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改進(jìn)的核酸定量方法與流程

文檔序號(hào):11633034閱讀:533來源:國(guó)知局
改進(jìn)的核酸定量方法與流程
本發(fā)明涉及在不需要將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至感興趣的參照基因或合成基因下定量核酸的方法。特別地,本發(fā)明涉及用于基因表達(dá)研究的改進(jìn)的定量核酸的通用方法。該方法適用于診斷、法醫(yī)和研究用途。然而,應(yīng)當(dāng)理解,本發(fā)明不限于這些特定領(lǐng)域的用途。
背景技術(shù)
:在整個(gè)說明書中對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的任何討論絕不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)這種現(xiàn)有技術(shù)是廣為人知的或構(gòu)成本領(lǐng)域公知常識(shí)的一部分。通過開發(fā)快速熱循環(huán)儀以及在每次循環(huán)后引入擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光監(jiān)測(cè)(實(shí)時(shí)pcr)而使得用于定量基因表達(dá)的pcr技術(shù)得以改善。通過使用染料,特別是熒光染料,以及在與反應(yīng)開始時(shí)樣品中核酸的量成比例的pcr擴(kuò)增指數(shù)期檢測(cè)熒光增加,而發(fā)生基因表達(dá)的定量。定量是基于閾值循環(huán),即具有可檢測(cè)熒光的第一次循環(huán),并且可以以利用外部標(biāo)準(zhǔn)品(通常為合成基因)的絕對(duì)方式或以利用比較性的標(biāo)準(zhǔn)化參照基因作為內(nèi)部校準(zhǔn)物的相對(duì)方式(即,參照基因)進(jìn)行定量。對(duì)照基因或參照基因用于將不同樣品之間的mrna水平標(biāo)準(zhǔn)化。由于基因表達(dá)的變化會(huì)改變靶基因的相對(duì)定量分布,所以選擇的參照基因不會(huì)波動(dòng)是至關(guān)重要的。移液和稀釋誤差也會(huì)改變擴(kuò)增水平,從而改變定量分布。經(jīng)常使用如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)、膽色素原脫氨酶(pbgd)、β2-微球蛋白(b2m)或β-肌動(dòng)蛋白(actb)的基因作為實(shí)時(shí)pcr中的內(nèi)部校準(zhǔn)物。然而,已經(jīng)顯示上述基因應(yīng)答于實(shí)驗(yàn)條件或處理而改變表達(dá)水平。豐富表達(dá)的基因(如18s)也不是理想的參照基因,由于需要限制pcr條件,從而不會(huì)陷入(swamp)反應(yīng)。因此,合適的參照基因應(yīng)當(dāng)在感興趣的組織中充分表達(dá),最重要的是,在樣品之間以及在所使用的實(shí)驗(yàn)條件或處理下表現(xiàn)出最小的表達(dá)變異性。然而,這些對(duì)照基因中的許多可能表現(xiàn)出不可接受的表達(dá)變異性。已經(jīng)表明,這些基因的表達(dá)水平可以在組織或細(xì)胞中變化,并且可能在某些情況,即在不同的處理?xiàng)l件下變化。因此,在任何新的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中驗(yàn)證參照基因是至關(guān)重要的。找到適合在特定實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中使用的參照基因通常是耗時(shí)且困難的任務(wù)。在某些情況下,這可能是不可能的。在基因表達(dá)研究中使用外部標(biāo)準(zhǔn)品(即,合成參照)通常需要克隆感興趣的基因以提供合成的參照基因。在該方法中,將已知量的合成參照基因序列系列稀釋,然后進(jìn)行擴(kuò)增以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法的克隆序列的生產(chǎn)通常是耗時(shí)、勞動(dòng)密集的任務(wù),并且稀釋誤差以指數(shù)方式放大,這可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確地評(píng)估核酸水平。高度稀釋的克隆序列的穩(wěn)定性和保存也會(huì)引起困難。因此,仍然需要定量核酸的簡(jiǎn)單而有效的通用方法,該方法適用于不需要使用感興趣的參照基因或合成基因以標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)和/或定量基因表達(dá)的任何實(shí)驗(yàn)情況或處理?xiàng)l件。本發(fā)明的目的是克服或改善現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)缺點(diǎn),或提供有用的替代方案。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:在廣泛的方面,本發(fā)明涉及用于定量感興趣的核酸而不需要使用感興趣的參照基因或合成基因來標(biāo)準(zhǔn)化核酸表達(dá)數(shù)據(jù)的方法。當(dāng)然,本發(fā)明的方法利用可用于產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線的通用參照核酸,由該校準(zhǔn)曲線可以計(jì)算樣品中經(jīng)過擴(kuò)增的靶核酸的水平。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明方法的試劑盒。在第一方面,本發(fā)明提供了定量靶核酸的方法,該方法包括以下步驟:測(cè)量已知量的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸的熒光以產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線;在熒光團(tuán)標(biāo)記的探針的存在下擴(kuò)增靶核酸,其中該熒光團(tuán)標(biāo)記的探針與靶核酸雜交;測(cè)量在靶核酸擴(kuò)增期間的熒光;將擴(kuò)增期間的熒光與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較并確定經(jīng)過擴(kuò)增的靶核酸的量。在一個(gè)實(shí)施方式中,基本上同時(shí)進(jìn)行步驟(a)至(d)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸是單鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用約0nm至約500nm的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用約0nm至約200nm的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用至少三種已知量的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用至少六種已知量的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用約0nm、約20nm、約40nm、約60nm、約80nm、約100nm和約120nm的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在另一個(gè)實(shí)施方式中,使用約0nm、約20nm、約40nm、約60nm、約80nm、約100nm、約120nm、約140nm、約160nm和約200nm的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的長(zhǎng)度小于約60bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的長(zhǎng)度大于約170bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的長(zhǎng)度約20bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的gc含量小于約45%、優(yōu)選小于約40%、優(yōu)選小于約35%、優(yōu)選小于約30%、優(yōu)選小于約25%、優(yōu)選小于約20%、優(yōu)選小于約15%、優(yōu)選小于約10%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的gc含量大于約60%、優(yōu)選大于約65%、優(yōu)選大于約70%、優(yōu)選大于約75%、優(yōu)選大于約80%、優(yōu)選大于約85%、優(yōu)選大于約90%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的gc含量為約30%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的gc含量為約40%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的gc含量為約60%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的gc含量為約80%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,通用參照核酸的長(zhǎng)度為約21bp以及gc含量為約62%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的長(zhǎng)度小于約80bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的長(zhǎng)度大于約150bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的長(zhǎng)度大于約210bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的長(zhǎng)度約90bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的長(zhǎng)度約500bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的長(zhǎng)度約1000bp。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的gc含量約75%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的gc含量約25%。在另一個(gè)實(shí)施方式中,靶核酸的擴(kuò)增是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施方式中,pcr是實(shí)時(shí)pcr。在另一個(gè)實(shí)施方式中,實(shí)時(shí)pcr是多重pcr。在另一個(gè)實(shí)施方式中,熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸和熒光團(tuán)標(biāo)記的探針在相同的發(fā)射通道中是可檢測(cè)的。在另一個(gè)實(shí)施方式中,熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸和熒光團(tuán)標(biāo)記的探針具有相同的激發(fā)和發(fā)射光譜。在另一個(gè)實(shí)施方式中,熒光團(tuán)選自由fam、hex、德克薩斯紅(texasred)、tye665、alexa594和cy5所組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中,進(jìn)行pcr約30至約45次循環(huán)。在第二方面,本發(fā)明提供了一種試劑盒,包括:(a)一種或多種的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸;(b)一種或多種的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針;和(c)用于在第一方面的方法中使用的說明書。在第三方面,本發(fā)明提供了一種在第一方面的方法中使用時(shí)的試劑盒,該試劑盒包含:(a)一種或多種的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸;和(b)一種或多種的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針。通用參照核酸序列不需要與靶核酸或與任何參照基因序列具有任何同源性。然而,由于在本發(fā)明的方法中使用通用參照核酸的特定方式(即,在將通用參照核酸系列稀釋之后制備校準(zhǔn)曲線),該通用參照核酸序列可以具有一定程度的同源性,或者甚至可以與靶核酸序列或參照基因或其較小部分相同。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于該方法可以利用相同的通用參照核酸來定量不同的靶核酸。通用參照核酸可以與靶核酸序列具有相同或相似的長(zhǎng)度,但不一定如此。通用參照核酸可以比靶核酸更長(zhǎng)或更短。通用參照核酸可以是雙鏈或單鏈。使用已知技術(shù)可以從生物來源、天然的或其它來源獲得通用參照核酸,或者其可以是合成制備的。通用參照核酸和探針均用熒光團(tuán)標(biāo)記。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適熒光團(tuán),包括但不限于fam、joe、hex、alexa594、德克薩斯紅、cy5和tye665。當(dāng)在實(shí)時(shí)pcr中使用時(shí),應(yīng)選擇熒光團(tuán)以使其在實(shí)時(shí)pcr裝置的發(fā)射通道中是可檢測(cè)的。優(yōu)選地,使用通用參照核酸制備單個(gè)校準(zhǔn)曲線,并且將校準(zhǔn)曲線用于多種靶核酸擴(kuò)增和定量。優(yōu)選地,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增。通常,將靶核酸擴(kuò)增30至40次循環(huán),但這對(duì)于本發(fā)明的方法并不是至關(guān)重要的。也可以在一次反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增多種感興趣的靶核酸(即,多重pcr)。除非上下文清楚地要求,否則在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中,詞語“包含(comprise)”,“包括(comprising)”等將以包容性意義進(jìn)行解釋,與排外性或窮盡的意義相反;也就是說,在“包括但不限于”的意義上。附圖說明圖1:對(duì)于稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm和120nm的21bp和30%gc含量的fam標(biāo)記的參照核酸,在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖1a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸濃度而創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并且計(jì)算線性回歸(圖1b)。使用fam標(biāo)記的水解探針,在對(duì)來自系列稀釋的原種λdna的92bp片段的擴(kuò)增期間在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖1c)。圖2:對(duì)于稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm和120nm的21bp和40%gc含量的fam標(biāo)記的參照核酸,在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖2a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸濃度而創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并且計(jì)算線性回歸(圖2b)。使用fam標(biāo)記的水解探針,在對(duì)來自系列稀釋的原種λdna的92bp片段的擴(kuò)增期間在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖2c)。圖3:對(duì)于稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm和200nm的21bp和62%gc含量的fam標(biāo)記的參照核酸,在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖3a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸濃度而創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并且計(jì)算線性回歸(圖3b)。使用fam標(biāo)記的水解探針,在對(duì)來自系列稀釋的原種λdna的92bp片段的擴(kuò)增期間在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖3c)。圖4:對(duì)于稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm和120nm的21bp和80%gc含量的fam標(biāo)記的參照核酸,在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖4a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸濃度而創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并且計(jì)算線性回歸(圖4b)。使用fam標(biāo)記的水解探針,在對(duì)來自系列稀釋的原種λdna的92bp片段的擴(kuò)增期間在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光(圖4c)。圖5:使用fam標(biāo)記的水解探針(圖5a)或嵌入染料evagreen(圖5b),在對(duì)來自系列稀釋的原種λdna的92bp片段的擴(kuò)增期間的40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光。圖6:使用fam標(biāo)記的水解探針,在對(duì)來自系列稀釋的原種λdna的92bp片段(圖6a)、501bp片段(圖6b)或1000bp片段(圖6c)的擴(kuò)增期間在40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光。圖7:使用fam標(biāo)記的水解探針,在對(duì)來自系列稀釋的原種合成寡核苷酸的具有75%cg組成(圖7a)或75%at組成(圖7b)的90bp片段的擴(kuò)增期間的40-45次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光。圖8:對(duì)于系列稀釋的fam(圖8a)、hex(圖8b)、德克薩斯紅(圖8c)和tye665(圖8d)標(biāo)記的參照核酸在45次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于熒光團(tuán)標(biāo)記的參照核酸濃度,創(chuàng)建針fam(圖8e)、hex(圖8f)、德克薩斯紅(圖8g)和tye665(圖8h)的校準(zhǔn)曲線。圖9:使用fam標(biāo)記的水解探針(圖9a)、hex-(黑)或joe-(灰)標(biāo)記的水解探針(圖9b)、alexa594-(黑)或德克薩斯紅-(灰)標(biāo)記的水解探針(圖9c)或者cy5-(黑)或tye665-(灰)標(biāo)記的水解探針(圖9d),在對(duì)稀釋的λdna的擴(kuò)增期間的45次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光。圖10:采用單獨(dú)使用(黑)或同時(shí)使用(灰)fam-、hex-或德克薩斯紅-標(biāo)記的水解探針,在對(duì)來自系列稀釋的λdna的92bp片段的擴(kuò)增期間的40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的并在綠色(fam)通道(圖10a)、黃色(hex)通道(圖10b)或橙色(德克薩斯紅)通道(圖10c)中檢測(cè)的熒光。圖11:使用fam標(biāo)記的探針在對(duì)mirna的擴(kuò)增期間的40次pcr循環(huán)內(nèi)測(cè)量的熒光。具體實(shí)施方式在本發(fā)明的上下文中的核酸是由核苷酸鏈組成的分子。如本文中所使用的,該術(shù)語旨在包括dna、rna及其變體和衍生物。核酸可以是雙鏈或單鏈。在本發(fā)明的上下文中的靶核酸是感興趣的核酸??梢酝ㄟ^聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方便地完成核酸序列的擴(kuò)增,但是也可以通過其它合適的方法如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來完成。在本說明書的上下文中,根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的其常規(guī)含義使用術(shù)語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”及其首字母縮寫“pcr”??梢栽诒绢I(lǐng)域中使用的普通分子生物學(xué)教科書和參考手冊(cè)中找到pcr方法的實(shí)例。例如,pcrtechnology:principlesandapplicationsfordnaamplification(1989)haerlich編輯.stockton出版,紐約。為了優(yōu)化pcr擴(kuò)增,可以以不同的濃度和比率使用引物。這些和其它變量的選擇將在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)得到理解。在本發(fā)明的上下文中的擴(kuò)增子是通過擴(kuò)增反應(yīng)(如通過pcr或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行的那些)形成的核酸。在一個(gè)上下文中,擴(kuò)增子可以是“靶核酸”的擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明的上下文中的實(shí)時(shí)pcr是基于pcr的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),其用于同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)/定量擴(kuò)增子。在本發(fā)明的上下文中的多重pcr是基于pcr的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),其由在單個(gè)pcr混合物內(nèi)的多種引物組和探針組成,以產(chǎn)生對(duì)不同靶核酸特異的多種擴(kuò)增子。在本發(fā)明的上下文中的探針是可變長(zhǎng)度的核酸,其用于檢測(cè)與探針中的序列互補(bǔ)的靶核酸的存在。探針包括但不限于水解探針、分子信標(biāo)和蝎型探針。在本發(fā)明的上下文中的引物是能夠作為核苷酸合成的初始點(diǎn)的核酸。在本發(fā)明的上下文中的通用參照核酸包括可用于制備用于定量靶核酸的校準(zhǔn)曲線的任何核酸,其中相同的通用參照核酸可用于定量不同的靶核酸。通用參照核酸可以是完全合成的或者可以從天然來源的核酸獲得。在本發(fā)明的上下文中的熒光團(tuán)是在光激發(fā)時(shí)可以重新發(fā)光的熒光化學(xué)分子。在本發(fā)明的上下文中的參照基因通常是維持基礎(chǔ)細(xì)胞功能所需的組成型基因。所有細(xì)胞均存在這些基因。一些參照基因以相對(duì)恒定的水平表達(dá),然而其它參照基因的表達(dá)可能根據(jù)所采用的實(shí)驗(yàn)條件而改變。在本發(fā)明的上下文中的校準(zhǔn)曲線是熒光相對(duì)于熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸的量的曲線圖。在本發(fā)明的上下文中的標(biāo)準(zhǔn)曲線是循環(huán)閾值(ct或cq)相對(duì)于系列稀釋的感興趣的合成基因或輸入核酸的曲線圖。在本發(fā)明的上下文中的系列稀釋是指制備包括感興趣的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸或合成基因的一定濃度范圍的校準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)曲線所必需的任何形式的稀釋。在本發(fā)明的上下文中,“dsdna”是指雙鏈dna,“bp”是指堿基對(duì),“dntp”是指三磷酸脫氧核苷酸,“rna”是指核糖核酸,“trna”是指轉(zhuǎn)運(yùn)rna,“rrna”是指核糖體rna,“sirna”是指小干擾rna,“mirna”是指微rna,“mrna”是指信使rna以及“cdna”是指互補(bǔ)dna。在本申請(qǐng)的上下文中的術(shù)語“accucal-p”是指用任何合適的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸。在本發(fā)明的上下文中的術(shù)語“accucal-d”是指使用任何合適的熒光嵌入染料標(biāo)記的通用參照核酸。在本發(fā)明的上下文中的術(shù)語“accubeacon”是指用任何合適的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸,其中核酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明的動(dòng)機(jī)是由于缺乏精確和有效的手段用于定量對(duì)照和處理動(dòng)物/人類組中的核酸表達(dá)。其還激勵(lì)于許多已知的基因表達(dá)研究中所使用的參照基因應(yīng)答于實(shí)驗(yàn)條件或處理而改變表達(dá)水平,從而使結(jié)果偏移的事實(shí)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于所描述的方法去掉了對(duì)于用于標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)和定量基因表達(dá)的參照基因或合成參照基因的需要。在本文描述的新穎方法中,使用已知量的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。通過系列稀釋熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸并繪制相對(duì)于熒光團(tuán)標(biāo)記的參照核酸濃度的熒光水平來產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。不需要擴(kuò)增通用參照核酸來產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線。這與用于評(píng)估基因表達(dá)的現(xiàn)有方法形成對(duì)比,其中以并列的方式或在一個(gè)反應(yīng)混合物中以組合的方式對(duì)測(cè)試樣品和參照基因/合成參照基因兩者進(jìn)行擴(kuò)增。一旦制備出相同的校準(zhǔn)曲線,如果需要定量超過一種的靶核酸,可以多次使用校準(zhǔn)曲線。用于制備校準(zhǔn)曲線的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸隨時(shí)間變化是穩(wěn)定的,例如在約一個(gè)月的時(shí)間內(nèi),以及將溶液反復(fù)冷凍和解凍。這使得能夠在任何實(shí)驗(yàn)要求之前準(zhǔn)備和儲(chǔ)存熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸溶液。在本發(fā)明的方法中使用的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸不是所描述的“參照基因”或“合成參照基因”,即其不需要與靶核酸一起擴(kuò)增。熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸不需要與靶核酸或任何參照基因序列具有任何同源性。然而,由于在本發(fā)明的方法中使用熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸的特定方式(即,在將熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸系列稀釋之后創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線),該熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸可以具有一定程度的同源性或甚至可以與靶核酸序列或參照基因或其較小部分相同。用限定數(shù)量的熒光團(tuán)(通常為1個(gè))標(biāo)記每個(gè)通用參照核酸。類似地,用已知數(shù)量的熒光團(tuán)標(biāo)記探針,該熒光團(tuán)允許由熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸所產(chǎn)生的熒光與由熒光團(tuán)標(biāo)記的探針結(jié)合的靶核酸所產(chǎn)生的熒光進(jìn)行直接比較。因此,熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸的長(zhǎng)度和/或組成是無關(guān)緊要的,只要可以測(cè)定到限定量的熒光團(tuán)即可。在本文所述的實(shí)施方式中,熒光團(tuán)標(biāo)記的參照核酸的長(zhǎng)度為21bp,并且其gc含量在30%-80%之間變化,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解,任何長(zhǎng)度或gc含量的熒光團(tuán)標(biāo)記的參照核酸將提供相似的結(jié)果。如果從生物學(xué)來源、天然的或其它來源獲得熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸,則可以使用限制酶以獲得合適的片段。也可以方便地使用合成的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸,并且可以通過已知技術(shù)簡(jiǎn)單地制備,如例如sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第二版(1989)coldspringharborlaboratory出版,coldspringharbor,n.y.以及roe等人,dnaisolationandsequencing”(基礎(chǔ)技術(shù)系列)(1996)johnwiley&sons,inc.,n.y中所描述的那些。可以將相同的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸用于許多核酸靶標(biāo)??商鎿Q地,可以使用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸和同樣不同的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針來產(chǎn)生多個(gè)校準(zhǔn)曲線以在多重pcr反應(yīng)中定量核酸。因此,由于本發(fā)明的方法滿足了擴(kuò)增參照基因并且不斷地進(jìn)行參照基因或合成參照基因測(cè)定的需要以在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中將核酸表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,該方法是有利的。可以制備一種校準(zhǔn)曲線并將其用于超過一種的可以在大小和序列上變化的靶核酸的定量,從而與常規(guī)基因表達(dá)測(cè)定相比縮減了成本和時(shí)間。作為用于制備本發(fā)明方法中使用的校準(zhǔn)曲線的通用指南,采用與用于靶核酸和相同反應(yīng)管一樣的反應(yīng)緩沖液一式兩份地將熒光團(tuán)標(biāo)記的通用參照核酸在一定濃度范圍內(nèi)系列稀釋,并使其經(jīng)受與靶核酸相同的擴(kuò)增條件。現(xiàn)在將參考特定但非限制性的描述特定組成和使用方法的實(shí)施例來更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而,應(yīng)當(dāng)理解,所包括的特定步驟、組成和方法的詳細(xì)描述僅僅是為了舉例說明本發(fā)明。不應(yīng)該以任何方式理解為是對(duì)上述發(fā)明觀點(diǎn)的廣泛描述的限制。實(shí)施例實(shí)施例1:使用accucal-p定量一系列經(jīng)過擴(kuò)增的λdna。將fam標(biāo)記的參照核酸(21bp和30%gc-accucal-p)稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm和120nm,并且測(cè)量40次pcr循環(huán)內(nèi)的熒光(圖1a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸的濃度來創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并計(jì)算線性回歸(圖1b)。在40次pcr循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增一系列的10倍系列稀釋的原種λdna,其中使用fam標(biāo)記的水解探針檢測(cè)92bp片段的經(jīng)過擴(kuò)增的λdna(圖1c)。以一式三份進(jìn)行每個(gè)pcr。與陰性對(duì)照(ntc)一起,接種核酸的理論量在4.5×107至4.5×101拷貝數(shù)/pcr的范圍內(nèi)。使用校正曲線以及每個(gè)反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分上的各自效率,使用公布的算法來定量接種到每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中的核酸的初始量(tichopad等人.2003,nucl.acidsres.,31(20):e122)。由校準(zhǔn)曲線,測(cè)定每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分內(nèi)的dna的pmol,使用方程式pmz=pm/en計(jì)算初始輸入dna平均值,其中pmz是在時(shí)間為零時(shí)的pmol,e為效率,n是循環(huán)數(shù)。使用pmz×6.02223×10-12將pmz轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)/pcr。對(duì)于每個(gè)一份三份,測(cè)定初始核酸的平均量以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(表1)。接種的理論量(c/pcr)計(jì)算的平均量(c/pcr)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差4.5×1014.59×1011.22×1014.5×1021.91×1023.95×1014.5×1033.87×1031.11×1034.5×1041.86×1044.51×1034.5×1056.17×1051.56×1054.5×1061.01×1072.67×1064.5×1077.89×1071.88×107ntc00表1實(shí)施例2:使用accucal-p定量一系列經(jīng)過擴(kuò)增的λdna。將fam標(biāo)記的參照核酸(21bp和40%gc-accucal-p)稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm和120nm,并且測(cè)量40次pcr循環(huán)內(nèi)的熒光(圖2a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸的濃度來創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并計(jì)算線性回歸(圖2b)。在40次pcr循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增一系列的10倍系列稀釋的原種λdna,其中使用fam標(biāo)記的水解探針檢測(cè)92bp片段的經(jīng)過擴(kuò)增的λdna(圖2c)。以一式三份進(jìn)行每個(gè)pcr。與陰性對(duì)照(ntc)一起,接種核酸的理論量在4.5×107至4.5×101拷貝數(shù)/pcr的范圍內(nèi)。使用校正曲線以及每個(gè)反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分上的各自效率,使用公布的算法來定量接種到每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中的核酸的初始量(tichopad等人.2003,nucl.acidsres.,31(20):e122)。由校準(zhǔn)曲線,測(cè)定每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分內(nèi)的dna的pmol,使用方程式pmz=pm/en計(jì)算初始輸入dna平均值,其中pmz是在時(shí)間為零時(shí)的pmol,e為效率,n是循環(huán)數(shù)。使用pmz×6.02223×10-12將pmz轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)/pcr。對(duì)于每個(gè)一份三份,測(cè)定初始核酸的平均量以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(表2)。接種的理論量(c/pcr)計(jì)算的平均量(c/pcr)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差4.5×1016.51×1011.23×1014.5×1022.95×1027.79×1014.5×1039.07×1032.50×1034.5×1041.89×1044.50×1034.5×1058.66×1052.76×1054.5×1061.43×1073.71×1064.5×1079.68×1072.34×107ntc00表2實(shí)施例3:使用accucal-p定量一系列經(jīng)過擴(kuò)增的λdna。將fam標(biāo)記的參照核酸(21bp和62%gc-accucal-p)稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm和200nm,并且測(cè)量40次pcr循環(huán)內(nèi)的熒光(圖3a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸的濃度來創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并計(jì)算線性回歸(圖3b)。在40次pcr循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增一系列的10倍系列稀釋的原種λdna,其中使用fam標(biāo)記的水解探針檢測(cè)92bp片段的經(jīng)過擴(kuò)增的λdna(圖3c)。以一式三份進(jìn)行每個(gè)pcr。與陰性對(duì)照(ntc)一起,接種核酸的理論量在4.5×107至4.5×101拷貝數(shù)/pcr的范圍內(nèi)。使用校正曲線以及每個(gè)反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分上的各自效率,使用公布的算法來定量接種到每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中的核酸的初始量(tichopad等人.2003,nucl.acidsres.,31(20):e122)。由校準(zhǔn)曲線,測(cè)定每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分內(nèi)的dna的pmol,使用方程式pmz=pm/en計(jì)算初始輸入dna平均值,其中pmz是在時(shí)間為零時(shí)的pmol,e為效率,n是循環(huán)數(shù)。使用pmz×6.02223×10-12將pmz轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)/pcr。對(duì)于每個(gè)一份三份,測(cè)定初始核酸的平均量以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(表3)。接種的理論量(c/pcr)計(jì)算的平均量(c/pcr)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差4.5×1018.58×1013.06×1014.5×1026.22×1021.15×1024.5×1037.48×1031.48×1034.5×1046.42×1041.26×1044.5×1054.44×1058.09×1044.5×1061.30×1072.42×1064.5×1079.19×1071.68×107ntc00表3實(shí)施例4:使用accucal-p定量一系列經(jīng)過擴(kuò)增的λdna。將fam標(biāo)記的參照核酸(21bp和80%gc-accucal-p)稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm和120nm,并且測(cè)量40次pcr循環(huán)內(nèi)的熒光(圖4a)。通過繪制每次循環(huán)的熒光值相對(duì)于參照核酸的濃度來創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線,并計(jì)算線性回歸(圖4b)。在40次pcr循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增一系列的10倍系列稀釋的原種λdna,其中使用fam標(biāo)記的水解探針檢測(cè)92bp片段的經(jīng)過擴(kuò)增的λdna(圖4c)。以一式三份進(jìn)行每個(gè)pcr。與陰性對(duì)照(ntc)一起,接種核酸的理論量在4.5×107至4.5×101拷貝數(shù)/pcr的范圍內(nèi)。使用校正曲線以及每個(gè)反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分上的各自效率,使用公布的算法來定量接種到每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中的核酸的初始量(tichopad等人.2003,nucl.acidsres.,31(20):e122)。由校準(zhǔn)曲線,測(cè)定每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)部分內(nèi)的dna的pmol,并且使用方程式pmz=pm/en計(jì)算初始輸入dna平均值,其中pmz是在時(shí)間為零時(shí)的pmol,e為效率且n是循環(huán)數(shù)。使用pmz×6.02223×10-12將pmz轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)/pcr。對(duì)于每個(gè)一份三份,測(cè)定初始核酸的平均量以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(表4)。接種的理論量(c/pcr)計(jì)算的平均量(c/pcr)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差4.5×1011.26×1023.63×1014.5×1023.71×1028.98×1014.5×1037.67×1031.90×1034.5×1043.38×1047.96×1034.5×1055.76×1051.53×1054.5×1061.33×1073.27×1064.5×1078.30×1071.93×107ntc00表4實(shí)施例5:使用accucal-d、accucal-p和accubeacon定量一系列經(jīng)過擴(kuò)增的λdna。使用三種參照核酸獨(dú)立地對(duì)一系列λdna進(jìn)行定量:accucal-d(用evagreen標(biāo)記的21bp和62%gc的參照核酸),accucal-p(用fam標(biāo)記的21bp和62%gc的參照核酸)和accubeacon(用fam標(biāo)記的21bp和62%gc的發(fā)夾式參照核酸)。將每種參照核酸(accucal-d、accucal-p和accubeacon)稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、140nm和200nm。由在4.5×106至4.5×102范圍內(nèi)的10倍系列稀釋的λdna以及ntc擴(kuò)增92bp片段,并且使用fam標(biāo)記的水解探針(圖5a)或嵌入染料evagreen(圖5b)進(jìn)行檢測(cè)。使用accucal-d、accucal-p或accubeacon作為校準(zhǔn)物計(jì)算初始核酸輸入量,并且將其與接種至每個(gè)pcr中的核酸的理論量進(jìn)行比較(表5a和5a)。表5a表5a實(shí)施例6:使用accucal-d或accucal-p定量一系列擴(kuò)增子大小。設(shè)計(jì)引物以擴(kuò)增來自λdna的92bp、501bp和1000bp的擴(kuò)增子(分別地,圖6a、6b和6c)。由在4.5×105至4.5×101范圍內(nèi)的10倍系列稀釋的λdna以及ntc擴(kuò)增每個(gè)片段。使用accucal-p(用fam標(biāo)記的21bp和62%gc的參照核酸)或accucal-d(用evagreen標(biāo)記的21bp和62%gc的參照核酸)作為校準(zhǔn)物計(jì)算初始核酸輸入量(表6)。表6實(shí)施例7:使用accucal-p定量不同組成的核酸。設(shè)計(jì)合成靶核酸,由此可以擴(kuò)增為75%cg組成(圖7a)或75%at組成(圖7b)的90bp擴(kuò)增子。將合成模板稀釋10倍以使得每個(gè)pcr接種1×107至1×103范圍內(nèi)的已知量的模板以及ntc。將accucal-p(用fam標(biāo)記的21bp和62%gc的參照核酸)稀釋至0nm、20nm、40nm、80nm、100nm和120nm。使用accucal-p作為富含gc的模板(表7a)和富含at的模板(表7b)的校準(zhǔn)物來計(jì)算初始核酸輸入量。表7a表7b實(shí)施例8:可以同時(shí)在同一孔中檢測(cè)不同量的分別用不同熒光團(tuán)標(biāo)記的四種參照核酸的熒光分別地,用fam(圖8a)、hex(圖8b)、德克薩斯紅(圖8c)和tye665(圖8d)標(biāo)記參照核酸(21bp和62%gc),并以綠色、黃色、橙色和紅色濾波器通道進(jìn)行檢測(cè)。在每種情況下,將熒光團(tuán)標(biāo)記的參照核酸稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm和160nm,并且在每個(gè)pcr擴(kuò)增循環(huán)的退火步驟結(jié)束時(shí)測(cè)量熒光。針對(duì)四種參照核酸中的每一種,產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線(圖8e至圖8h)。繪制各個(gè)濃度的校準(zhǔn)物的每次循環(huán)的熒光值,并計(jì)算線性回歸。在每種情況下,顯示線性回歸線的方程式和r2值。0nm校準(zhǔn)物代表試劑、塑料等的熒光的背景水平,并從所有值中將其去除,以提供各個(gè)濃度的校準(zhǔn)物的真正熒光值。使用稀釋為0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm和200nm并用fam、hex或德克薩斯紅標(biāo)記的三種參照核酸(21bp和62%gc)來定量一系列的λpcr(表8)。使用fam標(biāo)記的參照核酸來定量用fam標(biāo)記的水解探針檢測(cè)的λpcr。使用hex標(biāo)記的參照核酸來定量用hex標(biāo)記的水解探針或joe標(biāo)記的水解探針檢測(cè)的λpcr。使用德克薩斯紅標(biāo)記的參照核酸來定量用德克薩斯紅標(biāo)記的水解探針或alexa594標(biāo)記的水解探針檢測(cè)的λpcr。表8實(shí)施例9:使用以一種熒光團(tuán)標(biāo)記的參照核酸來定量使用不同熒光團(tuán)檢測(cè)的擴(kuò)增。擴(kuò)增λdna(4.5×105和4.5×104c/pcr),并且使用fam標(biāo)記的水解探針(圖9a)、hex-(黑)或joe-(灰)標(biāo)記的水解探針(圖9b)、alexa594-(黑)或德克薩斯紅(灰)標(biāo)記的水解探針(圖9c)或cy5-(黑)或tye665-(灰)標(biāo)記的水解探針(圖9d)進(jìn)行檢測(cè)。將fam標(biāo)記的參照核酸(21bp和62%gc)稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm和140nm,并用于定量所有的擴(kuò)增(表9)。表9實(shí)施例10:accucal-p和樣品兩者都可以是復(fù)合的。將用fam、hex或德克薩斯紅(accucal-p)標(biāo)記的三種參照核酸(21bp和62%gc)各自稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm和200nm,并將其合并在pcr板的一個(gè)孔中。在其它孔中,擴(kuò)增4.5×106至4.5×103c/pcr范圍內(nèi)的十倍稀釋的λdna以及ntc。擴(kuò)增每個(gè)長(zhǎng)度為約100bp的不同的λ擴(kuò)增子,并且單獨(dú)使用fam、hex或德克薩斯紅標(biāo)記的探針檢測(cè)(曲線顯示為黑色),或者所有探針在一起在同一孔中進(jìn)行檢測(cè)(曲線顯示為灰色),并以綠色(fam)通道(圖10a)、黃色(hex)通道(圖10b)或橙色(texasred)通道(圖10c)檢測(cè)。使用具有相同熒光團(tuán)的accucal-p參照核酸計(jì)算dna輸入量(表10)。表10實(shí)施例11:accucal-p可用于定量mirna。使用以fam標(biāo)記的水解探針的mirna試劑盒(appliedbiosystems)從大鼠腦rna擴(kuò)增hsa-mir-34a。逆轉(zhuǎn)錄后,對(duì)rna進(jìn)行1:3.5的稀釋,與無反轉(zhuǎn)錄的對(duì)照(輸入rna,圖11中的淺灰色)和ntc(無cdna,但含有所有的其它試劑;圖11中的淺灰色)一起,同時(shí)將純的(圖11中的深灰色)和經(jīng)過稀釋的(圖11中的黑色)cdna以一式三份擴(kuò)增。將fam標(biāo)記的參照核酸(accucal-p)稀釋至0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm和200nm,并用于測(cè)定核酸輸入量(表11)。樣品計(jì)算的平均量(c/pcr)樣品14.42×105樣品21.32×105無反轉(zhuǎn)錄0ntc0表11雖然已經(jīng)通過實(shí)施例描述了本發(fā)明,但是應(yīng)當(dāng)理解,在不脫離本發(fā)明的范圍下,可以進(jìn)行變化和修改。此外,如果存在針對(duì)于特定特征的已知等同物,則如同特定地引用而將其并入本說明書中。當(dāng)前第1頁12
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