分析性尺寸排阻色譜測(cè)定＞90％的單體IgG。物質(zhì)的內(nèi)毒素含量通過(guò)基于動(dòng)態(tài)LAL的測(cè)定法(CambrexEuropeanEndotoxinTestingService，Belgium)來(lái)測(cè)定。實(shí)施例5：嵌合OKT10(chOKT10；SEQIDNO：72和73)的產(chǎn)生和制備為構(gòu)建chOKT10，使用從鼠OKT10雜交瘤細(xì)胞系(ECACC#87021903)制備的cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增小鼠的VH和VL區(qū)。如Dattamajumdar等,1996；Zhou等,1994所公開(kāi)的使用一組引物。PCR產(chǎn)物用于Topo克隆(Invitrogen；pCRII載體)并對(duì)單克隆進(jìn)行序列分析(M13反向引物)，揭示了兩種不同的κ輕鏈序列和一個(gè)重鏈序列。根據(jù)序列比對(duì)(EMBL-核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù))和文獻(xiàn)(Krebber等,1997)，κ序列之一屬于腫瘤細(xì)胞融合配偶體X63Ag8.653的內(nèi)在組分，并因此不屬于OKT10抗體。因此，只有新κ序列和單VH片段用于進(jìn)一步克隆。兩種片段再擴(kuò)增以增加限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)，隨后克隆入各自的IgG1表達(dá)載體。重鏈序列(SEQIDNO:72)和輕鏈序列(SEQIDNO:73)列于圖6。HEK293細(xì)胞經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，F(xiàn)ACS分析上清液中與CD38過(guò)表達(dá)的Raji細(xì)胞系(ATCC)結(jié)合的嵌合OKT10抗體。實(shí)施例6:FACS分析交叉反應(yīng)性(MOR03087和MOR03088)1.材料與方法:圖11和12顯示淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞的FACS分析：EDTA處理的血液樣品從健康人(在征得同意之后)和非人靈長(zhǎng)類(lèi)(獼猴、短尾猴和狨猴)獲得，并根據(jù)提供商(Sigma)說(shuō)明書(shū)使用Histopaque細(xì)胞分離系統(tǒng)進(jìn)行密度梯度離心。為FACS分析，來(lái)自相界面(PBMC部分)和沉淀(紅細(xì)胞部分)的細(xì)胞用不同樣式的抗CD38抗體培養(yǎng)。不同抗CD38抗體的交叉反應(yīng)性特征概況顯示于圖13。2.總結(jié)與結(jié)論:結(jié)果顯示，在所有CD38抗體中，僅MOR03087和MOR03088顯示了對(duì)狨猴PBMC的交叉反應(yīng)性。令人驚訝的是，與短尾猴和獼猴紅細(xì)胞上的強(qiáng)表達(dá)相比較，狨猴紅細(xì)胞上的CD38表達(dá)幾乎不可檢測(cè)。因此，狨猴紅細(xì)胞和PBMC上的CD38表達(dá)更體現(xiàn)了人類(lèi)的情況，其中CD38在紅細(xì)胞上弱表達(dá)而在PBMC上中至高表達(dá)。因此，狨猴被認(rèn)為適合作為結(jié)合CD38的分子的毒性研究模型?；谏鲜鲅芯浚瑳Q定進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)合劑MOR03087和MOR03088，如本文其他地方所描述的，參見(jiàn)例如涉及“用于本發(fā)明的抗體”的段落。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，親本的衍生抗體也將顯示相當(dāng)?shù)慕徊娣磻?yīng)性特征。參考文獻(xiàn)：Antonelli,A.,Baj.,G.,Marchetti.,P.,Fallahi,P.,Surico,N.,Pupilli,C,Malavasi,F.,Ferrannini,P.(2001).Humananti-CD38autoantibodiesraiseintracellularcalciumandstimulateinsulinreleaseinhumanpancreaticislets.Diabetes50:985-991。AusielloC.M.,UrbaniF.,LandeR.,laSalaA.,DiCarloB.,BajG.,SuricoN.,HilgersJ.,DeaglioS.,FunaroA.,MalavasiF.(2000)FunctionaltopographyofdiscretedomainsofhumanCD38.TissueAntigens.2000Dec；56(6):539-47。Chamow,S.M.,Zhang,D.Z.,Tan,X.Y,Mathre,S.M.,Marsters,S.A.,Peers,D.H.,Byrn,R.A.,Ashknazi,A.,Junghans,R.P(1994).humanized,bispecificimmunoadhesin-antibodythatretargetsCD3+effectorstokillHIV-1-infectedcells.JImmunol.1994Nov1；153(9):4268-80。Dattamajumdar,A.K.,Jacobsen,D.P.,Hood,L.E.,Osman,G.E.(1996).Rapidcloningofrearrangedmouseimmunoglobulinvariablegenes.Immunogentetics43,141-151。EllisJ.H.,Barber,K.A.,Tutt,A.,Hale,C,Lewis,A.P.,Glennie,M.J.,Stevenson,G.T.,andCrowe,J.(1995).Engineeredanti-CD3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