本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種大豆根和根瘤特異表達(dá)的GmPHT1.01啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是基因中重要的順式作用元件，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游幾十個(gè)堿基處。啟動(dòng)子根據(jù)轉(zhuǎn)錄模式不同可分為三種：組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。組織或器官特異性啟動(dòng)子的活性是受特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理信號誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的，即這類啟動(dòng)子的表達(dá)具有特定的時(shí)空性。在這類啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位或特定的發(fā)育時(shí)期。組織或器官特異性啟動(dòng)子不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織部位積累，提高區(qū)域表達(dá)量，同時(shí)也可以避免目標(biāo)基因在其他組織器官中表達(dá)造成的不利影響。

到目前為止，已有大量的組織或器官特異性啟動(dòng)子被分離出來，其中包括葉片特異啟動(dòng)子、花特異啟動(dòng)子和種子特異啟動(dòng)子及根特異啟動(dòng)子等。根是植物體吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，根特異表達(dá)系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等。Borisjuk等用根特異啟動(dòng)子mas2、GFP和煙草鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)基因構(gòu)建融合表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因煙草水培研究結(jié)果表明：根細(xì)胞不僅能夠高效產(chǎn)生GFP，而且可將目的蛋白質(zhì)分泌到液體培養(yǎng)基中(Borisjuk et al.,1999)。此外，應(yīng)奇才等運(yùn)用松樹根特異性啟動(dòng)子PmPgRP10驅(qū)動(dòng)CMO/BADH雙價(jià)基因并轉(zhuǎn)入水稻。對轉(zhuǎn)基因植株根和葉的CMO酶、BADH酶活性及其它生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定，結(jié)果表明：CMO/BADH雙價(jià)基因可在根部特異性表達(dá)(應(yīng)奇才，2006)。

GmPHT1.01基因?qū)儆谥参锪邹D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的家族成員，在調(diào)控磷的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要的作用。因此有必要研究和獲得調(diào)控大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.01的啟動(dòng)子序列，從而為深入研究植物磷轉(zhuǎn)運(yùn)過程提供有效手段和途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.01的啟動(dòng)子序列，從而為在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根中特異表達(dá)目標(biāo)基因提供有效途徑。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供了一種大豆根特異表達(dá)的GmPHT1.01啟動(dòng)子，其具有：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸所獲得的具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列。

應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.01的啟動(dòng)子(SEQ ID No.1)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到所述啟動(dòng)子的突變序列。例如在非活性區(qū)段，在不改變啟動(dòng)子功能的情況下，進(jìn)行以下取代方式中的至少一種所獲得的核苷酸序列：將第110位的T取代為A,將第2601位的A取代為T,將第3004位的A取代為T。

本發(fā)明還提供了含有GmPHT1.01啟動(dòng)子的載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或表達(dá)盒。

在本發(fā)明可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，只要適合GmPHT1.01啟動(dòng)子的表達(dá)即可，例如可以為市售的載體及質(zhì)粒。

本發(fā)明所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或表達(dá)盒。本發(fā)明還提供了GmPHT1.01啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在調(diào)控下游基因在植物根中特異表達(dá)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.01啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在提高下游基因在植物根中表達(dá)量中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.01啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.01啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在植物根發(fā)育調(diào)節(jié)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.01啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在植物種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了GmPHT1.01啟動(dòng)子或含有其的上述生物材料在植物育種中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，上述植物為作物、林木、蔬菜、花卉、牧草。

更優(yōu)選地，上述植物為作物。最優(yōu)選為大豆。

本發(fā)明還提供了從大豆基因組中克隆得到5240bp的GmPHT1.01啟動(dòng)子序列所用的特異性引物，其包括正向引物：5’-attgGAGCTCGTGTCCCTTTGTATGATGGAATC-3’；和反向引物：5’-gagtCTGCAGCACTCACTAACTCAGCTACCTGA-3’。

含有上述特異性引物的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述特異性引物也可用于檢測本發(fā)明所述的大豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因GmPHT1.01的啟動(dòng)子。

本發(fā)明首次分離了大豆根特異表達(dá)的GmPHT1.01啟動(dòng)子，利用GmPHT1.01啟動(dòng)子表達(dá)GUS基因，結(jié)果表明GmPHT1.01啟動(dòng)子可明顯促進(jìn)植物根中GUS基因的表達(dá)量，因而，GmPHT1.01啟動(dòng)子在植物根具有特異性，適合在各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的根中特異表達(dá)目標(biāo)基因并能夠提高目標(biāo)基因的表達(dá)量。

附圖說明

圖1為GmPHT1.01-GUS在大豆根中的表達(dá)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1大豆GmPHT1.01啟動(dòng)子的克隆

利用正向引物正向引物：5’-attgGAGCTCGTGTCCCTTTGTATGATGGAATC-3’和反向引物：5’-gagtCTGCAGCACTCACTAACTCAGCTACCTGA-3’從大豆基因組中PCR擴(kuò)增并測序獲得長度為5240bp的GmPHT1.01啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR產(chǎn)物兩端分別帶有Sac I和Pst I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。

上述PCR擴(kuò)增體系為：(20μl體系)

PCR程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min共25個(gè)循環(huán)；72℃10min。

實(shí)施例2大豆GmPHT1.01啟動(dòng)子調(diào)控下游基因GUS的表達(dá)情況

根據(jù)實(shí)施例1中PCR克隆得到GmPHT1.01啟動(dòng)子，切膠回收產(chǎn)物用Sac I和Pst I雙酶切。將載體pCAMBIA3301(pCAMBIA3301購自澳大利亞Cambia公司)先用HindⅢ和Nco I雙酶切掉35S啟動(dòng)子后用Klenow補(bǔ)齊成平末端，Solution I自連后轉(zhuǎn)化至DH5α中擴(kuò)繁。提質(zhì)粒后再用Sac I和Pst I雙酶切，回收后與GmPHT1.11啟動(dòng)子的回收片段用Solution I連接。獲得雙元表達(dá)載體pGmPHT1.01::GUS，將植物表達(dá)載體pGmPHT1.01::GUS轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中擴(kuò)繁。

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，包括：(1)制備含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基；(2)取出貯存于-80℃的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴中融化后，加入5μl連接產(chǎn)物輕輕混勻，冰浴中放置30分鐘；(3)42℃熱激30秒，然后立即置于冰浴中3分鐘；加入300μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)1小時(shí)(160rpm)；(4)取適量培養(yǎng)液均勻涂于選擇性培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16小時(shí)，用滅菌牙簽挑取5-10個(gè)(或更多)菌落，置于200μl選擇性液體LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)；(5)PCR檢測篩選到的陽性克隆擴(kuò)繁提質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法，將pGmPHT1.01::GUS轉(zhuǎn)入大豆天隆一號，獲得轉(zhuǎn)化pGmPHT1.01::GUS的發(fā)根50條。

GUS活性分析表明，GmPHT1.01啟動(dòng)子在植物的根(圖1)中特異表達(dá)，可用于包括各種作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在內(nèi)的各種植物的根中特異表達(dá)目標(biāo)基因。

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆轉(zhuǎn)化的方法：

(1)將大豆用氯氣熏蒸法滅菌12個(gè)小時(shí)后，取出置于超凈臺吹凈剩余氯氣后，用滅菌的超純水浸泡16小時(shí)備用；

(2)將帶有pGmPHT1.01::GUS的農(nóng)桿菌K599挑單克隆活化后，試管小搖后用YEP大搖至菌液OD在0.8-1.0之間，4000轉(zhuǎn)，22℃離心10min后，重懸于LCCM(1/10X Gamborg B₅鹽,30g/L蔗糖,3.9g/L MES,pH 5.4.滅菌后加入40mg/L乙酰丁香酮)中；

(3)將浸泡好的大豆的胚根切下，以下胚軸為外植體，將外植體浸于重懸菌液中30min完成侵染，在濾紙上吸干浸染液，將侵染后的大豆外植體置于CCM(1/10X Gamborg B₅鹽,30g/L蔗糖,3.9g/LMES,4.25g/L瓊脂,pH 5.4.滅菌后加入Cysteine 400mg/L,and 40mg/L乙酰丁香酮)上避光培養(yǎng)3天；

(4)將共培養(yǎng)后的大豆外植體的下胚軸插入發(fā)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1X Gamborg B₅鹽,30g/L蔗糖,and 0.59g/L MES,7g/L瓊脂，pH5.7.滅菌后加入Cefotaxime 100mg/L)中，長日光照下培養(yǎng)10-14天誘導(dǎo)發(fā)根，發(fā)根生長至2cm時(shí)，取材；

轉(zhuǎn)化株的GUS染色：

(1)將組織樣品加入90％丙酮中，置于冰上20～30分鐘；

(2)經(jīng)丙酮處理后，用50mM磷酸緩沖液(pH7.2)、2mMK₄Fe[CN]₆及2mM K₃Fe[CN]₆溶液潤洗組織；

(3)將樣品放在X－Gluc染色液中(50mM磷酸緩沖液(pH7.2),1mM X-gluc,2mM K₄Fe[CN]₆,2mM K₃Fe[CN]₆)，抽氣10分鐘，然后37℃染色過夜；

(4)第二天用70％乙醇脫色；

(5)在載玻片上加幾滴HCG溶液，將脫色后的樣品置于其中；

(6)壓片，透明15分鐘或者過夜透明(根據(jù)組織的發(fā)育時(shí)期而定)。

GUS染色液配方：

20mM X-gluc(MW＝521.8)

用DMSO或N,N-二甲基甲酰胺溶解，100mg X-gluc需用9.58mlDMSO溶解,終濃度為20mM。

50mM磷酸緩沖液(pH7.0)

A液：NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g溶于無菌蒸餾水，定容至100ml；

B液：Na₂HPO₄·12H₂O 7.17g溶于無菌蒸餾水，定容至100ml；

取39mlA液與61mlB液混合。

染色液配制：5mM鐵氰化鉀；5mM亞鐵氰化鉀；10mMEDTA；50mM磷酸緩沖液；1mM X-gluc。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。