本發(fā)明涉及生物檢測領域，具體涉及一種微小核糖核酸122探針及其制備方法。

背景技術：

微小核糖核酸是內源性的小分子核糖核酸，其可以在轉錄后水平負調控基因的表達。近年來的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸的異常表達或功能均會引起下游原癌或抑癌基因的紊亂，從而誘發(fā)或促進疾病的發(fā)生發(fā)展。因而，微小核糖核酸與包括癌癥在內的眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，這也極大地推動了將微小核糖核酸作為疾病診斷治療的生物靶標，尤其是近年來包括let-7、微小核糖核酸-34在內的一些微小核糖核酸已經(jīng)成功進入到了臨床研究中，表明了微小核糖核酸在臨床應用中的巨大潛力。微小核糖核酸-122是肝特異性的微小核糖核酸，在正常肝細胞和組織中表達水平較高，但在肝癌細胞及組織中表達水平顯著降低。已有一些證據(jù)顯示微小核糖核酸-122與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系，而且在肝癌細胞中恢復微小核糖核酸-122的表達可以促進肝癌細胞的凋亡，然而治療效果仍然差強人意，這在很大程度上由于微小核糖核酸-122在正常肝細胞及肝癌細胞中的調控網(wǎng)絡目前仍然不明，單純地恢復微小核糖核酸-122的表達并不能從根本上逆轉肝癌的發(fā)展進程，因而目前急需了解肝細胞中微小核糖核酸-122的調控網(wǎng)絡，了解肝癌發(fā)病進程中微小核糖核酸-122的分子機制。

然而，微小核糖核酸靶基因的鑒定一直是當下微小核糖核酸研究及治療中的難點，目前依賴的方法主要為：（1）生物信息學預測；（2）免疫共沉淀微小核糖核酸相關功能蛋白，對功能蛋白中微小核糖核酸的靶基因進行鑒定，再結合生物信息學的方法解析；（3）在微小核糖核酸的3’末端標記生物素基團，利用生物素與鏈霉素之間的親和作用對細胞內與微小核糖核酸相互作用的靶基因進行分離鑒定。這幾類方法中，只有第三種方法可以高通量地對微小核糖核酸的靶基因進行直接地分離鑒定，但是近來的研究也發(fā)現(xiàn)在微小核糖核酸的3’末端直接修飾生物素可造成微小核糖核酸功能喪失，這就提示急需發(fā)展一類可代替生物素的基團以用于微小核糖核酸-122的標記。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是為了克服現(xiàn)有技術的不足而提供一種可方便對微小核糖核酸122及其下游靶基因的標記、分離及鑒定的微小核糖核酸122探針及其制備方法。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案。

本發(fā)明提供一種微小核糖核酸122探針，其化學結構如下：

其中:x可以是二硫鍵或酰胺鍵或酯鍵或醚鍵或聚乙二醇；r1-r8分別可以是氫、氮、氧、硫、含有一至十個碳的烷基、低聚或多聚乙二醇；n=1~8。

該微小核糖核酸122探針的制備方法，具體包括如下化學反應后得到：

熒光素酶實驗：

通過mir-122探針刺激肝癌細胞內的熒光素酶信號變化判斷其生物活性，具體流程如下：

（1）構建含有mir-122結合位點的熒光素酶質粒；

（2）將質粒和mir-122探針共轉染到肝癌細胞中；

（3）測定熒光素酶信號。

拉下實驗：

結合擊化學反應，將生物素連接到mir-122探針上，并利用生物素與鏈霉素間強親和作用對正常肝細胞和肝癌細胞內與mir-122探針作用的靶基因進行分離，并對其進行相應的鑒定。具體流程如下：

（1）將mir-122探針轉染到肝細胞中；

（2）在細胞裂解液中，通過點擊化學反應將生物素連接到mir-122探針上；

（3）將得到的細胞裂解液與帶有鏈霉素的磁珠作用，使mir-122及與之相互作用的靶基因固定到磁珠表面；

（4）分離磁珠上的mir-122及靶基因；

（5）利用熒光定量pcr對分離的mir-122及靶基因進行分析定量；

（6）利用高通量測序技術對mir-122的靶基因進行分析測定。

凋亡實驗：

利用mir-122探針刺激肝癌細胞的凋亡。具體流程如下：

（1）將mir-122探針轉染到肝癌細胞中；

（2）分離細胞，并用凋亡試劑盒對凋亡細胞進行染色；

（3）利用流式細胞儀對凋亡細胞進行分析

由于上述技術方案的運用，本發(fā)明具有的益技術效果：本技術方案的該生物正交官能團修飾的微小核糖核酸122（以下簡稱mir-122）探針作用在肝細胞內并不影響mir-122本身的功能，在其與靶基因結合后通過點擊化學反應修飾親和基團，進而實現(xiàn)mir-122靶基因的富集及檢測；通過以上分析可以實現(xiàn)揭示mir-122在正常肝細胞及肝癌細胞內的mir-122調控網(wǎng)絡，為mir-122在肝癌發(fā)病進程中的分子機制提供新的解釋；本發(fā)明相比于傳統(tǒng)的生物化學方法，具有特異性高、操作簡便、成本低、適合推廣的有益技術效果。

附圖說明

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

圖1為相對熒光素霉信號對照圖。

圖2為相對mir-122表達量對照圖。

圖3為相對mir-122含量對照圖。

圖4為相對細胞凋亡量對照圖。

具體實施方式

實施案例1：小分子及mir-122探針的合成

步驟1：小分子的合成

將220mg或0.5mmol的化合物1a溶于10ml四氫呋喃中，分別加入43mg，0.5mmol的化合物1b及100μl的dipea，攪拌過夜，減壓蒸餾后在下一步中直接使用。

步驟2：mir-122探針的合成

將上一步得到的產(chǎn)品溶于無水dmso中，濃度為5mm。將氨基修飾的mir-122用pbs（ph=7.4）溶解（50μm），加入同體積的dmso配成5mm儲備液。室溫反應過夜，hplc純化并凍干得到mir-122探針。

實施案例2：熒光素酶實驗：

步驟1：報告質粒的構建

使用hindiii和spel內切酶剪切l(wèi)uciferase報告質粒的3’utr端，將得到的片斷進行電泳分離純化。mir-122的互補序列分別通過dna連接酶，t4ligase，插入到純化得到的luciferase報告質粒中，并轉化到感受態(tài)大腸桿菌內，再通過含有氨芐的篩選平板篩選得到可能的陽性質粒。最終將該報告質粒進行測序確認其正確性。

步驟2：熒光素酶實驗分析

將帶有mir-122互補序列的熒光素酶報告質粒通過轉染進入hepg2細胞中，首先將hepg2細胞種到24孔板中，當細胞密度達到70%-80%時，將0.25μgmir-122報告質粒和0.15μgβ-galactosidase內參質粒用lipofectamine2000試劑轉染進細胞，轉染操作遵循invitrogen產(chǎn)品說明。在轉染4小時后，將0.25μgmir-122探針用lipofectamine2000試劑轉染進細胞。5-6小時后，將細胞培液換成正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，測定luciferase和β-galactosidase內參信號。結果表明，相比于在3’末端直接修飾生物素，化學小分子修飾后，mir-122探針仍然具有抑制熒光素酶表達的活性，具體結果如附圖1所示。

實施案例3：mirna表達量的測定

取出5μl的rna進行逆轉錄反應制備相應的cdna樣品。具體逆轉錄反應10μl體系為：

5xamvbuffer（takara）2μl

amv（takara）0.5μl

rtprimer（abi）0.5μl

dntpmixture（takara）1μl

depch2o1μl

rna5μl

反應程序為：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存。制備好的cdna再用探針法（taqman）pcr對mir-122進行實時定量，20μl；

taqmanpcr反應體系為：

10xbuffer（takara）2μl

mgcl2(25mm)（takara）1.2μl

taq（takara）0.3μl

dntpmixture（10mm)0.4μl

probe（abi）0.33μl

cdna1μl

distilledh2o14.77μl

pcr反應程序為95℃5min，95℃15s后60℃1min40個循環(huán)擴增，實時熒光信號均在每個循環(huán)的60℃采集。

實施案例4：mrna表達量的測定

取出5μl的rna進行逆轉錄反應制備相應的cdna樣品。具體逆轉錄反應20μl體系為：

5xamvbuffer（takara）4μl

amv（takara）1μl

oligodt（takara）1μl

dntpmixture（takara）2μl

rri（takara）0.5μl

depch2o6.5μl

rna5μl

反應程序為：42℃60min，85℃5min，4℃保存。制備好的cdna再用染料法pcr對mrna進行實時定量，20μl；

taqmanpcr反應體系為：

10xbuffer（takara）2μl

mgcl2(25mm)（takara）1.6μl

taq（takara）0.2μl

dntpmixture（10mm)0.4μl

sybrgreen1μl

forward+reverseprimers0.4μl

cdna1μl

distilledh2o13.4μl

pcr反應程序為95℃5min，95℃30s，62℃30s，72℃30s，40個循環(huán)擴增，實時熒光信號均在每個循環(huán)的72℃采集。

實施案例5：下拉實驗

將30μgmir-122探針用lipofectamine2000轉染進入1.5×107hepg2細胞內。24小時后，將細胞分別用150μlpbs（0.1%triton）裂解，通過離心收集上清。上清加入100μm炔鍵修飾的生物素分子，隨后加入硫酸銅（50mm,1μl），抗壞血酸鈉（250mm,10μl）以及thpta（50mm,6μl）。室溫反應4小時后，將細胞裂解液用超濾管和pbs洗滌4次。收集的上清與鏈霉素磁珠在室溫孵育2個小時后，將磁珠用洗滌緩沖液和低鹽緩沖液分別洗滌4次和1次，最后將與磁珠作用的核酸用洗脫緩沖液洗脫收集，分別進行定量pcr或高能量測序分析。定量pcr實驗發(fā)現(xiàn)用mir-122探針處理后的樣品中有明顯的mir-122的富集而且mir-122的一些已知靶基因也可以實現(xiàn)富集和鑒定，具體結果如附圖2和附圖3所示。

實施案例6：凋亡實驗

將hepg2細胞種入6孔板中，24小時后，將mir-122探針轉染加入到細胞培養(yǎng)基中，mir-122終濃度為300nm，培養(yǎng)48小時后，收集細胞并用流式凋亡檢測試劑盒進行染色，隨后用流式細胞儀式進行定量檢測。如附圖4所示，相比于對照，mir-122探針處理后的細胞凋亡顯著上升。

以上僅是本發(fā)明的具體應用范例，對本發(fā)明的保護范圍不構成任何限制。凡采用等同變換或者等效替換而形成的技術方案，均落在本發(fā)明權利保護范圍之內。