本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥種子皮層特異啟動子pTaWG04的分離及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

小麥是世界上重要的糧食作物之一，約占全世界糧食種植面積的17%。目前，小麥的年消耗量超過了680萬噸，為全世界五分之一的人口提供了食物來源。小麥種子主要由三個主要的部分構(gòu)成：胚、胚乳和麥麩。麥麩是小麥磨取面粉后篩下的種皮，含有豐富的膳食纖維，其用途不僅可以用作飼料，而且可以用于維生素E、麩皮蛋白、植物酸的提取，低聚糖的制取，丙酮和丁醇的生產(chǎn)，尤其可以用作藥膳且擁有食療功效，對促進人類健康、預防疾病十分有益。因此分離和鑒定小麥種子皮層特異表達啟動子，并利用基因工程技術(shù)對小麥種皮中的營養(yǎng)成分進行遺傳改良已成為當前一種非常有效的手段。

高等植物的生長發(fā)育是不同基因在時間和空間上有序表達和協(xié)同作用的過程。啟動子作為轉(zhuǎn)錄水平上一個重要的調(diào)控元件，通過和眾多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進而決定了基因的表達模式和表達強度。對特異型啟動子的篩選和鑒定一直是基因工程研究的熱點之一，目前已經(jīng)鑒定出多個在種子中表達的特異型啟動子，如水稻胚乳特異啟動子Gt1（秈稻胚乳特異性啟動子Gt1的克隆及其功能驗證，長江大學學報，2010 (2)：44-48）、小麥儲藏蛋白基因Avenin-like b的啟動子（小麥儲藏蛋白基因Avenin-like b啟動子的克隆及表達載體構(gòu)建，華中科技大學，2011）、大豆油酸脫氫酶FAD2-1B啟動子（大豆油酸脫氫酶基因啟動子的克隆及其表達活性分析，中國生物工程雜志，2013 (4)：80-84）等等，利用信息生物學分析這些啟動子發(fā)現(xiàn)，它們均含有典型的種子特異性表達元件Skn-1 motif和GCN4 motif，這些元件的發(fā)現(xiàn)對初期啟動子功能的鑒別具有一定的指導意義。

小麥種子皮層特異啟動子作為一類專一性啟動子，能指導外源基因在小麥種皮中特異表達，它不僅能使目的基因定向、高效、穩(wěn)定在種子皮層中表達，而且可以有效的規(guī)避外源基因在其它器官發(fā)生諸如代謝負擔之類的負面效應(yīng)。所以，利用小麥種子皮層特異啟動子控制目的基因的特異表達具有重要的理論和實踐意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要目的是提供一種小麥種子皮層特異啟動子pTaWG04，該啟動子能驅(qū)動外源基因在小麥種子皮層中特異表達，利用這一特性，可為小麥新品種培育奠定良好應(yīng)用基礎(chǔ)。

本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。

小麥種子皮層特異啟動子pTaWG04，其堿基序列如SEQ ID No.1所示，包含1571bp堿基，該啟動子含有RNA聚合酶結(jié)合位點TATA-box，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點MBS，光響應(yīng)元件4cl-CMA2b、AT1-motif、Box4、GA-motif、I/L-box、TCT-motif等，以及種子啟動子所特有的元件Skn-1-motif和GCN4-motif。

所述小麥種子皮層特異啟動子pTaWG04，既驅(qū)動下游基因TaWG04的表達，同時也能驅(qū)動外源基因在小麥種子皮層中特異表達的啟動子，所述外源基因，具體例如GUS基因。

所述小麥種子皮層特異啟動子pTaWG04的制備方法，通過PCR制備獲得，具體步驟為：

（1）提取小麥品種鄭麥004的基因組DNA；

（2）設(shè)計引物，以步驟（1）中基因組DNA為模板，進行PCR擴增；

引物設(shè)計如下：

pTaWG04F：5’-ACGCGTCGACACACAAGCTGCCTTTCCATAA-3’（序列中5’端ACGCGTCGAC部分堿基為SalI酶切位點）；

pTaWG04R：5’-CGCGGATCCTGAATTTGTGGTTACTCTTGAT-3’（ 序列中5’端CGCGGATCC部分堿基為BamHI酶切位點）；

50μL的PCR反應(yīng)體系設(shè)計如下：

含Mg²⁺的 5×HF buffer，10μL；

濃度為2.5mM 的dNTP，2μL；

濃度均為5μM的pTaGW04F，2μL；

濃度均為5μM的pTaGW04R，2μL；

Phusion酶，0.5μL；

步驟（1）中所提取基因組模板，2μL；

ddH₂O， 31.5μL；

PCR反應(yīng)條件為：98℃預變性30s；98℃變性10s，56℃退火10s，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

本申請首次克隆獲得了pTaWG04啟動子，并對其生物學信息進行了初步分析，認為其屬于一個種子特異性啟動子。進一步通過Real-time PCR對其驅(qū)動的下游基因TaWG04進行定量分析，結(jié)果進一步證明，pTaWG04是一個種子皮層特異啟動子。而通過重組載體構(gòu)建及GUS染色實驗，結(jié)果證明，該啟動子可驅(qū)動外源基因在種子皮層中特定表達。

本發(fā)明所提供的小麥種子皮層特異啟動子pTaWG04，其克隆鑒定將對小麥品質(zhì)的改良和麥麩食療、藥用等具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為利用Real-time PCR技術(shù)對啟動子pTaWG04驅(qū)動的下游基因TaWG04進行的定量分析情況，其中A圖是Real-time PCR檢測TaWG04基因在小麥根、莖、葉、花藥、授粉后7天、14天、21天、28天和35天種子的表達情況；B圖是分離出授粉后28天種子的胚和胚乳，利用Real-time PCR檢測TaWG04基因的表達量；Real-time PCR分析過程中，Actin作為內(nèi)標；

圖2為利用啟動子在線分析軟件PlantCARE對pTaWG04啟動子分析情況；

圖3為構(gòu)建含有pTaWG04啟動子和GUS基因的重組質(zhì)粒過程示意圖及酶切驗證結(jié)果；其中A圖為重組質(zhì)粒構(gòu)建過程示意圖；B圖為對構(gòu)建的PMDC83-pTaWG04-GUS重組質(zhì)粒的酶切驗證結(jié)果；

圖4為轉(zhuǎn)基因小麥陽性苗PCR檢測，其中P為質(zhì)粒對照；陰性對照CK（鄭麥103）與water（水）；M：分子量標記Maker；

圖5為不同組織的GUS化學染色結(jié)果；其中A：小麥根部；B小麥莖部；C小麥葉片；D小麥花藥；E：授粉后7天種子；F：授粉后14天種子；G：授粉后21天種子；H：授粉后28天種子；I：授粉后35天種子；

圖6為授粉后28天種子的石蠟切片，其中A圖：授粉后28天種子（CK）；B：授粉后28天種子（轉(zhuǎn)基因植株）。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中部分實驗背景情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

鄭麥004、鄭麥366和鄭麥103，商品化小麥品種；

大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自北京全式金公司；

植物表達載體pMDC83-GUS ：由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室涂金星教授贈予；

實驗試劑：

DNA分子量標記、PCR mix等購自TaKaRa 公司；

高保真酶Phusion、限制性內(nèi)切酶BamHI、SalI、T4 DNA連接酶、PMD18-T載體、cDNA第一條鏈合成試劑盒均購自于Fermentas公司；

質(zhì)粒小提試劑盒和膠回試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司；

RNA提取試劑盒TransZol^TM Plant購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；

實時定量熒光PCR試劑盒購自于TOYOBO公司。

實施例1

本實施例首先對pTaWG04啟動子在植株體內(nèi)表達情況進行分析，具體過程如下。

首先，分別提取鄭麥004根、莖、葉片、花藥、授粉后7天、14天、21天、28天、35天的種子、胚和純胚乳的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

組織RNA提取按TransZol^TM Plant RNA提取試劑盒說明書操作，其步驟簡述如下：

（1）液氮研磨：選取鄭麥004不同組織的樣品0.1g放入研缽中，加入液氮并迅速研磨，

直至樣品呈粉末狀；

（2）勻漿：加入1mL TP1，室溫放置5min，使其充分裂解；12000g、4℃離心5min；

（3）吸取上清600μL至新的2mL RNase-free離心管中，并加入等體積的TPII溶液，顛倒混勻后加入150μL氯仿，再次顛倒混勻，室溫放置5min后，12000g、4℃離心5min；

（4）吸取上層水相500μL于新的2mLRNase-free離心管中；按等體積加入異丙醇混勻，室溫放置5~10min，12000g、4℃離心10min，棄上清，RNA沉于管底；

（5）加入1mL 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，10000g、4℃離心10min，盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥5~10min；

（6）用30μL RNA溶解液溶解沉淀，即得到總RNA。

cDNA第一條鏈合成使用Fermentas cDNA 第一條鏈合成試劑盒，其步驟簡述如下：

（1）取上述提取的組織RNA 1μg于200μL RNase-free離心管中，加入1 μL Oligo（dT）引物，并補充DEPC水至12μL，充分混勻，65℃孵育5min后置于冰上；

（2）在步驟（1）的混合物中，分別加入4μL 5×Reaction Buffer、1μL RiboLock RNase Inhibitor、2μL 10mM dNTP Mix、1μL RevertAid^TM M-MuLV，混勻后，42℃孵育1小時；

（3）70℃加熱5min，終止反應(yīng)，得到組織的cDNA。

其次，設(shè)計基因特異引物pTaGW04F和pTaGW04R，以小麥基因Actin作為內(nèi)參基因，利用Real time PCR方法檢測其在各個部位的表達。

具體引物序列設(shè)計如下：

TaWG04-F：5’- TGCATGTCCCATCTGATTGC-3’，

TaWG04-R：5’-TTTCCATTGCTACATCGATGGT-3’；

Actin-F:：5’- GGCCCTTGCTCCTAGCAGTA-3’，

Actin-R：5’- CCGGGACCAGACTCATCGTA-3’；

20μL的Real time PCR反應(yīng)體系設(shè)計如下：

cDNA 模板，60ng/μL、8.4μL；

上游引物，10μM、0.8μL；

下游引物，10μM、0.8μL；

SYBR Green Real-time PCR Master Mix，10μL；

Real time PCR 擴增程序如下：

95℃、2min (1 個循環(huán))；95℃、10s，60℃、10s，72℃、30s，40個循環(huán)；95℃、10s (1 個循環(huán))；65℃至95℃ 5s。

最后，依照2^{?ΔΔ Ct}方法，利用Bio-Rad CFX Manager軟件分析Real-time PCR 的結(jié)果。根據(jù)表達量均值±SEM作圖。

結(jié)果如圖1A所示，經(jīng)Real-time PCR對其驅(qū)動的下游基因TaWG04進行定量分析，發(fā)現(xiàn)該基因在授粉后14天、21天、28天和35天的種子中表達，而在根、莖、葉、花藥和授粉后7天的種子中無表達。分離出種子皮層、胚和純胚乳進行定量分析發(fā)現(xiàn)（圖1B），該基因在種子皮層中表達，進一步表明pTaWG04是種子皮層特異啟動子。

實施例2

本實施例主要介紹一下對pTaWG04啟動子片段的克隆情況。具體過程如下。

首先，利用植物DNA提取試劑盒提取鄭麥004幼嫩葉片基因組；

其次，以上述所提取基因組為模板，使用高保真酶Phusion，利用特異引物對：pTaWG04F和pTaWG04R進行PCR擴增，

引物對序列設(shè)計如下：

pTaWG04F：5’-ACGCGTCGACACACAAGCTGCCTTTCCATAA-3’，

pTaWG04R：5’-CGCGGATCCTGAATTTGTGGTTACTCTTGAT-3’；

50μL的PCR反應(yīng)體系設(shè)計如下：

含Mg²⁺的 5×HF buffer，10μL；

濃度為2.5mM 的dNTP，2μL；

濃度均為5μM的pTaGW04F，2μL；

濃度均為5μM的pTaGW04R，2μL；

Phusion酶，0.5μL；

步驟（1）中所提取基因組模板，2μL；

ddH₂O， 31.5μL；

PCR反應(yīng)條件：98℃預變性30s；98℃變性10s，56℃退火10s，72℃、1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

對PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，切取含目的條帶的凝膠，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

將其回收產(chǎn)物pTaWG04與PMD18-T載體 (Fermentas公司)進行連接。

10μL連接體系為：

PMD18-T Vector，1μL；

Solution I，5μL；

pTaWG04回收片段， 4μL；

16℃連接過夜。

將連接產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進行陽性（氨芐霉素抗性，50mg/mL）篩選，將陽性克隆送上海生工生物有限公司測序，測序正確單克隆命名為pMD18-T-pTaWG04。

利用啟動子在線分析軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html ）對pTaWG04啟動子進行分析，結(jié)果如圖2及下表所示。分析表明，該啟動子含有RNA聚合酶結(jié)合位點TATA-box，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點MBS，光響應(yīng)元件4cl-CMA2b、AT1-motif、Box4、GA-motif、I/L-box、TCT-motif等，以及種子啟動子所特有的元件GCN4 motif、Skn-1 motif。此外，還包括生長素、茉莉酸甲酯、低溫脅迫響應(yīng)元件以及MYB轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。

pTaWG04順式作用元件情況：

。

實施例3

在實施例2對pTaWG04啟動子分析基礎(chǔ)上，為進一步驗證該啟動子能否驅(qū)動外源基因在小麥體內(nèi)進行表達，發(fā)明人以GUS基因（β-葡聚糖苷酶基因）作為外源基因為例，通過構(gòu)建含有pTaWG04啟動子和GUS基因的重組質(zhì)粒，并進一步利用基因槍介導法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了小麥愈傷組織，結(jié)果表明，pTaWG04啟動子可以驅(qū)動外源基因在小麥體內(nèi)表達，從而為該基因在小麥品質(zhì)改良方面的具體應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)，相關(guān)實驗簡要介紹如下。

（一）含有pTaWG04啟動子和GUS基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒構(gòu)建過程示意圖如圖3A所示，具體為：

首先，用限制性內(nèi)切酶SalI和BamHI分別對pMD18-T-pTaWG04（實施例2所制備）和植物表達載體PMDC83-GUS進行雙酶切，并回收純化酶切片段；

酶切時的雙酶切體系設(shè)計為：

10×Fast Digest buffer，6μL；

pMDC83-GUS質(zhì)粒（或pMD18-T-pTaWG04），2μg、20μL；

SalI，1U/L、2μL；

BamHI，1U/L、2μL；

ddH₂O，30 μL。

其次，利用T4 DNA連接酶將上述酶切產(chǎn)物進行連接；

T4 DNA連接酶連接時的連接體系設(shè)計如下：

10×T4 DNA 連接緩沖液，1μL；

pTaWG04片段，7μL；

pMDC83-GUS，1μL；

T4 DNA 連接酶，1μL；

16℃連接過夜。

最后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并進行抗性篩選，挑取陽性克隆菌株提取質(zhì)粒后，送上海生工測序，測序正確的質(zhì)粒命名為PMDC83-pTaWG04-GUS，即欲構(gòu)建的含有pTaWG04啟動子和GUS基因的重組質(zhì)粒。

對測序正確的載體再進行雙酶切（SalI和BamHI，酶切體系參考前述重組質(zhì)粒構(gòu)建過程中的酶切體系）驗證，酶切產(chǎn)物進行電泳，可以得到約1500bp的片段，與pTaWG04的片段一致（電泳結(jié)果如圖3B所示）。

（二）含有pTaWG04啟動子和GUS基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小麥

利用基因槍介導法，將上述所構(gòu)建的含有pTaWG04啟動子和GUS基因的重組質(zhì)粒PMDC83-pTaWG04-GUS轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，并通過種子石蠟切片染色方法，檢測判定GUS基因是否得到了表達，相關(guān)實驗過程介紹如下。

（1）以小麥品種鄭麥103 的幼胚為受體材料，取開花后12左右未成熟的種子，用70%的酒精對其進行消毒，用無菌水沖洗3 次后，用0.1%的HgCl₂消毒10min，無菌水沖洗3~4 次；

（2）無菌條件下剝出幼胚（約1mm），于MS 誘導培養(yǎng)基（MS+2mg/L 2,4-D+4g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=6.2）上暗培養(yǎng)5天后，再置于高滲培養(yǎng)基（MS+2mg/L 2,4-D+7g/L瓊脂+72.88g/L甘露醇+30g/L蔗糖，pH=5.8）上滲透處理4~6h；

（3）金粉制備：將25mg金粉（直徑為1.0 μm）置于1.5mL離心管中，加入1mL無水乙醇，漩渦混勻，超聲波處理2 min，離心使金粉沉淀于管底，棄上清，重復2次，加入500μL無菌水，漩渦混勻，離心使金粉沉淀于管底，棄上清，重復1次；

金粉沉淀重懸于500μL無菌水中，使?jié)舛冗_到50 μg/μL，渦旋混勻后分裝，每管50 μL，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（4）DNA 包被：

取50μL制備好的金粉懸液在室溫條件下融化，渦旋，并超聲處理1min；

加入5μL含15μg DNA的水溶液；

加入50μL、2.5M的CaCl₂和20μL、0.1M的亞精胺，渦旋3min充分混勻，冰上靜置15min，棄上清；

加入300μL、70%乙醇，渦旋混勻后冰上靜置15 min，棄上清；

加入10μL 無水乙醇重懸后均勻涂在微彈載體中心，超凈工作臺吹干，用于基因槍轟擊；

（5）使用 PDS 1000/He 型基因槍，可裂圓片壓力為1100 psi，轟擊距離為9 cm，真空度為28 cm Hg，轟擊次數(shù)為 1 次；

（6）基因槍轟擊后在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)處理16h，轉(zhuǎn)至分化篩選培養(yǎng)基（MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+2％Hygromycin，pH=6.2），25℃光照條件下培養(yǎng)14天；

（7）待分化出綠芽后，轉(zhuǎn)至潮霉素篩選再生培養(yǎng)基（1/2MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+4g/L瓊脂+30g/L蔗糖+4％Hygromycin，pH=6.2），25℃光照條件下培養(yǎng)，連續(xù)篩選2 代，每代2 周；

（8）待綠芽生長至2~3cm后，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.2mg/L NAA+4g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH=6.5）中，25℃光照條件下培養(yǎng)，每14天繼代一次，繼代2-3次后，待再生幼苗根系健壯時，洗去根系攜帶的培養(yǎng)基殘渣移入苗缽。

對上述移入苗缽的植株進行轉(zhuǎn)基因植株鑒定，步驟為：

首先，提取植株的葉片DNA

其次，利用上述步驟（1）中的DNA為模板，設(shè)計檢測引物進行PCR鑒定，檢測引物設(shè)計如下：

GUS-F：5'-GACGCTCACACCGATACCATCA-3'，

GUS-R：5'-CGAAGTTCATGCCAGTCCAGCG-3'；

PCR鑒定結(jié)果如圖4所示。對圖4進行分析可以看出，轉(zhuǎn)基因植株中成功轉(zhuǎn)入有GUS基因。經(jīng)驗證，最終統(tǒng)計獲得抗性再生植株16 株。

對所獲得的再生植株，將T1代轉(zhuǎn)基因植株種入溫室，分別取小麥根、莖、葉片、花藥、授粉后7天、14天、21天、28天、35天的種子進行GUS組織化學染色，以檢測判定GUS基因是否表達，具體實驗過程為：

配制GUS染色液（0 .1M磷酸鈉緩沖液；10mM EDTA；0 .5mM鐵氰化鉀；0 .5mM亞鐵氰化鉀；1mM X-Gluc；0 .1％Triton X-100）；

將試驗材料在90%丙酮中（冰?。┕潭?5-20min；然后在染色液（不含X-Gluc ）中漂洗3次；

將材料置于GUS染色液中，37℃放置12-16h；先用70%酒精脫色半小時，再用100%酒精脫色；鏡檢照相。

結(jié)果如圖5所示。分析表明，21天、28天和35天種子能染上藍色，其余組織不能染上藍色。因此，pTaWG04能驅(qū)動外源基因在小麥的種子中特異表達，它是一個種子特異表達啟動子。

進一步地，制備種子石蠟切片，以便進行進一步分析，具體實驗過程為：

取授粉后28天種子用FAA固定液固定48小時以上，用50%酒精、70%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精分級洗脫，每級4~12小時，100%酒精中1.5小時；

隨后進行5級氯仿透明，每級4個小時，純氯仿2次，每次2~3小時；

透明后，將氯仿中加入少許碎蠟，置于36℃溫箱過夜，之后經(jīng)過50%、70%蠟各3小時，更換純蠟三次，每次1個小時；

隨后進行包埋，提升溫箱溫度至60℃，利用牛皮紙疊成紙盒置于溫箱，倒入材料，補足石蠟，均勻后取出石蠟凝固晾干；

切片機進行切片后利用二甲苯進行脫蠟，用番紅染色4小時以上后進行封片、鏡檢和拍照。

對轉(zhuǎn)基因植株授粉后28天的種子進行石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出，種子皮層上著色明顯，進一步證明該啟動子是一個種子特異表達啟動子。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所

<120> 小麥種子皮層特異啟動子pTaWG04及其應(yīng)用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1571

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

tagatcccct gttgtaattt atcaaaaatt tatacacaag ctgcctttcc ataatttgaa 60

acattgtact ttctacttgc ctgcaggaag aactcttttg ttatggaccc ccttatctgg 120

cgaatagtcg ccaggagggg gtggcatttg cgaatgattc gctggcagtt ttagtttgag 180

ggatggaagt ttacatcagg gcgacatgac aatttctttt tgagaaggca aattgttgtt 240

ttaaataggc atcgtttgat cttgtctcgg aaccgaaact gccatcgaaa gagtttcgtt 300

tgccacctct ctcccagcaa acgattgcca attatgatta ccgtttgtta tatgcatgaa 360

ctgtgcgtct acagttggcg gcagcgaggt tgaggagacc ggtgtcatcg gcagcggctt 420

cagccggtgg aggcgtccta tggttgacgg ccgtgctcct tcctgctcga gaagagaagt 480

gagagggtgg tgagaggtga agagagcagg aggcggcagc ctggtgctgc tgcgggtcgt 540

agtaggagcc aaggcggcgg tgctgggtgg ctcgggctgt tatgcgggcg cgcgagcgac 600

accaagccct caacaaccgt gtccgtttca gttgggtctt ccatgttggg tacactggtg 660

gtgtccggct ctccgtctgc gtccattgtc cgttttggcg acccaaacgg acaaaaagcg 720

gacaaaaatt cgtgtccgtt tgagtcattg cgttgaagtt ggccttatgc tattccacag 780

tatactcaac gcactctaat tcacattgca tgctattaca tgcgtcattg tatttgatac 840

accgtgtgca atattttttt tctggtgaca atatatctac tatcgaacca agtataaagt 900

tcctcaaagg gtttaatatc atgttcatgg tgttcccgcg gaaatgcatg ggaatcatct 960

agtgtctatt aacaactata cgacattact aacattggca taaaaaaaag aattgatgag 1020

tcatgtatgc ttgttcatct taccatcata ttacacaaaa ctacgaagtt agttcagaaa 1080

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