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水稻根特異表達(dá)啟動子POsRO4及相應(yīng)水稻培育方法與流程

文檔序號:11506047閱讀:411來源:國知局
水稻根特異表達(dá)啟動子POsRO4及相應(yīng)水稻培育方法與流程

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言,本發(fā)明涉及一種水稻根特異表達(dá)啟動子posro4的克隆及利用其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻培育的方法。



背景技術(shù):

高等生物的生長發(fā)育是不同基因在時(shí)間和空間上有序表達(dá)和協(xié)同作用的過程。啟動子作為一個(gè)重要的調(diào)控元件,通過和眾多轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而決定了基因的表達(dá)模式與表達(dá)強(qiáng)度。

通過分子生物學(xué)以及基因工程的手段去研究和改良作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。在近年的時(shí)間里,植物基因工程的研究取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展,已經(jīng)成為作物遺傳改良和基因功能研究中的一項(xiàng)重要方法和手段。但是在其廣泛運(yùn)用的過程中也逐漸暴露了一些問題。其中之一就是現(xiàn)階段研究中經(jīng)常用組成型表達(dá)啟動子來驅(qū)動目的基因表達(dá)。盡管組成型啟動子能高效、非特異性的啟動外源基因表達(dá),但這種外源基因的組成型表達(dá)往往會造成大量異源蛋白的積累,從而打破植物原有的代謝平衡,妨礙植物的正常生長。例如生長遲緩、生長期長、甚至不育和死亡。因此,需要尋找更為有效的特異啟動子來調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)。組織特異性啟動子使基因的表達(dá)往往只限于某些特定的器官或組織部位,不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在該器官或組織積累,增加區(qū)域表達(dá)量,同時(shí)可避免植物體內(nèi)不必要的營養(yǎng)浪費(fèi),減少對植物生長的副作用,因此具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

水稻作為人類最重要的糧食作物之一,其產(chǎn)量的高低對人類生活,經(jīng)濟(jì)具有重要的影響,而病蟲害及逆境常常造成水稻大量減產(chǎn),因此利用基因工程技術(shù)改良水稻,使其獲得抗病、抗蟲能力以及對環(huán)境的耐受性是提高水稻產(chǎn)量的有效途徑之一。要使外源基因有效、合理、穩(wěn)定的表達(dá),需要有相應(yīng)的啟動子來驅(qū)動。根是水稻吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官,根特異表達(dá)系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等。目前在植物中,雖然已有少數(shù)根部特異表達(dá)的啟動子被克隆并應(yīng)用于基因功能的研究,但在一個(gè)載體中重復(fù)使用同一個(gè)啟動子易造成轉(zhuǎn)基因沉默,由此可見,有必要去發(fā)展更多的水稻等禾谷科作物的根特異型啟動子,這對基礎(chǔ)性研究和遺傳改良應(yīng)用都具有重要的意義。

水稻發(fā)育的最重要的器官并非種子,而是根部,水稻的根毛部位是水稻根系發(fā)揮其作用的最重要的一個(gè)部位,現(xiàn)有的根特異啟動子,往往是在整個(gè)水稻的根系發(fā)揮作用,而實(shí)際上,根毛部位和根主干部位所起到的作用還是具有很大差異的,因此,若是能夠提供一種僅在水稻根毛部位表達(dá),而在其他部位,不表達(dá)的啟動子,則可以在減少植物代謝負(fù)擔(dān)的情況下,而實(shí)現(xiàn)對植物的特異性調(diào)控。

但是目前現(xiàn)有的文獻(xiàn)中,均未見到有根毛特異性表達(dá)啟動子的報(bào)道。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻根特異表達(dá)基因posro4的啟動子,利用該啟動子能驅(qū)動外源基因在水稻根組織中特異表達(dá)。

為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供水稻根特異表達(dá)基因posro4的啟動子,其特征在于,該啟動子包含seqidno:1所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地,所述啟動子還包括1)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與seqidno:1所示的核苷酸序列雜交、且具有啟動子功能的核苷酸序列;或者

2)與1)限定的dna序列與seqidno:1所示的dna序列有至少80%的同源性,且具有啟動子功能的核苷酸序列;或者

3)在seqidno:1中所示的核苷酸序列中取代、缺失或添加一個(gè)或插入多個(gè)核苷酸后所獲得的具有啟動子功能的核苷酸序列。

另一方面,本發(fā)明提供一組擴(kuò)增所述核苷酸序列的全部或其任意片段的引物對。

優(yōu)選地,正向引物的核苷酸序列如seqidno:2所示,反向引物的核苷酸序列如seqidno:3所示。

另一方面,本發(fā)明提供一種表達(dá)盒,其特征在于,所述表達(dá)盒包含所述的核苷酸序列。

另一方面,本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體,其特征在于,其為在植物表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入所述的核苷酸序列得到的重組質(zhì)粒,所述核苷酸序列連接于載體中待表達(dá)基因序列的上游。

另一方面,本發(fā)明提供一種所述的啟動子posro4在驅(qū)動目標(biāo)基因在植物中根特異性表達(dá)方面的應(yīng)用。

另一方面,本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因水稻培育方法,其特征在于,所述方法包括:(1)獲取權(quán)利要求1所述的啟動子posro4;

(2)將步驟(1)中所獲得的啟動子連接至具有改善根功能的目標(biāo)基因,獲得重組表達(dá)載體;

(3)將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入目標(biāo)水稻種子;

(4)利用所述目標(biāo)水稻種子進(jìn)行水稻植株的培育。

在一種實(shí)現(xiàn)方式中,所述待表達(dá)的基因?yàn)間us基因。該重組表達(dá)載體為將seqidno.1所示的序列即posro4或啟動子posro4。構(gòu)建于pcambia1381中得到的重組表達(dá)載體,本文中稱為pcambia1381-posro4?;蛘叽磉_(dá)基因可以為任何對水稻根組織具有改善功能的基因。

優(yōu)選地,所述待表達(dá)基因?yàn)榫哂懈纳扑靖M織性狀能力的基因。

另一方面,本發(fā)明提供一種所述的水稻根表達(dá)啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用,其特征在于,所述應(yīng)用包括:將所述水稻根表達(dá)啟動子連接于載體中待表達(dá)的基因序列上游,從而構(gòu)建重組表達(dá)載體;將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。

進(jìn)一步地,所述應(yīng)用用于改良植物生長特性,特別是根部的生長及改良。

序列表中seqidno.1所示的dna序列為來源于日本晴水稻(oryzasativalcv.nipponbare)的根特異性強(qiáng)表達(dá)啟動子,本文中稱為posro4或啟動子posro4。具體而言,本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1972bp的dna序列,具有驅(qū)動目標(biāo)基因水稻根中特異性表達(dá)的功能,并且分離克隆、鑒定該dna序列的功能。

技術(shù)效果

本發(fā)明所述的啟動子序列可與植物雙元表達(dá)載體連接,用于取代組成型啟動子。并且,該啟動子序列可以與所需的靶標(biāo)基因連接,構(gòu)建重組植物表達(dá)載體,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化后,在水稻的根部位(尤其是根毛部位)特異性的驅(qū)動靶標(biāo)基因的表達(dá),增加轉(zhuǎn)基因的效果,避免不必要部位表達(dá)帶來的物質(zhì)能量浪費(fèi),有效改良水稻的特性,在實(shí)際應(yīng)用中具有顯著價(jià)值,如通過該啟動子驅(qū)動目標(biāo)基因在植株根中表達(dá),可以增強(qiáng)根發(fā)育過程中對環(huán)境的抵抗力,比如耐寒性、耐熱性等等;或提高根部吸收營養(yǎng)和水分的能力;或提高根部抵抗害蟲的能力,從而培育出理想的轉(zhuǎn)基因植物品種。

附圖說明

以下,結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案,其中:

圖1為將啟動子posro4構(gòu)建于pcambia1381載體質(zhì)粒中的示意圖,其中圖a為pcambia1381示意圖,圖b為pcambia1381-posro4示意圖,其中示出了利用posro4啟動子驅(qū)動位于其下游的gus基因表達(dá)。

圖2為對本發(fā)明的pcambia1381-posro4表達(dá)載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。

圖3為對獲得的posro4::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株pcr檢測電泳圖,m:dnamarker2000;pc,陽性質(zhì)粒;nc,陰性對照植株;1-16:pcambia1381-posro4轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素hpt基因pcr產(chǎn)物。

圖4為對獲得的posro4::gus轉(zhuǎn)基因陽性水稻植株進(jìn)行g(shù)us染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、根特異表達(dá)啟動子的獲得

一、根特異性表達(dá)啟動子的獲得及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)ncbi中提供的水稻品種日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因組序列,利用primer5引物設(shè)計(jì)軟件依據(jù)水稻posro4啟動子的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點(diǎn),設(shè)計(jì)引物的酶切位點(diǎn),引物序列如下:

fp:gtcgacgagagcaggacagcgcaactaa

rp:gaattcttttaatctatatttttttcct

其中g(shù)tcgac堿基為限制性內(nèi)切酶sali的識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基;gaattc堿基為限制性內(nèi)切酶ecori的識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基。

采用天根公司(北京)的植物dna提取試劑盒方法提取水稻基因組dna。以基因組dna為模板,利用正向引物、反向引物,采用phusion高保真dna聚合酶,按常規(guī)pcr體系,采用如下擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸2min30s,循環(huán)35次;最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?;厥誴cr產(chǎn)物,并按照說明書,將其連接至t‐載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,在含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。待長出單個(gè)克隆后,對單個(gè)克隆進(jìn)行pcr篩選,挑出陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒,送去北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序,并與ncbi中該啟動子序列比對。測序結(jié)果表明,pcr產(chǎn)物具有序列表的序列,末端第1至1796位核苷酸所示的dna片段,并將序列表的序列末端第1至1796位核苷酸所示的dna片段命名為posro4。

用限制性內(nèi)切酶sali和ecori酶切植物表達(dá)載pcambia1381,回收線性化載體骨架(約10657bp)。

將posro4的酶切回收產(chǎn)物與載體骨架線性化片段用progemat4連接酶連接(10×t4ligasebuffer1μl,t4ligase1μl,目的片段2μl,pcambia1381質(zhì)粒大片段6μl),4℃冰箱過夜連接16-18h,得到連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒,并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)過菌落pcr篩選重組子和雙酶切驗(yàn)證正確的(酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示),送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序并將測序。測序正確的重組子,提取其質(zhì)粒,利用凍融法將其轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌eha105中,挑取陽性的菌落搖菌,并用甘油保存菌液備用。至此,獲得含有pcambia1381‐posro4表達(dá)載體的農(nóng)桿菌,用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

實(shí)施例2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

(1)愈傷組織誘導(dǎo)消毒后的種子用無菌水在30℃黑暗條件下浸泡過夜,用解剖刀將胚剝下置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每皿(規(guī)格為100×25mm的一次性塑料培養(yǎng)皿,內(nèi)含50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基)均勻放置12個(gè)胚,在30℃黑暗條件下放置2~3周誘導(dǎo)愈傷組織,至長出淡黃色顆粒狀愈傷。

(2)預(yù)培養(yǎng)從誘導(dǎo)培養(yǎng)基上挑選顆粒狀、不帶病斑的愈傷組織置于新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,于30℃黑暗條件下培養(yǎng)3~5d。

(3)侵染及共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至50ml無菌管中,加入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡20min,倒出菌液,并用無菌濾紙將殘余菌液吸干。后將愈傷均勻撒在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上,于23℃黑暗條件下培養(yǎng)2~3d。

(4)恢復(fù)將共培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基上(愈傷之間盡量避免重疊)。23℃黑暗培養(yǎng)3~5d。

(5)篩選從篩選培養(yǎng)基上挑選不帶菌斑顏色鮮亮呈淡黃色顆粒狀的抗性胚性愈傷組織,每皿30粒接種于篩選培養(yǎng)基,30℃黑暗培養(yǎng)2~3周,至長出新的抗性顆粒狀愈傷。

(6)分化每一轉(zhuǎn)化事件(篩選時(shí)由一粒愈傷組織繁殖產(chǎn)生的所有愈傷組織)挑選三個(gè)獨(dú)立的胚性愈傷到分化培養(yǎng)基某一區(qū)域,30℃光照培養(yǎng)室(16h光照/8h黑暗)條件下培養(yǎng)3~4周,待幼苗長出。

(7)生根每一區(qū)域挑選兩棵健壯的幼苗移栽至生根培養(yǎng)基,30℃組織培養(yǎng)室光周期(16h光照/8h黑暗)培養(yǎng)三周左右,進(jìn)行鑒定并移栽至田間。

實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因水稻苗中啟動子的特異表達(dá)

按照天根試劑盒的方法,提取實(shí)施例2轉(zhuǎn)化了pcambia1381-posro4表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因水稻葉片的dna,用潮霉素基因hpt檢測引物進(jìn)行擴(kuò)增,挑出陽性轉(zhuǎn)基因植株,結(jié)果如圖3所示。

選取轉(zhuǎn)基因陽性植株的組織器官,即根、莖、葉、葉鞘、花和種子分別進(jìn)行g(shù)us染色(50ml0.5m磷酸緩沖液(ph7.0),50μl100mm鐵氰化鉀k3fe(cn)6,50μl100mm亞鐵氰化鉀k4〔fe(cn)6〕·3h2o,1ml0.5medta,250μl1mg/mlx-gluc)。將各組織分別浸于gus染色液中,37℃過夜24小時(shí)。經(jīng)75%乙醇脫色后,在體視鏡下觀察并記錄gus染色的結(jié)果。結(jié)果如圖4所示(標(biāo)尺=0.5cm),在含有posro4::gus轉(zhuǎn)基因水稻植株中,只有根中有明顯的藍(lán)色,而在莖、葉、葉鞘、花和種子中沒有著色。這表明posro4啟動子驅(qū)動gus基因只在根部表達(dá),由此說明,posro4啟動子是根部特異表達(dá)啟動子。

此外,申請人發(fā)現(xiàn),從圖中的深淺度對比可以看出,并且通過各部位表達(dá)量的歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行對比也可以得出,啟動子在根毛部位的表達(dá)強(qiáng)度要比根其他部位表達(dá)強(qiáng)度高5倍以上,也就是說,本發(fā)明的啟動子是一種在根尖的根毛部位具有特異性強(qiáng)表達(dá)的啟動子,而根毛是根更新?lián)Q代和生長最重要的器官,本發(fā)明的啟動子在根毛部位的特異性強(qiáng)表達(dá)意義重大。

以上對本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形,只要不脫離本發(fā)明的精神,均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。

序列表

<110>安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所

<120>水稻根特異表達(dá)啟動子posro4及相應(yīng)水稻培育方法

<130>hci20170109

<160>3

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<213>根特異表達(dá)啟動子

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