本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種基于ilv衰減子的工程菌及其在生產異亮氨酸中的應用。
背景技術：
：l-異亮氨酸是人體必需的8種氨基酸之一，與亮氨酸、纈氨酸統(tǒng)稱為分支鏈氨基酸。由于它特殊的結構和功能，l-異亮氨酸在人和動物生命代謝中具有重要作用，參與合成激素、酶類等。目前，l-異亮氨酸主要用于飼料以及功能性飲料的添加劑。此外，l-異亮氨酸還被廣泛應用于生物醫(yī)藥、食品工業(yè)、化妝品等領域，且新的用途被不斷發(fā)現(xiàn)，大大增加了市場需求量。目前國內外工業(yè)化生產l-異亮氨酸的主要方法是微生物發(fā)酵法。然而，微生物中l(wèi)-異亮氨酸的合成途徑及調控方式較復雜，是高效發(fā)酵生產l-異亮氨酸及其衍生物的關鍵限制因素。微生物合成氨基酸(如l-組氨酸、l-蘇氨酸、l-苯丙氨酸、l-亮氨酸、l-異亮氨酸和l-色氨酸等)的操縱子基因的轉錄表達存在衰減調節(jié)機制。當胞內特定氨基酸濃度較高時，氨基酸操縱子的轉錄提前終止。相反地，當胞內特定氨基酸缺乏時，rna聚合酶轉錄氨基酸操縱子。微生物發(fā)酵生產l-異亮氨酸或其衍生物的過程中，胞內l-異亮氨酸逐步積累，通過上述衰減調控機制反饋阻遏ilvlxgmeda操縱子的表達，從而反饋抑制l-異亮氨酸或其衍生物的生物合成。為了構建高效生產異亮氨酸或其衍生物的工程菌，亟需開發(fā)ilv衰減子改造的方法，以提高ilvlxgmeda操縱子表達水平和異亮氨酸產量。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種基于ilv衰減子的工程菌及其在生產異亮氨酸中的應用。本發(fā)明首先提供了dna分子甲(ilv衰減子突變體)，為如下(a1)、(a2)或(a3)：(a1)將ilv衰減子的第1至n4位核苷酸去除得到的dna分子；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)；(a2)在(a1)的末端連接標簽序列得到的dna分子；(a3)在(a1)的末端連接連接序列得到的dna分子。所述dna分子甲具體可如序列表的序列19第n1至n2位核苷酸所示。所述dna分子甲具體可如序列表的序列19第n1至155位核苷酸所示(ilv衰減子截短體)。所述dna分子甲具體可如序列表的序列19第n1至n3位核苷酸所示(ilv衰減子變體)。n1為129以上148以下的自然數(shù)(n1優(yōu)選為137)。n2為155以上215以下的自然數(shù)(n2具體可為155以上185以下的自然數(shù)或186以上215以下的自然數(shù)，更具體可為155、185或215)。n3為156以上215以下的自然數(shù)(n3具體可為156以上185以下的自然數(shù)或186以上215以下的自然數(shù)，更具體可為185或215)。本發(fā)明還保護所述dna分子甲在促進下游目的基因表達中的應用。所述應用中，所述dna分子甲作為調控元件。所述應用中，所述dna分子甲位于所述目的基因的啟動子和所述目的基因的起始密碼子之間。所述應用中，所述啟動子具體可為序列表的序列21所示的啟動子pthr-trc。所述應用中，所述目的基因具體可為序列表的序列22所示的gfp基因。本發(fā)明還保護dna分子乙，自上游至下游依次包括：所述dna分子甲和目的基因。所述目的基因具體可為序列表的序列22所示的gfp基因。本發(fā)明還保護dna分子丙，自上游至下游依次包括：啟動子、所述dna分子甲、目的基因和終止子。所述啟動子具體可為序列表的序列21所示的啟動子pthr-trc。所述目的基因具體可為序列表的序列22所示的gfp基因。所述終止子具體可為ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。所述dna分子乙自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列19第137至215位核苷酸，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列22所示的gfp基因。所述dna片段丙自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列21所示的啟動子pthr-trc，限制性內切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列19第137至215位核苷酸，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列22所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。本發(fā)明還保護dna分子丁(解除反饋阻遏的ilvlxgmeda操縱子基因，又稱ilvlxgmeda操縱子基因突變體)，是將ilvlxgmeda操縱子基因中從ilv衰減子第1位開始計數(shù)的第1至n4位核苷酸去除得到的dna分子；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述dna分子丁具體可為序列表的序列19第137至6556位核苷酸所示的雙鏈dna分子。本發(fā)明還保護dna分子戊，包括所述dna分子丁。dna分子戊中，不具有序列表的序列19第1至n4位核苷酸；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。dna分子戊自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列20第1至987位核苷酸所示的dna分子、序列表的序列19第137至6556位核苷酸所示的dna分子。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重組載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組菌的基因組中不具有序列表的序列19第1至n4位核苷酸；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述重組菌中，具有編碼蘇氨酸操縱子的基因。所述重組菌中，具有編碼ilva*蛋白的基因。所述重組菌中，具有編碼ilvc蛋白的基因。所述重組菌中，具有編碼ilvg蛋白的基因。所述重組菌中，不具有編碼meta蛋白的基因。所述重組菌中，不具有編碼lysa蛋白的基因。所述重組菌中，不具有編碼tdh蛋白的基因。所述重組菌中，不具有編碼tdcc蛋白的基因。所述重組菌中，不具有編碼sstt蛋白的基因。本發(fā)明還保護一種構建重組菌的方法，包括如下步驟：通過同源重組的方式，使出發(fā)菌的基因組中具有所述dna分子丁或所述dna分子戊，得到重組菌。所述出發(fā)菌具體可為重組菌ec711。重組菌ec711為以大腸桿菌k12w3110為初始菌，敲除編碼高絲氨酸琥珀酰轉移酶(meta蛋白)的基因、編碼二氨基庚二酸脫羧酶(lysa蛋白)的基因、編碼蘇氨酸脫水酶(tdh蛋白)的基因、編碼蘇氨酸吸收轉運蛋白(tdcc蛋白)的基因和編碼蘇氨酸吸收轉運蛋白(sstt蛋白)的基因，并且導入編碼蘇氨酸操縱子的基因，得到的重組菌。重組菌ec711為以大腸桿菌k12w3110為初始菌，敲除編碼高絲氨酸琥珀酰轉移酶(meta蛋白)的基因、編碼二氨基庚二酸脫羧酶(lysa蛋白)的基因、編碼蘇氨酸脫水酶(tdh蛋白)的基因、編碼蘇氨酸吸收轉運蛋白(tdcc蛋白)的基因和編碼蘇氨酸吸收轉運蛋白(sstt蛋白)的基因，并且導入編碼蘇氨酸操縱子的基因和編碼蘇氨酸脫氨酶(ilva蛋白或ilva*蛋白，優(yōu)選為ilva*蛋白；ilva蛋白為野生型蛋白，ilva*蛋白為在ilva蛋白基礎上進行突變得到的解除反饋抑制的蛋白)的基因，得到的重組菌。重組菌ec711為以大腸桿菌k12w3110為初始菌，敲除編碼高絲氨酸琥珀酰轉移酶(meta蛋白)的基因、編碼二氨基庚二酸脫羧酶(lysa蛋白)的基因、編碼蘇氨酸脫水酶(tdh蛋白)的基因、編碼蘇氨酸吸收轉運蛋白(tdcc蛋白)的基因和編碼蘇氨酸吸收轉運蛋白(sstt蛋白)的基因，并且導入編碼蘇氨酸操縱子的基因和編碼蘇氨酸脫氨酶(ilva蛋白或ilva*蛋白，優(yōu)選為ilva*蛋白)的基因和編碼乙酰羥酸異構還原酶(ilvc蛋白)的基因，得到的重組菌。由于ilva蛋白受異亮氨酸反饋抑制，是異亮氨酸合成的限速步驟。因此本發(fā)明使用解除反饋抑制的ilva*蛋白。meta蛋白和lysa蛋白均為競爭代謝途徑的蛋白，tdh蛋白為蘇氨酸降解途徑的蛋白，tdcc蛋白和sstt蛋白為蘇氨酸內排轉運蛋白。為了更好的實現(xiàn)異亮氨酸合成，還需使其前體代謝物蘇氨酸高效積累。作為蘇氨酸高效生物合成的代謝工程改造方法，需要過表達蘇氨酸操縱子基因。作為過表達的方法，可以使用表達強度增強的表達元件，如啟動子和rbs等；也可以在染色體上增加所需表達基因的拷貝數(shù)；還可以在工程菌種導入攜帶所需過表達基因的質粒。所述“編碼蘇氨酸操縱子的基因”為編碼天冬氨酸激酶i-高絲氨酸脫氫酶復合體的基因、編碼高絲氨酸脫氫酶的基因和編碼蘇氨酸合成酶的基因。所述天冬氨酸激酶i-高絲氨酸脫氫酶復合體為thra蛋白(野生蛋白)或thra*蛋白(突變蛋白)。所述高絲氨酸脫氫酶為thrb蛋白。所述蘇氨酸合成酶為thrc蛋白。編碼thra蛋白的基因為thra基因。編碼thra*蛋白的基因為thra*基因。編碼thrb蛋白的基因為thrb基因。編碼thrc蛋白的基因為thrc基因。所述thra*蛋白為如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列10所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b2)將序列10的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有天冬氨酸激酶i-高絲氨酸脫氫酶復合體功能的由序列10衍生的蛋白質。所述thra*基因為編碼區(qū)如序列表中序列9第337-2799位核苷酸所示的dna分子。所述thrb蛋白為如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列11所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(c2)將序列11的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有高絲氨酸脫氫酶功能的由序列11衍生的蛋白質。所述thrb基因為編碼區(qū)如序列表中序列9第2801-3733位核苷酸所示的dna分子。所述thrc蛋白為如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列12所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(d2)將序列12的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有蘇氨酸合成酶功能的由序列12衍生的蛋白質。所述thrc基因為編碼區(qū)如序列表中序列9第3734-5020位核苷酸所示的dna分子。所述“編碼蘇氨酸操縱子的基因”為序列表的序列9第172-5132位核苷酸所示的dna分子。所述ilva*蛋白為如下(e1)或(e2)：(e1)由序列表中序列15所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(e2)將序列15的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有蘇氨酸脫氨酶功能的由序列15衍生的蛋白質。編碼ilva*蛋白的基因為開放閱讀框如序列表的序列14第1至1545位核苷酸所示的dna分子或為如序列表的序列14第1至1630位所示的dna分子。所述ilvc蛋白為如下(f1)或(f2)：(f1)由序列表中序列16所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(f2)將序列16的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰羥酸異構還原酶功能的由序列16衍生的蛋白質。編碼ilvc蛋白的基因為開放閱讀框如序列表的序列14第1717至3192位核苷酸所示的dna分子或為如序列表的序列14第1631至3275位所示的dna分子。所述重組菌ec711中，編碼蘇氨酸操縱子的基因整合于基因組的lysa基因位點(lysa基因位點即編碼lysa蛋白的基因的位點)。所述重組菌ec711中，編碼蘇氨酸脫氨酶的基因整合于基因組的sstt基因位點(sstt基因位點即編碼sstt蛋白的基因的位點)。所述重組菌ec711中，編碼蘇氨酸脫氨酶的基因和編碼乙酰羥酸異構還原酶的基因整合于基因組的sstt基因位點(sstt基因位點即編碼sstt蛋白的基因的位點)。所述meta蛋白為如下(g1)或(g2)：(g1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(g2)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質。所述meta基因為編碼區(qū)如序列表中序列1第752-1681位核苷酸所示的dna分子或為序列表中序列1所示的dna分子。所述lysa蛋白為如下(i1)或(i2)：(i1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(i2)將序列4的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質。所述lysa基因為編碼區(qū)如序列表中序列3第639-1901位核苷酸所示的dna分子或為序列表中序列3所示的dna分子。所述tdh蛋白為如下(j1)或(j2)：(j1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(j2)將序列6的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列6衍生的蛋白質。所述tdh基因為編碼區(qū)如序列表中序列5第753-1778位核苷酸所示的dna分子或為序列表中序列5所示的dna分子。所述tdcc蛋白為如下(k1)或(k2)：(k1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(k2)將序列8的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列8衍生的蛋白質。所述tdcc基因編碼區(qū)如序列表中序列7第701-2032位核苷酸所示的dna分子或為序列表中序列7所示的dna分子。所述sstt蛋白為如下(m1)或(m2)：(m1)由序列表中序列18所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(m2)將序列18的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列18衍生的蛋白質。所述sstt基因為編碼區(qū)如序列表中序列17第701-1945位核苷酸所示的dna分子或為序列表中序列17所示的dna分子。所述出發(fā)菌可為埃希氏菌屬細菌或棒桿菌屬細菌。所述埃希氏菌屬細菌具體可為大腸桿菌。所述棒桿菌屬細菌具體可為谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明還保護以上任一所述重組菌在制備異亮氨酸中的應用。應用所述重組菌生產異亮氨酸時，采用葡萄糖作為碳源。應用所述重組菌生產異亮氨酸時，采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所述重組菌。所述發(fā)酵培養(yǎng)基可以是豐富培養(yǎng)基，也可以是無機鹽培養(yǎng)基。培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機離子、抗生素和其它的營養(yǎng)因子。作為碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖類；也可以是甘油、甘露醇等醇類；也可以使用葡萄糖酸、檸檬酸、丁二酸等有機酸類。作為氮源，可以使用氨水、硫酸銨、磷酸銨、氯化銨等無機氮源；也可以使用玉米漿、豆粕水解液、毛發(fā)粉、酵母提取物、蛋白胨等有機氮源。無機離子包含鐵、鈣、鎂、錳、鉬、鈷、銅、鉀等離子中的一種或多種。其它營養(yǎng)因子還包括生物素、維生素b1、吡哆醛等維生素。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖。所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體可為：葡萄糖20.0g/l、硫酸銨15.0g/l、磷酸二氫鉀2.0g/l、七水硫酸鎂2.0g/l、酵母粉2.0g/l、蛋氨酸0.6g/l、l-賴氨酸鹽酸鹽1.2g/l、碳酸鈣15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量為水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量為水。所述培養(yǎng)的條件具體可為：37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)36h。所述培養(yǎng)的條件具體可為：將種子液以3％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)36h。種子液的制備方法如下：將重組菌接種至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液。所述種子液的od600nm值具體可為5.0。所述培養(yǎng)的過程中進行如下過程控制：培養(yǎng)過程中，用氨水調節(jié)反應體系的ph值使其維持在6.8-7.0；培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，檢測葡萄糖含量，當體系中的葡萄糖含量低于5g/l時，補加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達到10g/l。本發(fā)明還保護一種提高微生物生產異亮氨酸的能力的方法，包括如下步驟：刪除微生物的ilvlxgmeda操縱子基因中從ilv衰減子第1位開始計數(shù)的第1至n4位核苷酸；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述微生物為具有ilvlxgmeda操縱子的微生物。所述微生物具體可為埃希氏菌屬微生物。所述埃希氏菌屬微生物具體可為大腸桿菌。本發(fā)明還保護一種解除微生物中ilvlxgmeda操縱子反饋阻遏的方法，包括如下步驟：刪除微生物的ilvlxgmeda操縱子基因中從ilv衰減子第1位開始計數(shù)的第1至n4位核苷酸；n4為128以上147以下的自然數(shù)(n4優(yōu)選為136)。所述微生物為具有ilvlxgmeda操縱子的微生物。所述微生物具體可為埃希氏菌屬微生物。所述埃希氏菌屬微生物具體可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌k-12或其衍生菌株。以上任一所述ilvlxgmeda操縱子可為來源于埃希氏菌屬微生物的ilvlxgmeda操縱子，具體可為來源于大腸桿菌的ilvlxgmeda操縱子。埃希氏菌屬微生物并不特別限定用哪一種微生物，若野生型株用作含有ilvlxgmeda操縱子的dna供體株，可以得到含有野生型ilvlxgmeda操縱子的dna。然而，大腸桿菌k-12株不表達活性的乙酰羥基酸合成酶同工酶ⅱ。因此，本發(fā)明的ilvg基因來源于大腸桿菌bl21株的染色體dna供體。以上任一所述ilvlxgmeda操縱子基因包括ilv衰減子、編碼ilvx蛋白的基因，編碼ilvg蛋白(乙酰乳酸合酶)的基因、編碼ilvm蛋白(乙酰乳酸合酶)的基因、編碼ilve蛋白(支鏈氨基酸轉氨酶)的基因、編碼ilvd蛋白(二羥酸脫水酶)的基因和編碼ilva蛋白(蘇氨酸脫氨酶)的基因。所述ilvx蛋白可為如下(p1)或(p2)：(p1)由序列表中序列24所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(p2)將序列的氨基酸序列24經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列24衍生的蛋白質。ilvg蛋白可為如下(q1)或(q2)：(q1)由序列表中序列25所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(q2)將序列的氨基酸序列25經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乳酸合酶功能的由序列25衍生的蛋白質。ilvm蛋白可為如下(r1)或(r2)：(r1)由序列表中序列26所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(r2)將序列的氨基酸序列26經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙酰乳酸合酶功能的由序列26衍生的蛋白質。ilve蛋白可為如下(s1)或(s2)：(s1)由序列表中序列27所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(s2)將序列的氨基酸序列27經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有支鏈氨基酸轉氨酶功能的由序列27衍生的蛋白質。ilvd蛋白可為如下(t1)或(t2)：(t1)由序列表中序列28所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(t2)將序列的氨基酸序列28經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有二羥酸脫水酶功能的由序列28衍生的蛋白質。ilva蛋白可為如下(w1)或(w2)：(w1)由序列表中序列29所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(w2)將序列的氨基酸序列29經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有二羥酸脫水酶功能的由序列29衍生的蛋白質。編碼ilvx蛋白的基因具體可如序列表的序列19第186-236位核苷酸所示。編碼ilvg蛋白的基因具體可如序列表的序列19第239-1885位核苷酸所示。編碼ilvm蛋白的基因具體可如序列表的序列19第1882-2145位核苷酸所示。編碼ilve蛋白的基因具體可如序列表的序列19第2165-3094位核苷酸所示。編碼ilvd蛋白的基因具體可如序列表的序列19第3159-5009位核苷酸所示。編碼ilva蛋白的基因具體可如序列表的序列19第5012-6556位核苷酸所示。ilv衰減子如序列表的序列19第1至155位核苷酸所示。ilvlxgmeda操縱子具體可如序列表的序列19所示。以上任一所述異亮氨酸具體可為l-異亮氨酸。本發(fā)明通過去除ilv衰減子的特定序列，意外的獲得了可以顯著提高基因表達水平的ilv衰減子突變體。本發(fā)明通過刪除衰減子中編碼前導肽的基因ilvl和終止子莖環(huán)結構中前段反向互補回文序列，可以顯著提高后續(xù)基因的表達水平。顯而易見，根據(jù)本專利的試驗結果，本領域技術人員可輕易推論得到，在本發(fā)明保護的ilv衰減子突變體上同時保留上述衰減子終止子莖環(huán)結構中前段反向互補回文序列的部分序列，但尚未形成穩(wěn)定的莖環(huán)結構，同樣可能得到相似性能的ilv衰減子突變體。因此，這種類似的改造ilv衰減子的方法也在本專利的保護范圍之中。顯而易見，在改造菌株染色體上的ilv衰減子同時刪除ilvl開放閱讀框上游若干堿基對，也在本發(fā)明的保護范圍內。顯而易見，本發(fā)明解除大腸桿菌的ilv衰減子的方法，同樣可應用于其它菌屬的ilv衰減子。ilvlxgmeda操縱子基因編碼從蘇氨酸合成異亮氨酸的5步反應的酶，因此，通過改造ilv衰減子，可以高效解除ilvlxgmeda操縱子的衰減調控，提高ilvlxgmeda操縱子的表達水平。本發(fā)明可以用于生產異亮氨酸，因此，顯而易見，本發(fā)明還可用于異亮氨酸代謝途徑下游化合物的生物合成以及異亮氨酸衍生物的合成。采用本發(fā)明提供的方案，可以顯著提高異亮氨酸及其衍生物產量，對于異亮氨酸及其衍生物的生產領域具有極其重大的應用推廣價值。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。下述實施例中如未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學出版社)、《微生物學實驗(第4版)》(高等教育出版社)以及相應儀器和試劑的廠商說明書等參考。atcc：https://www.atcc.org/。大腸桿菌k12w3110(又稱e.colik12w3110)：日本技術評價研究所生物資源中心(nitebiologicalresourcecenter,nbrc)。大腸桿菌k12mg1655：atcc編號為700926。pkov質粒：addgene公司，產品目錄號為25769。pacyc184質粒：neb公司，產品目錄號e4152s。pgfpuv載體：clontechlaboratories,inc.，catalogno.632312。大腸桿菌ec135：記載于如下文獻：zhangetal,plosgenetics，2012,8(9):e1002987。實施例1、e.colik-12w3110△meta△lysa△tdh△tdcc的構建以大腸桿菌k12w3110為出發(fā)菌株，依次敲除meta基因(編碼高絲氨酸琥珀酰轉移酶的基因)、lysa基因(編碼二氨基庚二酸脫羧酶的基因)、tdh基因(編碼蘇氨酸脫水酶的基因)和tdcc基因(編碼蘇氨酸吸收轉運蛋白的基因)，獲得底盤工程菌，將其命名為e.colik-12w3110△meta△lysa△tdh△tdcc。1、敲除meta基因(1)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy569和wy570組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅰ-甲(meta基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy571和wy572組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅰ-乙(meta基因下游區(qū)域)。(3)將dna片段ⅰ-甲和dna片段ⅰ-乙混合后作為模板，采用wy569和wy572組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅰ-丙。(4)取pkov質粒，用限制性內切酶sali和noti進行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取dna片段ⅰ-丙，用限制性內切酶sali和noti進行雙酶切，回收酶切產物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產物連接，得到重組質粒ⅰ。根據(jù)測序結果，對重組質粒ⅰ進行結構描述如下：在pkov質粒的sali和noti酶切位點之間插入了如下特異dna分子：自上游至下游依次由序列表的序列1第245-751位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列1第1682-2154位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。meta基因如序列表的序列1所示，第752-1681位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列2所示的meta蛋白)。(7)將重組質粒ⅰ導入大腸桿菌k12w3110，得到meta基因敲除的重組菌，命名為e.colik12w3110△meta。meta基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用wy583和wy584組成的引物對進行pcr擴增，如果得到1375bp擴增產物，初步判斷為候選的目標菌；進一步通過測序驗證菌株染色體上的meta基因的開放閱讀框被敲除。2、敲除lysa基因(1)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy573和wy574組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅲ-甲(lysa基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy575和wy576組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅲ-乙(lysa基因下游區(qū)域)。(3)將dna片段ⅲ-甲和dna片段ⅲ-乙混合后作為模板，采用wy573和wy576組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅲ-丙。(4)取pkov質粒，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取dna片段ⅲ-丙，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收酶切產物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產物連接，得到重組質粒ⅲ。根據(jù)測序結果，對重組質粒ⅲ進行結構描述如下：在pkov質粒的bamhi和noti酶切位點之間插入了如下特異dna分子：自上游至下游依次由序列表的序列3第132-638位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列3第1902-2445位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。lysa基因如序列表的序列3所示，第639-1901位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列4所示的lysa蛋白)。(7)將重組質粒ⅲ導入e.colik12w3110△meta，得到lysa基因敲除的重組菌，命名為e.colik-12w3110△meta△lysa。lysa基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用wy585和wy586組成的引物對進行pcr擴增，如果得到1302bp擴增產物，初步判斷為候選的目標菌；進一步通過測序驗證菌株染色體上的lysa基因的開放閱讀框被敲除。3、敲除tdh基因(1)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy598和wy599組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅳ-甲(tdh基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy600和wy601組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅳ-乙(tdh基因下游區(qū)域)。(3)將dna片段ⅳ-甲和dna片段ⅳ-乙混合后作為模板，采用wy598和wy601組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅳ-丙。(4)取pkov質粒，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取dna片段ⅳ-丙，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收酶切產物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產物連接，得到重組質粒ⅳ。根據(jù)測序結果，對重組質粒ⅳ進行結構描述如下：在pkov質粒的bamhi和noti酶切位點之間插入了如下特異dna分子：自上游至下游依次由序列表的序列5第227-752位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列5第1779-2271位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。tdh基因如序列表的序列5所示，第753-1778位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列6所示的tdh蛋白)。(7)將重組質粒ⅳ導入e.colik-12w3110△meta△lysa，得到tdh基因敲除的重組菌，命名為e.colik-12w3110△meta△lysa△tdh。tdh基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用wy602和wy603組成的引物對進行pcr擴增，如果得到1434bp擴增產物，初步判斷為候選的目標菌；進一步通過測序驗證菌株染色體上的tdh基因的開放閱讀框被敲除。4、敲除tdcc基因(1)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy476和wy477組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅴ-甲(tdcc基因上游區(qū)域)。(2)以大腸桿菌k12w3110的基因組dna為模板，采用wy478和wy479組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅴ-乙(tdcc基因下游區(qū)域)。(3)將dna片段ⅴ-甲和dna片段ⅴ-乙混合后作為模板，采用wy476和wy479組成的引物對進行pcr擴增，得到dna片段ⅴ-丙)。(4)取pkov質粒，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收載體骨架(約5.6kb)。(5)取dna片段ⅴ-丙，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收酶切產物。(6)將步驟(4)得到的載體骨架和步驟(5)得到的酶切產物連接，得到重組質粒ⅴ。根據(jù)測序結果，對重組質粒ⅴ進行結構描述如下：在pkov質粒的bamhi和noti酶切位點之間插入了如下特異dna分子：自上游至下游依次由序列表的序列7第176-700位核苷酸所示的上游區(qū)段和序列表的序列7第1853-2388位核苷酸所示的下游區(qū)段組成。tdcc基因如序列表的序列7所示，第701-2032位核苷酸為開放閱讀框(編碼序列表的序列8所示的tdcc蛋白)。(7)將重組質粒ⅴ導入e.colik-12w3110△meta△lysa△tdh，得到tdcc基因敲除的重組菌，命名為e.colik-12w3110△meta△lysa△tdh△tdcc。tdcc基因敲除的重組菌的鑒定方法：采用wy497和wy498組成的引物對進行pcr擴增，如果得到1453bp擴增產物，初步判斷為候選的目標菌；進一步通過測序驗證菌株染色體上的tdcc基因的如下區(qū)段被敲除：序列7中第701-1852位核苷酸。實施例中所用的各個引物序列如下(5’→3’)：wy569：gcgtcgacatagaacccaaccgcctgctca；wy570：aacgatcgactatcacagaagaaacctgattacctcactacata；wy571：tatgtagtgaggtaatcaggtttcttctgtgatagtcgatcgtt；wy572：attgcggccgcccgaaataaaatcaggcaacgt；wy583：cgttaatgaaatatcgccag；wy584：tcgaaatcggccataaagac。wy573：cgcggatccggcacgatatttaagctgac；wy574：caaccagcgactaaccgcagaacaaactccagataagtgc；wy575：gcacttatctggagtttgttctgcggttagtcgctggttg；wy576：attgcggccgcgctggcaacgcgtcatttaa；wy585：gtaacacacacacttcatct；wy586：gatcccggatgctgatttag。wy598：cgcggatccatactgcgatgtgatgggcc；wy599：aataccagcccttgttcgtgctcacatcctcaggcgataa；wy600：ttatcgcctgaggatgtgagcacgaacaagggctggtatt；wy601：attgcggccgccgttgccacttcaatcccac；wy602：gctatgccaacaacgatatg；wy603：ggttaatacgccggttgagc。wy476：cgcggatccggaacgattggtctggaaat；wy477：ggcttcaatcaggtcaaggatatcctatcctcaacgaatta；wy478：taattcgttgaggataggatatccttgacctgattgaagcc；wy479：attgcggccgccgcgacggatattatcaatgac；wy497：gcgccaaaatccaaagtagc；wy498：atgtgcgcgctgggaaacat。實施例2、制備異亮氨酸一、制備具有thra突變基因的蘇氨酸操縱子1、以大腸桿菌k12w3110的基因組為模板，采用wy914和wy926組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。wy914：cccaagcttacagagtacacaacatccatg；wy926：gtaggaaagctccatcgcctggtaggacatcgacttc。2、以大腸桿菌k12w3110的基因組為模板，采用wy925和wy832組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。wy925：gaagtcgatgtcctaccaggcgatggagctttcctac；wy832：cccgatatcgcatttattgagaatttctcc。3、將步驟1得到的pcr擴增產物和步驟2得到的pcr擴增產物混合后作為模板，采用wy914和wy832組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。經測序，步驟3得到的pcr擴增產物的hindⅲ和ecorv酶切識別位點之間的核苷酸如序列表的序列9第172至5132所示。序列表的序列9中，第337-2799位核苷酸編碼thra*蛋白，第2801-3733位核苷酸編碼thrb蛋白，第3734-5020位核苷酸編碼thrc蛋白。thra*蛋白(突變蛋白)如序列表的序列10所示，與thra蛋白(野生蛋白)相比，突變蛋白只存在一個氨基酸殘基的差異，即第253位氨基酸殘基由谷氨酸突變?yōu)榱私M氨酸。thrb蛋白如序列表的序列11所示。thrc蛋白如序列表的序列12所示。二、構建重組質粒pacyc184-ppl1、合成序列表的序列13所示的雙鏈dna分子(啟動子ppl)。2、以步驟1制備的雙鏈dna分子為模板，采用wy843和wy842組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。wy843：tgctctagacaattccgacgtctaagaaa；wy842：cccaagcttggtcagtgcgtcctgctgat。3、取步驟2得到的pcr擴增產物，用限制性內切酶xbai和hindiii進行雙酶切，回收酶切產物。4、取pacyc184質粒，用限制性內切酶xbai和hindiii進行雙酶切，回收載體骨架(約4.1kb)。5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pacyc184-ppl。三、構建具有thra突變基因的蘇氨酸操縱子的重組質粒1、取重組質粒pacyc184-ppl，用限制性內切酶hindⅲ和ecorv雙酶切，回收載體骨架(約4.2kb)。2、取步驟一的3得到的pcr擴增產物，用限制性內切酶hindⅲ和ecorv雙酶切，回收酶切產物。3、將步驟1的載體骨架和步驟2的酶切產物連接，得到重組質粒pacyc184-ppl-thrla*bc914。根據(jù)測序結果，對重組質粒pacyc184-ppl-thrla*bc914進行結構描述如下：在質粒pacyc184的xbai和ecorv酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列13所示的啟動子ppl，限制性內切酶hindⅲ的酶切識別序列，序列表的序列9第172-5132位核苷酸所示的dna分子。四、lysa位點蘇氨酸操縱子整合質粒的構建1、以大腸桿菌k12w3110的基因組為模板，采用wy970和wy971組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物(lysa位點整合的上游同源臂)。wy970：aactgcagggcacgatatttaagctgac；wy971：gaagatctaacaaactccagataagtgc。2、取步驟1得到的pcr擴增產物，用限制性內切酶psti和bglii進行雙酶切，回收酶切產物。3、取pkov質粒，用限制性內切酶psti和bglii進行雙酶切，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物與步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pkov-uplysa。5、以大腸桿菌k12w3110的基因組為模板，采用wy974和wy975組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物(lysa基因位點整合的下游同源臂)。wy974：cgcggatccctgcggttagtcgctggttg；wy975：ctagtctagagctggcaacgcgtcatttaa。6、取步驟5得到的pcr擴增產物，用限制性內切酶bamhi和xbai進行雙酶切，回收酶切產物。7、取重組質粒pkov-uplysa，用限制性內切酶bamhi和xbai進行雙酶切，回收載體骨架。8、將步驟6的酶切產物和步驟7的載體骨架連接，得到重組質粒pkov-uplysa-downlysa。9、以重組質粒pacyc184-ppl-thrla*bc914為模板，采用wy978和wy979組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物(ppl-thra*bc片段)。wy978：gaagatctcaattccgacgtctaagaaa；wy979：cgcggatccgcatttattgagaatttctcc。10、取步驟9的pcr擴增產物，用限制性內切酶bglii和bamhi進行雙酶切，回收酶切產物。11、取重組質粒pkov-uplysa-downlysa，用限制性內切酶bglii和bamhi進行雙酶切，回收載體骨架。12、將步驟10的酶切產物和步驟11的載體骨架連接，得到重組質粒pkov-uplysa-ppl-thra*bc-downlysa。根據(jù)測序結果，對重組質粒pkov-uplysa-ppl-thra*bc-downlysa進行結構描述如下：在pkov質粒的psti和xbai酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列3第132-638位核苷酸所示的lysa基因位點整合的上游同源臂、限制性內切酶bglii的酶切識別序列、序列表的序列13所示的啟動子ppl，限制性內切酶hindⅲ的酶切識別序列，序列表的序列9第172-5132位核苷酸所示的dna分子、限制性內切酶bamhi的酶切識別序列、序列表的序列3第1902-2445位核苷酸所示的lysa基因位點整合的下游同源臂。五、整合蘇氨酸操縱子工程菌的構建將重組質粒pkov-uplysa-ppl-thra*bc-downlysa導入e.colik-12w3110△meta△lysa△tdh△tdcc，得到lysa基因位點整合了步驟三的3中所述的特異dna分子的重組菌，命名為重組菌e.coliw3110△meta△tdh△tdcc△lysa::ppl-thra*bc，簡稱重組菌ec272。lysa基因位點整合了步驟三的3中所述的特異dna分子的重組菌的鑒定方法：采用引物wy585和wy586進行pcr鑒定，如果得到6443bp的擴增產物初步判斷為候選的目標菌；進一步通過測序驗證。六、ec272sstt::ilva*-ilvc的構建1、ilva基因定點突變以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4027和wy4028組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a1；以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4029和wy4030組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a2；將pcr擴增產物a1和pcr擴增產物a2混合后作為模板，采用wy4027和wy4030組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a3。wy4027：atggctgactcgcaacccctwy4028：cagcgtgttggcgaagcgcagaaacgcgc；wy4029：gcgcgtttctgcgcttcgccaacacgctg；wy4030：ctatatgacaggaaatttattgcgggcattctggaagattttgc。引物中，方框標注rbs，波浪下劃線標注啟動子ptrc部分區(qū)段。引物wy4028和引物wy4029引入了4個點突變，ilva基因的開放閱讀框的第1339位核苷酸由c突變?yōu)閠，且第1341位核苷酸由g突變?yōu)閠，且第1351位堿基由c突變?yōu)間，且第1352位堿基由t突變?yōu)閏。ilva基因發(fā)生上述4個點突變后命名為ilva*基因。2、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4025和wy4026組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物b1；wy4025:cgcggatccgtgctgacctcaaacctgt；wy4026:ctcggttacattatacgagccggatgattaattgtcaacgatcctttcattgtgttgtc。3、將步驟1得到的pcr擴增產物a3和步驟2得到的pcr擴增產物b1混合后作為模板，采用wy4025和wy4030組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物c1。4、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4031和wy4032組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物b2。wy4031:gcaaaatcttccagaatgccccgcaataaatttcctgtcatatag；wy4032:accgaacatattacaggccagcaaggccttctccaggagaa。5、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4033和wy4034組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物b3。wy4033:ttctcctggagaaggccttgctggcctgtaatatgttcggt；wy4034:5-attgcggccgcctcgcgaagttccatcatcct。6、將步驟4得到的pcr擴增產物b2和步驟5得到的pcr擴增產物b3混合后作為模板，采用wy4031和wy4034組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物c2。7、將步驟3得到的pcr擴增產物c1和步驟6得到的pcr擴增產物c2混合后作為模板，采用wy4025和wy4034組成的引物對進行重疊pcr，得到pcr擴增產物d。8、取步驟7得到的pcr擴增產物d，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收酶切產物。9、取pkov質粒，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收載體骨架。10、將步驟8的酶切產物和步驟9的載體骨架連接，得到重組質粒pkov-ilva*-ilvc。根據(jù)測序結果，對重組質粒pkov-ilva*-ilvc進行結構描述如下：在pkov質粒的bamhi和noti酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列17第45-696位核苷酸所示的上游臂、啟動子ptrc“ttgacaattaatcatccggctcgtataatgt”、rbs序列“aaccgaggagcagaca”、序列表的序列14所示的dna分子(序列14中，第1至1630位為ilva*基因，第1631至3275位為ilvc基因)、序列表的序列17第1760-2240位核苷酸所示的下游臂。ilva*基因的開放閱讀框如序列表的序列14第1至1545位核苷酸所示，編碼序列表的序列15所示的ilva*蛋白(突變蛋白)。ilvc基因的開放閱讀框如序列表的序列14第1717至3192位核苷酸所示，編碼序列表的序列16所示的ilvc蛋白。sstt基因如序列表的序列17所示，其開放閱讀框為第701-1945位核苷酸，編碼序列表的序列18所示的sstt蛋白。11、將重組質粒pkov-ilva*-ilvc導入重組菌ec272，得到sstt基因被部分敲除(sstt基因的如下區(qū)段被敲除：序列17中第697-1759位核苷酸)且sstt基因位點整合了啟動子ptrc“ttgacaattaatcatccggctcgtataatgt”、rbs序列“aaccgaggagcagaca”和序列表的序列14所示的dna分子組成的dna分子的重組菌，將已進行測序驗證的重組菌命名為重組菌e.coliw3110△meta△tdh△tdcc△lysa::ppl-thra*bc△sstt::ilva*-ilvc，簡稱重組菌ec711。七、構建工程菌ec711ilvg+δhisl1、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4037和wy4038組成的引物對進行pcr擴增。wy4037：cgcggatccggctgtaagctgttctgag；wy4038：caaaaaaaacccccggacctgcatcttgttcgaaggaatg。2、以大腸桿菌bl21(de3)的基因組dna為模板，采用wy4039和wy4040組成的引物對進行pcr擴增。wy4039：cattccttcgaacaagatgcaggtccgggggttttttttg；wy4040：attgcggccgcccagacgttctcaagttcgt。3、將步驟1得到pcr擴增產物和步驟2得到的pcr擴增產物混合后作為模板，采用wy4037和wy4040組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。4、取步驟3得到的pcr擴增產物，采用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收酶切產物。5、取pkov質粒，采用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收載體骨架。6、將步驟4得到的酶切產物和步驟5得到的載體骨架連接，得到重組質粒pkov-ilvl*-ilvg。根據(jù)測序結果，對重組質粒進行結構描述如下：在pkov質粒的bamhi和noti酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列20第355至987位核苷酸所示的上游臂、序列表的序列19第137至1831位核苷酸所示的dna分子。7、將重組質粒pkov-ilvl*-ilvg導入重組菌ec711，得到發(fā)生同源重組的重組菌，將其命名為工程菌ec711ilvg+δhisl。經測序驗證，工程菌ec711ilvg+δhisl的基因組中具有特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列20第1至987位核苷酸所示的dna分子、序列表的序列19第137至6556位核苷酸所示的dna分子。與重組菌ec711相比，工程菌ec711ilvg+δhisl的差異為：敲除了重組菌ec711基因組中aagaaaagacaaa(位于上游)和序列表的序列19第1至136位核苷酸(位于下游)連接組成的dna分子，并且用編碼活性ilvg蛋白的基因取代了重組菌ec711中編碼失活ilvg蛋白的基因。大腸桿菌bl21(de3)中的ilvlxgmeda操縱子中具有編碼ilvg蛋白的基因(如序列表的序列19第239-1885位核苷酸所示)，而大腸桿菌k12w3110中的ilvlxgmeda操縱子中的相應基因發(fā)生了突變(突變后的相應基因如序列表的序列23所示)，因此，大腸桿菌bl21(de3)中的ilvlxgmeda操縱子不能形成活性ilvg蛋白。八、構建工程菌ec711ilvg+1、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy4037和wy4043組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。wy4043：attgcggccgccaactcttccagcgactgca。2、取步驟1得到的pcr擴增產物，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收酶切產物。3、取pkov質粒，用限制性內切酶bamhi和noti進行雙酶切，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒pkov-ilvl質粒。5、將重組質粒pkov-ilvl質粒導入工程菌ec711ilvg+δhisl，得到發(fā)生同源重組的重組菌，將其命名為工程菌ec711ilvg+。經測序驗證，工程菌ec711ilvg+δhisl的基因組中具有特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列20所示的dna分子、序列表的序列19所示的dna分子。九、異亮氨酸工程菌的搖瓶發(fā)酵試驗試驗菌株為：工程菌ec711ilvg+δhisl或工程菌ec711ilvg+。1、取試驗菌株，劃線接種于固體lb培養(yǎng)基平板，37℃靜置培養(yǎng)12小時。2、挑取平板上的菌苔，接種至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到種子液(od600nm值＝5.0)。3、完成步驟2后，將種子液按照3％的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/l、硫酸銨15.0g/l、磷酸二氫鉀2.0g/l、七水硫酸鎂2.0g/l、酵母粉2.0g/l、蛋氨酸0.6g/l、l-賴氨酸鹽酸鹽1.2g/l、碳酸鈣15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量為水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量為水。培養(yǎng)過程中，用氨水調節(jié)反應體系的ph值使其維持在6.8-7.0。培養(yǎng)過程中，每隔3-4h取樣一次，使用生物傳感分析儀sba-40d檢測葡萄糖含量，當體系中的葡萄糖含量低于5g/l時，補加葡萄糖并使體系中的葡萄糖濃度達到10g/l。培養(yǎng)36h后取樣，12000g離心2分鐘，取上清液，檢測l-異亮濃度。結果見表1(三次重復試驗的平均值±標準差)。與工程菌ec711ilvg+相比，工程菌ec711ilvg+δhisl的發(fā)酵上清中l(wèi)-異亮氨酸的濃度顯著提高。表1發(fā)酵上清中的l-異亮氨酸含量(g/l)工程菌ec711ilvg+1.02±0.17工程菌ec711ilvg+δhisl2.55±0.35l-異亮氨酸濃度的檢測方法：高效液相法，在參考文獻(氨基酸和生物資源，2000，22，59-60)中氨基酸檢測方法的基礎上進行優(yōu)化，具體方法如下(2,4-二硝基氟苯(fdbn)柱前衍生高效液相法)：取10μl上清液于2ml離心管中，加入200μl0.5mnahco3水溶液和100μl1％(體積比)fdbn-乙腈溶液，于60℃水浴中暗處恒溫加熱60min，然后冷卻至室溫，然后加入700μl0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/lkoh水溶液調整ph)并搖勻，靜置15min，然后過濾并收集濾液。濾液用于上樣，進樣量為15μl。色譜柱為c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm,agilent,usa)；柱溫：40℃；紫外檢測波長：360nm；流動相a為0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/100mlkoh水溶液調整ph)，流動相b為55％(體積比)乙腈水溶液，流動相總流量為1ml/min。洗脫過程：洗脫起始時刻(0min)流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為86％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為14％；洗脫過程分為4個階段，每個階段中流動相a和流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)均為線性變化；第1階段(從起始時刻開始共進行2min)結束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為88％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為12％，第2階段(從第1階段結束時刻開始共進行2min)結束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為86％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為14％，第3階段(從第2階段結束時刻開始共進行6min)結束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為70％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為30％，第4階段(從第3階段結束時刻開始共進行10min)結束時流動相a占流動相總流量的體積份數(shù)為30％、流動相b占流動相總流量的體積份數(shù)為70％。以市售l-異亮氨酸為標準品制作標準曲線，計算樣品的異亮氨酸濃度。實施例3、衰減子突變體調控gfp基因的表達一、構建重組質粒pacyc184-pthr-trc1、合成序列表的序列21所示的雙鏈dna分子(啟動子pthr-trc)。2、以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy1947和wy1948組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。wy1947：ctagtctagagcttttcattctgactgcaac；wy1948：cccaagcttacattatacgagccggatgattaattgtcaactgtctgtgcgctatgcct。3、取步驟2得到的pcr擴增產物，用限制性內切酶xbai和hindiii進行雙酶切，回收酶切產物。4、取pacyc184質粒，用限制性內切酶xbai和hindiii進行雙酶切，回收載體骨架(約4.1kb)。5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pacyc184-pthr-trc。二、構建各個重組質粒以及相應的重組菌1、構建重組菌gfp3227(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3227和wy3254組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a2；將pcr擴增產物a1和pcr擴增產物a2混合后作為模板，采用wy3227和wy1859組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a3。wy3227：cccaagcttaagatgcaagaaaagacaaaatgacag；wy3254：agttcttctcctttactcatagaaccagaaccagaacctgagaaacagaattttgtgct；wy3105：ggttctggttctggttctatgagtaaaggagaagaacttttca；wy1859：acatgcatgcttatttgtagagctcatccatgcca。引物中，下劃線標注的為酶切識別序列，方框標注的為終止子序列。(2)取步驟(1)得到的pcr擴增產物a3，用限制性內切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產物。(3)取重組質粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產物和步驟(3)的載體骨架連接，然后化轉至大腸桿菌ec135，并從轉化子中提取質粒，得到重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3227。根據(jù)測序結果，對重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3227進行結構描述如下：在質粒pacyc184的xbai和sphi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列21所示的啟動子pthr-trc，限制性內切酶hindiii的酶切識別序列，ilvl基因的rbs序列“aagatgcaagaaaagacaaa”，序列表的序列19第1至215位核苷酸(包含完整的ilv衰減子序列和ilvx基因開放閱讀框中編碼前10個氨基酸殘基的核苷酸序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列22所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。含有重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3227的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3227。2、構建重組菌gfp3228(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3228和wy3254組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a2；將pcr擴增產物a1和pcr擴增產物a2混合后作為模板，采用wy3228和wy1859組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a3。wy3228：cccaagcttaggtccgggggttttttttgac。(2)取步驟(1)得到的pcr擴增產物a3，用限制性內切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產物。(3)取重組質粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產物和步驟(3)的載體骨架連接，然后化轉至大腸桿菌ec135，并從轉化子中提取質粒，得到重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3228。根據(jù)測序結果，對重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3228進行結構描述如下：在質粒pacyc184的xbai和sphi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列21所示的啟動子pthr-trc，限制性內切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列19第137至215位核苷酸(包含進行截短改造后的ilv衰減子序列和ilvx基因開放閱讀框中編碼前10個氨基酸殘基的核苷酸序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列22所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。含有重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3228的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3228。3、構建重組菌gfp3229(1)以大腸桿菌k12mg1655的基因組dna為模板，采用wy3229和wy3254組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a1；以pgfpuv載體為模板，采用wy3105和wy1859組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a2；將pcr擴增產物a1和pcr擴增產物a2混合后作為模板，采用wy3229和wy1859組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產物a3。wy3229：cccaagcttacataaccgaggagcagaca。(2)取步驟(1)得到的pcr擴增產物a3，用限制性內切酶hindiii和sphi雙酶切，回收酶切產物。(3)取重組質粒pacyc184-pthr-trc，用限制性內切酶hindiii和sphi雙酶切，回收載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產物和步驟(3)的載體骨架連接，然后化轉至大腸桿菌ec135，并從轉化子中提取質粒，得到重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3229。根據(jù)測序結果，對重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3229進行結構描述如下：在質粒pacyc184的xbai和sphi酶切位點之間插入了特異dna分子；特異dna分子自上游至下游依次由如下元件組成：序列表的序列21所示的啟動子pthr-trc，限制性內切酶hindiii的酶切識別序列，序列表的序列19第166至215位核苷酸(完全刪除ilv衰減子，包含ilvx基因開放閱讀框中編碼前10個氨基酸殘基的核苷酸序列)，連接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列22所示的gfp基因，終止子序列ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg。含有重組質粒pacyc184-pthr-trc-ilvlx-gfp3229的大腸桿菌ec135命名為重組菌gfp3229。4、構建gfp對照將重組質粒pacyc184-pthr-trc導入大腸桿菌ec135，得到的重組菌命名為gfp對照。三、gfp熒光強度分析試驗菌株為：重組菌gfp3227、重組菌gfp3228或重組菌gfp3229。設置gfp對照作為對照菌株。1、將試驗菌株或對照菌株接種至含34mg/l氯霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。2、取步驟1得到的菌液，按照1％接種量接種于含34mg/l氯霉素的液體lb培養(yǎng)基中，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)12小時。3、取150μl步驟2得到的菌液，加入黑邊透底的96孔板中，使用高通量多功能酶標儀(infinite200pro型，瑞士tecan)同時檢測細胞密度和gfp熒光信號。檢測細胞密度的相關參數(shù)設置見表2。檢測gfp熒光信號的相關參數(shù)設置見表3。表2吸光度(absorbance)波長(wavelength)600nm帶寬(bandwidth)9nm閃光次數(shù)(numberofflashes)25建立時間(settletime)0ms表3熒光頂讀(fluorescencetopreading)激發(fā)波長(excitationwavelength)400nm發(fā)射波長(emissionwavelength)510nm激發(fā)帶寬(excitationbandwidth)9nm發(fā)射帶寬(emissionbandwidth)20nm收集(gain)100(manual，手動)閃光次數(shù)(numberofflashes)15積分時間(integrationtime)20μs滯后時間(lagtime)0μs建立時間(settletime)0msz位置(z-position)20000μm(manual，手動)各個試驗菌株的熒光強度值＝實測熒光值÷細胞密度-對照菌株的實測熒光值÷對照菌株的細胞密度。設置三次重復試驗，相應的平均值和標準差結果見表4。與重組菌gfp3227(攜帶完整ilv衰減子)相比，重組菌gfp3228(攜帶ilv衰減子截短體)的熒光強度值提高了149.0％。與重組菌gfp3229(不攜帶ilv衰減子)相比，重組菌gfp3228的熒光強度值提高了34.1％。結果表明，位于啟動子和目的基因之間的ilv衰減子截短體可以作為調控元件，促進目的基因的表達。ilv衰減子突變體如序列表的序列19第n1至n2位核苷酸所示；n1為129以上148以下的自然數(shù)(n1優(yōu)選為137)，n2為155以上215以下的自然數(shù)(n2具體可為155以上185以下的自然數(shù)或186以上215以下的自然數(shù)，更具體可為155、185或215)。ilv衰減子突變體包括ilv衰減子截短體和ilv衰減子變體(全稱為在ilv衰減子截短體下游連接其他核苷酸的變體)。ilv衰減子截短體如序列表的序列19第n1至155位核苷酸所示。ilv衰減子變體如序列表的序列19第n1至n3位核苷酸所示，n3為156以上215以下的自然數(shù)(n3具體可為156以上185以下的自然數(shù)或185以上215以下的自然數(shù)，更具體可為185或215)。表4熒光強度重組菌gfp32271465.4±165.5重組菌gfp32283649.3±413.2重組菌gfp32292721.1±138.4最后應說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。sequencelisting<110>中國科學院微生物研究所<120>基于ilv衰減子的工程菌及其在生產異亮氨酸中的應用<130>gncyx171069<160>29<170>patentinversion3.5<210>1<211>2305<212>dna<213>大腸桿菌<400>1cgttaatgaaatatcgccagttccacatccatgcgcaatcagcggtactcagtgatagtg60cggtcatggcaatgcttaagcagaaataatcgtgtcaccattggtgggtactaaacctga120agttcagcccaccgggatgagaaaaaatcgcctacgcccccacatacgccagattcagca180acggatacggtttccccaaatcgtccacctcagagcgtcccgtaaccttaaaacccacct240tcttatagaacccaaccgcctgctcattttgctcattaacgttggttgtcagttccggtg300ccatcgagagcgcatgctccaccagcacccgacctacgccgcagccgcgcacatcaggat360cgataaacagcgcatccatatgctgcccacttagcaacataaatccaaccggctgatccc420gctcattaaccgcgacccacaacggcgcttccggcaggaaggaacgaactaggtcctcca480gctcggtccgatactctgctgatagaaaatcgtgagtggcatcgacagaacgacaccaaa540tcgcaacgagttcctccccttcctcatgccgtgagcggcgaatactaataaccattttct600ctccttttagtcattcttatattctaacgtagtcttttccttgaaactttctcaccttca660acatgcaggctcgacattggcaaattttctggttatcttcagctatctggatgtctaaac720gtataagcgtatgtagtgaggtaatcaggttatgccgattcgtgtgccggacgagctacc780cgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaacttctcgtgcgtctgg840tcaggaaattcgtccacttaaggttctgatccttaacctgatgccgaagaagattgaaac900tgaaaatcagtttctgcgcctgctttcaaactcacctttgcaggtcgatattcagctgtt960gcgcatcgattcccgtgaatcgcgcaacacgcccgcagagcatctgaacaacttctactg1020taactttgaagatattcaggatcagaactttgacggtttgattgtaactggtgcgccgct1080gggcctggtggagtttaatgatgtcgcttactggccgcagatcaaacaggtgctggagtg1140gtcgaaagatcacgtcacctcgacgctgtttgtctgctgggcggtacaggccgcgctcaa1200tatcctctacggcattcctaagcaaactcgcaccgaaaaactctctggcgtttacgagca1260tcatattctccatcctcatgcgcttctgacgcgtggctttgatgattcattcctggcacc1320gcattcgcgctatgctgactttccggcagcgttgattcgtgattacaccgatctggaaat1380tctggcagagacggaagaaggggatgcatatctgtttgccagtaaagataagcgcattgc1440ctttgtgacgggccatcccgaatatgatgcgcaaacgctggcgcaggaatttttccgcga1500tgtggaagccggactagacccggatgtaccgtataactatttcccgcacaatgatccgca1560aaatacaccgcgagcgagctggcgtagtcacggtaatttactgtttaccaactggctcaa1620ctattacgtctaccagatcacgccatacgatctacggcacatgaatccaacgctggatta1680atcttctgtgatagtcgatcgttaagcgattcagcaccttacctcaggcaccttcgggtg1740ccttttttatttccgaaacgtacctcagcaggtgaataaattttattcatattgttatca1800acaagttatcaagtatttttaattaaaatggaaattgtttttgattttgcattttaaatg1860agtagtcttagttgtgctgaacgaaaagagcacaacgatccttcgttcacagtggggaag1920ttttcggatccatgacgaggagctgcacgatgactgaacaggcaacaacaaccgatgaac1980tggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggtag2040aatttctgactgagctggtgacgcattttacgccacaacgcaataaacttctggcagcgc2100gcattcagcagcagcaagatattgataacggaacgttgcctgattttatttcggaaacag2160cttccattcgcgatgctgattggaaaattcgcgggattcctgcggacttagaagaccgcc2220gcgtagagataactggcccggtagagcgcaagatggtgatcaacgcgctcaacgccaatg2280tgaaagtctttatggccgatttcga2305<210>2<211>309<212>prt<213>大腸桿菌<400>2metproileargvalproaspgluleuproalavalasnpheleuarg151015glugluasnvalphevalmetthrthrserargalaserglyglnglu202530ileargproleulysvalleuileleuasnleumetprolyslysile354045gluthrgluasnglnpheleuargleuleuserasnserproleugln505560valaspileglnle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