本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及大豆基因啟動(dòng)子序列在低溫脅迫下可以作為啟動(dòng)子調(diào)控基因的表達(dá)。

背景技術(shù)：

大豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在世界范圍內(nèi)普遍種植，不僅是人類蛋白和脂類的主要來(lái)源，同時(shí)也是重要的家畜飼料和工業(yè)原料，在醫(yī)學(xué)上也有很大價(jià)值。然而低溫、干旱、高鹽等不利環(huán)境條件會(huì)對(duì)大豆的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致大豆產(chǎn)量降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。除了常規(guī)育種技術(shù)，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和植物基因工程育種技術(shù)的成熟，應(yīng)用基因工程方法改良大豆抗逆性成為可能。

啟動(dòng)子是DNA分子上位于結(jié)構(gòu)基因上游，結(jié)合RNA多聚酶從而啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列?；虮磉_(dá)效率主要取決于啟動(dòng)子的活性，高水平的表達(dá)內(nèi)源或外源基因需要有高效的啟動(dòng)子。在基因工程中，目前常用CaMV35S等一些組成型啟動(dòng)子來(lái)控制目的基因的表達(dá)。這些啟動(dòng)子雖然能使目的基因過(guò)量表達(dá)，但它們是無(wú)組織、無(wú)環(huán)境、無(wú)時(shí)間特異性的組成型表達(dá)。利用組成型啟動(dòng)子控制抗逆相關(guān)基因的表達(dá)雖然可以提高植物在逆境條件下的抗逆能力，但即使在植物正常情生長(zhǎng)情況下相關(guān)抗逆蛋白也會(huì)過(guò)量表達(dá)，這對(duì)植物代謝來(lái)說(shuō)是一種浪費(fèi)。并且正常環(huán)境下植物體內(nèi)抗逆蛋白的長(zhǎng)時(shí)間過(guò)量積累也會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，引起轉(zhuǎn)基因植物形態(tài)發(fā)生異常，生長(zhǎng)延緩甚至是死亡。而逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子僅在植物遭受逆境脅迫時(shí)才大量啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，可以避免外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中持續(xù)表達(dá)所引起的植物生長(zhǎng)缺陷。因此克隆并應(yīng)用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可以實(shí)現(xiàn)高效、可控和特異(定點(diǎn)、定時(shí)、定量)的調(diào)控抗逆基因的表達(dá)，在改良植物的抗逆性方面具有極大的優(yōu)越，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外存在一些有關(guān)低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的報(bào)道。例如擬南芥rd29A啟動(dòng)子可以被低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)，是目前抗逆基因工程中應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。從冬麥中獲得受低溫誘導(dǎo)的blt101.1啟動(dòng)子。從野生稻中克隆出且具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性的冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子p-LTT1。從水稻品種日本晴中獲得低溫強(qiáng)誘導(dǎo)啟動(dòng)子POscold6，該啟動(dòng)子能夠特異的驅(qū)動(dòng)外源基因在低溫/冷脅迫條件下在植物中表達(dá)。但總的來(lái)說(shuō)，目前能在基因工程中應(yīng)用的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然不多，因此，對(duì)有效的新的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆及研究仍然是今后研究的重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決有效的大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子未被研制出來(lái)的問(wèn)題，而提供了大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、包含該啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體及應(yīng)用。。

本發(fā)明的啟動(dòng)子來(lái)源于大豆乙烯響應(yīng)因子基因GmERF9的啟動(dòng)子序列，命名為GmERF9P，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的序列中含有多種與脅迫相關(guān)的順式作用元件。

包含大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體，其重組表達(dá)載體的原始載體為pCAMBIA1301。

本發(fā)明的大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在低溫下誘導(dǎo)抗寒基因表達(dá)中的應(yīng)用。

本發(fā)明利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)大豆葉片中GmERF9基因在4℃處理2h時(shí)的表達(dá)量，此時(shí)GmERF9的表達(dá)量顯著升高，證明GmERF9基因具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)特性。因此，在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索GmERF9基因上游大概2000bp序列，設(shè)計(jì)引物，從大豆葉片基因組中克隆出1885bp的GmERF9啟動(dòng)子序列，命名為GmERF9P。將GmERF9P構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上，通過(guò)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。通過(guò)潮霉素篩選和PCR鑒定，獲得T₁代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行低溫處理2h。對(duì)未處理煙草及低溫處理煙草進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GUS基因的表達(dá)量，表明GmERF9P在低溫脅迫下具有低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)特性，為低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：

利用組成型啟動(dòng)子控制抗逆相關(guān)基因的表達(dá)雖然可以提高植物在逆境條件下的抗逆能力，但即使在植物正常情生長(zhǎng)情況下相關(guān)抗逆蛋白也會(huì)過(guò)量表達(dá)，這對(duì)植物代謝來(lái)說(shuō)是一種浪費(fèi)。并且正常環(huán)境下植物體內(nèi)抗逆蛋白的長(zhǎng)時(shí)間過(guò)量積累也會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，引起轉(zhuǎn)基因植物形態(tài)發(fā)生異常，生長(zhǎng)延緩甚至是死亡。而逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子僅在植物遭受逆境脅迫時(shí)才大量啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，可以避免外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中持續(xù)表達(dá)所引起的植物生長(zhǎng)缺陷。本發(fā)明克隆了一個(gè)大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的獲得為植物抗寒基因工程研究提供有利工具，可在低溫條件下啟動(dòng)抗寒相關(guān)基因的高效表達(dá)，從而培育出實(shí)用有效的抗寒植物品種。

附圖說(shuō)明

圖1 GmERF9基因在低溫處理0h和2h時(shí)表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖2 GmERF9基因啟動(dòng)子序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M為DL2000Marker，1為擴(kuò)增條帶；

圖3 GmERF9P啟動(dòng)子序列順式作用元件預(yù)測(cè)分析；

圖4重組載體pCAMBIA1301-GmERF9P的質(zhì)粒雙酶切結(jié)果，其中M為DL2000Marker，1-3為雙酶切條帶；

圖5 GmERF9P T₁代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草PCR鑒定結(jié)果，其中M為DL2000Marker，1-6為T₁代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草擴(kuò)增條帶，7為野生型煙草陰性對(duì)照，8為pCAMBIA1301-GmERF9P質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；

圖6未處理野生型煙草葉片GUS組織化學(xué)染色結(jié)果；

圖7低溫處理2h野生型煙草葉片GUS組織化學(xué)染色結(jié)果；

圖8未處理T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS組織化學(xué)染色結(jié)果；

圖9低溫處理2h T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS組織化學(xué)染色結(jié)果；

圖10 GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中低溫處理2h時(shí)表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，其中1為未處理T₁代轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因表達(dá)量，2為低溫處理2h時(shí)T₁代轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因表達(dá)量，3為陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1301轉(zhuǎn)基因煙草中GUS基因表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意合理組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列如序列表中SEQ IDNO：1所示。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述的序列中含有與脅迫相關(guān)的順式作用元件。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是，所述順式作用元件分別為GT-1、BIHD10S、WRKY、MYB、MYC和G-box。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式的包含大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式四不同的是，所述重組表達(dá)載體的原始載體為pCAMBIA1301。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在低溫下誘導(dǎo)抗寒基因表達(dá)中的應(yīng)用。

實(shí)施例1：本實(shí)施例將從以下實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的大豆低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列進(jìn)行驗(yàn)證：

(一)低溫處理下GmERF9基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

將正常條件下盆栽的四葉期大豆幼苗置于4℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，在處理0h和2h時(shí)，分別剪取0.1g葉片迅速置于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆?。采用Plant RNAzol試劑(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)提取大豆低溫處理及未處理時(shí)葉片總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)的說(shuō)明書合成第一鏈cDNA。

根據(jù)GmERF9基因(GenBank登錄號(hào)：AK245092)cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(F:5′-CATACCAACCTTCAAATGCCTC-3′；R:5′-TTTCTATTAGGGTCACGGATTTC-3′)。在BIO-RAD CFX96Real-Time PCR儀上，以大豆組成型表達(dá)基因β-Tubuin(GenBank登錄號(hào)：GMU12286)作為內(nèi)參基因(F:5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′；R:5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′)，以大豆葉片cDNA為模板。反應(yīng)體系為2×SYBR Premix Ex Taq(購(gòu)自TaKaRa公司)10μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、cDNA 2μL、Primer F 0.4μL、Primer R 0.4μL，補(bǔ)水至總體積20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10s；95℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)。各處理均做3次重復(fù)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)結(jié)果利用BIO-RAD CFX Manager軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如表1和圖1所示，結(jié)果表明GmERF9基因在低溫處理2h時(shí)表達(dá)量顯著升高。

表1低溫處理下GmERF9基因的相對(duì)表達(dá)量(數(shù)值為三次重復(fù)平均值)

(二)GmERF9基因啟動(dòng)子序列的克隆及順式作用元件分析

根據(jù)大豆GmERF9基因cDNA序列搜索大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)GmGDB(http：//www.plantgdb.org/GmGDB/)，獲得其上游大概2000bp的啟動(dòng)子序列。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5設(shè)計(jì)引物，序列如下，F(xiàn)：5'-ACGCGTCGACCCGTGCAACTTGATATTCGT-3'(下劃線代表SalⅠ酶切位點(diǎn))；R：5'-GGCCATGGTTTTTGGTTGTGAAATTGAGG-3'(下劃線代表NcoⅠ酶切位點(diǎn))。采用植物基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)提取大豆葉片基因組DNA，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：94℃8min；94℃40s，56℃40s，72℃1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。得到的擴(kuò)增條帶如圖2。將上述擴(kuò)增片段回收后與克隆載體pMD18-T(購(gòu)自TaKaRa公司)進(jìn)行連接，將篩選獲得陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD18-T-GmERF9P，并送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證序列正確。PLACE(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)數(shù)據(jù)庫(kù)用于啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)分析。

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到GmERF9基因啟動(dòng)子序列GmERF9P，長(zhǎng)度1885bp(如序列表中SEQ ID NO：1所示)。經(jīng)預(yù)測(cè)GmERF9P序列含有多種與逆境相關(guān)的順式作用元件，由圖3可以看出與逆境相關(guān)的順式作用元件包括3個(gè)GT1元件，1個(gè)G-box元件，2個(gè)BIHD10S結(jié)合位點(diǎn)，5個(gè)WRKY結(jié)合位點(diǎn)，3個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)MYC結(jié)合位點(diǎn)。將GmERF9P序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性Blast，沒(méi)有得到與其具有同源性的啟動(dòng)子序列，表明GmERF9P是一個(gè)新的啟動(dòng)子序列。

(三)GmERF9P的煙草轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因煙草鑒定

植物表達(dá)載體構(gòu)建方法：

用SalⅠ和NcoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶(各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司)雙酶切pMD18-T-GmERF9質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)純化后，與同樣用SalⅠ和NcoⅠ雙酶切的pCAMBIA1301載體(目的是切除CaMV35S啟動(dòng)子)連接，得到pCAMBIA1301-GmERF9P。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后(結(jié)果如圖4所示)，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(購(gòu)自Biovector公司)。

利用農(nóng)桿菌侵染煙草葉盤法將pCAMBIA1301-GmERF9P轉(zhuǎn)化煙草NC89(購(gòu)自中煙種子有限公司)，同時(shí)轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301空載體作為陽(yáng)性對(duì)照。具體方法如下：

1將煙草種子置于1.5mL離心管中，用10％的次氯酸鈉浸泡消毒3min，無(wú)菌水沖洗4-5次；

2將煙草種子鋪于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件：16h(28℃)光照/8h(22℃)黑暗；

3取萌發(fā)后生長(zhǎng)1-2個(gè)月的無(wú)菌煙草葉片，將其剪成0.5cm²的小塊(去掉主脈)，并接種于MS分化培養(yǎng)基上(MS添加3mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA)，預(yù)培養(yǎng)2天；

4挑取pCAMBIA1301-GmERF9P單克隆于5mL附加50μg/mL利福平和50mg/L卡那霉素的YEP(蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、NaCl 5g/L)中，28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)24h；

5按1：100的比例將上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mL附加50μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的YEP中，28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4-0.5；

6 5000rpm，室溫下離心15min，去除上清，將菌體重懸于MS液體培養(yǎng)集中，至OD₆₀₀＝0.5左右；

7將預(yù)培養(yǎng)后的煙草葉片在重懸液中侵染20min，吸干葉片表面的菌液，置于共培養(yǎng)基上(PH至調(diào)至5.4左右)，共培養(yǎng)3天；

8將共培養(yǎng)后的煙草葉片用含500mg/L羧芐青霉素的MS液體培養(yǎng)基清洗，晾干后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上(MS添加3mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、500mg/L羧芐青霉素和8mg/L潮霉素)，每15天繼代一次；

9待抗性芽長(zhǎng)到1cm時(shí)，移入生根培養(yǎng)集中(MS添加200mg/L羧芐青霉素和5mg/L潮霉素)，促其長(zhǎng)根；

10待煙草苗根系發(fā)育好后，移入土中，常規(guī)管理。

轉(zhuǎn)基因煙草的篩選及鑒定方法：

1取T₀代煙草葉片，按照Universal Genomic DNA Extraction Kit(購(gòu)自TaKaRa公司)說(shuō)明書中的方法提取葉片總DNA；

2將提取的DNA稀釋50倍后，取1μL為模板，用引物(F：5'-CCGTGCAACTTGATATTCGT-3'；R：5'-TTTTTGGTTGTGAAATTGAGG-3')進(jìn)行常規(guī)PCR驗(yàn)證。其中以未轉(zhuǎn)化的野生煙草為陰性對(duì)照，質(zhì)粒pCAMBIA1301-GmERF9P為陽(yáng)性對(duì)照；

3收獲陽(yáng)性煙草植株的種子，即T₁代種子；

4將T₁代種子種入土中獲得T₁代煙草苗，對(duì)其繼續(xù)提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，取T₁代陽(yáng)性煙草植株進(jìn)行后續(xù)抗性鑒定試驗(yàn)。

圖5為GmERF9P在部分T₁代轉(zhuǎn)基因煙草中的PCR鑒定結(jié)果，表明GmERF9P啟動(dòng)子已經(jīng)成功整合到煙草基因組中。

(四)轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理下葉片GUS組織化學(xué)染色

將正常盆栽培養(yǎng)的6周大T₁代轉(zhuǎn)基因煙草置于4℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。剪取未處理的T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片和低溫處理2h的T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片，同時(shí)剪取未處理和低溫處理2h的野生型煙草葉片作為陰性對(duì)照，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色：加入GUS染色液(大豆硬脂酸-ACP脫飽和酶基因啟動(dòng)子的克隆及其表達(dá)活性分析，張慶林等，2011)，于37℃溫育過(guò)夜，用75％的乙醇脫色至底色完全消失。

GUS組織化學(xué)染色結(jié)果如圖6-9所示，未處理和低溫處理2h的野生型煙草葉片沒(méi)有被染成藍(lán)色；未處理的T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片被染成淺藍(lán)色，但著色較淺，表明GmERF9P具有啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性；低溫處理2h的T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片被染成藍(lán)色且著色較深，表明GmERF9P的啟動(dòng)活性在低溫處理2h時(shí)被誘導(dǎo)，使下游報(bào)告基因GUS的表達(dá)量增高。

(五)轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理下GUS基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

將正常盆栽培養(yǎng)的6周大T₁代轉(zhuǎn)基因煙草置于4℃培養(yǎng)箱中低溫處理2h。剪取低溫處理2h和未處理的T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片0.1g，同時(shí)剪取pCAMBIA1301T₁代轉(zhuǎn)基因煙草葉片作為陽(yáng)性對(duì)照，迅速置于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆?。采用Plant RNAzol試劑(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)提取煙草葉片總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司)說(shuō)明書合成第一鏈cDNA。

在BIO-RAD CFX96Real-Time PCR儀上，以煙草組成型表達(dá)基因α-tubulin(GenBank登錄號(hào)：AB052822)作為內(nèi)參基因(F：5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′；R：5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′)，GUS基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物如下，F(xiàn)：5′-GATCGCGAAAACTGTGGAAT-3′；R：5′-TAATGAGTGACCGCATCGAA-3′。以煙草葉片cDNA為模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上，退火溫度改為55℃。如圖10和表2所示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明GmERF9P在低溫處理2h時(shí)可以明顯提高下游報(bào)告基因GUS的表達(dá)量。

表2轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理下GUS基因的相對(duì)表達(dá)量(數(shù)值為三次重復(fù)平均值)