一對用于連接非依賴克隆的接頭序列及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，特別涉及一對用于連接非依賴克隆的接頭序列及其應 用。
【背景技術】
[0002] 采用限制性內切酶進行酶切、DNA連接酶連接構建質粒載體的方法受到酶切位點 的序列、排列方式、方向等的限制。
[0003] 連接非依賴的克隆技術(LIC)利用DNA聚合酶的外切活性，在目的載體和插入片段 產生DNA雙鏈5'較長的粘性末端，通過堿基互補配對形成帶有切刻的環(huán)狀DNA，轉化大腸桿 菌后，在細菌細胞內修復成為無切刻的質粒DNA，從而完成目的片段的克隆。LIC技術可以克 服酶切連接克隆的限制，目的片段不受載體酶切位點的影響，克隆效率高，適用于高通量的 克隆。
[0004] 連接非依賴克隆的關鍵之一在于接頭序列的設計，由于質粒載體多用于目的蛋白 的表達，因此接頭序列應盡量避免引入稀有氣基酸殘基、帶電荷氣基酸殘基等，以保證蛋白 質性質不發(fā)生顯著變化。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供一對用于連接非依賴克隆的接頭序列，將它連接到質粒載體的多克隆 位點位置后，可以進行外源基因片段的連接非依賴的克隆，用于連接非依賴克隆的載體的 構建。
[0006] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0007] -種用于連接非依賴克隆的接頭序列，該接頭序列包括
[0008] 上游序列：gggAgCggAAgCgg，SEQIDN0:7所示的核苷酸序列；和
[0009]下游序列：gC Cag AgC CAC Cgc，SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。本發(fā)明的用于 連接非依賴克?。╨igation independent cloing，LIC)序列，將該接頭序列連接入質粒載 體后形成的新的載體，可以實現目的片段的連接非依賴克隆。
[0010] -種所述的接頭序列在連接非依賴克隆方面的應用，包括如下步驟：
[0011] a、序列的獲得人工合成權利要求1所述的接頭序列；
[0012] b、利用分子生物學技術將接頭序列連接到質粒載體的多克隆位點位置后，形成的 新的載體，對外源片段進行連接非依賴的克隆。
[0013] 作為優(yōu)選，利用分子生物學技術，合成擴增Gateway盒的引物，其中本發(fā)明的上下 游接頭序列分別位于上下游引物的5'末端，通過PCR擴增Gateway盒，通過酶切連接克隆入 目的載體的多克隆位點，形成新的載體可以用于作為連接非依賴的克隆，其中該載體的多 克隆位點的上下游位置分別為本發(fā)明上下游接頭序列。進行連接非依賴克隆時，本發(fā)明的 上下游接頭序列應分別設計與目的基因的上下游引物5'末端，通過PCR擴增獲得側翼序列 為上下游接頭的目的基因片段。通過T4DNA聚合酶處理載體和中介片段，獲得5'末端突出的 載體和中間片段，其中的末端突出為接頭序列。通過將5'末端突出的載體和片段混合，形成 堿基互補配對，轉化如大腸桿菌后，在大腸桿菌內修復形成完整的質粒載體，完成對目的片 段的克隆。
[0014] 本發(fā)明所述的兩段核苷酸序列，將它連接到質粒載體的多克隆位點位置后，可以 進行外源基因片段的連接非依賴的克隆，用于連接非依賴克隆的載體的構建。本發(fā)明的序 列能夠用于適于LIC質粒載體接頭。
[0015] 本發(fā)明利用分子生物學實驗技術將本發(fā)明序列連到質粒載體的多克隆位點，形成 用于連接非依賴克隆的質粒載體，可以用于目的基因的連接非依賴克隆。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā) 明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發(fā)明保護范圍。
[0017] 在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等 均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常 規(guī)方法。
[0018] 本發(fā)明所提供的實施例均按照常規(guī)實驗條件，其中所采用的引物序列如表1。
[0019] 表1連接非依賴克隆載體構建引物
[0022] 實施例1:連接非依賴克隆接頭序列的設計、合成、擴增和測定
[0023] 1.連接非依賴克隆接頭序列的設計、合成
[0024] 分別含有接頭序列SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列的引物對 Licll-FP( + )，Licll-RP(_)由核酸合成公司合成并純化
[0025] 2 · Gateway 盒擴增
[0026] 以引物對1^(3114?( + )，1^(：11-1^(-)擴增63七6￥37盒序列，？0財廣增體系為：3841^ 水、5yL 10XPCR Buffer for Pfu、4yL 2.5mM dNTPs、上下游引物（ΙΟμΜ)各0.5yL、lyL Gateway盒質粒模板、lyL Pfu聚合酶。總反應體系為50yL。各片段的反應條件為:94°C5min; 94°C45s，52°C45s，72°C4min，35個循環(huán);72°C10min。擴增的PCR產物純化后經測序拼接獲得 含有接頭序列邊界的Gateway盒。
[0027] 3.連接非依賴克隆載體的構建
[0028] 步驟2中PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen公司）純化后，利用DNA連 接酶進行PCR片段的克隆，采用10yL體系反應，條件如下：10Xligase buffer lul，Nde I和 Xhao I雙酶切線性化克隆載體pET3250ng，Gateway盒回收片段5〇]^，14-1丨83861111(大連寶 生物），最后用ddH2〇調整體系至10yL，混勻后4°C反應16h。反應完畢后，取5ul反應液加入到 含有100ul大腸桿菌Db3.1感受態(tài)細胞的離心管中，輕輕混勻冰上放置30m后，42°C熱激90s， 立即放置冰上2-3分鐘，向離心管中加入LB液體培養(yǎng)基900ul。將離心管放于37°C搖床上震 動培養(yǎng)1.5hr后，離心收集培養(yǎng)液涂布于含有50mg/L卡那青霉素、10mg/L氯霉素的固體LB培 養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)。選擇菌斑送至杭州擎科公司測序。含有正確插入序列的克隆命名為 pET32a-LIC(Seq ID No.5)〇
[0029] 實施例2:外源基因的連接非依賴克隆
[0030] 1.外源基因的擴增
[0031] 以引物對 Licll-NbPinlFP( + )，Licll-NbPinlRP(_)擴增外源基因 NbPinl 序列，PCR 擴增體系為：38yL水、5yL 10XPCR Buffer for Pfu、4yL 2.5mM dNTPs、上下游引物（10μΜ) 各0.5yL、lyL Nbpinl模板、lyL Pfu聚合酶。總反應體系為50yL。各片段的反應條件為:94°C 5min; 94°C45s，52°C45s，72°C4min，35 個循環(huán)；72°C 10min。擴增的 PCR 產物純化后經測序拼 接獲得含有接頭序列的Nbpinl基因片段。
[0032] 2.外源片段克隆入pET32-LIC
[0033]步驟1中PCR產物采用PEG沉淀純化后，進行連接非依賴的克隆。
[0034] 1)PCR產物PEG沉淀純化
[0035] 等體積加入ddH20，30 % PEG-8000/30mM MgCl2，渦旋混勻。離心（14，OOOrpm， 20min)，此時PCR產物沉淀于離心管底部；去除液體，加入lmL 75%乙醇漂洗DNA沉淀，離心 (14，OOOrpm，20min);去除液體，烘干(37°C，5min);加入1/10PCR反應體積ddH 20，溶解PCR產 物，電泳檢測純化效果。
[0036] 2)PCR產物末端處理
[0037] 反應體系于冰浴中配制，步驟1)中片段濃度100ng/yL，dATP濃度為5mM;加入4yL DNA聚合酶，溫浴(37°C，20min)處理PCR產物，產生5'-末端單鏈;溫?。?5°(3,2〇11^11)，滅活 T4DNA聚合酶。
[0038] 3)LIC載體處理：
[0039] 堿法提取質粒PET28-LIC;采用快速限制性內切酶Sac頂每切，質粒濃度5yg/100y L，并去除RNA;補水至400yL，氯仿：異戊醇（24 :1)抽提2次；乙醇沉淀，漂洗；烘干（37°C， 5min)，溶解并電泳檢測酶切效果；反應體系于冰浴中配制，線性化質粒濃度5yg/100yL， dTTP濃度為5mM;加入4DNA聚合酶，溫浴(37°C，20min)，處理線性化質粒，產生5 ' -末端單鏈； 溫浴（75°C，20min)，滅活T4DNA聚合酶。
[0040] 4)連接非依賴的克隆：
[0041] 等體積混合T4DNA聚合酶處理的步驟2)中間片段和步驟3)載體；溫浴（70°C， 5min)，溫?。?2°C，30min)形成末端退火；反應完畢后，轉化大腸桿菌DH5a。涂布于含有 50mg/L氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)。選擇菌斑送至杭州擎科公司測序，經 檢測含有正確插入序列的克隆命名為pET32a_Nbpinl(Seq ID No.6)。
[0042] 綜上，利用本發(fā)明序列，可以構建用于連接非依賴克隆的載體，從而方便的進行外 源基因的連接非依賴克隆。
[0043] 以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的 限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權項】
1. 一對用于連接非依賴克隆的接頭序列，其特征在于：該接頭序列包括上游序列：gg gAg Cgg AAg Cgg，SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；和下游序列：gC Cag AgC CAC Cgc，SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。2. -種權利要求1所述的接頭序列在連接非依賴克隆方面的應用，其特征在于： a、 序列的獲得人工合成權利要求1所述的接頭序列； b、 利用分子生物學技術將接頭序列連接到質粒載體的多克隆位點位置后，形成的新的 載體，對外源片段進行連接非依賴的克隆。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于b步驟具體是:合成擴增Gat eway盒的引物， 其中上下游接頭序列分別位于上下游引物的5'末端，通過PCR擴增Gateway盒，通過酶切連 接克隆入目的載體的多克隆位點，形成新的載體作為連接非依賴的克隆，其中該載體的多 克隆位點的上下游位置分別為所述的上下游接頭序列； 進行連接非依賴克隆時，所述的上下游接頭序列分別設計與目的基因的上下游引物5' 末端，通過PCR擴增獲得側翼序列為上下游接頭的目的基因片段； 通過T4DNA聚合酶處理載體和中介片段，獲得5'末端突出的載體和中間片段，其中的末 端突出為接頭序列;通過將5 '末端突出的載體和片段混合，形成堿基互補配對，轉化，形成 完整的質粒載體，完成對目的片段的克隆。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域，特別涉及一對用于連接非依賴克隆的接頭序列及其應用。一種用于連接非依賴克隆的接頭序列，該接頭序列包括上游序列：gg？gAg？Cgg？AAg？Cgg，SEQ？ID？NO：7所示的核苷酸序列；和下游序列：gC？Cag？AgC？CAC？Cgc，SEQ？ID？NO：8所示的核苷酸序列。本發(fā)明的用于連接非依賴克隆(ligation？independent？cloing，LIC)序列，將該接頭序列連接入質粒載體后形成的新的載體，可以實現目的片段的連接非依賴克隆。
【IPC分類】C12N15/63, C12N15/11
【公開號】CN105524919
【申請?zhí)枴緾N201511027677
【發(fā)明人】趙晉平, 彭杰軍, 魯宇文, 燕飛, 程曄, 陳劍平
【申請人】浙江省農業(yè)科學院
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2015年12月31日