發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及病毒診斷領(lǐng)域，并且更具體地，涉及用于檢測(cè)耐藥性結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)的利用水解探針的pcr檢測(cè)方法。發(fā)明背景結(jié)核病(tb)是一種最常見于肺部的由各種分枝桿菌菌株，如結(jié)核分枝桿菌(mtb)，引起的細(xì)菌性疾病。當(dāng)患有肺或喉結(jié)核的個(gè)體咳嗽、打噴嚏或吐痰，并將mtb推進(jìn)到空氣中時(shí)，結(jié)核病通過空氣而在人與人之間傳播。據(jù)估計(jì)，世界人口的三分之一感染有mtb，而每年有9百萬人發(fā)展成tb。tb一直是人類傳染病的主要原因，并且mtb耐藥菌株正在增加，尤其是在發(fā)展中國家中。用于治療mtb的兩種常用一線藥物包括異煙肼(inh)和利福平(rif)，而患者可以通過居住在或訪問耐藥性普遍的地方而獲得耐藥mtb。當(dāng)患者的抗生素治療方案被打斷時(shí)，也可以發(fā)展出耐藥mtb。在固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)仍然被視為用于mtb和mtb耐藥性檢測(cè)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)可花費(fèi)長達(dá)八周的時(shí)間以獲得結(jié)果。許多針對(duì)mtb耐藥性的商用核酸測(cè)試具有非?？焖俚闹苻D(zhuǎn)時(shí)間，但無法檢測(cè)在包含野生型和突變種二者的混合感染中，突變種占小百分比的群體。因此，本領(lǐng)域需要快速且可靠的方法從而以靈敏的方式特異性檢測(cè)對(duì)利福平耐受的mtb(mtb-rif)和/或?qū)Ξ悷熾履褪艿膍tb(mtb-inh)。發(fā)明概述本文所述的實(shí)施方案涉及快速檢測(cè)生物或非生物樣品中是否存在mtb-rif和/或mtb-inh的方法，例如，通過實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在單個(gè)試管中多重檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh。實(shí)施方案包括檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的方法，該方法包括進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)步驟，其可包括擴(kuò)增步驟和雜交步驟。此外，實(shí)施方案包括設(shè)計(jì)用于在單個(gè)試管中檢測(cè)單一mtb-rif或mtb-inh感染或mtb-rif和mtb-inh混合感染的引物、探針以及試劑盒。所述檢測(cè)方法被設(shè)計(jì)用于同時(shí)特異性識(shí)別靶mtb基因中rpob(β亞基原核rna聚合酶)、inha(烯?；??；d體蛋白還原酶)和katg(過氧化氫酶-過氧化物酶)的單多態(tài)性(snp)，其允許在單次測(cè)試中檢測(cè)并區(qū)分mtb-rif和/或mtb-inh感染。例如，在rbob基因中存在17種賦予mtb中對(duì)利福平的抗性的snp，其包括：rpob531l、rpob531w、rpob526l、rpob526y、rpob526d、rpob526n、rpob513l、rpob513k、rpob513p、rpob522l、rpob522q、rpob522w、rpob516v、rpob516y、rpob533p、rpob511p和rpob526r；在inha基因中存在3種賦予mtb中對(duì)異煙肼的抗性的snp，其包括：inha-15t、inha-8a和inha-8c；且在katg基因中存在4種也賦予mtb中對(duì)異煙肼的抗性的snp，其包括：katg315i、katg315n、katg315t和katg315t2。在一個(gè)方面，提供了檢測(cè)樣品中mtb-rif和/或mtb-inh的方法，包括進(jìn)行擴(kuò)增步驟，其包括使所述樣品與至少一組rpob引物、一組inha引物以及一組katg引物接觸，從而，如果在所述樣品中存在任何rpob、inha和katg靶核酸，則產(chǎn)生一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物；進(jìn)行雜交步驟，其包括使所述一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物與多種可檢測(cè)的rpob探針、多種可檢測(cè)的inha探針以及多種可檢測(cè)的katg探針接觸，包括：用于檢測(cè)賦予mtb利福平抗性的17種單核苷酸多態(tài)性snp中的一種或多種的至少17種rpob探針；用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的3種snp中的一種或多種的至少3種inha探針；和用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的4種snp中的一種或多種的至少4種katg探針；以及檢測(cè)所述一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否，其中存在所述一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中存在mtb-rif和/或mtb-inh，而其中不存在所述一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物表明樣品中不存在mtb-rif和/或mtb-inh；其中所述多種rpob探針包括用于檢測(cè)賦予mtb利福平抗性的17種snp中的每一種的水解探針，包括：rpob531l、rpob531w、rpob526l、rpob526y、rpob526d、rpob526n、rpob513l、rpob513k、rpob513p、rpob522l、rpob522q、rpob522w、rpob516v、rpob516y、rpob533p、rpob511p和rpob526r；其中所述多種inha探針包括用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的3種snp中的每一種的水解探針，包括：inha-15t、inha-8a和inha-8c；且其中所述多種katg探針包括用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的4種snp中的每一種的水解探針，包括：katg315i、katg315n、katg315t和katg315t2。在某些實(shí)施方案中，rpob探針包含選自seqidno:1-289和437-438的核酸序列或其互補(bǔ)物，或由其組成；inha探針包含選自seqidno:344-409和436的核酸序列或其互補(bǔ)物，或由其組成；且katg探針包含選自seqidno:290-343和434-435的核酸序列或其互補(bǔ)物，或由其組成。在一些實(shí)施方案中，rpob探針選自seqidno:1-289和437-438或其互補(bǔ)物；inha探針選自seqidno:344-409和436或其互補(bǔ)物；且katg探針選自seqidno:290-343和434-435或其互補(bǔ)物。在一些實(shí)施方案中，多種可檢測(cè)的rpob、inha和katg探針中的每一種均用供體熒光部分和對(duì)應(yīng)的受體熒光部分標(biāo)記，且檢測(cè)步驟包括檢測(cè)一種或多種的rpob、inha和katg探針中的所述供體熒光部分與所述受體熒光部分之間是否存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)，其中熒光發(fā)射的存在與否表明樣品中是否存在mtb-rif和/或mtb-inh。在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。在一些實(shí)施方案中，所述供體和受體熒光部分在所述探針上彼此相距不超過8個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述受體熒光部分為猝滅劑。在另一方面，提供了寡核苷酸，其包含選自seqidno:1-409和434-438的核苷酸序列或其互補(bǔ)物，或由其組成，該寡核苷酸具有100個(gè)或更少的核苷酸。在另一方面，本公開提供了寡核苷酸，其包含與seqidno:1-409和434-438之一或其互補(bǔ)物具有至少70%序列同一性(例如，至少75%、80%、85%、90%或95%等)的核酸，該寡核苷酸具有100個(gè)或更少的核苷酸。一般來講，在這些實(shí)施方案中，這些寡核苷酸可以是引物核酸、探針核酸等。在這些實(shí)施方案的某些中，寡核苷酸具有40個(gè)或更少的核苷酸(例如，35個(gè)或更少的核苷酸、30個(gè)或更少的核苷酸，等)。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，例如，以相對(duì)于未經(jīng)修飾的核苷酸改變核酸雜交穩(wěn)定性。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)標(biāo)記。任選地，寡核苷酸包含至少一個(gè)標(biāo)記和/或至少一個(gè)猝滅劑部分。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括至少一種保守修飾的變異(variation)。特定核酸序列的“保守修飾的變異”或簡稱“保守變異”是指那些核酸，其編碼相同或基本上相同的氨基酸序列，或當(dāng)其中所述核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，是指基本上相同的序列。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，改變、添加或缺失所編碼的序列中的單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于5%，更通常小于4%、2%或1%)的單獨(dú)的取代、缺失或添加是“保守修飾的變異”，其中所述改變導(dǎo)致氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸取代。在一個(gè)方面，擴(kuò)增可以采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。因此，第一和第二熒光部分可沿著探針的長度方向彼此相距不超過8個(gè)核苷酸。在另一方面，提供了一組寡核苷酸，其包括專門用于檢測(cè)rpob、inha和katg擴(kuò)增產(chǎn)物的多種可檢測(cè)rpob、inha和katg探針，包括：用于檢測(cè)賦予mtb利福平抗性的17種snp中的一種或多種的17種rpob探針；用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的3種snp中的一種或多種的3種inha探針；和用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的4種snp中的一種或多種的4種katg探針；其中所述多種rpob探針包括用于檢測(cè)賦予mtb利福平抗性的17種snp中的每一種的水解探針，包括：rpob531l、rpob531w、rpob526l、rpob526y、rpob526d、rpob526n、rpob513l、rpob513k、rpob513p、rpob522l、rpob522q、rpob522w、rpob516v、rpob516y、rpob533p、rpob511p和rpob526r；其中所述多種inha探針包括用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的3種snp中的每一種的水解探針，包括：inha-15t、inha-8a和inha-8c；且其中所述多種katg探針包括用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的4種snp中的每一種的水解探針，包括：katg315i、katg315n、katg315t和katg315t2。在本文中，所述寡核苷酸組適用于檢測(cè)樣品中對(duì)利福平耐受的結(jié)核分枝桿菌(mtb-rif)和/或?qū)Ξ悷熾履褪艿膍tb(mtb-inh)的核酸。在一些實(shí)施方案中，rpob探針包含選自seqidno:1-289和437-438的核酸序列或其互補(bǔ)物；inha探針包含選自seqidno:344-409和436的核酸序列或其互補(bǔ)物；且katg探針包含選自seqidno:290-343和434-435的核酸序列或其互補(bǔ)物。在一些實(shí)施方案中，在該組內(nèi)的寡核苷酸具有100個(gè)或更少的核苷酸。在這些實(shí)施方案的某些中，寡核苷酸具有40個(gè)或更少的核苷酸(例如，35個(gè)或以下的核苷酸、30個(gè)或更少的核苷酸等)。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，例如，以相對(duì)于未經(jīng)修飾的核苷酸改變核酸雜交穩(wěn)定性。任選地，寡核苷酸包含至少一個(gè)標(biāo)記和/或至少一個(gè)猝滅劑部分。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包括至少一種保守修飾的變異。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸包含第一和第二熒光部分，這兩部分可沿著探針的長度方向彼此相距不超過8個(gè)核苷酸。在另外的方面，提供了用于檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的一種或多種核酸的試劑盒。所述試劑盒可以包括專門用于擴(kuò)增rpob、inha和katg基因靶標(biāo)的多組rpob、inha和katg引物；和專門用于檢測(cè)rpob、inha和katg擴(kuò)增產(chǎn)物的多種可檢測(cè)的rpob、inha和katg探針。在一些實(shí)施方案中，所述多種可檢測(cè)的rpob、inha和katg特異性探針至少包括：用于檢測(cè)賦予mtb利福平抗性的17種snp中的一種或多種的17種rpob探針；用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的3種snp中的一種或多種的3種inha探針；和用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的4種snp中的一種或多種的4種katg探針；其中所述多種rpob探針包括用于檢測(cè)賦予mtb利福平抗性的17種snp中的每一種的水解探針，包括：rpob531l、rpob531w、rpob526l、rpob526y、rpob526d、rpob526n、rpob513l、rpob513k、rpob513p、rpob522l、rpob522q、rpob522w、rpob516v、rpob516y、rpob533p、rpob511p和rpob526r；其中所述多種inha探針包括用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的3種snp中的每一種的水解探針，包括：inh15t、inha-8a和inh8c；且其中所述多種katg探針包括用于檢測(cè)賦予mtb異煙肼抗性的4種snp中的每一種的水解探針，包括：katg315i、katg315n、katg315t和katg315t2。在一些實(shí)施方案中，rpob探針包含選自seqidno:1-289和437-438的核酸序列或其互補(bǔ)物，或由其組成；inha探針包含選自seqidno:344-409和436的核酸或其互補(bǔ)物，或由其組成；且katg探針包含選自seqidno:290-343和434-435的核酸或其互補(bǔ)物，或由其組成。在一些實(shí)施方案中，rpob探針選自seqidno:1-289和437-438或其互補(bǔ)物；inha探針選自seqidno:344-409和436或其互補(bǔ)物；且katg探針選自seqidno:290-343和434-435或其互補(bǔ)物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可包括已經(jīng)用供體和對(duì)應(yīng)的受體熒光部分標(biāo)記的探針，或可以包括用于標(biāo)記這些探針的熒光部分。在一些實(shí)施方案中，所述多種可檢測(cè)的rpob、inha和katg探針中的每一種探針均包含供體熒光部分和對(duì)應(yīng)的受體熒光部分。在一些實(shí)施方案中，所述受體熒光部分為猝滅劑。所述試劑盒還可以包括三磷酸核苷、核酸聚合酶以及對(duì)于核酸聚合酶功能所必需的緩沖液。所述試劑盒還可以包括藥品說明書以及使用所述引物、探針和熒光部分以檢測(cè)樣品中是否存在mtb-rif和/或mtb-inh的說明。除非另行定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。在下文中描述了合適的方法和材料，但與本文所述那些類似或等同的方法和材料也可用于實(shí)踐或測(cè)試本主題。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅為說明性，且非旨在限制。在以下的附圖和說明書中描述了一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容。其它特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將體現(xiàn)于所述附圖和詳細(xì)描述以及權(quán)利要求書。附圖簡述圖1a和1b顯示了針對(duì)rpob基因靶標(biāo)的野生型和突變型擴(kuò)增子序列并指明了賦予mtb利福平抗性的17種snp中的每一種。圖2a和2b顯示了針對(duì)inha基因靶標(biāo)的野生型和突變型擴(kuò)增子序列并指明了賦予mtb異煙肼抗性的3種snp中的每一種。圖3a和3b顯示了針對(duì)katg基因靶標(biāo)的野生型和突變型擴(kuò)增子序列并指明了賦予mtb異煙肼抗性的4種snp中的每一種。圖4和4b顯示了相比使用針對(duì)522lsnp的修飾探針，使用針對(duì)522lsnp的未經(jīng)修飾的探針的單重pcrsnp特異性探針檢測(cè)的生長曲線測(cè)定(mt靶標(biāo)(~1e6、1e2、1e310c/pcr)，相比wt)。發(fā)明詳述通過核酸擴(kuò)增診斷mtb-rif和/或mtb-inh感染提供了用于迅速且準(zhǔn)確檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh感染的方法。在本文中描述了用于檢測(cè)樣品中mtb-rif和/或mtb-inh的實(shí)時(shí)測(cè)定。提供了用于檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的rpob、inha和katg靶核酸的引物和探針，以及含有此類引物和探針的制品或試劑盒。用于檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的實(shí)時(shí)pcr相比其它方法在靈敏度上的提升，以及實(shí)時(shí)pcr的改進(jìn)特征(包括樣品控制(samplecontainment)和對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè))，使得將這項(xiàng)技術(shù)的實(shí)施適宜用于在臨床實(shí)驗(yàn)室中對(duì)mtb-rif和/或mtb-inh感染的常規(guī)診斷。識(shí)別耐藥mtb需要檢測(cè)mtb基因組中位于多個(gè)不同基因上的大量單核苷酸多態(tài)性(snp)。使用水解探針(也稱為taqman探針)設(shè)計(jì)的新變型，創(chuàng)建了多重高分辨率taqman探針，其中每個(gè)taqman探針可以檢測(cè)單一snp而沒有交叉反應(yīng)性。所述探針被設(shè)計(jì)得很短并且高度穩(wěn)定，從而僅對(duì)完全匹配的耐藥(突變型)序列以高特異性結(jié)合并切割。本公開提供了taqman探針，其用于檢測(cè)賦予mtb-rif和mtb-inh抗性的多種snp。taqman相容的探針一般無法檢測(cè)單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配。一般來講，taqman探針被設(shè)計(jì)得長得多，并且具有明顯高于相關(guān)pcr引物的解鏈溫度，從而確保足夠的探針先于引物結(jié)合至靶序列并在pcr期間獲得最大的探針切割。由于此類探針的高解鏈溫度和長度，其一般非常耐受在探針區(qū)域下的單個(gè)堿基錯(cuò)配，并因此并不分辨僅相差單個(gè)堿基的兩個(gè)靶標(biāo)。在本公開中，水解taqman探針能夠成功地僅檢測(cè)耐藥mtb，并且不與可能僅相差單個(gè)堿基的藥物敏感mtb交叉反應(yīng)。本公開提供了大量短的、經(jīng)高度修飾的探針，其可以檢測(cè)探針區(qū)域下的單個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配。在探針設(shè)計(jì)中，可以被取代的經(jīng)修飾的堿基包括：丙炔基-dc、叔丁基-芐基dc、丙炔基-du、g夾、甲基-dc、n6-甲基da和7-脫氮-dg。在設(shè)計(jì)探針時(shí)，本發(fā)明人策略性地將多個(gè)經(jīng)修飾的堿基對(duì)置于探針序列內(nèi)，從而使探針的分辨能力最大化。發(fā)現(xiàn)一些修飾的效果優(yōu)于其它，并且分辨能力受到修飾在探針中的位置的影響。本公開提供了用于多重測(cè)定的方法和試劑盒，所述多重測(cè)定可以利用多種經(jīng)高度修飾的taqman探針，其中每種探針可以檢測(cè)在mtb基因組中已知賦予利福平(rif)和異煙肼(inh)耐藥性的單一snp，而不與藥物敏感(野生型)mtb發(fā)生顯著交叉反應(yīng)。本公開的taqman探針的檢測(cè)突變型snp而沒有顯著wt交叉反應(yīng)性的獨(dú)特能力使得所述測(cè)定能夠檢測(cè)混合于野生型(wt)的背景中時(shí)的少量存在的耐藥mtb。已經(jīng)報(bào)道了混合感染的存在，并且其已經(jīng)表明，由于現(xiàn)有商用測(cè)定不能在存在藥物敏感mtb的情況下檢測(cè)耐藥mtb，所以混合感染的流行程度被低估了。據(jù)疾病控制中心(cdc)報(bào)道，患者在wt的背景下感染了低至1%的耐藥mtb可能導(dǎo)致其建議的治療方案失敗。所述方法可包括進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)步驟，其包括使用多對(duì)引物從樣品擴(kuò)增rpob、inha和katg核酸分子基因靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)部分，所述引物包括如本文所用稱為寡核苷酸引物的rpob、inha和katg特異性引物，其分別特異性退火至編碼rpob、inha和katg的核酸序列，并在適當(dāng)?shù)臈l件下由此引發(fā)合成。所討論的rpob、inha和katg引物中的每一種退火至各自的rpob、inha和katg靶核酸分子內(nèi)的或與之相鄰的靶標(biāo)，使得每種擴(kuò)增產(chǎn)物的至少一部分包含對(duì)應(yīng)于各自靶標(biāo)的核酸序列。只要樣品中存在rpob、inha和katg核酸中的一種或多種，就產(chǎn)生所述rpob、inha和katg擴(kuò)增產(chǎn)物中的一種或多種，因此，存在所述rpob、inha和katg擴(kuò)增產(chǎn)物中的一種或多種表明樣品中存在rpob、inha和katg。所述擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)包含與一種或多種可檢測(cè)的探針互補(bǔ)的核酸序列，所述探針用于檢測(cè)rpob、inha和katg中賦予mtb利福平和/或異煙肼抗性的snp。每個(gè)循環(huán)步驟均包括擴(kuò)增步驟、雜交步驟和檢測(cè)步驟，在檢測(cè)步驟中使樣品與針對(duì)rpob、inha和katg的一種或多種可檢測(cè)的探針接觸，以檢測(cè)樣品中是否存在mtb-rif和/或mtb-inh。如本文所用，術(shù)語“擴(kuò)增”是指合成與模板核酸分子(例如，rpob、inha和katg核酸分子)的一條鏈或兩條鏈互補(bǔ)的核酸分子的方法。擴(kuò)增核酸分子通常包括使模板核酸變性、在低于引物解鏈溫度的溫度將引物退火至模板核酸以及從引物酶促延伸以生成擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增通常需要存在脫氧核糖核苷三磷酸、dna聚合酶(例如，platinum?taq)以及用于聚合酶活性最優(yōu)化的合適的緩沖液和/或輔助因子(例如，mgcl2和/或kcl)。本文中所用的術(shù)語“引物”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且是指低聚化合物，主要指寡核苷酸但也指經(jīng)修飾的寡核苷酸，其能夠通過模板依賴性dna聚合酶“引導(dǎo)”dna合成，即，例如，寡核苷酸的3'端提供游離的3'-oh基團(tuán)，而可以通過模板依賴性dna聚合酶，將另外的“核苷酸”連接到其上形成3'至5'磷酸二酯鍵，由此使用脫氧核苷三磷酸，并且由此釋放焦磷酸。因此，可能除了對(duì)于所預(yù)期的功能之外，“引物”、“寡核苷酸”或“探針”之間不存在根本的區(qū)別。術(shù)語“雜交”是指一個(gè)或多個(gè)探針退火至擴(kuò)增產(chǎn)物。雜交條件通常包括低于探針的解鏈溫度但避免探針的非特異性雜交的溫度。術(shù)語“5'至3'核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，其通常與核酸鏈的合成有關(guān)，由此將核苷酸從核酸鏈的5'端移除。術(shù)語“熱穩(wěn)定聚合酶”是指熱穩(wěn)定的聚合酶，即，該酶催化與模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的形成，并且當(dāng)其經(jīng)受引起雙鏈模板核酸變性所必要的時(shí)間的高溫時(shí)，不會(huì)不可逆地變性。一般來講，合成起始于每個(gè)引物的3'端并以5'至3'的方向沿著模板鏈進(jìn)行。已經(jīng)從黃棲熱菌(thermusflavus)、紅棲熱菌(t.ruber)、嗜熱棲熱菌(t.thermophilus)、水生棲熱菌(t.aquaticus)、乳棲熱菌(t.lacteus)、紅色棲熱菌(t.rubens)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)和熾熱甲烷嗜熱菌(methanothermusfervidus)中分離出了熱穩(wěn)定聚合酶。盡管如此，非熱穩(wěn)定的聚合酶也可被用于pcr測(cè)定，前提是不斷補(bǔ)充該酶。術(shù)語“其互補(bǔ)物”是指與給定的核酸不僅長度相同并且還完全互補(bǔ)的核酸。當(dāng)談到核酸而使用時(shí)，術(shù)語“延伸”或“延長”是指額外的核苷酸(或其它類似分子)被摻入到核酸中的情況。例如，核酸任選地被摻入核苷酸的生物催化劑延伸，如聚合酶，其通常在核酸的3'末端添加核苷酸。在兩個(gè)或更多個(gè)核酸序列的語境中，術(shù)語“相同的”或“同一性”百分比是指兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列，其在就最大對(duì)應(yīng)程度進(jìn)行比較和比對(duì)(例如，使用技術(shù)人員可獲得的序列比較算法或通過目測(cè)進(jìn)行測(cè)量)時(shí)，是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸。適用于確定序列同一性和序列相似性百分比的示例性算法為blast程序，其描述在，例如，altschul等人(1990)“basiclocalalignmentsearchtool”j.mol.biol.215:403-410,gish等人(1993)“identificationofproteincodingregionsbydatabasesimilaritysearch”naturegenet.3:266-272,madden等人(1996)“applicationsofnetworkblastserver”meth.enzymol.266:131-141,altschul等人(1997)“gappedblastandpsi-blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms”nucleicacidsres.25:3389-3402以及zhang等人(1997)“powerblast:anewnetworkblastapplicationforinteractiveorautomatedsequenceanalysisandannotation”genomeres.7:649-656。在寡核苷酸的語境中，“經(jīng)修飾的核苷酸”是指一種改變，其中寡核苷酸序列的至少一個(gè)核苷酸被不同的核苷酸所替換，這為寡核苷酸提供了所需的特性。本文中所述的寡核苷酸中可被取代的示例性的經(jīng)修飾的核苷酸包括，例如，c5-甲基-dc、c5-乙基-dc、c5-甲基-du、c5-乙基-du、2,6-二氨基嘌呤、c5-丙炔基-dc、c5-丙炔基-du、c7-丙炔基-da、c7-丙炔基-dg、c5-炔丙基氨基-dc、c5-炔丙基氨基-du、c7-炔丙基氨基-da、c7-炔丙基氨基-dg、7-脫氮-2-脫氧黃嘌呤核苷、吡唑并嘧啶類似物、偽-du、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基核糖-u、2'-0-甲基核糖-c、n4-乙基-dc、n6-甲基-da等。所述寡核苷酸中可被取代的許多其它經(jīng)修飾的核苷酸在本文中提到，或以其他方式為本領(lǐng)域中已知。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的未經(jīng)修飾的寡核苷酸的解鏈溫度，經(jīng)修飾的核苷酸取代改變了寡核苷酸的解鏈溫度(tm)。為了進(jìn)一步說明，在一些實(shí)施方案中，某些經(jīng)修飾的核苷酸取代可以減少非特異性核酸擴(kuò)增(例如，最小化引物二聚體的形成等)，和/或增加預(yù)定靶擴(kuò)增子的產(chǎn)率等。這些類型的核苷酸修飾的實(shí)例描述在，例如美國專利no.6,001,611中。mtb-rif和/或mtb-inh核酸以及寡核苷酸本公開提供了通過擴(kuò)增，例如，一種或多種的rpob、inha和katg核酸序列的一部分，來檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的方法。rpob、inha和katg的核酸序列可例如通過genbank得到。具體地，本公開的實(shí)施方案中提供了用于擴(kuò)增和檢測(cè)rpob、inha和katg核酸分子靶標(biāo)的引物和探針。更具體地，寡核苷酸的實(shí)施方案各自包括了這樣的核酸，所述核酸具有選自seqidno:1-409和434-438的序列、其基本上相同的變體，其中所述變體與seqidno:1-409和434-438之一具有至少例如80%、90%或95%序列同一性，或seqidno:1-409和434-438以及所述變體的互補(bǔ)物。表i：用于rpob、inha和katg核酸分子靶標(biāo)的探針rpob531ltcg/ttgser/leu寡聚物名稱seqidno序列修飾rmrpo3sp531l091fgttggqjgctggggcpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,j-g-夾rmrpo3sp531l182factgttqgglgltgggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3sp531l193fctgttqgglglugggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l18b4factgttqgglglugggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l18c5fctgtuqgglglugggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l1b6fctgttqgglgctggggcpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3sp531l207falugttqgglgluggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l208jccgaltgttgqglglupj-threo-ja270::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3sp531l229jctgttggcglugqggpj-threo-ja270::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3sp531l2410fluguuqgglgltgggglpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3sp531l2511fluguuqgglgltggggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3sp531l2612fuguugqglgltgggglllpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l20b13faluguuqgglgluggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l20c14ealuguuqgglgluggpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l20d15falugutqgglgluggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l25b16eluguuqgglglugggpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l25c17eluguuqgglglugglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531l20f18ealuguuqgglgluglaglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l20hs19ealuguuqjgglgluggpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l25c220eluguugqglglugglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l20c221ealuguuqgglgluglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l25c322ealuguuqgglglugglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3s531f123ealuguuqlglgluggpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l25b224eluguuqgglgltgggpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l3125euguugqglgltggggpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l25b326eluguugqglgltgggpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l25b427eluguugqglgltggcpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3f531l28fccjacaqgtcggcgcttgpf-threo-fam::j-叔丁基芐基-da::p-磷酸::q-bhq-2rmrpo3f531l0229fccjacaqgtcggcgcttgtgggtcpf-threo-fam::j-叔丁基芐基-da::p-磷酸::q-bhq-2rmrpo3f531l0430fccaacaqgtlgglglttgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3f531l0531fccaacqagtlgglglttgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3f531l0632fccaacaqgulgglgltugpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3ap531l1133fccaacaqgtjggcgcttgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,j-g-夾rmrpo3ap531l1234fccaajaqgtcggcgcttgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,j-g-夾rmrpo3ap531l1335fccaacaqgtcggjgcttgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,j-g-夾rmrpo3ap531l1436fccaacaqgtcggcgjttgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,j-g-夾rmrpo3a531l12b37fccaalqagucggcgcttgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3ap531l1738fccaalaqgtlgglglpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3a531l17b39fccaalqagtlgglglpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3a531l1940fccaalqagtlgglgctpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3a531l2041eccaalaqgtlgglgctpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrmrpo3a531l18d42jccaalagulggcqgltpj-threo-ja270::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3a531l12c43eccaalqagucggcgcttgpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3a531l12d44eccaalqagulggcgcttgpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l17b245eccaalaqgulgglglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l17b346ellaalaqgulgglglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3a531l2147fllaalqagulgglglupf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3a531l2248flljalqagulgglglpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基du,j-g-夾rmrpo3531l17b449fllaalqagulgglglpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基durmrpo3531l17b550flljalqagulgglglpe-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基du,叔丁基芐基-darmrpo3a531l20b51ellaalaqgulgglglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrm5l17b3a52ellaalaqgtlgglglpe-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dcrpob531wtcg/tggser/trp寡聚物名稱seqidno:序列修飾rmrpo3f531w53fcclacaqgtcggcgcttgpf=threo-fam;q=叔丁基芐基-dc;p=磷酸;q=bhq-2rmrpo3f531w0254fcclacaqgtcggcgcttgtpf=threo-fam;l=叔丁基芐基-dc;p=磷酸;q=bhq-2rmrpo3f531w0655fccjacaqgtcggcgcpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,j-g-夾rpob526lcac/ctchis/leu寡聚物名稱seqidno:序列修飾rmrpo3a0756fluugagqggulaallllpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc:u=丙炔基durmrpo3a07b257fttgaggqgtlaalcccgacggggpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc:u=丙炔基durmrpo3a0858falllulqaaglgllgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc:u=丙炔基durmrpo3a08b59falllulqaaglgllpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc:u=丙炔基durmrpo3a08c60falllulqaagcgllgpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc:u=丙炔基durmrpo3a0961jluugagggulaaqllllpj-ja270::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc:u=丙炔基duayrpo3526lfm0762fluugagggqulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526lfm0863fgluugagqggulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526lfm0964fgluugaggqgulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526lfm1065fgluugagggqulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526lfm1166fgluugaggqgjlaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::l-pdc::u-pduayrpo3526lfm1267fgluugagggqujaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::l-pdc::u-pduayrpo3526lja0168fgluugaggqgulaallllgapf-th-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526lja0269fgluugagggqulaallllgapf-th-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526lja0370fgluugaggqgjlaallllgapf-th-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::l-pdc::u-pduayrpo3526lja0471fgluugagggqujaallllgapf-th-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::l-pdc::u-pduayrpo3526lja0572fgluugagggjqlaallllgapf-th-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::l-pdc::u-pduayrpo3526lja0673fgluugagggjlaaqllllgapf-th-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::l-pdc::u-pdurpob526ycac/tachis/tyr寡聚物名稱seqidno:序列修飾rmrpo3a06e74juuguaggulaalqlllgapj-ja270::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基duayrpo3526yfm0775fluugujggqulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-t-propda::l-pdc::u-pduayrpo3526yfm0876fluugqujggulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-t-propda::l-pdc::u-pduayrpo3526yfm0977fluugujgqgulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-t-propda::l-pdc::u-pduayrpo3526yfm1078fluuguagqgulaallllgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0179fluugujgqgulaallllgapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::j-t-propda::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0280fluuguagqgulaallllgapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0381fuugujgqgulaallllgapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::j-t-propda::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0482fuugujgqgulaallllpf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::j-t-propda::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0583fuugujqggulaallllpf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::j-t-propda::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0684fluup66guagqgjlaallllgapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0785fluuguagqgulaallllgalapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0886flgluuguagqgulaallllgapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx0987fgluuguagqgulaallllgalapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pduayrpo3526yhx1088flgluuguagqgulaallllgalapf-threo-hex::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pdurpob:526dcac/gachis/asp名稱seqidno:序列修飾rmrpo3a03c89fluugulqggucaaclllpf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc:u=丙炔基durmrpo3a03d90jluugulggulaaqllccpj-ja270::p-磷酸::q-bhq-2,l=丙炔基dc,u=丙炔基duayrpo3526dfm0391ftgtjgqgtcaaccccgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayrpo3526dfm0492ftgtjggqtcaaccccgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayrpo3526dfm0593fgttgtqjggtcaaccccgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayrpo3526dfm0694fgttgtjggqtcaaccccgapf-threo-fam::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayrpo3526dja0795fuugujggulaqallllpf-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pdu::j-g-夾ayrpo3526dja0896fluugujggulaqallllpf-ja270::p-磷酸::q-bhq-2::l-pdc::u-pdu::j-g-夾ayrpo3526dja0997fuugujggula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caacggcatcqgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm04308fcaacggqcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm05309fcaacggcqatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm04a310fcaacggqcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm05a311fcaacggcqatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm07312fcaalgqgcatlgaggtlgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5_me_dcaykat315ncm08313faacggcqatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm09314fcaccaaqcggcatcgaggtcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm10315fcaccaaqcggcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm11316flaalgqglatlgaggtlgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm12317faalgglqatlgaggtlgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5_me_dcaykat315ncm13318flallaaqlgglatlgaggtlpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5_me_dcaykat315ncm14319flallaaqlgglatlgaggtlgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5_me_dcaykat315ncm15320flaalgqglatlgaggtlgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5-丙炔基dcaykat315ncm16321faalgglqatlgaggtlgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5-丙炔基dcaykat315ncm17322flallaaqlgglatlgaggtlpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5-丙炔基dcaykat315ncm18323flallaaqlgglatlgaggtlgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5-丙炔基dcaykat315ncm19324fcaacqggcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm20325fccaacgqgcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm21326fccaacqggcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm22327faccaacqggcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315ncm23328faccaaqcggcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2rm315n2b434fcaajqgcaucgaggucguapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾::u-5-丙炔基dukatg315tagc/acc寡聚物名稱seqidno:序列修飾aykat315tcm01329fcaccacqcggcatcgaggtcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2aykat315tcm02330fcaccajqcggcatcgaggtcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcm03331fcajcggqcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcm04332fcajcggqcatcgaggtcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcm05333fcaccajqcggcatcgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcm05a334fcaccaqjcggcatcgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcm05b335fcaccajcgqgcatcgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcm05c336fcaccajcggcqatcgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcy05b1337fcaccajcgqgcatcgapf-cy5.5::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcy05b2338fcaccajcggcqatcgapf-cy5.5::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcy05b3339fcaccajcggcatqcgapf-cy5.5::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315tcy05b4340fcaccajcggcatcgaqf-cy5.5::q-bhq-2::j-g-夾katg315t2agc/aca寡聚物名稱seqidno:序列修飾aykat315t2cm01341fcaccaqjaggcatcgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315t2cm02342fcaccajagqgcatcgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾aykat315t2cm03343fcaccajaggcqatcgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾rm315t2435faccacaqggcatcgaggtcgtapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2inha探針設(shè)計(jì)inha-15tc->t寡聚物名稱seqidno:序列修飾ayinha15tcm01344fgcgagaqtgataggttgtcggpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm02345fgagatgqataggttgtcggggtgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm03346fglgagaqugauagguugulggpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5-丙炔基dc::u-5-丙炔基duayinha15tcm04347fagatgaqtaggttgtcggggtgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm05348fagaugaquagguugulggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::l-5-丙炔基dc::u-5-丙炔基duayinha15tcm06349fgatgatqaggttgtcggggtgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm04a350fagatgataqggttgtcggggtgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm04b351fagatgataggqttgtcggggtgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm04c352fagatqgataggttgtcggggtgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm04d353fagatqgataggttgtcggggtgapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha15tcm07354fagaugaquagguugucggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha15tcm08355fgaugaquagguugucggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha15tcm09356faugaquagguugucggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha15tcm09a357faugauqagguugucggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha15tcm09b358fatgauqagguugucggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha15tcm06a359fgaugauqagguugucggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha15tcm06b360fgatgaquagguugucggggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基dujfinha15tcm06a_1361fgaugauqagguugucgjggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha15tcm06a_2362fgaugauqagguugucggjgugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha15tcm06b_1363fgatgaquagguugucgjggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha15tcm06b_2364fgatgaquagguugucggjgugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfyinha15tcm09a_1365faugauqagguugucgjggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha15tcm09a_1366faugauqagguugucggjgugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha15tcm09b_1367fatgauqagguugucgjggugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha15tcm09b_2368fatgauqagguugucggjgugapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgayinhar15tcm01369fctatcaqtctcgccgcggcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar15tcm02370fctatcaqtctcgccgcggccpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar15tcm03371fctatcaqtctcgccgcggccgpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar15tcm04372ftatcatqctcgccgcggccpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2inha-8at->a寡聚物名稱seqidno:序列修飾ayinha8acm01373ftaggatqgtcggggtgactgccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm02374ftaggatqgtcggggtgactgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm03375fgataggqatgtcggggtgactgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm04376fuaggauqgulggggugalupf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha8acm05377ftaggaqtgtcggggtgactgccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm06378ftaggatgtqcggggtgactgccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm07379ftaggatgtcgqgggtgactgccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm08380ftaggqatgtcggggtgactgccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm08a381fuaggqaugucggggugacugccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinha8acm08b382fuaggqaugulggggugalugllapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinhar8acm01383fcgacatqcctatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm02384fgacatcqctatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm03385facatccqtatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm04386fcatcctqatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm05387fcgacatqcctatcgtctcgccpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm02a388fgacatcqctatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm02b389fgacatccqtatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm02c390fgacatcctaqtcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm02d391fgacatqcctatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8acm02e392fgacatcqcuaucgucucgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinhar8acm02f393fgacatccquaucgucucgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinhar8acm02g394fgacatccuaqucgucucgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基duayinhar8acm02h395fgacatqccuaucgucucgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基dujfinha8acm08a_1396fuaggqaugucgjggugacugccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha8acm08a_2397fuaggqaugucggjgugacugccapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dgjfinha8acm08b_1398fuaggqaugulgjggugalugllapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dg::l-5_me_dcjfinha8acm08b_2399fuaggqaugulggjgugalugllapf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du::j-7_dz_dg::l-5_me_dcinha-8ct->c寡聚物名稱seqidno:序列修飾ayinha8acm01400ftaggctqgtcggggtgactgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinha8acm02401ftaggjtqgtcggggtgactgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayinha8acm03402fgataggqjtgtcggggtgactgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayinha8acm04403fataggjqtgtcggggtgactgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayinha8acm05404faggjtgqtcggggtgactgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::j-g-夾ayinhar8ccm01405fcgacagqcctatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8ccm02406fgacagcqctatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8ccm03407facagccqtatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8ccm04408fcagcctqatcgtctcgccgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2ayinhar8ccm05409fcgacagqcctatcgtctcgccpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2rminha8c4bb436facagcqcuaucgucucgcpf-threo-coum343::p-磷酸::q-bhq-2::u-5-丙炔基du在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了上述多組rpob、inha和katg引物和探針，從而提供在疑似含有mtb-rif和/或mtb-inh的生物樣品中的mtb-rif和/或mtb-inh的檢測(cè)。這些引物和探針的組可包括特異于rpob、inha和katg核酸序列的引物和探針，或由其組成，其包括seqidno:1-409和434-438的核酸序列，或由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)rpob、inha和katg靶標(biāo)的引物和探針包括seqidno:1-409和434-438的引物中任一者的功能活性變體，或由其組成。seqidno:1-409和434-438的探針中任一者的功能活性變體可通過使用所公開方法中的探針識(shí)別。seqidno:1-409和434-438中任一者的探針的功能活性變體屬于這樣的引物，相比seqidno:1-409和434-438的各自的序列，其在本文所述方法或試劑盒中提供相似或更高的特異性和靈敏度。所述變體可例如通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸添加、缺失或取代而不同于與seqidno:1-409和434-438的序列，如在seqidno:1-409和434-438的各自的序列的5'端和/或3'端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸添加、缺失或取代。如上文詳述的，引物(和/或探針)可以經(jīng)化學(xué)修飾，即，引物和/或探針可包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。這樣，探針(或引物)即為經(jīng)修飾的寡核苷酸?！敖?jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)通過一些修飾而不同于天然“核苷酸”，但仍然由堿基或堿基樣化合物、戊呋喃糖或戊呋喃糖樣化合物、磷酸部分或磷酸樣部分或其組合組成。例如，可以將“標(biāo)記”連接到“核苷酸”的堿基部分，從而得到“經(jīng)修飾的核苷酸”。同樣地，還可以用，例如，7-脫氮嘌呤替換“核苷酸”中的天然堿基，從而得到“經(jīng)修飾的核苷酸”。術(shù)語“經(jīng)修飾的核苷酸”或“核苷酸類似物”在本申請(qǐng)中可互換使用?！敖?jīng)修飾的核苷”(或“核苷類似物”)以如上文對(duì)于“經(jīng)修飾的核苷酸”(或“核苷酸類似物”)所概括的方式，通過一些修飾而不同于天然核苷?？梢允褂美缬?jì)算機(jī)程序如oligo(molecularbiologyinsightsinc.,cascade,colo.)設(shè)計(jì)包括經(jīng)修飾的寡核苷酸和寡核苷酸類似物在內(nèi)的寡核苷酸，其擴(kuò)增編碼rpob、inha和katg核酸序列的核酸分子，例如，編碼rpob、inha和katg的替代部分的核酸。在設(shè)計(jì)待用作擴(kuò)增引物的寡核苷酸時(shí)的重要特征包括但不限于適當(dāng)大小的擴(kuò)增產(chǎn)物以方便檢測(cè)(例如，通過電泳)、引物對(duì)的成員的相似的解鏈溫度、以及每個(gè)引物的長度(即，引物需要足夠長，以序列特異性地退火并啟動(dòng)合成，但又不過長使得在寡核苷酸合成過程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的長度為8至50、特別是10至40或12至40個(gè)核苷酸(例如，長度為8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50個(gè)核苷酸)。除了引物組，所公開的方法可使用一種或多種探針以檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的存在與否。術(shù)語“探針”是指合成或生物產(chǎn)生的核酸(dna或rna)，其經(jīng)過設(shè)計(jì)或選擇而含有特定的核苷酸序列，以允許其在明確的預(yù)定嚴(yán)格性下與“靶核酸”特異性地(即，優(yōu)先地)雜交，在本發(fā)明的情況下，與mtb-rif和/或mtb-inh(靶標(biāo))核酸特異性地雜交。“探針”可被稱為“檢測(cè)探針”，意味著其檢測(cè)靶核酸。在一些實(shí)施方案中，所述rpob、inha和katg探針可以用至少一種熒光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述rpob、inha和katg探針可以用供體熒光部分(例如，熒光染料)和對(duì)應(yīng)的受體熒光部分(例如，猝滅劑)來標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述探針包含熒光部分和所述核酸序列或由其組成，所述核酸序列包含seqidno:1-409和434-438，或由其組成。待用作雜交探針的寡核苷酸的設(shè)計(jì)可以與設(shè)計(jì)引物類似的方式進(jìn)行。實(shí)施方案可使用單一探針或探針對(duì)以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。取決于實(shí)施方案，所用探針可包含至少一個(gè)標(biāo)記和/或至少一個(gè)猝滅劑部分。如引物一樣，探針通常具有相似的解鏈溫度，并且每個(gè)探針的長度必須足以使序列特異性雜交發(fā)生，但又不過長使得在合成過程中保真度降低。寡核苷酸探針通常具有40個(gè)或更少的核苷酸，并且特別是在12至40、15至40以及15至30(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)個(gè)核苷酸之間的長度。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)美國專利no.4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公開了常規(guī)的pcr技術(shù)。pcr通常采用兩種寡核苷酸引物，其結(jié)合所選的核酸模板(例如，dna或rna)?？捎糜谝恍?shí)施方案中的引物包括能夠充所述rpob、inha和katg核酸序列內(nèi)的核酸合成起始點(diǎn)的寡核苷酸。引物可通過常規(guī)方法從限制性酶切產(chǎn)物中純化，或其可以經(jīng)合成產(chǎn)生。就最大擴(kuò)增效率而言，引物優(yōu)選地為單鏈的，但引物也可以是雙鏈的。雙鏈引物首先經(jīng)過變性，即，處理以使鏈分離。使雙鏈核酸變性的一種方法是通過加熱。如果模板核酸是雙鏈的，那么有必要在其可被用作pcr中的模板之前，將兩條鏈分離。鏈的分離可以通過任何合適的變性方法(包括物理、化學(xué)或酶促方式)而實(shí)現(xiàn)。分離核酸鏈的一種方法涉及加熱核酸直到其大部分變性(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%變性)。使模板核酸變性所必要的加熱條件將取決于，例如，緩沖液的鹽濃度以及待變性的核酸的長度和核苷酸組成，但通常在約90℃至約105℃的范圍內(nèi)進(jìn)行一段時(shí)間，而時(shí)間取決于反應(yīng)的特征(如溫度和核酸長度)。變性通常進(jìn)行約30秒至4分鐘(例如，1分鐘至2分30秒，或1.5分鐘)。如果通過加熱使雙鏈模板核酸變性，則允許反應(yīng)混合物冷卻至促進(jìn)每個(gè)引物退火至所述rpob、inha和katg核酸分子上的其靶序列的溫度。退火溫度通常為約35℃至約65℃(例如，約40℃至約60℃；約45℃至約50℃)。退火時(shí)間可以為約10秒至約1分鐘(例如，約20秒至約50秒；約30秒至約40秒)。然后，調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物至促進(jìn)或優(yōu)化聚合酶活性的溫度，即，足以發(fā)生從退火引物的延伸以生成與模板核酸互補(bǔ)的產(chǎn)物的溫度。該溫度應(yīng)當(dāng)足以從每個(gè)退火至核酸模板的引物合成延伸產(chǎn)物，但不應(yīng)當(dāng)過高而使延伸產(chǎn)物從其互補(bǔ)模板變性，例如，用于延伸的溫度通常在約40℃至約80℃的范圍內(nèi)(例如，約50℃至約70℃；約60℃)。延伸時(shí)間可以為約10秒至約5分鐘(例如，約30秒至約4分鐘；約1分鐘至約3分鐘；約1分30秒至約2分鐘)。pcr測(cè)定可采用mtb-rif和/或mtb-inh核酸如rna或dna(cdna)。模板核酸不需要經(jīng)過純化；其可以是復(fù)雜混合物的一小部分，如包含在人類細(xì)胞中的mtb-rif和/或mtb-inh核酸。mtb-rif和/或mtb-inh核酸分子可以通過如那些在diagnosticmolecularmicrobiology:principlesandapplications(persing等人(編撰),1993,americansocietyformicrobiology,washingtond.c.)中所述的常規(guī)技術(shù)從生物樣品中提取。核酸可得自多種來源，如質(zhì)?；蛱烊粊碓?包括細(xì)菌、酵母、病毒、細(xì)胞器)或高等生物(如植物或動(dòng)物)。在誘導(dǎo)引物延伸的反應(yīng)條件下，將寡核苷酸引物與pcr試劑組合。例如，鏈?zhǔn)窖由旆磻?yīng)一般包含50mmkcl、10mmtris-hcl(ph8.3)、15mmmgcl2、0.001%(w/v)明膠、0.5-1.0μg變性的模板dna、50皮摩爾的每種寡核苷酸引物、2.5utaq聚合酶和10%dmso。反應(yīng)通常含有各150至320μm的datp、dctp、dttp、dgtp或其一種或多種類似物。新合成的鏈形成雙鏈分子，其可被用于反應(yīng)的后續(xù)步驟中。鏈分離、退火和延伸的步驟可根據(jù)需要的頻次重復(fù)，以產(chǎn)生所需數(shù)量的對(duì)應(yīng)于靶標(biāo)mtb-rif和/或mtb-inh核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)的限制因素是存在于反應(yīng)中的引物、熱穩(wěn)定酶和三磷酸核苷的量。優(yōu)選地，將循環(huán)步驟(即，變性、退火和延伸)重復(fù)至少一次。就檢測(cè)用途而言，循環(huán)步驟的次數(shù)將取決于，例如，樣品的性質(zhì)。如果樣品是核酸的復(fù)雜混合物，則將需要更多的循環(huán)步驟以擴(kuò)增足以用于檢測(cè)的靶序列。通常，循環(huán)步驟重復(fù)至少約20次，但也可能重復(fù)多達(dá)40、60或甚至100次。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)fret技術(shù)(參見，例如，美國專利no.4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)是基于這樣的概念：當(dāng)供體熒光部分和對(duì)應(yīng)的受體熒光部分被置于彼此一定距離之內(nèi)時(shí)，兩個(gè)熒光部分之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，其可以被目測(cè)或檢測(cè)和/或定量。當(dāng)供體經(jīng)適當(dāng)波長的光輻射激發(fā)時(shí)，供體通常向受體轉(zhuǎn)移能量。受體通常將轉(zhuǎn)移來的能量以不同波長的光輻射的形式重新發(fā)射出去。在一個(gè)實(shí)例中，寡核苷酸探針可含有供體熒光部分和對(duì)應(yīng)的猝滅劑，所述猝滅劑可以是或不是熒光的，并且其將轉(zhuǎn)移來的能量以光以外的形式耗散掉。當(dāng)探針完整時(shí)，能量轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在兩個(gè)熒光部分之間，這樣使得來自供體熒光部分的熒光發(fā)射被猝滅。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的延伸步驟期間，結(jié)合至擴(kuò)增產(chǎn)物的探針通過例如，taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性被裂解，這樣使得供體熒光部分的熒光發(fā)射不再被淬滅。用于此目的的示例性探針描述在，例如美國專利號(hào)5,210,015、5,994,056和6,171,785。常用的供體-受體對(duì)包括fam-tamra對(duì)。常用的猝滅劑為dabcyl和tamra。常用的暗猝滅劑包括blackholequenchers?(bhq)(biosearchtechnologies,inc.,novato,cal.)、iowablack?(integrateddnatech.,inc.,coralville,iowa)、blackberry?quencher650(bbq-650)(berry&assoc.,dexter,mich.)。在另一個(gè)實(shí)例中，兩個(gè)寡核苷酸探針(其各自含有熒光部分)可以在由所述寡核苷酸探針與所述mtb-rif和/或mtb-inh靶核酸序列的互補(bǔ)性決定的特定位置雜交至擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)所述寡核苷酸探針在適當(dāng)?shù)奈恢秒s交至所述擴(kuò)增產(chǎn)物核酸后，生成fret信號(hào)。雜交溫度可以在約35℃至約65℃的范圍，持續(xù)約10秒至約1分鐘。可以使用，例如，光子計(jì)數(shù)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)(包含用于在特定范圍監(jiān)測(cè)熒光發(fā)射的合適的分色鏡與濾光器)、光子計(jì)數(shù)光電倍增管系統(tǒng)或熒光計(jì)來進(jìn)行熒光分析?？墒褂脷咫x子激光器、高強(qiáng)度汞(hg)弧燈、光纖光源或針對(duì)在所需范圍內(nèi)的激發(fā)經(jīng)適當(dāng)過濾的其它高強(qiáng)度光源來進(jìn)行激發(fā)以引發(fā)能量轉(zhuǎn)移。如本文中所用，關(guān)于供體和對(duì)應(yīng)的受體熒光部分，“對(duì)應(yīng)的”是指受體熒光部分具有與供體熒光部分的激發(fā)光譜重疊的發(fā)射光譜。受體熒光部分發(fā)射光譜的最大波長應(yīng)當(dāng)比供體熒光部分激發(fā)光譜的最大波長大至少100nm。因此，它們之間可以產(chǎn)生有效的非輻射能量轉(zhuǎn)移。對(duì)熒光供體和對(duì)應(yīng)的受體部分的選擇通常是根據(jù)(a)高效率的forster能量轉(zhuǎn)移；(b)大的最終stokes位移(>100nm)；(c)向可見光譜紅區(qū)(>600nm)盡可能遠(yuǎn)的發(fā)射位移；以及(d)發(fā)射位移至比通過供體激發(fā)波長激發(fā)所產(chǎn)生的raman水熒光發(fā)射更高的波長。例如，可選擇那些具有以下的供體熒光部分：其最大激發(fā)在激光譜線附近(例如，氦-鎘442nm或氬488nm)、高消光系數(shù)、高量子產(chǎn)率以及其熒光發(fā)射與對(duì)應(yīng)的受體熒光部分的激發(fā)光譜的良好重疊?？蛇x擇那些具有以下的對(duì)應(yīng)的受體熒光部分：高消光系數(shù)、高量子產(chǎn)率、其激發(fā)與供體熒光部分的發(fā)射的良好重疊，以及發(fā)射位于可見光譜的紅區(qū)(>600nm)?？稍趂ret技術(shù)中與各種受體熒光部分一起使用的代表性的供體熒光部分包括熒光素、熒光黃、b-藻紅蛋白、9-異硫氰酸吖啶酯、熒光黃vs、4-乙酰氨基-4'-異硫氰酰二苯乙烯-2,2'-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4'-異硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亞胺酯以及4-乙酰氨基-4'-異硫氰酰二苯乙烯-2,2'-二磺酸的衍生物。取決于所用供體熒光部分，代表性的受體熒光部分包括lcred640、lcred705、cy5、cy5.5、麗絲胺羅丹明b磺酰氯、四甲基異硫氰酸羅丹明、異硫氰酸羅丹明x、異硫氰酸赤蘚紅、熒光素、二亞乙基三胺五乙酸酯或其它鑭系元素離子(例如，銪或鋱)的螯合物。供體和受體熒光部分可得自，例如，molecularprobes(junctioncity,oreg.)或sigmachemicalco.(st.louis,mo.)?？赏ㄟ^連接臂將供體和受體熒光部分連接至合適的探針寡核苷酸。每個(gè)連接臂的長度很重要，因?yàn)檫B接臂將影響供體和受體熒光部分之間的距離。連接臂的長度為從核苷酸堿基到熒光部分的距離(以埃(?)計(jì))。一般來講，連接臂為約10?至約25?。連接臂可能是wo84/03285中所述的那種。wo84/03285還公開了用于將連接臂連接至特定核苷酸堿基，以及還用于將熒光部分連接至連接臂的方法?？蓪⑹荏w熒光部分(如lcred640)與含有氨基接頭(例如，c6-氨基亞磷酰胺，可得自abi(fostercity,calif.)或glenresearch(sterling,va.))的寡核苷酸組合以產(chǎn)生，例如，lcred640標(biāo)記的寡核苷酸。經(jīng)常用于將供體熒光部分(如熒光素)偶聯(lián)至寡核苷酸的接頭包括硫脲接頭(衍生自fitc的，例如，來自glenresearch或chemgene(ashland,mass.)的熒光素-cpg's)、酰胺接頭(衍生自熒光素-nhs-酯的，如來自biogenex(sanramon,calif.)的cx-熒光素-cpg)或需要在寡核苷酸合成后偶聯(lián)熒光素-nhs-酯的3'-氨基-cpg。mtb-rif和/或mtb-inh的檢測(cè)本公開提供了用于檢測(cè)生物或非生物樣品中是否存在mtb-rif和/或mtb-inh的方法。本文所提供的方法避免了樣品污染、假陰性和假陽性的問題。所述方法包括進(jìn)行至少一個(gè)循環(huán)步驟和fret檢測(cè)步驟，所述循環(huán)步驟包括使用多對(duì)rpob、inha和katg引物從樣品中擴(kuò)增rpob、inha和katg靶核酸分子的一部分。優(yōu)選地，在熱循環(huán)儀中進(jìn)行多個(gè)循環(huán)步驟。本文所述的方法可以使用rpob、inha和katg引物和探針進(jìn)行以檢測(cè)rpob、inha和katg靶標(biāo)的存在，并且檢測(cè)到rpob、inha和katg靶標(biāo)中的所述snp表明樣品中存在mtb-rif和/或mtb-inh。如本文中所述，可使用利用fret技術(shù)的經(jīng)標(biāo)記的雜交探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。一種fret方式使用taqman?技術(shù)以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否，并由此檢測(cè)靶核酸的存在與否。taqman?技術(shù)利用一種經(jīng)例如一種熒光染料和一種猝滅劑標(biāo)記的單鏈雜交探針，所述猝滅劑可以是或不是熒光的。當(dāng)?shù)谝粺晒獠糠钟珊线m波長的光激發(fā)時(shí)，所吸收的能量根據(jù)fret原理被轉(zhuǎn)移至第二熒光部分。第二熒光部分通常為猝滅劑分子。在pcr反應(yīng)的退火步驟期間，經(jīng)標(biāo)記的雜交探針結(jié)合至靶dna(即，擴(kuò)增產(chǎn)物)并在后續(xù)的延伸階段通過例如taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性被降解。因此，熒光部分和淬滅劑部分在空間上變得彼此分離。作為結(jié)果，當(dāng)猝滅劑不存在時(shí)激發(fā)第一熒光部分后，則可以檢測(cè)到來自第一熒光部分的熒光發(fā)射。舉例來說，abiprism?7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(appliedbiosystems)使用taqman?技術(shù)，并且適用于實(shí)施本文中所述的用于檢測(cè)樣品中靶核酸存在與否的方法。一般來講，存在fret表明樣品中存在mtb-rif和/或mtb-inh，而不存在fret則表明樣品中不存在mtb-rif和/或mtb-inh。然而，標(biāo)本采集不足、運(yùn)輸延誤、不恰當(dāng)?shù)倪\(yùn)輸條件或使用某些采集拭子(藻酸鈣或鋁軸(aluminumshaft))均是可以影響測(cè)試結(jié)果的成功和/或準(zhǔn)確度的條件。使用本文所公開的方法，在例如，45個(gè)循環(huán)步驟之內(nèi)檢測(cè)到fret表明存在mtb-rif和/或mtb-inh感染。可以使用的代表性的生物樣品包括但不限于皮膚拭子、鼻腔拭子、傷口拭子、血液培養(yǎng)物、皮膚和軟組織感染。生物樣品的采集和保存方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。生物樣品可經(jīng)過處理(例如，通過本領(lǐng)域已知的核酸提取方法和/或試劑盒)以釋放mtb-rif和/或mtb-inh核酸，或在一些情況下，生物樣品可以與pcr反應(yīng)組分以及合適的寡核苷酸直接接觸。在熱循環(huán)儀的每次運(yùn)行中，對(duì)照樣品也可以被循環(huán)。使用例如，對(duì)照引物和對(duì)照探針，陽性對(duì)照樣品可以擴(kuò)增靶核酸對(duì)照模板(而不是所述靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物)。陽性對(duì)照樣品還可以擴(kuò)增，例如，含有靶核酸分子的質(zhì)粒構(gòu)建體。可以使用與用于檢測(cè)所期望靶標(biāo)相同的引物和探針，對(duì)此類質(zhì)粒對(duì)照進(jìn)行內(nèi)部擴(kuò)增(例如，在樣品內(nèi))或在單獨(dú)的樣品中與患者樣品并排運(yùn)行。此類對(duì)照是擴(kuò)增、雜交和/或fret反應(yīng)成功與否的指標(biāo)。熱循環(huán)儀的每次運(yùn)行還可以包含陰性對(duì)照，例如，其缺乏靶模板dna。陰性對(duì)照可以測(cè)量污染。這確保了系統(tǒng)和試劑將不會(huì)產(chǎn)生假陽性信號(hào)。因此，對(duì)照反應(yīng)可容易地確定，例如，引物序列特異性地退火和啟動(dòng)延伸的能力以及探針序列特異性地雜交和進(jìn)行fret的能力。在實(shí)施方案中，所述方法包括避免污染的步驟。例如，在美國專利no.5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了使用尿嘧啶dna糖苷酶的酶促方法以減少或消除熱循環(huán)儀的一次運(yùn)行與下一次之間的污染?？梢允褂媒Y(jié)合了fret技術(shù)的常規(guī)pcr方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了lightcycler?儀器。下列專利申請(qǐng)描述了如lightcycler?技術(shù)中所用到的實(shí)時(shí)pcr：wo97/46707、wo97/46714和wo97/46712。lightcycler?可以使用pc工作站進(jìn)行操作并且可以使用windowsnt操作系統(tǒng)。機(jī)器將毛細(xì)管依次置于光學(xué)元件上方而獲取來自樣品的信號(hào)。軟件可以在每次測(cè)量后立刻實(shí)時(shí)顯示熒光信號(hào)。熒光采集時(shí)間為10-100毫秒(msec)。在每個(gè)循環(huán)步驟之后，可持續(xù)更新所有樣品相對(duì)于循環(huán)次數(shù)的熒光定量顯示。生成的數(shù)據(jù)可以被保存用于進(jìn)一步分析。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實(shí)施方案不受限于一種或多種市售儀器的配置。制品/試劑盒本公開的實(shí)施方案還提供了用以檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的制品或試劑盒。制品可包括用于檢測(cè)rpob、inha和katg的引物和探針，連同合適的包裝材料。用于檢測(cè)mtb-rif和/或mtb-inh的代表性的引物和探針能夠雜交至rpob、inha和katg靶核酸分子。此外，試劑盒還可包括dna固定、雜交和檢測(cè)所需的適當(dāng)包裝的試劑和材料，如固相支持物、緩沖液、酶和dna標(biāo)準(zhǔn)品。本文中公開了設(shè)計(jì)引物和探針的方法，并提供了擴(kuò)增和雜交rpob、inha和katg靶核酸分子的引物和探針的代表性的實(shí)例。制品還可以包括用于標(biāo)記探針的一種或多種熒光部分，或者可選地，試劑盒所提供的探針可以是經(jīng)標(biāo)記的。例如，制品可包括用于標(biāo)記rpob、inha和katg探針的供體和/或受體熒光部分。上文提供了合適的fret供體熒光部分和對(duì)應(yīng)的受體熒光部分的實(shí)例。制品還可以包括藥品說明書或藥品標(biāo)記，其上具有關(guān)于使用rpob、inha和katg引物和探針以檢測(cè)樣品中的mtb-rif和/或mtb-inh的說明。制品可額外包括用于實(shí)施本文所公開方法的試劑(例如，緩沖液、聚合酶、輔助因子或防止污染的試劑)。此類試劑可專用于本文所述的市售儀器之一。將在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述本公開的實(shí)施方案，其不限制權(quán)利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例使用示例性rpob、inha和katg探針檢測(cè)特定的snp檢查了示例性探針檢測(cè)以下的能力：rbob基因中賦予mtb對(duì)利福平的抗性的17種snp，包括：rpob531l、rpob531w、rpob526l、rpob526y、rpob526d、rpob526n、rpob513l、rpob513k、rpob513p、rpob522l、rpob522q、rpob522w、rpob516v、rpob516y、rpob533p、rpob511p和rpob526r；inha基因中賦予mtb對(duì)異煙肼的抗性的3種snp，包括：inha-15t、inha-8a和inha-8c；以及katg基因中也賦予mtb對(duì)異煙肼的抗性的4種snp，包括：katg315i、katg315n、katg315t和katg315t2。使用了包含各自核酸(每一種代表了一種、兩種或三種snp)的各種質(zhì)粒。在本文中，在每個(gè)孔中，包含緩沖液、zo5dna聚合酶、三磷酸核苷、能夠擴(kuò)增rpob、inha和katg靶標(biāo)區(qū)域的引物對(duì)以及表ii中所示的示例性探針的主混合物(mmx)摻雜了一種類型的質(zhì)粒dna(每一種包含如表ii中所展示的一種、兩種或三種特定snp)。包含16s序列的質(zhì)粒被用作陽性對(duì)照，使用16s特異性引物對(duì)和探針。隨后，將多孔板加載到cobas?6800系統(tǒng)(rochemolecularsystems)上并進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)反應(yīng)。結(jié)果在表2中給出。表ii：rpob、inha和katg的示例性探針的結(jié)果雖然出于清楚和理解的目的較為詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是通過閱讀本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，可在形式和細(xì)節(jié)上做出各種變化而不脫離本發(fā)明的真實(shí)范圍。例如，上述所有技術(shù)和裝置可以各種組合使用。序列表<110>rochediagnosticsgmbhf.hoffmann-larocheagrochemolecularsystems,inc.<120>用于檢測(cè)耐藥性結(jié)核分枝桿菌的組合物和方法<130>p32319-wo-hs<150>us14/575879<151>2014-12-18<160>438<170>patentinversion3.5<210>1<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l09<400>1gttggcgctggggc14<210>2<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l18<400>2actgttggcgctggg15<210>3<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l19<400>3ctgttggcgcuggg14<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l18b<400>4actgttggcgcuggg15<210>5<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l18c<400>5ctgtuggcgcuggg14<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l1b<400>6ctgttggcgctggggc16<210>7<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l20<400>7acugttggcgcugg14<210>8<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l20<400>8ccgactgttggcgcu15<210>9<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l22<400>9ctgttggcgcuggg14<210>10<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l24<400>10cuguuggcgctggggc16<210>11<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l25<400>11cuguuggcgctgggg15<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3sp531l26<400>12uguuggcgctggggccc17<210>13<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l20b<400>13acuguuggcgcugg14<210>14<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l20c<400>14acuguuggcgcugg14<210>15<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l20d<400>15acugutggcgcugg14<210>16<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l25b<400>16cuguuggcgcuggg14<210>17<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l25c<400>17cuguuggcgcuggc14<210>18<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531l20f<400>18acuguuggcgcugcagc17<210>19<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l20hs<400>19acuguucggcgcugg15<210>20<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l25c2<400>20cuguuggcgcuggc14<210>21<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l20c2<400>21acuguuggcgcugc14<210>22<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l25c3<400>22acuguuggcgcuggc15<210>23<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3s531f1<400>23acuguucgcgcugg14<210>24<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l25b2<400>24cuguuggcgctggg14<210>25<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l31<400>25uguuggcgctgggg14<210>26<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l25b3<400>26cuguuggcgctggg14<210>27<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3531l25b4<400>27cuguuggcgctggc14<210>28<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3f531l<400>28ccaacagtcggcgcttg17<210>29<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3f531l02<400>29ccaacagtcggcgcttgtgggtc23<210>30<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3f531l04<400>30ccaacagtcggcgcttg17<210>31<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3f531l05<400>31ccaacagtcggcgcttg17<210>32<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3f531l06<400>32ccaacagucggcgctug17<210>33<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3ap531l11<400>33ccaacagtcggcgcttg17<210>34<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3ap531l12<400>34ccaacagtcggcgcttg17<210>35<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3ap531l13<400>35ccaacagtcggcgcttg17<210>36<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3ap531l14<400>36ccaacagtcggcgcttg17<210>37<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>組合的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3a531l12b<400>37ccaacagucggcgcttg17<210>38<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3ap531l17<400>38ccaacagtcggcgc14<210>39<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3a531l17b<400>39ccaacagtcggcgc14<210>40<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3a531l19<400>40ccaacagtcggcgct15<210>41<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸<220><223>rmrpo3a531l20<400>41ccaacagtcggcgct15<210>4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