本發(fā)明屬于植物分子生物學技術領域，具體涉及植物低溫誘導啟動子及其應用，特別涉及薺菜低溫誘導的、能調控冷誘導基因的啟動子，以及該啟動子在改良植物抗寒性中的應用。

背景技術：

外界環(huán)境因素的如溫度、水分、光照、土壤離子濃度等大幅度變化都會對植物造成不利影響，不僅影響農(nóng)作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量，也會限制它們的時間和空間分布（Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat.Biotechnol., 1999, 17:287-291）。而低溫地區(qū)的許多植物經(jīng)歷了長期適應過程提高了對較低的零上溫度的適應能力，這種對低溫的適應能力稱冷馴化，能夠引發(fā)植物體內出現(xiàn)一系列生理生化反應，如細胞膜的流動性和穩(wěn)定性的變化，細胞內滲透物質的積累，細胞壁的抗壓能力的變化等等（Medina J. Luc-imaging the cold signal transduction pathway. Trends Plant Sci., 2001, 6(8):344）。低溫引起的這些生理變化多數(shù)是通過基因表達的變化造成的，這些基因包括感知低溫信號并傳遞低溫信號的轉錄因子和一些低溫誘導基因產(chǎn)生的低溫誘導蛋白。近些年從多種物種中克隆分離了一些冷誘導相關的基因，對于改良農(nóng)作物的抗冷性有著極大的意義（Zhou MQ, Shen C, Wu LH, Tang KX, Lin J. CBF-dependent signaling pathway: A key low temperature responder in plants. Crit. Rev.Biotechnol. 2011, 31(2):186-192）。但是在這些基因轉到植物中表達時，由于使用的是組成性的CaMV35S啟動子，導致基因在植物體內廣泛性的大量表達，雖然植物的抗冷性有了很大程度的提高，但植物在非低溫的正常環(huán)境下出現(xiàn)了矮化、生長延遲、晚花等表型，同樣會影響農(nóng)作物的產(chǎn)量（Zhou MQ, Xu M, Wu LH, Shen C, Ma H, Lin J. CbCBF from Capsella bursa-pastorisenhances cold tolerance and restrains growth via antagonism with gibberellin and affecting cell cycle signaling in tobacco,PlantMol Biol,2014, 85:259-275）。為了在達到植物抗冷目的的同時，保證植物的正常生長發(fā)育，利用抗冷基因自身的啟動子進行轉基因植物的培育已成為一種新的途徑。一些研究發(fā)現(xiàn)利用低溫調控基因自身的啟動子能保證低溫響應基因在正常溫度下維持較低的表達量，只在低溫寒害來臨時增加目的基因的表達，這樣不僅能提高植物的抗冷性，也大大減輕植物生長發(fā)育遲緩的表型（Kasuga M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol., 2004, 45(3):346-350）。利用特異性的誘導型啟動子降低外源基因在宿主植物中非特異性的持續(xù)、高效表達，避免出現(xiàn)不需要的表型，已經(jīng)得到普遍認可，但實際上有效應用于轉基因植物生產(chǎn)的特異性啟動子卻屈指可數(shù)，冷誘導型的特異啟動子則更是少之又少?？寺』虻奶禺悊幼硬⒀芯科浣Y構功能早已是轉基因植物研究中的一個熱點，而這一熱點所催發(fā)的一系列應用也會大力推動轉基因植物的研究發(fā)展，從而促進轉基因植物產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。

植物在遭受冷害時，會導致機體中產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），過多的ROS積累會對植物細胞造成損傷，但是一定量的ROS的提升還可做為細胞信號傳遞途徑中的第二信使，如鈣離子的增加，從而激活植物細胞中一種抗氧化防御機制來消除ROS的不利作用，導致植的抗冷能力的提高。近幾年在模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)一類低豐度的低溫誘導基因，稱為RCI（Rare Cold Inducible）基因。其中一類基因編碼產(chǎn)物為一種陽離子過氧化物酶（Llorente F, López-Cobollo RM, Catalá R, Martínez-Zapater JM, Salinas J. A novel cold-inducible gene from Arabidopsis, RCI3, encodes a peroxidase that constitutes a component for stress tolerance. Plant J.2002, 32(1):13），該基因受低溫誘導，在植物中的作用為在嚴寒脅迫下可增強植物細胞中活性氧的解毒功能從而抗寒（Kim MJ, Ciani S, Schachtman DP. A peroxidase contributes to ROS production during Arabidopsis root response to potassium deficiency. Mol. Plant. 2010, 3(2):420-427）。本發(fā)明的薺菜過氧化物酶基因啟動子是從較抗冷植物薺菜葉片的總基因組中克隆得到。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關薺菜過氧化物酶基因啟動子在培育耐寒植物中的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的薺菜過氧化物酶基因啟動子，該啟動子是能夠在低溫下強烈誘導表達的植物內源性啟動子。

本發(fā)明的的第二目的是提供所述薺菜過氧化物酶基因啟動子在利用轉基因技術改良植物抗逆（耐低溫）上的應用。

首先，通過基因組步移技術，從薺菜總DNA中克隆過氧化物酶基因的啟動子。過氧化物酶基因為植物中受冷誘導表達，能夠通過調控細胞內的活性氧而調控植物產(chǎn)生抗冷性的一類稀有的冷誘導上調基因（RCI），將該基因的啟動子命名為pCbRCI。所述啟動子序列是序列表SEQ ID No: 1中的堿基第1-1021位堿基序列。

本發(fā)明所提供的薺菜過氧化物酶基因啟動子區(qū)域含有4種與冷誘導以及非生物誘導相關的順式作用元件，分別是：

一個GGTCCAT-motif（auxin-responsive element），可以和生長素反應因子（ARF）相結合；

一個CGTCA-motif和一個TGACG-motif（MeJA-responsiveness），說明此基因可能能夠被甲基茉莉酸所誘導；

一個TATCCCA-motif（auxin-responsive element），說明此基因可能可以被赤霉素誘導激活；

一個GAGAAGAATA-motif和一個TCAGAAGAGG-motif，表明此基因可能可以被水楊酸誘導激活。

此外還發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)域除了這些與啟動子核心功能和非生物誘導相關的順式作用元件外，還有一組與逆境誘導相關的元件，如與干旱誘導相關的MBS元件（MYB binding site involved in drought-inducibility），說明此基因在干旱情況下也可能會強烈表達。

將利用所述啟動子構建的誘導性表達載體轉入植物中時，發(fā)現(xiàn)該啟動子能夠強烈誘導報告基因在植株中的表達，尤其是在植物根中的表達。

利用本發(fā)明所提供的啟動子構建的帶有抗寒基因的表達載體，轉化煙草后，在低溫誘導條件下，該啟動子可驅動抗寒基因在抗冷性較差的模式植物煙草中誘導表達，可通過檢測轉基因煙草的表型和抗寒的生理指標，顯示植株耐寒性能有了顯著提高。

本發(fā)明詳細技術方案如下：

本發(fā)明首先提供一種分離出的薺菜DNA分子，即薺菜過氧化物酶基因,它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No: 1所示；其中薺菜過氧化物酶基因啟動子包含序列表SEQ ID No: 1所示序列中的1-1021位堿基的核苷酸序列，之后連接的基因編碼一個受低溫誘導的、通過調控細胞內的活性氧而調控植物產(chǎn)生抗冷性的基因。

所述的一種分離的DNA分子，其啟動子區(qū)（SEQ ID No: 1序列中1-1021位）包含有一個響應生長素順式作用元件GGTCCAT，兩個響應甲基茉莉酸的順式作用元件CGTCA和TGACG，一個響應赤霉素的元件TATCCCA，兩個水楊酸誘導的元件GAGAAGAATA和TCAGAAGAGG，還有兩個與干旱誘導相關的MBS元件CAACTG。

此外還有甲基茉莉酸、水楊酸、生長素、赤霉素等4種激素的順式響應元件。

本發(fā)明還提供一種植物表達載體，所述表達載體含有權利要求1所述的薺菜過氧化物酶基因啟動子。

本發(fā)明還提供所述的薺菜過氧化物酶基因啟動子的制備方法，具體步驟為：

（1）將薺菜種子經(jīng)過70%酒精消毒后，播種于MS培養(yǎng)基上；

（2）待所述薺菜種子長出葉片后，提取所述葉片的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析其質量；以及

（3）采用基因克隆技術得到薺菜過氧化物酶基因的啟動子序列，使用的引物對為：上游引物為CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（SEQ ID No：2），下游引物為CbRCIR: 5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（SEQ ID No：3）。

本發(fā)明還提供所述植物表達載體的制備方法，具體步驟為：

（1）擴增出上述薺菜過氧化物酶基因啟動子的DNA片段，所用引物對為：上游引物為CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（SEQ ID No：2），下游引物為CbRCIR: 5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（SEQ ID No：3）；

（2）將所述DNA片段克隆到中間載體pMD18-T，再進一步克隆到植物表達載體p1304上，得到所述表達載體。

上述方法中，還包括向所述上游引物引入限制性酶切位點KpnI，以及向所述下游引物引入限制性酶切位點NcoI。

本發(fā)明還提供所述的薺菜過氧化物酶基因的啟動子或所述的植物表達載體在植物的抗寒性改良中的應用。

所述植物為具有經(jīng)濟價值的作物，優(yōu)選水稻、小麥、玉米、棉花、油菜、番茄或黃瓜。

附圖說明

圖1薺菜過氧化物酶基因啟動子的活性分析。其中，A. 帶有pCbRCI35::GUS的質粒構建模式圖；B.GUS基因表達量分析；C. 培養(yǎng)2周的擬南芥轉基因陽性苗全株冷處理前后GUS染色結果；D.培養(yǎng)5周的擬南芥轉基因陽性苗冷處理前后GUS染色后半薄切片分析（幼苗中bar為0.1cm，根、莖、葉中bar為 0.001cm）。

具體實施方式

下面結合實驗室具體的實驗方法和操作過程，進一步闡述本發(fā)明所做的工作。這些實驗方法僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如例如薩姆布魯克(著)，黃培堂(主譯). 分子克隆驗指南 (精編版) ，化學工業(yè)出版社，2008）或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1 薺菜過氧化物酶基因啟動子的分離和鑒定

在該實施例中，通過基因組步移技術獲得薺菜過氧化酶基因啟動子序列。實驗操作過程按照Universal Genome Walker TM Kit（CLONTECH）的說明書進行。

1. 薺菜幼苗的培養(yǎng)

所用播種的薺菜種子購買于上海市種子公司，播種前先在4℃處理3-7d，即進行春化處理，使種子萌發(fā)保持一致。春化過的種子用75%乙醇消毒5-10min，然后再到無菌操作臺進行下一步操作。將75%乙醇中的種子換到少量的無水乙醇溶液中，然后將種子連同無水乙醇一起倒在滅菌的濾紙上。等無水乙醇揮發(fā)完濾紙上種子干燥后，將濾紙上的種子散播在含有1/2MS培養(yǎng)基（MS粉 4.41g/L，蔗糖30g/L，瓊脂粉8.5g/L）的培養(yǎng)皿中，然后放置到22℃光照培養(yǎng)箱（16h光/8h暗）中培養(yǎng)。

2. 薺菜基因組DNA提取

將1 g新鮮薺菜葉片用液氮研磨成粉末狀后加入500 μL 65℃預熱的CTAB提取緩沖液，65℃水浴保溫60 min（中間不時緩慢振搖）；加入等體積的氯仿-異戊醇，輕輕混勻后靜置10 min；8000 g離心10 min使其分層，取出上清液轉入另一離心管；加入等體積的預冷的異丙醇（加入一滴NaAc），混勻后置于-20℃過夜以沉淀DNA；第二天取出離心管4℃，8000 g 離心10 min，棄去上清；用70%乙醇洗滌沉淀，8000 g 離心10 min，棄去上清，在空氣中干燥；將DNA沉淀溶解在合適體積（50μL）的TE緩沖液或dd H₂O水中，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量后放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. 基因組步移文庫的構建

將薺菜基因組DNA分別用限制性內切酶DraI，StuI，Pvu，EcoR酶切后，與Genome Walker 接頭連接（試劑盒提供）。連接的產(chǎn)物即為制備的4個基因組步移文庫。

4. PCR擴增

分為三個階段進行：

（1）根據(jù)薺菜過氧化酶基因的（GenBankAccesion No., AY566573）cDNA序列的開放閱讀框（ORF）設計2條引物：CbRCIF1：5-ATGAACTGCTTGAGAGCTATTGCCC-3（記為SEQ ID No. 2）和CbRCIF2：5-TTAACTATTTGCAACGGAACATTGCCT-3（記為SEQ ID No. 3），以基因組DNA序列為模板為，進行PCR擴增。PCR反應體系為：10×PCR Buffer 5μL；MgCl₂ (25mM) 10μL；dNTP Mix (10mM) 5μL；Taq DNA聚合酶(5U/μL) 1μL；Primer1 (10 μM) 1μL；Primer2 (10 μM) 1μL；DNA1 μL；dH₂O 26 μL; 總體積 50μL。使用程序為：94℃ for 5 min，30 cycles (94℃ for 30 sec, 56℃ for 30 sec, 72℃ for 50 sec)。擴增到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條特異性很強的片段，長度為1500bp左右?；厥赵撈尾⑦B接到pMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉化E. coil DH5a感受態(tài)細胞，測序得到序列長度為1532bp。與薺菜過氧化酶的cDNA序列（AY566573）比對分析，發(fā)現(xiàn)除了多出的三段內含子序列外，其余序列與AY566573均相同，說明我們得到的序列為薺菜過氧化物酶基因組序列；

（2）根據(jù)步驟（1）獲得的序列分別設計擴增中間序列上游的引物，其中兩個上游引物分別記為CbRCI5-1（5-TCGCACGAAACAATCATGGAAATG-3（記為SEQ ID No.4））和CbRCI5-2（5-AGCACTGATCCATCGCATCC-3（記為SEQ ID No.5））。以步驟3構建基因組步移文庫為模板，利用CIONTECH公司提供的Universal GenomeWalker Kit（Clontech）試劑盒中的接頭引物AP1和AP2分別與上游基因特異引物組合進行巢式擴增，所得目的條帶即包含有向中間序列的5’端外移了一定距離的序列。PCR的反應體系和程序均按試劑盒的說明書進行。上游序列的擴增經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條特異性很強的片段，長度為1300bp左右。回收這個片段并連接到pMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉化E. coil DH5a感受態(tài)細胞，測序得到上游序列長度為1312bp；

（3）根據(jù)步驟（2）擴增片段進行分析，發(fā)現(xiàn)步驟（2）擴增的片段與步驟（1）獲得的片段有213bp是重復的，說明我們獲得的序列為薺菜過氧化物酶基因的啟動子序列。根據(jù)步驟（2）擴增片段，設計2條引物，上游引物為CbRCIF：5-TCACAAAACTAGTTGTTCTTTAGTT-3（記為SEQ ID No.6），下游引物為CbRCIR：5-CTTTAAAGTTGTGGGGGTTTTTTTT-3（記為SEQ ID No.7）。擴增獲得全長啟動子序列。

5. 擴增序列分析

測序結果顯示克隆到的薺菜過氧化酶基因的5端序列全長1312bp記為SEQ ID No. 1。薺菜過氧化酶基因基因編碼框的第一個起始密碼子在1100個堿基處，第一個起始密碼子ATG前的1099個堿基為薺菜過氧化酶基因的5’側翼序列，為薺菜過氧化酶基因的啟動子序列，命名為pCbRCI。

6. 啟動子序列順式作用元件的預測

將測序得到的序列輸入Neural Network Promoter Prediction

(http://fruitfly.org:9005/seq_tools/promoter.html)預測轉錄起始位點。并將測序得到的序列輸入PLANTCARE網(wǎng)站進行啟動子順式作用元件的分析。

PLANTCARE網(wǎng)站地址為：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/。

實施例2 薺菜過氧化物酶基因在冷誘導和冷馴化處理下的表達特性

在該實施例中證實薺菜過氧化物酶基因具有低溫誘導特性。

1. 薺菜幼苗的處理

薺菜幼苗的培養(yǎng)與實施例1的程序相同。待薺菜幼苗生長到4w后進行冷馴化和冷誘導處理，冷馴化按溫度梯度12℃ (4d), 4℃ (4d), 0℃ (2h)連續(xù)處理，冷誘導在4℃條件下，分別按4h，8h，24h時間梯度處理，之后分別收集葉片、莖段和根等材料，放置到-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 薺菜幼苗的RNA抽提

采用植物RNA提取試劑盒（CW0588）（北京康為世紀生物科技有限公司）分別提取薺菜根、莖、葉三種組織的總RNA, 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。

3. 熒光定量PCR擴增

采用熒光定量PCR技術檢測各種處理條件下薺菜過氧化物酶基因表達量的變化，實驗設置三組重復，以薺菜18s rRNA基因（GenBank Accession No.：AY662285）為內參。反轉錄反應采用SYBR? Green qPCR試劑盒進行操作，操作步驟按試劑盒操作程序反應液配制在冰上進行，將各項組分輕柔混勻后立即進行反轉錄反應。然后使用TaKaRa生物公司的熒光定量試劑，在ABI step one plus 機器上進行熒光定量PCR反應。SYBR?Green I與雙鏈DNA結合后發(fā)出熒光，通過檢測反應體系中的SYBR?Green I熒光強度，檢測PCR產(chǎn)物擴增量。

4. 擴增結果分析

當薺菜生長在22℃條件下時，其體內的過氧化酶基因在根、莖和葉中的表達有些差別，在根中有少許微量表達，相對根中的表達，在莖和葉中表達量相對較低，幾乎無表達。在4℃冷誘導處理后薺菜根、莖、葉中過氧化酶基因的表達均有不同程度的提高，在0到8h內表現(xiàn)出持續(xù)上調，且在8h達到最高，之后表達量下降，24h時下降到比較低的量。冷馴化處理后，薺菜根中過氧化酶基因的表達量也有一定的上調，12℃處理時表達有少量增加，4℃處理后表達量的上調明顯進一步增加，0℃增加最為明顯。但在莖和葉中，冷馴化處理后過氧化酶表達量增加不明顯。

實施例3 薺菜過氧化物酶基因啟動子低溫誘導活性的GUS分析

在該實施例中，將克隆到的薺菜過氧化物酶基因的啟動子序列加上酶切位點BglⅡ和PstⅠ，通過取代CaMV35S啟動子的位置而連到pCAMBA1301載體上（由澳大利亞 CAMBIA [the Center of the Application of MolecularBiology to International Agriculture, Australia]提供），構建出一個驅動GUS基因表達的植物轉化載體。轉化擬南芥實驗表明，薺菜過氧化物酶基因啟動子在低溫誘導下能增強GUS基因的表達。因此，薺菜過氧化物酶基因啟動子在利用基因工程手段培育抗寒作物中具有潛在的應用前景。

1. 表達載體的構建

在本實施方案中，構建的表達載體pCAMBA1301-GUS通過酶切連接的方法切除了商品化的植物表達載體pCAMBA1301上自帶的CaMV35S啟動子，連入薺菜過氧化物酶基因的啟動子，調控GUS基因的表達，構建的模式圖見圖1A所示。

2. 將質粒轉入GV3101農(nóng)桿菌

取出存于-80℃的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，放在冰上融化后，加入1μl上述構建好的表達載體混勻，冰上放置30min后，加入液氮，5min后移入37℃水浴鍋中熱激5min，取出后再在冰上放5min，然后加入0.8mlLB培養(yǎng)液。放在28℃恢復培養(yǎng)2~3h后，5500rpm離心5min，留下約100μl上清，吹打底部沉淀混勻后，在超凈工作臺中將菌液涂到帶有三抗培養(yǎng)基（LB+50 mg/mL鏈霉素＋30 mg/mL利福平＋25 mg/mL卡那霉素）的培養(yǎng)皿中，晾干后倒置在28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d。

3. 農(nóng)桿菌菌液的培養(yǎng)和轉化液配制

挑取培養(yǎng)皿中生長的單個菌斑，接種到裝有10ml的三抗培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中活化培養(yǎng)，并采用PCR方法鑒定菌中是否帶有潮霉素和目的基因片段。轉化前一天，取確定的陽性菌按照1:100擴大培養(yǎng)轉入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時，農(nóng)桿菌液OD₆₀₀當在1.2到1.6之間。室溫5000rpm離心10min。棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應體積的滲透培養(yǎng)基里，使OD₆₀₀在0.8左右。

4. 浸花法轉化擬南芥

轉基因之前將已經(jīng)長出的果莢和花序上已經(jīng)開放和露白的花去掉，將花序浸泡在轉化液中約3~5min，然后將擬南芥水平放置在托盤上，將幼嫩的花序浸入相應的農(nóng)桿菌菌液中浸泡1 min后，用保鮮膜覆蓋住植株，移入黑暗中恒溫過夜培養(yǎng)，第二天將擬南芥取出光照培養(yǎng)，7d后相同操作步驟再轉化一次。培養(yǎng)3到4w待種子成熟后，收種子并放在干燥環(huán)境存放2w，該種子被稱為T0代種子。

5. 轉基因陽性植株的獲得和純系篩選

將T0代的種子先進行消毒，消毒程序為：70%乙醇浸泡8min，處理時不停地懸浮種子，最后用無水乙醇懸浮三次，置于無菌濾紙上待種子干燥后。然后均勻播撒在含有20mg/L潮霉素的平板上，2-3w后將生根的抗性苗移到營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，待苗長到4-5片葉時，取一小片葉提取DNA，PCR鑒定擬南芥抗性小苗中是否帶有潮霉素基因或者GUS基因。留下PCR鑒定的陽性苗，繼續(xù)培養(yǎng)，單株收種子，得到T1代種子。繼續(xù)種植，觀察T1代植株有沒有發(fā)生性狀分離，若發(fā)生分離則為雜合，若不分離則為純合；如果沒有純合植株，則繼續(xù)種植T2代，最終獲得不發(fā)生性狀分離的轉基因純合陽性株系。

6. GUS染色

將獲得的轉GUS基因的擬南芥純合株系的種子播撒在1/2MS 固體培養(yǎng)基上，待幼苗長到2w左右時，將一部分幼苗移入培養(yǎng)箱中4°C冷處理1 d后進行GUS 染色分析。GUS染色步驟如下：先將X-gluc用 N,N-二甲基甲酰胺預溶后加入GUS染色液儲存液（配方：100ml 溶液中含有0.2M NaH₂PO₄、0.2M Na₂HPO₄、100mM K₃Fe(CN)₆、100mM K₄Fe(CN)₆）中。然后將材料用預冷的90%丙酮處理10min，再用GUS 染色液儲存液（未添加 X-gluc）沖洗干凈。加入冷的GUS染色液，用真空抽氣泵抽氣1 h后， 37°C溫育過夜。逐步加入100%-90%-80%-75%一系列乙醇脫去葉綠素，65°C溫育，每隔1 h換一次乙醇，直至葉綠素脫干凈，染色后的材料在體視鏡下進行觀察和拍照。

另一部分擬南芥幼苗移栽植到營養(yǎng)土中，培養(yǎng)6w左右，對擬南芥苗進行4°C冷處理1d，分別取根、莖和葉進行 GUS 染色。GUS基因的表達產(chǎn)物，可將反應液中的X-Gluc水解成藍色物質，使組織呈現(xiàn)藍色，藍色的深淺及斑點數(shù)量，一定程度上反應GUS基因的表達水平。

7. 結果分析

將冷處理前后的純合轉基因幼苗進行組織染色分析，并通過熒光實時定量PCR檢測冷處理前后GUS基因的表達量變化。通過染色分析發(fā)現(xiàn)在正常溫度下，轉化pCbRCI35-GUS質粒的轉基因煙草小苗根莖葉組織幾乎沒有藍色，但在低溫條件下，擬南芥小苗根莖葉組織均顯現(xiàn)藍色斑點，由此說明，薺菜過氧化物酶基因的啟動子低溫誘導后在擬南芥中能啟動報告基因的表達（圖1C），同時發(fā)現(xiàn)在幼苗的根莖葉組織中，GUS的表達量在冷處理8 h后明顯上升，在冷處理8h后上調了18倍左右（圖1B）。

實施例4 薺菜過氧化物酶基因啟動子低溫誘導活性的半薄切片觀察

1、薺菜轉基因陽性苗

轉基因陽性苗獲得與實施例3相同。

2、GUS染色

轉基因陽性苗的GUS染色與實施例3相同。

3、半薄切片

取已經(jīng)進行GUS染色的葉片、根、莖等組織，用FAA固定液固定材料，然后分別用70%-85%-95%的乙醇連續(xù)脫水30min，更換無水乙醇后繼續(xù)脫水兩次，每次2h。接著將無水乙醇與Base Liquid Technovit 7100等體積混勻后預滲透材料約1~2h。將1g硬化劑1溶于100ml Base Liquid Technovit 7100后用于滲透材料過夜。隨后將1ml硬化劑2加入15ml預滲透液中，混勻后，立即包埋樣品，然后于65℃烘箱烘烤2-3d。半薄切片切片機切片，厚度約4~5um。最后在顯微鏡下觀察、拍照。

4、結果分析

轉基因幼苗長到5w大小時，利用半薄切片技術觀察組織的染色情況，如圖所示（圖1C）發(fā)現(xiàn)冷處理之前根莖葉中的表達量都非常低，葉和莖中幾乎沒有，根中也只能看到一點點隱隱約約的淡藍色。但是冷處理之后組織中表達量都有明顯上升，根中上升尤其明顯而且根中表達量的上調主要集中在根組織中細胞特別集中的形成層部位，這說明此基因可能參與冷害中植物具有分化能力部位組織的保護，莖和葉片中可以看出淡淡的藍色出現(xiàn)在細胞邊緣。

<110> 復旦大學

<120> 薺菜過氧化物酶基因啟動子及其改良植物抗寒性中的應用

<130> 001

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1312

<212> DNA

<213> 薺菜（Capsella bursa-pastoris）

<400> 1

tcacaaaact agttgttctt tagttaaatt ttgctttata tctcgaggcg attgctcaac 60

taccactaat tcactatata tgttttcatc catccataaa ttcatcagaa tattcaagat 120

tttacgaatt ctaaaaatga aagtgtcata gaatctcagt tatgatgtat aacttttaat 180

ttttggtgtt gattatgaca tcacaacgct caagacaatt aattaagttt agctttctat 240

gttacttact attagctaga cttttttctg ctgttgatta tgacatcata acgctcaaat 300

tcgaaaaaga gtcaaataag tttacgagac gttctatgtt accaacttac ccatagcttg 360

atttaaggac caactattta ccctctttta acatatctaa tactttatta tcccaggaca 420

aaataaaata aaataaaata tgtaaataca gttattgagg tttgagtttt aatacaatag 480

tcattgaaat ataattatct tttatagaga accaaacgag aaaaataagg aaactacatc 540

cctttccacc caagaattat ggcgagagta ttggtcatgc ccaaatcttt agtaacttaa 600

aacaaaatca cattggctac cttctggtgt aaaaatagtt ccataaacga actaaaacac 660

aagttacaag taatgggagg aaaacaatat ataagtggaa agacgtaaaa ctttaattaa 720

cttgagagta aaaacatctt ccaacttctc taattgaagc taaacatgat aatatgatat 780

attcattagt aagagtaata taaaaaccca taatcgtaat ttaattatga aattaaattt 840

tcaagctttt gtaattacga gtggcgcaga aaaaataatg aaaaataaca aaagcaaaac 900

aatgtacaac tcatgagaga gtgcacatgt tagttagctt gaatggaccc agcttacaca 960

accaacccag cagaaccttt ctatataaac cctcttttga cgtctcaata gaccacacac 1020

aacactacaa cacagtgaac atagtcctcc caaaaagaca tttgtgtctt gagaaaaaaa 1080

aacccccaca actttaaaga tgaactgctt gagagctatt gccctctcac tctctctctt 1140

tcttgtggga atggtcggac cgatccaagc tcagttgcag atgaacttct atgccaatac 1200

ttgtcctaac gccgaaaaga ctgttcaaga ttttgtttca aaccatattt ctaatgctcc 1260

ttctcttgct gctgctctca ttaggatgca tttccatgat tgtttcgtgc ga 1312

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213>

<400> 2

atgaactgct tgagagctat tgccc 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

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<400> 3

ttaactattt gcaacggaac attgcc 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

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tcgcacgaaa caatcatgga aatg 24

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<211> 20

<212> DNA

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<400> 5

agcactgatc catcgcatcc 20

<210> 6

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<212> DNA

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<400> 6

tcacaaaact agttgttctt tagtt 25

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<400> 7

ctttaaagtt gtgggggttt ttttt 25