本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種矮牽牛花藥早期特異表達啟動子pphgrp的鑒定及其應(yīng)用。從矮牽牛植物中分離并克隆一個花藥早期特異性表達的啟動子，將其應(yīng)用于構(gòu)建特定的表達載體，可使特定的基因在花藥中特異性表達，達到調(diào)控花藥發(fā)育和創(chuàng)造基因工程雄性不育系等目的。

背景技術(shù)：

基因的表達主要受轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，其上游啟動子(promoter)和轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)結(jié)合，決定著基因的轉(zhuǎn)錄表達。啟動子一般可以分為組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異型啟動子三種。組成型啟動子可以調(diào)控下游的基因在不同組織不同時間段比較恒定的表達，現(xiàn)在比較常用的是花椰菜花葉病毒的啟動子(camv35s)，但是該啟動子會因持續(xù)驅(qū)動目的基因在植物各個組織中表達而消耗植物體內(nèi)過多的物質(zhì)能量，并造成一系列不利的結(jié)果(gittinsetal2000)，此外，還發(fā)現(xiàn)因組成型過表達目的基因而引起了基因沉默的現(xiàn)象(kumpatlaetal1998)。相比之下，受某些外界信號刺激的誘導(dǎo)性啟動子和在特定發(fā)育階段的特異組織中起作用的特異性啟動子，在應(yīng)用上則有很大靈活性和目的性。

組織特異性啟動子在轉(zhuǎn)基因定向改良植物性狀方面有著重要的意義，如莖特異啟動子有助于培育矮化或長梗的花卉品種?；ㄋ幪禺愋詥幼幼钪饕挠猛驹谟趧?chuàng)制雄性不育系，以利雜交制種。mariani等最早將煙草絨氈層特異性啟動子ta29融合barnase核糖核酸酶基因?qū)霟煵莺陀筒?，通過barnase在絨氈層特異表達，獲得了雄性不育株系(marianietal1990)。此后，該策略成功應(yīng)用于辣椒在內(nèi)的多種作物，擬南芥、大白菜、豌豆和水稻等都已開發(fā)用于雄性不育基因工程的花藥特異啟動子。srinivasan等將紅花線粒體編碼的未編輯基因uneditednad3融合酵母信號肽序列后，在ta29啟動子的驅(qū)動下轉(zhuǎn)化煙草，也可獲得雄性不育植株(srinivasanetal2015)。此外，用花藥特異啟動子高效表達目的基因，有助于研究后者在花藥中的特定功能。可見，花藥特異啟動子在實踐和理論上都有重要的意義。

矮牽牛(mitchell)被譽為花壇之王，具有較強的雜種優(yōu)勢，目前市場流行的品種均為f1代，每年的種子用量數(shù)以噸計，市場需求巨大。雄性不育是植物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑，利用雄性不育系創(chuàng)制雜交種對于矮牽牛的遺傳改良具有重要的意義。因此，挖掘矮牽?；ㄋ幪禺惐磉_啟動子，開展矮牽牛雄性不育相關(guān)基因功能驗證和雄性不育系創(chuàng)制具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個在矮牽?；ㄋ幇l(fā)育早期特異性表達的啟動子。本發(fā)明的啟動子屬于一種內(nèi)源啟動子，通過定量pcr檢測表明該啟動子驅(qū)動的內(nèi)源基因只在花藥發(fā)育早期表達，在其他時期或其他組織中均無表達。通過構(gòu)建該啟動子驅(qū)動的報告基因gus及毒素基因barnase的表達載體，分別轉(zhuǎn)化擬南芥和矮牽牛，發(fā)現(xiàn)所述的啟動子驅(qū)動的基因只在擬南芥的花藥中表達，本發(fā)明成功獲得了完全雄性不育的矮牽牛株系。本發(fā)明獲得了矮牽?；ㄋ幪禺惐磉_的啟動子，同時將該啟動子應(yīng)用于基因工程培育了矮牽牛雄性不育系，預(yù)示著該啟動子在植物花藥發(fā)育研究和開發(fā)中具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

發(fā)明人構(gòu)建了矮牽牛在短日照下形成的敗育花與正?；ǖ囊种撇顪p文庫，在敗育花文庫中篩選到一個差異表達顯著的基因phgrp。通過定量pcr檢測時空表達分析表明，該基因只在矮牽?；ㄋ幇l(fā)育早期特異性地表達(如圖1所示)。通過pcr擴增得到了phgrp基因的啟動子pphgrp，該啟動子的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示(長度為1220bp)。

發(fā)明人通過構(gòu)建由該啟動子驅(qū)動的報告基因gus的植物表達載體pphgrp::gus(見圖2所示)，并將其異源轉(zhuǎn)化到擬南芥(columbia)中，得到轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥植株。通過gus染色分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子只驅(qū)動gus基因在花藥中表達，在根、葉、角果、花瓣中均不表達(如圖3所示)。

進一步，發(fā)明人通過構(gòu)建由該啟動子驅(qū)動的毒素基因barnase的植物表達載體pphgrp::barnase(見圖4)，并將其同源轉(zhuǎn)化到矮牽牛中，得到轉(zhuǎn)基因陽性矮牽牛植株。通過表型觀測發(fā)現(xiàn)，該啟動子只驅(qū)動barnase基因在花藥中表達，最終導(dǎo)致矮牽牛雄性不育，而矮牽牛的營養(yǎng)器官及花的其他器官均發(fā)育正常(圖5)。

可以將本發(fā)明的啟動子用于構(gòu)建組織特異性表達載體。此外，還可以將目的基因可操作地連接到本發(fā)明的啟動子之下，構(gòu)建得到表達盒，進一步可將該表達盒導(dǎo)入植物表達載體，獲得組織特異表達的重組表達載體。因此，本發(fā)明還包括由上述啟動子構(gòu)建的表達盒，以及含有上述表達載體或表達盒的表達載體或重組載體。

上述重組表達載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織或器官，得到轉(zhuǎn)基因植物細胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無性系或其后代。所述含有上述花藥特異性啟動子的工程菌以及轉(zhuǎn)基因植物的細胞或組織或器官也屬于本發(fā)明的保護范圍。

應(yīng)用本發(fā)明的啟動子通過基因工程技術(shù)獲得的植物雄性不育系也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明的啟動子在花藥中能夠特異性地表達，可以用于目的基因在花藥中高效特異表達的功能研究。

2.本發(fā)明的啟動子在花藥發(fā)育早期特異性地表達，可以用于創(chuàng)建較為徹底的植物雄性不育系，為植物的遺傳改良提供了新的遺傳資源。

附圖說明

序列表seqidno：1是本發(fā)明分離的啟動子pphgrp的核苷酸序列。

圖1：矮牽牛phgrp基因的時空定量表達分析。附圖標記說明：圖1中的a圖是8個不同發(fā)育時期的花芽(0.2bud、0.3bud、0.5bud、1.0bud、1.5bud、2.0bud、2.5bud、3.5bud分別為來自去除花萼后高度為2mm、3mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、35mm的花芽)，圖1中的b圖是8個不同發(fā)育時期花芽中的花藥，圖1中的c圖是四輪花器官以及根、莖、葉、開放的花朵的qpcr表達分析結(jié)果。

圖2：植物表達載體pphgrp::gus的構(gòu)建圖。附圖標記說明：圖2中的a圖是pcambia1391z載體物理圖譜，圖2中的b圖是含有本發(fā)明的啟動子pphgrp的pphgrp::gus載體物理圖。

圖3：啟動子pphgrp驅(qū)動的gus基因在擬南芥中的表達檢測。附圖標記說明：圖3中的a圖是gus檢測顯示只在擬南芥的花藥部位染色，圖3中的b圖是在擬南芥角果、葉和根中不染色。

圖4：植物表達載體pphgrp::barnase的構(gòu)建圖。附圖標記說明：圖4中的a圖是bpfull1::barnase載體物理圖譜，圖4中的b圖是含有本發(fā)明的啟動子pphgrp的pphgrp::barnase載體物理圖。

圖5：轉(zhuǎn)pphgrp::barnase的矮牽牛植株表型觀測。附圖標記說明：圖5中的a圖是與野生型(即非轉(zhuǎn)基因，簡稱wt)矮牽牛相比，矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系1和轉(zhuǎn)基因株系2的花藥萎縮；圖5中的b圖是矮牽牛野生型(wt)與矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系1-4的花藥大小的比較，不同的大寫字母代表差異極顯著；圖5中的c圖是矮牽牛野生型(wt)與矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系的花粉染色測試；圖5中的d圖是矮牽牛野生型(wt)與矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系1成熟花粉的掃描電鏡觀察；圖5中的e圖是矮牽牛野生型(wt)與矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系的開放花朵；圖5中的f圖是矮牽牛野生型(wt)與矮牽牛轉(zhuǎn)基因株系1-4花朵大小的比較；圖5中的g圖是轉(zhuǎn)基因株系1不同花藥發(fā)育時期的半薄切片觀察，分別為來自去除花萼后高度為2、3、6、8、13、25和65mm的花芽。

具體實施方式

以下實施例進一步定義本發(fā)明。根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。

實施例1：phgrp基因的表達分析

①矮牽牛rna的提取

矮牽牛rna的提取采用液氮研磨法(具體方法參照huangetal.2015)，所用easyspinplantrnakit試劑盒購自北京艾德萊公司。rna分別提自8個不同發(fā)育時期的花芽(0.2bud、0.3bud、0.5bud、1.0bud、1.5bud、2.0bud、2.5bud、3.5bud分別為來自去除花萼后高度為2mm、3mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、35mm的花芽)、根、莖、葉、開放的花朵以及8個不同發(fā)育時期花芽中的花藥。

②反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cdna

使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的一步法試劑盒合成矮牽牛各組織的第一鏈cdna，該方法可在合成第一鏈cdna的同時，可以去除rna模板中殘留的基因組dna，無需對dnasei進行熱失活處理，從而降低了rna在反轉(zhuǎn)錄過程中被污染的幾率和損傷。

反轉(zhuǎn)錄體系：rna總體系7μl；anchoredoligo(dt)18primer(0.5μg/μl)1μl；2×tsreactionmix10μl；rt/rienzymemix1μl；gdnaremover1μl。

pcr程序：42℃反應(yīng)30min；85℃加熱5min。

③qpcr檢測phgrp基因的表達模式

試驗方法中使用的儀器為abi公司的7500fast熒光定量pcr儀。pcr反應(yīng)總體系為20μl，使用takara公司的sybr熒光染料。以各個物種間保守性都非常強的看家基因beta-actin作為內(nèi)參，根據(jù)genbank上同為茄科的番茄beta-actin(登陸號為u60482)和煙草beta-actin(登陸號為x69885)的保守區(qū)域設(shè)計一對特異引物(beta-actinf/beta-actinr)，將滅過菌的雙蒸餾水作為陰性對照。通過溶解曲線法來確定引物的質(zhì)量，每個樣品進行3次重復(fù)實驗。所用引物的序列如下：

qphgrpf：gggtattggaggttttggtttt，

qphgrpr：tcattgcatatttcttgggactg；

beta-actinf：gttggactctggtgatggtgtg，

beta-actinr：ccgttcagcagtggtggtg；

qpcr程序：95℃預(yù)變性30s，95℃變性3s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。

通過qpcr檢測，我們發(fā)現(xiàn)phgrp基因是在矮牽?；ㄑ堪l(fā)育早期的特定時間段(0.3bud)突然上調(diào)表達的基因(圖1中的a圖)，因為矮牽?；ㄑ渴怯伤妮喕ㄆ鞴俳M成的，所以我們將0.3bud這一時期的花芽分成四個部分(花萼、花冠、花藥、雌蕊)來進行該基因表達水平的檢測。通過分析我們發(fā)現(xiàn)該基因在幼根、嫩莖、葉片、開放的花朵、花萼、花冠、雌蕊中都檢測不到表達，只在花藥中有著很高的表達水平(見圖1中的c圖)。也就是說phgrp基因不僅具有花器官組織表達的特異性，而且還具有在花藥中特異表達的特性。最后我們又探究了phgrp基因在花藥各個發(fā)育時期的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在花藥各個發(fā)育時期的表達模式與在花芽各時期中非常相似，都是在組織發(fā)育的初期達到了峰值(圖1中的b圖)，可見phgrp基因具有發(fā)育時期的特異性。

實施例2：啟動子pphgrp的克隆

①矮牽牛基因組dna提取

矮牽牛dna的提取采用常規(guī)ctab法，具體操作方法參照huangetal.2015文獻報道。

②啟動子pphgrp序列的獲得

使用primer5軟件進行引物的設(shè)計，用于擴增該啟動子的引物序列如下：

pphgrpf:gaaatgttgtcatcaccctca，

pphgrpr:tttcttcaatagcagtacttgagag；

pcr反應(yīng)體系：10×buffer2μl；dntp0.4μl；上下游引物各0.2μm；taq聚合酶0.2μl，加ddh2o補足至20μl體系。

pcr程序：94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec,72℃1min，28個循環(huán)；72℃延伸至7min。

通過pcr克隆我們成功的獲得了長為1220bp的phgrp基因的啟動子，我們將該基因的啟動子命名為pphgrp，該啟動子的核苷酸序列如序列表seqidno：1所示。

實施例3：利用啟動子表達載體pphgrp::gus載體轉(zhuǎn)化擬南芥

①表達載體pphgrp::gus的構(gòu)建

表達載體pphgrp::gus的構(gòu)建是將啟動子pphgrp插入到含有g(shù)us基因的pcambia1391z的質(zhì)粒中去。使用primerpremier5軟件設(shè)計引物，進行pcr反應(yīng)，回收目的片段后進行bp反應(yīng)，然后通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5α，挑取飽滿的菌落進行pcr檢測。

引物序列：

pphgrpf:gaaatgttgtcatcaccctca，

gus-r：tttttgtcacgcgctatcag；

pcr反應(yīng)體系：10×buffer2μl；dntp0.4μl；上下游引物各0.2μl；taq聚合酶0.2μl，加ddh2o補足至20μl體系。

pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，25個循環(huán)；72℃延伸至7min。

挑取陽性菌落進行測序，從測序正確的單菌落中提取質(zhì)粒，并同時提取載體質(zhì)粒。酶切檢測后重新連接啟動子和線性化質(zhì)粒，我們將構(gòu)建好的表達載體命名為pphgrp::gus。

②利用表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105

利用目的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌eha105，具體步驟如下：于-80℃中取出實驗室保存的根癌農(nóng)桿菌eha105，放置冰上凍融大約5min，電轉(zhuǎn)前將電轉(zhuǎn)杯提前用95％的乙醇沖洗，將質(zhì)粒和電轉(zhuǎn)杯在冰上預(yù)冷；將1μl表達載體質(zhì)粒輕輕加入感受態(tài)中，輕柔地吸打。將反應(yīng)液吸入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中電轉(zhuǎn)，將電壓調(diào)為2200v；調(diào)緊電轉(zhuǎn)杯旋鈕，按下start鍵，電轉(zhuǎn)結(jié)束顯示6ms；立即向電轉(zhuǎn)杯中加入900μl液體lb(提前預(yù)熱)，重懸后轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，于28℃搖床(200r/min)振蕩1h；菌液4000r離心2min，棄掉800μl上清，涂于含有km的lb培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)室倒置培養(yǎng)3d；對長出的單菌落進行pcr檢測，挑選陽性單菌落，搖菌，按照700μl菌液/300μl50％甘油的比例保菌，-80℃保存，用于下一步轉(zhuǎn)化。

③利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥columbia

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花器浸醮法轉(zhuǎn)化擬南芥(columbia)，具體步驟如下：挑取陽性單菌落于100ml液體lb(含有100μl卡那霉素即km)中，28℃搖床200r·min-1搖動24h；搖濃后，分裝至兩個50ml離心管中，于4000r下離心10min，去上清，加入一定量的重懸液(5g蔗糖+50μlsilwetl-77，定容至100ml)振蕩后至od值為0.8。將擬南芥花序放入重懸液中，30s后取出，未能浸入重懸液中的花序可用棉花蘸取重懸液涂抹在花序上，或用移液槍滴加。為了確保每個枝條上的花序都完成侵染，用木棍將待試植株固定，套上黑色塑料袋，避光處理24h后恢復(fù)正常生長條件，1周后用相同的步驟重復(fù)侵染一次；在第二次侵染3周后，停止?jié)菜?，待植株干枯后收取種子，晾干后烘干，放入4℃冰箱中春化一周，開始篩選種子。

④gus基因在擬南芥中表達的檢測

將生殖生長時期轉(zhuǎn)基因陽性植株的組織(例如根、莖、葉片、花芽)放入1.5ml離心管中，加入一定量的gus染液，以淹沒植物組織為準，放入37℃恒溫箱中過夜；之后將gus染液用移液器全部吸出，加入70％乙醇，脫色3-4次，直至植物組織呈白色。脫色完成后，將樣品置于體視顯微鏡下拍照觀察。

擬南芥的染色結(jié)果表明，pphgrp驅(qū)動的gus只在花藥發(fā)育的初期被染上色(圖3a)，而根、葉和角果均未染色(見圖3中的b圖)，證明了該啟動子是花藥組織特異性啟動子，并具有物種間的通用性。

實施例4：利用啟動子表達載體pphgrp::barnase轉(zhuǎn)化矮牽牛

①表達載體pphgrp::barnase的構(gòu)建

通過pcr反應(yīng)，用限制性內(nèi)切酶sall和bamhl去除bpfull1::barnase表達載體中的bpfull1啟動子，然后將長度為1220bp的pphgrp啟動子(序列見序列表seqidno:1)連接上去，構(gòu)建得到pphgrp::barnase表達載體。

上游引物序列：atgtcgacgaaatgttgtcatcaccctca，

下游引物序列：atggatcctttcttcaatagcagtacttgagag；

pcr反應(yīng)體系：10×buffer2μl；dntp0.4μl；上下游引物各0.2μl；taq聚合酶0.2μl，加ddh2o補足至20μl的反應(yīng)體系中。

pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，25個循環(huán)；72℃延伸至7min。

②利用表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌eha105

將目的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌eha105。(具體方法參照實施例3中的步驟②)

③利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化矮牽牛mitchell

采用葉盤法進行矮牽牛(mitchell，huangetal.2015)的遺傳轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，16h光照/8h黑暗的光周期，光照強度為7147lx，相對濕度保持在40％。具體步驟如下：挑取陽性農(nóng)桿菌的單克隆菌落于添加100mg·l-1km的5ml的液體lb培養(yǎng)基中，置于28℃，200r·min-1搖床中震蕩培養(yǎng)過夜至od值＝0.4；選取幼嫩的矮牽牛葉片(簡稱外植體)，流水沖洗葉片表面10min，在超凈工作臺中先用75％濃度的酒精消毒10s，再用無菌水沖洗2次，然后用0.1％升汞消毒30min，最后用無菌水沖洗3-5次，將外植體置于無菌濾紙上切成1.0cm×1.0cm大小方塊。在超凈工作臺上向制備好的菌液中加入已滅菌的ddh2o至50ml，添加100umol·l^-1as(乙酰丁香酮)500ul；將切好的矮牽牛葉片置于菌液中侵染30min，期間不斷晃動錐形瓶。將侵染完成的葉片外植體取出放在已滅菌的濾紙上，吸盡多余的菌液后將被侵染的葉片遠軸面朝下平放在共培培養(yǎng)基上，在25℃下暗培3d；然后將共培后的矮牽牛葉片轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，于25℃光下培養(yǎng)，兩周更換一次培養(yǎng)皿，直至形成抗性芽。待抗性芽長至3cm左右，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根(將未生根的外植體葉片每20d左右用新鮮的篩選培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)一次)，去除假陽性苗，待抗性芽的根系長勢良好，根長3cm，株高7cm左右時(約需要10d)打開瓶蓋在室內(nèi)煉苗3-5d。移栽時仔細去除再生小苗根上的培養(yǎng)基，將再生小苗栽于培養(yǎng)基質(zhì)上(配方：泥炭土：蛭石：珍珠巖的體積比＝4：3：3)中保濕培養(yǎng)1-2d后送入溫室內(nèi)培養(yǎng)。待再生小苗生長健壯后移入常規(guī)園土中做常規(guī)養(yǎng)護管理。

培養(yǎng)基的配制：

共培培養(yǎng)基：ms+2％蔗糖+1％葡萄糖+0.75％瓊脂+2.0mg·l^-16-ba+0.1mg·l^-1naa+1.0mg·l^-1zt+2.0mmol·l^-1as；

篩選培養(yǎng)基：ms+2％蔗糖+1％葡萄糖+0.75％瓊脂+2.0mg·l^-16-ba+0.1mg·l^-1naa+1.0mg·l^-1zt+100mg·l^-1km+300mg·l^-1cef；

出芽培養(yǎng)基：ms+2％蔗糖+1％葡萄糖+0.75％瓊脂+2.0mg·l^-16-ba+0.1mg·l^-1naa+2.0mg·l^-1zt+100mg·l^-1km+300mg·l^-1cef；

生根培養(yǎng)基：ms+3％蔗糖+0.75％瓊脂+0.1mg·l^-1iba+50mg·l^-1km+300mg·l^-1cef

lb液體培養(yǎng)基：0.1％nacl+0.05％酵母提取物+0.1％蛋白胨；

④轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株的陽性檢測

分別采集矮牽牛轉(zhuǎn)基因km抗性苗及對照(ck)的嫩葉用于gdna的提取。用特異性引物(phgrp-pf和barnase-r)對提取的dna進行pcr擴增。

引物序列為：

phgrp-pf：gaaatgttgtcatcaccctca，

barnase-r：catattgttcatctcccatt；

pcr反應(yīng)體系：10×buffer2μl；dntp0.4μl；上下游引物各0.2μl；taq聚合酶0.2μl，加ddh2o補足至體系至20μl。

pcr程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，59℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸至10min，20℃保溫。

我們用pphgrp::barnase載體轉(zhuǎn)化矮牽牛共獲得10棵陽性植株，其中3株表現(xiàn)為完全的雄性不育，營養(yǎng)器官和其它3輪花器官的生長均未受到影響(圖5)。

主要參考文獻目錄

gittinsjr,pellnytk,hileser,rosac,biricoltis,jamesdj(2000)transgeneexpressiondrivenbyheterologousribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenasesmall-subunitgenepromotersinthevegetativetissuesofapple(maluspumilamill.).planta210:232–240.

kumpatlasp,chandrasekharanmb,iyerlmetal.(1998).genomeintruderscanningandmodulationsystemsandtransgenesilencing.trendsinplantscience3:97–104.

marianic,beuckeleermd,truettnerj,leemansj,goldbergrb(1990).inductionofmalesterilityinplantsbyachimaericribonucleasegene.nature347:737-741.

srinivasana,yaminikn,reddyss,kumarvd(2015).tapetumspecificexpressionofuneditednad3genefromsafflowerandtargetingtheproteinintomitochondriainducesmalesterilityintransgenictobaccoplants.plantcelltissueandorganculture120(1):387-398.

xuehuang,yuanzhengyue,jiansun,haopeng,zhaonanyang,manzhubao,huironghu(2015).characterizationofafertility-relatedsant/mybgene(phrl)frompetunia,scientiahorticulturae183:152-159。

sequencelisting

<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>矮牽?；ㄋ幵缙谔禺惐磉_啟動子pphgrp的鑒定和應(yīng)用

<130>

<141>2017-03-14

<160>1

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>1220

<212>dna

<213>矮牽牛（petuniahybrida）

<400>1

gaaatgttgtcatcaccctcaatgaacaaagatgaggaaattttaccacttagtcacgaa60

attcatccaaaatttcagctgtcattagcctatggaaggaaggtcaaaaccttccaccat120

gttcaaggatgactccaatggctatggtgctaaaatttagtgaaatctttaacatttagg180

tattggttgtaagatatatgattattaaaaggttcctcctccttgattgtttttagtcgg240

ataatagatgggggagtggtaaaagtaatgcccaccaatattgtgcataagtgttcaact300

caaaattttgagactgcagacgctagatggtaccatatctctgtccttagaagccaaagt360

ggaagtaggagaactctgtgttagtataacgttgtactaaggtttttgctgaacagtatc420

tctttagcgaacagcaaaattgctcttaggtttcatggtttcagtttaaaccataacaag480

ttgatgcacttaatcatagcttttgaagtttgaagaagcgttcttgagcttttttcttgt540

ctctcttagtccgggagaaagggacttggagtattttattttgtcttagttgtatgaaag600

tatatatgacgaactccatgaattggcaagaaatgctaaaaaaagtttaatacctttaag660

agtctgctatcactttccttaatagaaacttaatcctaagtttaactgtgacaatccaac720

ttcccatctaccttgatcatattgaggaaaatgcacgtgtgcataaaacatgttggaagg780

atttctaaatgagaagtgacactttttatttacttaatgatatcttcaactgttcttttt840

acatgggactaacttcttaggctcgtggaattctttgatgaaagatttgatgtaaatctt900

caggatgtttctttggatgtgacctaagtgaataaaagatgtatatttgaaggaataatt960

gattagctttgctgtaaggaagaattaggttgatcatgaagttgagatggtgagactgaa1020

gtctctttctgtaaagacgtagttggcttcttgttgtaaacaaaatatatgtacaataat1080

agtgcacattgcatgagttcctaactatcacattcttccttgctatttcacttccttagc1140

tactataaaacatcaacttccaaactcaaacatctcacactcaaaacatcttttactctc1200

aagtactgctattgaagaaa1220