本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種與白血病相關(guān)的環(huán)狀circRNA-011235基因及其用途。
背景技術(shù)：
：白血病俗稱血癌，因其病因尚未明確，患者存活期短，死亡率高，已對(duì)人們的健康造成巨大威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國有400多萬白血病患者，每年還會(huì)新增4萬多例。造血干細(xì)胞移植(HSCT)是目前根治惡性血液系統(tǒng)疾病的首選方案，而全身輻照(Totalbodyirradiation,TBI)是造血干細(xì)胞(HSCs)移植的必要輔助手段之一。TBI治療的目的:一是免疫抑制，主要是使移植骨髓能被受體接受。二是消滅機(jī)體內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞達(dá)到治療白血病的目的。三是殺滅骨髓中造血干細(xì)胞使髓腔出現(xiàn)空間,以利于造血干細(xì)胞植入。骨髓移植前的TBI對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的損傷可能會(huì)影響HSCs的植入和移植療效，甚至導(dǎo)致移植失敗，TBI對(duì)BMSCs的損傷是否會(huì)影響其支持HSCs造血及其作用機(jī)制尚不清楚。明確TBI對(duì)BMSCs的影響有利于臨床醫(yī)師合理選擇治療方案，實(shí)現(xiàn)高效、低毒的臨床療效具有很高的指導(dǎo)價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)狀circRNA-011235基因，該基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為預(yù)測(cè)HSCT移植療效的標(biāo)記物，為臨床醫(yī)生選擇合理的治療方案提供了新的思路。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)白血病患者經(jīng)TBI后BMSCs中環(huán)狀circRNA-011235基因上調(diào)表達(dá)高達(dá)10.38倍，通過circRNABase預(yù)測(cè)該基因的應(yīng)答元件為miR143-3p，有研究已經(jīng)證明在BMSCs中miR143-3p抑制TGF-β表達(dá)，而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TBI處理后BMSCs內(nèi)TGF-β表達(dá)量明顯增高，同時(shí)miR-143-3p下調(diào)表達(dá)明顯，因此我們根據(jù)文獻(xiàn)和前期工作提出科學(xué)假設(shè)：TBI后BMSCs中上調(diào)表達(dá)的circRNA-011235將通過“海綿作用”吸附miR-143-3p，從而降低其對(duì)TGF-β的負(fù)調(diào)控，使BMSCs中的TGF-β蛋白水平異常上升，這可能導(dǎo)致骨髓纖維化，不利于造血細(xì)胞的歸巢、自我更新、增殖和分化，進(jìn)而影響HSCs移植療效。本發(fā)明的第一方面，提供一種環(huán)狀circRNA-011235基因，其cDNA序列為SEQIDNO:1所示。本發(fā)明的第二方面，提供了環(huán)狀circRNA-011235基因在制備檢測(cè)該基因的引物、試劑盒中的用途。本發(fā)明的第三方面，提供了環(huán)狀circRNA-011235基因在制備治療白血病藥物中的用途。本發(fā)明的第四方面，提供了用于檢測(cè)環(huán)狀circRNA-011235基因的引物對(duì)，其序列如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3所述。在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的上述技術(shù)特征和下文實(shí)施例中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的技術(shù)方案，限于篇幅，再次不一一贅述。本發(fā)明首次證實(shí)了一個(gè)新的環(huán)狀circRNA-011235基因的客觀存在，通過檢測(cè)全身輻照病人中該基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平明顯降低，該環(huán)狀circRNA-011235基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以作為預(yù)測(cè)造血干細(xì)胞移植療效的標(biāo)記物，為臨床醫(yī)生選擇合理的治療方案提供了新的思路；含有該環(huán)狀circRNA-011235基因及其引物對(duì)的試劑盒，可以用于造血干細(xì)胞移植預(yù)后診斷；環(huán)狀circRNA-011235基因也可以作為治療全身輻照藥物的靶基因，在白血病治療中起到重大作用。附圖說明圖1正常組骨髓基質(zhì)細(xì)胞中環(huán)狀RNA芯片結(jié)果圖；圖2全身輻照處理組骨髓基質(zhì)細(xì)胞環(huán)狀RNA芯片結(jié)果圖；圖3正常組和全身輻照處理組骨髓基質(zhì)細(xì)胞中環(huán)狀RNA表達(dá)情況的聚類分析圖；圖中左側(cè)為正常組骨髓基質(zhì)細(xì)胞中環(huán)狀RNA表達(dá)情況的聚類分析圖，右側(cè)為全身輻照處理組骨髓基質(zhì)細(xì)胞中環(huán)狀RNA表達(dá)情況的聚類分析圖。圖4內(nèi)參GAPDH基因的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線；圖5circRNA-011235基因?qū)崟r(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線；圖6正常組和處理組中TGF-β蛋白水平異常上升圖.；其中1為轉(zhuǎn)染了過表達(dá)cricRNA-011235基因腺病毒載體的骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1表達(dá)，2為轉(zhuǎn)染空載體的骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1表達(dá)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定，本發(fā)明中所用的方法及其相關(guān)的試劑，可以有其他可選擇和替代方案，能夠達(dá)到相同技術(shù)結(jié)果即可。實(shí)施例1：擴(kuò)增環(huán)狀circRNA-011235基因引物對(duì)根據(jù)環(huán)狀circRNA-011235基因SEQIDNO:1所示的cDNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增用引物，各引物的具體序列見表1。表格1環(huán)狀circRNA‐011235基因擴(kuò)增引物序列引物名稱序列(5’→3’)SEQ.IDFAACAAGGACCGAAACTAAGAGG2RTGTATCCACCAGAATTACTCCC3上述引物人工合成后，作為擴(kuò)增環(huán)狀circRNA-011235基因cDNA序列引物對(duì)使用。實(shí)施例2：樣品中總RNA的制備按照TRIZOL法RNA提取步驟，提取對(duì)照組、全身輻照處理組的骨髓基質(zhì)細(xì)胞樣品中的總RNA。簡述如下：1、勻漿樣品按照TRIZOL法說明書，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，加入TRIZOL試劑后，勻漿；2、兩相分離勻漿后的樣品在15-30℃孵育5分鐘后，按照每1ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12,000×g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。3、RNA沉淀將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個(gè)樣品勻漿時(shí)加入1mlTRIZOL試劑的此時(shí)加0.5ml的異丙醇。混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃12,000×g離心10分鐘。4、RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4℃7,500×g離心5分鐘。5、重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘，切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小于1.6。溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾次，然后55到60℃孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于-70℃。6、總RNA質(zhì)量檢測(cè)提取的總RNA，使用ND-1000測(cè)定RNA濃度和純度，測(cè)量前先用溶解RNA用的DEPC水調(diào)零。提取的總RNA質(zhì)量、數(shù)質(zhì)量應(yīng)能滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。實(shí)施例3：總cDNA序列的合成經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格的總RNA，按照下面所述的方法進(jìn)行cDNA的合成。合成所用的試劑及其生產(chǎn)商如下：RNA酶抑制劑(Epicentre)；SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)；5×RT緩沖液(Invitrogen)；2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTestLtd)；Primer(英駿生物技術(shù)有限公司)cDNA合成用熱循環(huán)儀為GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)。具體的操作方法如下：1、配制退火混合物RNA800ng0.5ug/ulRandom(N9)1μldNTPsMix(2.5mM)1.6μl加無RNA酶的H2O至總體積14.5μl；混合液在65℃水浴5分鐘,冰上放置2分鐘。2、短暫離心后，在離心管中依次加入RT反應(yīng)液混合后37℃恒溫1分鐘，然后用移液槍輕輕吸打幾次混合均勻。3、50℃溫育60分鐘。4、70℃溫育15分鐘使酶失活。5、總cDNA置冰浴待用或-20℃保存。實(shí)施例4：環(huán)狀circRNA-011235基因cDNA擴(kuò)增本發(fā)明中，環(huán)狀circRNA-011235基因cDNA擴(kuò)增體系如下：取實(shí)施例3合成的總cDNA樣品，配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下：輕柔的使溶液混合，5000rpm短暫離心。cDNA的擴(kuò)增按照以下程序進(jìn)行：95℃，10min；40個(gè)PCR循環(huán)(95℃，10秒；60℃，60秒)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR信號(hào)收集在PCR循環(huán)的60℃，60秒階段進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束PCR產(chǎn)物與100bpDNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。實(shí)施例5：環(huán)狀circRNA-011235基因檢測(cè)試劑盒一種環(huán)狀RNA基因檢測(cè)試劑盒，包括DNA聚合酶、鎂離子、緩沖液、環(huán)狀RNA基因特異性引物、水。具體體系如下：使用時(shí)，加入經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的總cDNA樣品，在下列PCR擴(kuò)增程序中進(jìn)行擴(kuò)增：95℃，10min；40個(gè)PCR循環(huán)(95℃，10秒；60℃，60秒)。實(shí)施例6：基因芯片法研究全身輻照病人中環(huán)狀circRNA-011235基因表達(dá)情況取經(jīng)全身輻照處理后的患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞，按照實(shí)施例2中樣品中總RNA的制備，提取的總RNA進(jìn)行環(huán)狀RNA基因芯片檢測(cè)。具體步驟如下：1、總RNA的純度和濃度檢測(cè)用NanoDropND-1000檢測(cè)提取的總RNA的純度和濃度，結(jié)果如下所示：表格2總RNA的純度和濃度質(zhì)量檢測(cè)2、RNA標(biāo)記質(zhì)量合格的總RNA，用Rnase富集環(huán)狀RNA。富集后的circRNA經(jīng)擴(kuò)增后用Arraystar公司的超級(jí)RNA標(biāo)記探針(Arraystar,Inc)標(biāo)記。3、Array雜交標(biāo)記后的circRNA與Arraystar公司circRNA芯片(8*15K,Arraystar)在安捷倫分子雜交儀中65℃孵育17小時(shí)，進(jìn)行雜交。4、Array掃描充分洗滌后，芯片用安捷倫掃描儀G2505C進(jìn)行檢測(cè)。5、用安捷倫數(shù)據(jù)處理軟件獲取數(shù)據(jù)；6、circRNAs表達(dá)分析用R軟件包進(jìn)行一系列包括均一化的數(shù)據(jù)處理。7、CircRNA的差異表達(dá)用倍數(shù)變化cutoff值或者火山圖分別分析輻照組和對(duì)照組中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的circRNA。8、注釋circRNA和microRNA相互作用采用Arraystar’s預(yù)測(cè)軟件分析circRNA與microRNA的相互作用，所有差異表達(dá)的circRNA都詳細(xì)注釋了與之相互作用的microRNA。9、環(huán)狀RNA基因芯片檢測(cè)結(jié)果正常組和全身輻照處理組骨髓基質(zhì)細(xì)胞中環(huán)狀RNA基因芯片檢測(cè)結(jié)果如圖1、2所示，表達(dá)情況的聚類分析結(jié)果如圖3所示。環(huán)狀circRNA芯片檢測(cè)結(jié)果原始數(shù)據(jù)如下表所示表格3circRNA‐011235基因在環(huán)狀circRNA芯片檢測(cè)結(jié)果中原始熒光強(qiáng)度組別CircRNA-011235熒光強(qiáng)度對(duì)照組8.21693054345939TBI處理組11.5937732455632所得熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)經(jīng)用安捷倫數(shù)據(jù)處理軟件處理后，得到全身輻照處理組骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)circRNA-011235基因比對(duì)照組上調(diào)表達(dá)10.3879762倍。利用cytoscape生物信息學(xué)軟件進(jìn)行ceRNA分析，可以預(yù)測(cè)出cirRNA-011235可以通過海綿吸附作用調(diào)節(jié)miR-143-3p對(duì)TGF-β的調(diào)控。利用TargetScan和miRanda兩種生物信息軟件預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)miR-143-3p為circRNA-001235的應(yīng)答元件。實(shí)施例7：實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA-011235基因和miR-143-3p基因表達(dá)情況樣品總RNA提取，總cDNA合成，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系組成、擴(kuò)增等參數(shù)如實(shí)施例1、2、3、4所示，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)circRNA-011235基因和miR-143-3p基因的表達(dá)情況，各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機(jī)器生成。每個(gè)樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。內(nèi)參GAPDH基因的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線如圖4所示，circRNA-011235基因的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線如圖5所示。其中圖4、圖5實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖中的△Rn含義是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果，Rn(Normalizedreporter)是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組骨髓基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)circRNA-011235和miR-143-3p，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果校正如下：表4全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA‐011235基因和miR‐143‐3p基因表達(dá)情況實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后，所得的表達(dá)情況如下表所示：表5全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA‐011235基因和miR‐143‐3p基因相對(duì)于內(nèi)參GAPDH基因表達(dá)情況數(shù)據(jù)比較方案circRNA_011235/GAPDHmiR-143-3p/GAPDH處理組/正常組1.600.48結(jié)果顯示，經(jīng)過全身輻照患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞中circRNA-011235上調(diào)表達(dá)，較正常組高1.60倍，同時(shí)miR-143-3p下調(diào)表達(dá)明顯，僅為正常組的0.48倍。實(shí)施例8：環(huán)狀circRNA-011235基因過表達(dá)與TGF-β蛋白水平異常上升經(jīng)實(shí)施例6、7中全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA-011235基因表達(dá)情況的數(shù)據(jù)，利用cytoscape生物信息學(xué)軟件進(jìn)行ceRNA分析，可以預(yù)測(cè)出cirRNA-011235可以通過海綿吸附作用調(diào)節(jié)miR-143-3p對(duì)TGF-β的調(diào)控。為驗(yàn)證該預(yù)測(cè)，將轉(zhuǎn)染了過表達(dá)circRNA-011235基因腺病毒載體的骨髓基質(zhì)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照骨髓基質(zhì)細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)TGF-β蛋白水平異常上升，具體如下：1、circRNA-011235基因擴(kuò)增根據(jù)實(shí)施例1設(shè)計(jì)環(huán)狀circRNA-011235擴(kuò)增引物；按照實(shí)施例2制備環(huán)狀circRNA-011235基因擴(kuò)增用樣品；按照實(shí)施例3進(jìn)行總RNA基因cDNA序列的合成；然后按照實(shí)施例4進(jìn)行環(huán)狀circRNA-011235基因cDNA擴(kuò)增，并回收擴(kuò)增的circRNA-011235基因的cDNA。2、pcDNA3-circRNA-011235重組質(zhì)粒和腺病毒的制備用taq酶將擴(kuò)增后環(huán)狀circRNA-011235基因cDNA鏈接到pcDNA3載體上，并包被到rAD-EGFP腺病毒中，命名為rAD-4-circRNA011235腺病毒。3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24h將1×105骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種6孔板培養(yǎng)皿，當(dāng)細(xì)胞長至70％-80％融合的時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染當(dāng)日棄去舊培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入無血清、無雙抗的純DMEN1ml，本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組用1×105的rAD-EGFP腺病毒，處理組用1×105的rAD-4-circRNA011235腺病毒感染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后將6孔板置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，棄去培養(yǎng)基，換成2ml含10％血清的DMEN培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48h，收細(xì)胞檢測(cè)TGF-β蛋白表達(dá)水平。4、TGF-β表達(dá)情況檢測(cè)本試驗(yàn)對(duì)照組和處理組細(xì)胞中TGF-β表達(dá)情況如圖6所示，轉(zhuǎn)染了過表達(dá)circRNA-011235基因腺病毒載體的骨髓基質(zhì)細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照骨髓基質(zhì)細(xì)胞相比，TGF-β1蛋白水平異常上升。在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)白血病患者經(jīng)TBI后BMSCs中circRNA-011235上調(diào)表達(dá)高達(dá)10.38倍，通過circRNABase預(yù)測(cè)circRNA-011235的應(yīng)答元件為miR143-3p，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TBI處理后BMSCs內(nèi)TGF-β表達(dá)量明顯增高，同時(shí)miR-143-3p下調(diào)表達(dá)明顯，這可能導(dǎo)致骨髓纖維化，不利于造血細(xì)胞的歸巢、自我更新、增殖和分化，進(jìn)而影響HSCs移植療效。以上具體實(shí)施方式僅為本創(chuàng)作的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神及原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3