本發(fā)明涉及基因工程和遺傳修飾領(lǐng)域，具體地說，涉及利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對MC4R基因進行編輯，并通過體細胞核移植技術(shù)獲得MC4R基因敲除豬。

背景技術(shù)：

PVN是食欲調(diào)節(jié)的一把鑰匙，主要表達MC4R。在PVN區(qū)，MC4R的活性受弓狀核不同神經(jīng)元分泌的激素調(diào)節(jié)(如激動劑α-MSH和拮抗劑Agrp等)。MC4R與配體結(jié)合后被活化，細胞外的信號傳到細胞內(nèi)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)cAMP濃度增高。最終激活cAMP應答元件(cAMPresponseelement，CRE)調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細胞的物質(zhì)代謝和基因表達。MC4R除參與經(jīng)典的信號調(diào)節(jié)通路外，它還調(diào)節(jié)MAPK信號通路中某些信號因子的活性，發(fā)揮減少體重的功能。

MC4R可以作為大動物育種的一個候選基因。該基因的突變與體重及脂肪性狀的呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性。如豬MC4R基因高度保守區(qū)內(nèi)發(fā)生一個錯義突變Asp298Asn，該位點多態(tài)性與豬的許多經(jīng)濟性狀顯著相關(guān)：MC4R基因型為298Asp時，豬表現(xiàn)為背膘厚減少、增長速度變慢、采食量降低，MC4R基因型突變?yōu)?98Asn時，豬表現(xiàn)為背膘厚增多、增長速度加快、采食量提高等相關(guān)性狀。

MC4R基因突變是最常見的單基因肥胖病因，占早期開始的嚴重兒童期肥胖的4％。

因而MC4R基因?qū)τ谵r(nóng)業(yè)上大動物的育種改良，以及醫(yī)學上的治療早發(fā)性肥胖具有重要的意義。

因而通過制作基因敲除豬，在此模型的基礎上闡明MC4R在豬脂肪發(fā)育中信號通路的作用，具有重要的意義。

CRISPR/Cas9是一種存在于細菌和古生菌中的適應性免疫系統(tǒng)。利用人工合成的sgRNA序列與基因組DNA的堿基互補配對，Cas9核酸內(nèi)切酶可以實現(xiàn)基因組的定點切割，從而產(chǎn)生DNA的雙鏈斷裂。DNA雙鏈斷裂可以通過兩種方式進行修復：其一是采取非同源末端連接修復方式(NHEJ)，這種方式會在雙鏈斷裂處產(chǎn)生隨機類型的插入/缺失修復，可能會造成基因的移碼突變，造成基因功能缺失。另一種修復方式是在以單鏈寡核苷酸或者雙鏈Donor質(zhì)粒載體為模板的指導下，通過同源重組(HR)的方式實現(xiàn)預期的精準修復。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種制備MC4R基因敲除豬的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供特異性靶向MC4R基因的sgRNA，其靶向MC4R基因CDS區(qū)6133-6152bp序列或7127-7146bp序列。

進一步地，當所述sgRNA靶向MC4R基因CDS區(qū)6133-6152bp序列時，其核苷酸序列為5’-ttctggaaccgcagcaccta-3’。

當所述sgRNA靶向MC4R基因CDS區(qū)7127-7146bp序列時，其核苷酸序列為5’-gactttctccttacacagtc-3’。

其次，本發(fā)明還提供了含有前述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶載體。作為優(yōu)選，其為連接有sgRNA的px-330質(zhì)粒，所述pX330質(zhì)粒購于Addgene公司。

所述CRISPR/Cas9打靶載體，是通過以下方法制備得到的：以合成引物的方式，合成sgRNA及其互補的寡核苷酸序列。將寡核酸序列進行退火操作，步驟為在94℃，5min；37℃，10min；冰上，5min。用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ酶切pX330質(zhì)粒，切膠回收載體骨架，利用T4DNA連接酶與退火后的寡核苷酸產(chǎn)物進行連接。

進一步地，本發(fā)明還提供了一種制備MC4R基因敲除細胞的方法，將含有靶向MC4R基因CDS區(qū)6133-6152bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶載體，與含有靶向MC4R基因CDS區(qū)7127-7146bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶載體共轉(zhuǎn)染細胞，從而敲除細胞的MC4R基因。

與此同時，本發(fā)明還提供了一種制備MC4R基因敲除豬的方法，即同時利用靶向MC4R基因CDS區(qū)6133-6152bp序列的CRISPR/Cas9打靶載體與靶向MC4R基因CDS區(qū)7127-7146bp序列的CRISPR/Cas9打靶載體，對MC4R基因?qū)崿F(xiàn)敲除。

具體而言，所述方法包括如下步驟：

(1)將含有靶向MC4R基因CDS區(qū)6133-6152bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶載體、含有靶向MC4R基因CDS區(qū)7127-7146bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶載體、與PL452-Neo質(zhì)粒分別進行酶切，得到線性化片段；所述pl452-Neo質(zhì)粒購于Addgene公司；

(2)將步驟(1)得到的線性化片段共轉(zhuǎn)染豬的胎兒成纖維細胞，通過G418(遺傳霉素)篩選具有抗性的單細胞克隆；

(3)選取狀態(tài)良好的陽性單細胞克隆作為核移植的供體細胞，卵母細胞作為核移植的受體細胞，利用體細胞核移植技術(shù)構(gòu)建克隆胚胎，將優(yōu)質(zhì)的克隆胚胎移植到代孕母豬的輸卵管內(nèi)，經(jīng)過全期發(fā)育獲得MC4R基因敲除豬。

其中，CRISPR/Cas9打靶載體pX330(包括靶向MC4R基因CDS區(qū)不同序列的兩種CRISPR/Cas9打靶載體pX330)與PL452-Neo基因進行共轉(zhuǎn)豬的胎兒成纖維細胞的方法為：pX330質(zhì)粒的總量為4μg(兩種pX330各2μg)，PL452-Neo基因線性載體與pX330質(zhì)粒按照摩爾比1:3混合，利用lonza核電轉(zhuǎn)儀及成纖維細胞電轉(zhuǎn)試劑盒進行轉(zhuǎn)染。

進一步地，本發(fā)明還提供了前述sgRNA或前述CRISPR/Cas9打靶載體在CRISPR-Cas9特異性敲除豬MC4R基因中的應用。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明首次針對豬MC4R基因的CDS區(qū)的兩個位點設計的sgRNA，并借助CRISPR-Cas9系統(tǒng)對兩個位點同時進行切割，實現(xiàn)了MC4R基因的大片段刪除，并且獲得了大片段刪除的敲除豬個體，這種制備MC4R基因敲除豬的方法在國內(nèi)外之前是沒有報道的。為研究豬MC4R基因提供了一種切實可行的方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中針對MC4R基因設計的靶向序列位置。

圖2為本發(fā)明實施例7中對單克隆細胞進行測序后，序列比對的結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實施例9中使用PCR方法鑒定新生豬的突變類型；其中，1號為820，2號為11502，3號為11501，4號為11503，5號為死胎，WT為野生型。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

其中：

pX330載體，pl452-Neo質(zhì)粒購于Addgene公司；

T4DNA連接酶、Q5超保真酶、BbsⅠ及T7EN1購于NEB公司；

引物合成由上海生工完成；

測序由美吉生物公司合成。

質(zhì)粒去內(nèi)毒素提取試劑盒及基因組提取試劑盒購于QIAGEN公司。

膠回收試劑盒購于GENSTAR公司。

酶切、連接、切膠回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴增等常規(guī)實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。

實施例1、CRSIPR/Cas9打靶載體cas-1-3、cas-3-3的構(gòu)建

根據(jù)CRISPR/Cas9的作用原理，在豬MC4R基因的CDS區(qū)設計sgRNA序列，如圖1所示。

選取cas9靶點1-3：

sgRNA序列為5’-ttctggaaccgcagcaccta-3’，根據(jù)堿基互補配對的原則，其反向互補序列為5’-taggtgctgcggttccagaa-3’；

選取cas9靶點3-3：

sgRNA序列為5’-gactttctccttacacagtc-3’，根據(jù)堿基互補配對的原則，其反向互補序列為5’-gactgtgtaaggagaaagtc-3。

pX330載體骨架需要使用BbsⅠ進行酶切，所以需要在sgRNA序列上補出BbsⅠ酶切位點的粘性末端，以利于其連入pX330載體骨架。加入BbsⅠ粘性末端的sgRNA序列及其互補序列。

a.將設計好的加入BbsⅠ酶切位點粘性末端的sgRNA及其互補序列以合成引物的方式進行合成。將合成的寡核苷酸進行退火操作，使其形成帶有粘性末端的DNA雙鏈。退火程序如下：94℃，5min；37℃，10min；冰上，5min。

b.pX330載體骨架使用BbsⅠ酶切，37℃水浴4h。然后進行瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收目的條帶。

c.載體骨架與sgRNA序列連接。將回收的載體骨架與sgRNA序列退火產(chǎn)物于16℃連接儀進行連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其長出單克隆后，挑取單克隆劃線，并進行測序鑒定陽性單克隆。測序引物為F:5'-GAGGGCCTATTTCCCATGAT-3'；R：5'-GGAAAGTCCCTATTGGCGTTA-3'。構(gòu)建好的質(zhì)粒(打靶載體)命名為cas-1-3、cas-3-3。

實施例2、陽性菌落的大量培養(yǎng)

a.挑取測序正確的陽性單克隆菌落，將其加入2-5ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，于搖床中37℃，300rpm劇烈搖動8h。

b.將初始培養(yǎng)的菌液以1/500-1/1000的稀釋比例加入到100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，于搖床中37℃，300rpm劇烈搖動12h-16h。

實施例3、cas-1-3、cas-3-3質(zhì)粒的去內(nèi)毒提取

參見QIAGEN公司的EndoFree Plasmid Maxi Kit說明書。將提取好的質(zhì)粒測濃度后分裝、凍存，用于后續(xù)的豬胎兒成纖維細胞的轉(zhuǎn)染。

實施例4、PL452-Neo質(zhì)粒的酶切

使用NEB公司的限制性內(nèi)切酶NotⅠ和NheⅠ對PL452-Neo質(zhì)粒酶切，37℃水浴4h。使用Genstar的膠回收試劑盒回收,測濃度后分裝，凍于-20℃冰箱備用。

實施例5、豬胎兒成纖維細胞的建系

a.將妊娠30天的農(nóng)大小香豬麻醉，從其子宮內(nèi)無菌取出胎兒，用含雙抗的PBS清洗胎兒后，置于超凈工作臺中，用眼科剪去除胎兒的頭部、四肢、內(nèi)臟及軟骨組織，用PBS沖洗干凈；

b.在細胞培養(yǎng)皿內(nèi)用眼科剪將剩余組織剪碎成約1mm³小塊；

c.加入適量的FBS，保持組織不至于過分干燥。將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移到1個T75細胞培養(yǎng)瓶中，將組織塊均勻鋪開；

d.加入5mL細胞培養(yǎng)基，將鋪有組織塊的一面向上，不被培養(yǎng)基浸沒，于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5h后，將T75翻轉(zhuǎn)，使組織塊被培養(yǎng)基浸沒；

e.培養(yǎng)3天左右，觀察到組織塊周圍有大量細胞爬出，待細胞生長至約90％匯合度時，對細胞進行消化并凍存?zhèn)溆谩?/p>

實施例6、豬胎兒成纖維細胞的轉(zhuǎn)染和中靶單細胞克隆的篩選：

a.將一個六孔板孔中，已達到80-90％匯合的豬胎兒成纖維細胞，進行消化、離心，獲得數(shù)量約2×10⁵-2×10⁶的豬胎兒成纖維細胞。

b.將質(zhì)粒pX330-1-3、pX330-3-3及PL452-Neo基因線性化片段加入Lonza轉(zhuǎn)染試劑中，混勻。

c.使用加入質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑重懸細胞，并將細胞懸液加入到電擊杯中，T-016程序電擊細胞。

d.電擊完成后，立即將細胞吸出，加3ml含10％血清的DMEM到六孔板的一個孔中。

e.37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，細胞達到80％-90％匯合，將細胞消化下來，稀釋至20-30個10cm細胞培養(yǎng)皿中。

f.24-48h后，待10cm皿中的細胞貼壁、且狀態(tài)良好，加入400-600μg/ml的G418，每隔一天補加一次G418，加藥量根據(jù)細胞狀態(tài)及匯合度靈活掌控，總加藥量不能超過1000μg/ml。G418篩選10-14天，可見單克隆長出。

g.單克隆的挑取及擴大培養(yǎng)。在顯微鏡下，使用記號筆將狀態(tài)良好的單克隆用圓圈圈出。棄掉10cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS清洗一次，將克隆環(huán)蘸取明膠，用克隆環(huán)將細胞單克隆圈住，加入10-30μl0.1％的胰蛋白酶，37℃消化1min。在顯微鏡下觀察，細胞變圓、游離，加入含20％FBS的DMEM終止消化，將細胞吸出加入24孔板中。48-72h后，24孔板中細胞匯合至80-90％時，將細胞傳至12孔板中。待12孔板中細胞達到80％-90％匯合時，對細胞進行凍存。

實施例7、中靶陽性單細胞克隆的鑒定

由于Cas9的切割造成雙鏈斷裂，NHEJ的修復方式會隨機產(chǎn)生插入/缺失突變，因此我們需要以打靶單克隆的基因組為模板，PCR擴增打靶位點所在區(qū)域，對其區(qū)域進行測序，檢測其堿基的插入/缺失突變的情況。

提取48個單克隆的基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增，PCR擴增引物為，PCR產(chǎn)物大小為1427bp。以野生型細胞的基因組作為陰性對照。PCR程序如下：98℃，30s；98℃，10s；56℃，30s；72℃，1min；72℃，2min。35個循環(huán)。缺失或者插入大片段的細胞單克隆，可以使用瓊脂糖凝膠電泳進行初步判定。將PCR產(chǎn)物連接peasy-simple blunt載體進行測序，序列比對情況如圖2所示。

實施例8、MC4R基因敲除豬的制備

a.以實施例7獲得的陽性豬胎兒成纖維細胞為核移植供體細胞。培養(yǎng)胎兒成纖維細胞至100％匯合1-2天，去除培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基，加入PBS洗滌1次，然后用0.1％胰蛋白酶消化約2min，待細胞變圓后立即后用含血清的細胞培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5min，棄上清，用操作液T2重懸離心沉淀的細胞，冰浴放置備用。

b.以體外成熟的卵母細胞為核移植受體卵質(zhì)。從母豬卵巢中采集卵丘卵母細胞復合體，經(jīng)過體外成熟并用透明質(zhì)酸酶脫去卵丘細胞，而后在體式顯微鏡下挑選排出第一極體、形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻的成熟卵母細胞備用。

c.在顯微操作儀下，將核移植供體細胞移入去核的成熟卵母細胞中。經(jīng)過電融合及化學激活，誘導細胞與卵子融合并同時激活卵母細胞。構(gòu)建成重組胚胎，融合胚放入低氧培養(yǎng)環(huán)境下(低氧培養(yǎng)箱或充入低氧混合配氣封袋密閉培養(yǎng))培養(yǎng)。采用微滴或四孔板培養(yǎng)，氣相條件為含7％O₂、88％N₂、和5％CO₂的混合氣體，培養(yǎng)溫度為39℃，濕度為100％。體外發(fā)育至1-4細胞期后觀察卵裂情況及發(fā)育狀態(tài)，并用于胚胎移植。

d.挑選形態(tài)正常、發(fā)育優(yōu)良的克隆胚胎用手術(shù)法移植入胚胎同期的母豬內(nèi)。移植步驟為舒泰常規(guī)麻醉，將母豬保定在手術(shù)架上面，盡量避開血管，在腹中線處切口，露出卵巢，輸卵管及子宮，使用胚胎移植管吸取胚胎，然后沿輸卵管傘部進入將克隆胚胎釋放到輸卵管壺腹部、峽部結(jié)合處。胚胎移植后給代孕母豬注射消炎針，30天后進行B超檢測妊娠情況。

實施例9、MC4R基因敲除豬的DNA水平檢測

使用新生公豬820#、11501#、11502#、11503#的耳組織提取基因組DNA，以其為模板對MC4R基因進行PCR擴增。PCR擴增引物F：5'-GATGCTAATCAGAGCCCTAC-3'；R：5'-TCCATTGTGCCTATAACCTG-3'。使用該引物對野生型豬基因組DNA進行擴增的PCR產(chǎn)物大小應為1427bp。若新生豬為基因敲除豬，則PCR產(chǎn)物大小約為420bp。結(jié)果表明11501#為部分缺失。其他樣送測序比對結(jié)果表明820#及11502#發(fā)生移碼突變，翻譯提前終止。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。