本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中基因突變檢測領(lǐng)域，具體涉及一種中國人群中MagR基因新功能性突變體及其檢測和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：2015年11月，北京大學(xué)謝燦教授通過理論分析并通過實驗驗證，在果蠅中確定了一個編號CG8198的能感受磁場的不知名蛋白，并將其命名為磁場受體基因(magnetoreceptor，MagR)[SiyingQin,HangYin,CeliYang,CanXie.Amagneticproteinbiocompass[J].Naturematerials.2015.15(2).]，該基因結(jié)構(gòu)保守，不僅存在于果蠅中，它的同源基因同樣存在于鳥類和人類中。果蠅中發(fā)現(xiàn)的這種MagR蛋白既可以結(jié)合鐵和硫原子，形成特殊的棒狀結(jié)構(gòu)，在弱磁場中它們能以類似指南針的方式確定自身方向，感應(yīng)磁場變化；另外，它也可以與Cry結(jié)合，參與果蠅的晝夜節(jié)律。人類MagR基因核苷酸鏈位于第九染色體，共包含18030個核苷酸，由其表達(dá)的蛋白如SEQIDNO:2所示。人類MagR基因核苷酸鏈包含4個外顯子，共計390個核苷酸(第一外顯子：81個核苷酸，第二外顯子:54個核苷酸；第三外顯子：106個核苷酸；第四個外顯子：149個核苷酸)。在轉(zhuǎn)錄過程中，通過內(nèi)含子剪接，四個外顯子390個核苷酸共對應(yīng)著129個前體氨基酸(氨基酸序列：msaslvratvravskrklqptraaltltpsavnkikqllkdkpehvgvkvgvrtrgcnglsytleytktkgdsdeeviqdgvrvfiekkaqltllgtemdyvedklssefvfnnpnikgtcgcgesfni)，其中第13-129位的氨基酸共同構(gòu)成成熟肽，發(fā)揮作用。內(nèi)含子剪接需要區(qū)分外顯子及內(nèi)含子，識別信號主要包括內(nèi)含子5‘及3’末端序列及中間分支點(branchsite)附件的序列。內(nèi)含子5‘剪接點稱為供體點(donorsite)，3’剪接點稱為受體點(acceptorsite)。DNA內(nèi)含子開始和末尾的兩對堿基最為保守，大多數(shù)情況為GT-AG(約占99.24％)，少數(shù)為GC-AG(約占0.7％)，極少數(shù)為AT-AC(0.05)。除了這兩對堿基外，他們附件的堿基在不同物種間存在差異，但在物種內(nèi)有保守性。當(dāng)該保守堿基發(fā)生突變時，會導(dǎo)致可變剪接。據(jù)估計，人40-60％的基因存在可變剪接形式?？勺兗艚?alternativesplicing)：即一個mRNA前體通過不同的內(nèi)含子去除方式可以獲得不同成熟mRNA。通過可變剪接，同一基因可以產(chǎn)生多種蛋白產(chǎn)物，放大了對不同物種基因組的差別，極大的擴張了不同物種的變化空間?？勺兗艚优c基因表達(dá)的時空性息息相關(guān)，在不同時期，不同組織基因的表達(dá)形式可能不同，與物種發(fā)育的不同時期相對應(yīng)，可變剪接的調(diào)控與生物體的健康息息相關(guān)，其突變可以直接導(dǎo)致疾病。可變剪接主要包括四種模式：1、內(nèi)含子不切割；2、5‘或3’切點競爭；3、外顯子跳過；4、外顯子互斥。不同的剪接形式，將會選擇不同的外顯子，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能均不同。基因組水平上單個核苷酸變異可能會引起可變剪接，同時會引起DNA序列多態(tài)性，即單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達(dá)300萬個甚至更多。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。當(dāng)前對于SNP的檢測，主要通過基因分型：它是利用數(shù)據(jù)庫中已有的SNP進行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究，主要包括基因芯片技術(shù)，Taqman技術(shù)，分子信標(biāo)技術(shù)和焦磷酸測序法等。(一)、基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)：是在固相支持介質(zhì)上進行分子雜交和原位熒光檢測的一種高通量SNP分析方法。(二)、Taqman技術(shù)在pcr反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種不同熒光標(biāo)記的探針，他們分別與兩個等位基因完全配對。探針運用了熒光共振能量轉(zhuǎn)換技術(shù)，探針的5’端和3’端分別用特殊染料標(biāo)記，稱為供體-受體染料對或爆-猝滅燃料對。(三)、分子信標(biāo)技術(shù)與Taqman技術(shù)相似，分子信標(biāo)技術(shù)也是在PCR反應(yīng)體系種加入熒光標(biāo)記的探針與靶序列雜交，通過儀器檢測熒光值的變化，進行基因分型。(四)、焦磷酸測序法焦磷酸測序法是一種不依賴平板膠或毛細(xì)管電泳，不依賴DNA的熒光標(biāo)記/激發(fā)/檢測體系的序列分析技術(shù)，適用于已知SNP的序列驗證及基因分型。焦磷酸測序法主要是由4種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)反應(yīng)，包括DNA聚合酶、硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應(yīng)底物為adenosine5’phosphosulfate和熒光素。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種中國人群中MagR基因新功能性突變體及其檢測和應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種分離的編碼MagR突變體的核酸，所述核酸與野生型基因SEQIDNO:1相比，具有+8333G>A突變。一種用于檢測中國人群中MagR基因是否存在+8333G>A突變體的試劑盒，包括用于PCR擴增的如下的上游引物和下游引物：上游引物GTTGGCCTTCCCAGTGAGAT下游引物AGGCCACAGATGCTGTCAAA。所述的試劑盒還包括如下DNA抽提試劑：緩沖液A：0.5mmol/L的SDS，緩沖液B：50mmol/L的NaOH，緩沖液D：1mmol/L的碳酸鈉-丙酮，緩沖液W：無水乙醇，洗脫液:10mmol/L的Tris鹽。所述的試劑盒還包括：PCR反應(yīng)的試劑；從待測樣品中提取DNA的數(shù)據(jù)，對產(chǎn)物進行測序所需的測序反應(yīng)試劑。一種中國人群中MagR基因+8333G>A突變體的檢測方法，包括如下步驟：1)，提取外周血分離外周血白細(xì)胞；2)，DNA提??；3)，PCR擴增；4)，PCR產(chǎn)物純化；5)，對純化產(chǎn)物進行測序；6)，結(jié)果分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：MagR的內(nèi)含子開始和末尾的兩對堿基最為保守，大多數(shù)情況為GT-AG(約占99.24％)，當(dāng)該保守堿基對發(fā)生突變時，會導(dǎo)致基因剪接異常，可能會出現(xiàn)以下四種可能：1、內(nèi)含子不切割；2、5‘或3’切點競爭；3、外顯子跳過；4、外顯子互斥。最終導(dǎo)致由該基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的蛋白結(jié)構(gòu)、功能異常。本發(fā)明中MagR的SNP位點(+8333G>A)位于第二外顯子前一個核苷酸，處于外顯子和內(nèi)含子交界的高度保守區(qū)域，內(nèi)含子開始和末尾的兩對高度保守堿基(GT-AG)發(fā)生點突變，變成GT-AA，該SNP位點參與基因的可變剪接，使MagR基因第二外顯子因可變剪接，導(dǎo)致外顯子跳過，而不被轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使得MagR蛋白原本參與晝夜節(jié)律改變、識別磁場的功能喪失。當(dāng)前現(xiàn)有SNP檢測方法很多，每種檢測方法都能對該突變位點實現(xiàn)有效檢測。本發(fā)明的此一突變點對MagR基因存在重要影響，可以預(yù)見，它將直接導(dǎo)致MagR蛋白結(jié)構(gòu)異常，功能發(fā)生改變，使得有機體晝夜節(jié)律喪失，識別方向的能力變差，甚至直接導(dǎo)致某種疾病的發(fā)生：如失眠、定向障礙等。當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1的MagR基因及新發(fā)現(xiàn)SNP位點示意圖。具體實施方式人類MagR基因野生型核苷酸鏈基因序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明利用一代測序技術(shù)，對中國人群MagR基因進行測序，檢測并發(fā)現(xiàn)了一未曾報道過的MagR基因新的點突變位點(SNP位點)，此SNP位點(+8333G>A)位于第二外顯子前一個核苷酸，處于外顯子和內(nèi)含子交界的高度保守區(qū)域，提示此新的SNP位點參與了基因的可變剪接，改變了基因的結(jié)構(gòu)，從而影響著MagR基因的功能。因此，針對中國人群的此位點檢測具有重要的意義，因為MagR基因調(diào)節(jié)著生物體感知磁場方向的能力，而此新位點完全可以影響MagR基因調(diào)節(jié)生物體感知磁場方向的能力。本次新發(fā)現(xiàn)的SNP位點(+8333G>A)位于第二外顯子前一個核苷酸，處于外顯子和內(nèi)含子交界的高度保守區(qū)域，提示此新的SNP位點參與了基因的可變剪接，使MagR基因第二外顯子因可變剪接，導(dǎo)致外顯子跳過，而不被轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使得MagR蛋白原本參與晝夜節(jié)律改變、識別磁場的功能喪失。下方結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。實施例1本發(fā)明提供的對中國人群MagR基因進行測序的方法及試劑盒如下：一、DNA抽提：1、DNA抽提試劑：緩沖液A：0.5mmol/L的SDS；緩沖液B：50mmol/L的NaOH；緩沖液D：1mmol/L的碳酸鈉-丙酮；緩沖液W：無水乙醇；洗脫液:10mmol/L的Tris鹽。2、提取外周血分離外周血白細(xì)胞：(1)200人份上海地區(qū)人肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min；(2)小心吸取上層血漿，分裝到3個0.5ml離心管中；(3)在血細(xì)胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min；(4)2500rpm離心10min，棄上清；(5)加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min；(6)3000rpm離心10min，棄上清；(7)倒置離心管，去掉殘液；(8)得白細(xì)胞，－80℃凍存。3、DNA提取步驟：(1)上述白細(xì)胞中加入5mlDNA提取緩沖(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5％SDS)混勻；(2)加入25ul蛋白酶K使終濃度達(dá)到100ug/ml混勻，50℃水浴3h；(3)用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體積的(酚，氯仿，異戊醇)混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相；(4)用等體積的氯仿，異戊醇抽提一次。(5)2500rpm離心10min，轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇，室溫10min。2500rpm離心10min。棄上清。(6)加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉(PH5.2)與2倍體積-20℃預(yù)冷無水乙醇，-20℃20min。(7)12000r/min室溫離心5min。棄上清。將DNA溶于適量TE中。二、PCR1.預(yù)混PCR反應(yīng)液：預(yù)混反應(yīng)液包括2種，每種內(nèi)含有一對上下游PCR擴增引物，各檢測一個基因位點。按1ml配比量計算，共同的成分配置為：2.5uM的dNTPs：1×HotStarTaqbuffer；0.1UHotstarTaqpolymerase；2.8mMMgC12；2.5pmol的上游引物和2.5pmol的下游引物。2.PCR引物：設(shè)計了如下的引物：上游引物GTTGGCCTTCCCAGTGAGAT下游引物AGGCCACAGATGCTGTCAAA。3.PCR步驟：三、PCR產(chǎn)物純化1、儀器設(shè)備和耗材(1)儀器設(shè)備和耗材的品牌及型號如下表1。表1設(shè)備或耗材品牌貨號或型號電泳儀和電泳槽北京六一DYY-6CDYCP-31F冷凍離心機EppendorfCentrifuge5810R普通離心機EppendorfCentrifuge5424三孔電熱恒溫水槽上海精宏DK-8D凝膠成像儀復(fù)日集團移液器GILSONP20N,P200N,P1000NTipsAxygen粘性鋁膜3M電子分析天平上海精密科學(xué)儀器JA2003NMillipore純水機密理博Milli-QDirect8微波爐格蘭仕(2)試劑試劑品牌及型號如下表2。表2試劑品牌貨號或型號膠回收試劑盒AxygenEB上海生工生物有限公司無水乙醇上海生工生物有限公司64-17-5醋酸鈉上海生工生物有限公司瓊脂糖Biowest25×TAE緩沖液上海生工生物有限公司異丙醇BioBasicINC.67-63-02、工作流程確定未純化PCR產(chǎn)物的純化方法：樣品經(jīng)檢測膠檢測后，對樣品進行分析，采用如下的割膠純化法：配制回收膠回收膠濃度0.8％，梳齒使用8+18齒(1.5mm)厚。電泳點樣量：20L樣品+2L6×LoadingBuffer。割膠在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把已跑好的凝膠放在上面。關(guān)上樣品室外門，打開紫外燈(312nm)。打開電腦軟件，對回收膠進行拍照，保存圖片至相應(yīng)項目文件下。膠回收：參照《Axygen膠回收試劑盒使用說明書》。(1)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠。計算凝膠重量(提前記錄1.5ml離心管重量)，該重量作為一個凝膠體積(如100mg＝100μl體積)；(2)加入3個凝膠體積的BufferDE-A，混合均勻后于75℃加熱(低熔點瓊脂糖凝膠于40℃加熱)，間斷混合(每2-3min)，直至凝膠塊完全熔化(約6-8min)；(3)加0.5個BufferDE-A體積的BufferDE-B，混合均勻；當(dāng)分離的DNA片段小于400bp時，加入1個凝膠體積的異丙醇；(4)吸取步驟3中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離心管)中，12,000×g離心1min。棄濾液；(5)將制備管置回離心管，加0.5mlBufferW1，12,000×g離心30s，棄濾液；(6)將制備管置回離心管，加0.7mlBufferW2，12,000×g離心30s，棄濾液；(7)以同樣的方法再用0.7mlBufferW2洗滌一次12,000×g離心1min。注意：確認(rèn)在BufferW2concentrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇；(8)將制備管置于2ml離心管中，12,000×g離心2min；(9)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在室溫放置幾分鐘(大約需10分鐘)，以使乙醇充分揮發(fā)；(10)在DNA制備膜正中央加20-25μl水，室溫靜置1min。12,000×g離心1min洗脫DNA。純化的PCR產(chǎn)物濃度測定取1μl純化的PCR產(chǎn)物，用Nanodrop進行濃度測定。四、BDT測序反應(yīng)1、儀器設(shè)備和耗材(1)儀器設(shè)備和耗材的品牌及型號見下表3。表3設(shè)備或耗材品牌貨號或型號PCR儀器ABI9700冷凍離心機EppendorfCentrifuge5810R普通離心機EppendorfCentrifuge5424漩渦混合器Vor-Genie2美國SI移液器GILSONP20N,P200N,P1000NTipsAxygen粘性鋁膜3M(2)試劑試劑品牌及型號見下表4。表4試劑品牌貨號或型號BDTV3.1ABI5×SequencingBufferABIEDTA上海生工生物有限公司無水乙醇上海生工生物有限公司64-17-5醋酸鈉上海生工生物有限公司(3)試劑配制70％乙醇配制(100ml):用干凈的量筒量取70ml無水乙醇，將其全部倒入干凈滅菌的試劑瓶；再量取30ml超純水，將其全部倒入同一試劑瓶；搖勻。125mMEDTA：23.265克EDTA.Na2.2H2O，置于500ml燒杯中；加入約400mlddH2O，用熱磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?；用NaOH調(diào)節(jié)PH值到8；加ddH2O將溶液定容到500ml；高溫高壓滅菌后，室溫保存。3MNaAc：取102.06gNaAc·3H2O，溶于200mLdH2O中，用冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至250mL，分裝，高壓滅菌，室溫保存。試劑BDTv3.1,SequencingBuffer(5×)和Hi-DiFormamide初次使用前進行分裝，避免反復(fù)凍融。2、工作流程(1)配制測序體系前準(zhǔn)備將上述PCR純化產(chǎn)物、引物、超純水和SequencingBuffer(5×)從冰箱拿出，室溫融化；將BDTv3.1從冰箱拿出，冰上融化。引物為上游或下游引物中的一條引物。用普通離心機短暫離心上述步驟中已融化的試劑，使其離心管蓋和離心管壁上液體流入離心管底。取出96孔板，正放在冰上，右上角為A12。(2)測序反應(yīng)體系配制針對按照如下體系配制測序反應(yīng)體系，加入96孔板對應(yīng)孔內(nèi)。#：測序模板的用量。其中，經(jīng)割膠純化法純化的PCR產(chǎn)物：用量按如下公式計算：模板(ng)＝PCR產(chǎn)物長度/100*3.5。待反應(yīng)體系配制好后，用鋁膜封好96孔板。在Vortex上震蕩15sec后，用冷凍離心機短暫離心，待離心機升至2000rpm時停止。將96孔板取出離心機，放置在PCR儀上，蓋上PCR儀蓋。(3)設(shè)置BDT反應(yīng)程序BDT反應(yīng)程序96℃1min→(96℃10sec→50-55℃10sec→60℃2.5-4min)×(35-40)個循環(huán)→4℃保溫若引物的Tm≧58℃,測序時退火溫度設(shè)為55℃；若引物的Tm未知，測序時退火溫度設(shè)為52℃；若測序目的片段大小≦500bp，則60℃延伸2.5min；若測序目的片段大小>500bp,則60℃延伸3-4min；若為質(zhì)粒測序，則60℃延伸4min；質(zhì)粒測序循環(huán)數(shù)均設(shè)為4min。(4)BDT反應(yīng)產(chǎn)物純化BDT反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板放入離心機內(nèi)短暫離心。取出96孔板，往10μLBDT反應(yīng)產(chǎn)物中依次加入2.5μL125mMEDTA到溶液中，再加入30μL100％乙醇，用鋁膜封好，Vortex點振蕩4次或連續(xù)振蕩15sec。注意：有時BDT反應(yīng)產(chǎn)物由于反應(yīng)時封膜未封好，出現(xiàn)液體蒸發(fā)現(xiàn)象，對液體明顯減少的孔加去離子水補夠10μL，否則，造成乙醇濃度過高而測序結(jié)果容易出現(xiàn)染料峰。室溫避光放置15min。25℃，3860rpm，離心40min；離心結(jié)束后，立即將鋁膜掀開，倒置96孔板于紙巾上，再短暫離心，離心速度升至900rpm立即按停。加60μL70％酒精，3860rpm25℃離心15min；離心結(jié)束后，立即將鋁膜掀開，倒置96孔板于紙巾上，再短暫離心，離心速度升至900rpm立即按停。讓酒精在室溫避光揮發(fā)40min，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA，并用干凈鋁膜封好板，等待上測序儀。測序前放在-20℃冰箱保存。五、3730xl上機測序測序產(chǎn)物變性測序產(chǎn)物經(jīng)95℃5min后，立即冰上放置3-5min，待測序產(chǎn)物冷卻后，短暫離心，將產(chǎn)物離心至管底。開機打開穩(wěn)壓電源后，打開電腦進入windows界面，再把3730電源打開，自檢通過，左下角的綠燈亮起后，打開電腦上的程序“Run3730DataCollectionV3.0”。將樣品板放入樣品架上，然后打開3730右側(cè)的Stackerdoor，把樣品架放進去關(guān)門，關(guān)門后注意右下角的Stackerdoorindicatorlight的綠燈停止閃爍。注意將樣品板放入樣品架時的Septa的孔要與Retainer上的孔對齊，蓋上Retainer時注意兩邊有沒有扣緊。設(shè)定板及樣品編號“PlateManager”將設(shè)定好的數(shù)據(jù)選定然后按“Export”鍵導(dǎo)出，在其他電腦上以excel表格打開，對excel表格進行內(nèi)容更改。將B5“SampleName”下面相對的樣品名稱進行填寫(B6～B101為填寫樣品名的位置)，A7～A101為孔位置。將A2、B2、C2這三項進行填寫，這三項分別為“ContainerName”、“PlateID”和“Description”，然后將這個表格另存為A2相對的名稱。設(shè)定好的文件，拷入與3730配套的電腦，從“PlateManager”中將以前設(shè)定好的數(shù)據(jù)選定然后按“Ixport”鍵導(dǎo)入。從左邊的菜單選擇“RunScheduler”，點擊“SearchA…”鍵，進入面板“AddPlatestoInputStack”。用左鍵選中，然后點擊“Add”鍵，看到整個面板左上角的運行鍵變成綠色，然后按“Done”鍵退出面板。按運行鍵開始運行檢測。檢測完成后點擊“ServiceConsole”面板右下角的“StopAll”鍵把所有運行的程序停止，然后關(guān)閉3730，然后關(guān)電腦。六、結(jié)果分析1、MagR基因及新發(fā)現(xiàn)SNP位點示意圖請參見圖1。將本發(fā)明分離出的200個樣品的MagR基因與MagR基因野生型對比，發(fā)現(xiàn)其中兩個出現(xiàn)雜合型突變，該突變的SNP位點示意圖如圖1。從圖1可見，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的SNP位點(+8333G>A)位于第二外顯子前一個核苷酸，處于外顯子和內(nèi)含子交界的高度保守區(qū)域，內(nèi)含子開始和末尾的兩對高度保守堿基(GT-AG)發(fā)生點突變，變成GT-AA，該SNP位點參與基因的可變剪接，使MagR基因第二外顯子因可變剪接，導(dǎo)致第二外顯子跳過，其含有的54個核苷酸將被剪切掉，不參與轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使得MagR蛋白原本參與晝夜節(jié)律改變、識別磁場的功能喪失。除使用上述檢測方法對MagR基因的SNP位點(+8333G>A)進行檢測外，現(xiàn)有的SNP檢測方法，均能對本發(fā)明的MagR基因的SNP位點進行有效檢測。目前SNP的檢測方法大致可以分為兩大類:一大類是以單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性梯度凝膠電泳(DDGE)、酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)、等位基因特異性PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)等為代表的以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法。另一大類是以直接測序、DNA芯片、變性高效液相色譜(DHPLC)、質(zhì)譜檢測技術(shù)、高分辨率溶解曲線(HRM)等為代表的高通量、自動化程度較高的檢測方法。(一)、基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)：是在固相支持介質(zhì)上進行分子雜交和原位熒光檢測的一種高通量SNP分析方法。(二)、Taqman技術(shù)在pcr反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種不同熒光標(biāo)記的探針，他們分別與兩個等位基因完全配對。探針運用了熒光共振能量轉(zhuǎn)換技術(shù)，探針的5’端和3’端分別用特殊染料標(biāo)記，稱為供體-受體染料對或爆-猝滅燃料對。(三)、分子信標(biāo)技術(shù)與Taqman技術(shù)相似，分子信標(biāo)技術(shù)也是在PCR反應(yīng)體系種加入熒光標(biāo)記的探針與靶序列雜交，通過儀器檢測熒光值的變化，進行基因分型。(四)、焦磷酸測序法焦磷酸測序法是一種不依賴平板膠或毛細(xì)管電泳，不依賴DNA的熒光標(biāo)記/激發(fā)/檢測體系的序列分析技術(shù)，適用于已知SNP的序列驗證及基因分型。焦磷酸測序法主要是由4種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)反應(yīng)，包括DNA聚合酶、硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶，反應(yīng)底物為adenosine5’phosphosulfate和熒光素。以上公開的本發(fā)明優(yōu)選實施例只是用于幫助闡述本發(fā)明。優(yōu)選實施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該發(fā)明僅為所述的具體實施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發(fā)明的原理和實際應(yīng)用，從而使所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員能很好地理解和利用本發(fā)明。本發(fā)明僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。當(dāng)前第1頁1 2 3