本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基因敲除的斑馬魚突變體，具體涉及il7r基因缺失斑馬魚突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白細(xì)胞介素7受體(interleukin7receptor,il7r)屬于ⅰ型細(xì)胞因子受體家族成員的跨膜受體，由α鏈(il7rα，cd127)和γ鏈(γc，cd132)組成，α鏈?zhǔn)莍l7r的特異性組分；γ鏈?zhǔn)莍l2、il4、il7、il9、il15、il21等細(xì)胞因子受體的共同組分，也被稱為共有γ鏈，是啟動(dòng)il7r下游信號(hào)表達(dá)的必需成分。生理情況下，il7r是淋巴細(xì)胞增殖和分化的必需關(guān)鍵因子；病理情況下，il7r功能缺陷可導(dǎo)致重癥聯(lián)合免疫缺陷病，而il7r獲得性突變可引起急性t淋巴細(xì)胞白血病等。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)/crispr-associatednuclease(cas)，crispr/cas)系統(tǒng)是細(xì)菌或古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過程中形成的抵御外來遺傳物質(zhì)的一種獲得性免疫防御機(jī)制，能夠識(shí)別自身和外源入侵dna片段。crispr/cas系統(tǒng)有3種類型：ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型，其中ii型crispr/cas系統(tǒng)只需要一個(gè)cas9核酸內(nèi)切酶切割dna雙鏈，即crispr/cas9系統(tǒng)。在向?qū)na(singleguide,sgrna)指導(dǎo)下，cas9內(nèi)切酶像剪刀一樣對(duì)特定基因、特定位點(diǎn)進(jìn)行靶向性剪切，形成雙鏈dna缺口，細(xì)胞可以通過同源重組修復(fù)或者非同源性末端連接對(duì)斷裂dna進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的編輯。作為一種新興基因組編輯技術(shù)，crispr/cas9系統(tǒng)具有實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、操作容易和節(jié)省時(shí)間等優(yōu)勢(shì)。利用crispr/cas9技術(shù)在酵母、擬南芥、小鼠、大鼠、果蠅、青蛙等不同物種都成功進(jìn)行了基因定向改造。在斑馬魚研究領(lǐng)域，crispr/cas9系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于精確和靶向性的基因編輯。在單細(xì)胞胚胎階段通過注射sgrna和cas9mrna能夠快速、高效獲得基因敲除斑馬魚突變體，并且可以遺傳給子代，這大大拓展了在斑馬魚中進(jìn)行基因功能缺失的研究。

申請(qǐng)人先在幼魚脫髓鞘模型上以基因芯片進(jìn)行了表達(dá)譜分析，在獲得的差異表達(dá)基因中，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，il7r表達(dá)顯著降低，提示il7r可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有密切關(guān)系。斑馬魚的il7r和人類il7r的相似度為73％，利用il7r基因敲除突變體進(jìn)行研究是一個(gè)有效途徑，然而，目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。申請(qǐng)人認(rèn)為，有必要構(gòu)建il7r基因敲除斑馬魚突變體，并以此為模型對(duì)il7r在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及髓鞘形成中的作用進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種sgrna片段以及使用該sgrna片段構(gòu)建il7r基因缺失斑馬魚突變體的方法。為此，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，在眾多sgrna中篩選出活性最高的一種sgrna并將其用于突變體的構(gòu)建中，從而獲得了穩(wěn)定遺傳的il7r基因缺失斑馬魚突變體。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種sgrna片段，所述sgrna的dna序列如5-’actccactcactccagtcaccgg-3’所示，其中3’端的cgg為pam識(shí)別位點(diǎn)。

本發(fā)明提供了一種基因打靶試劑盒，所述試劑盒包括前面所述的sgrna。使用該試劑盒可以用于il7r基因表達(dá)的沉默。

本發(fā)明提供了一種基因敲除方法，所述方法的步驟如下：利用前面所述的sgrna片段識(shí)別目的基因上的雙鏈上的不同靶位點(diǎn)，與一種核酸酶結(jié)合并通過識(shí)別靶位點(diǎn)處pam序列，引導(dǎo)核酸酶結(jié)合到目的基因靶位點(diǎn)處，并開始進(jìn)行隨機(jī)剪切，隨后從切口處脫落，形成dsb缺口，隨后細(xì)胞通過非同源末端連接修復(fù)機(jī)制修復(fù)目的基因雙鏈，造成移碼突變，最終目的基因被敲除。

進(jìn)一步，所述sgrna片段與核酸酶發(fā)揮作用的數(shù)量為一個(gè)或以上。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種il7r基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，所述制備方法包括：

(1)將前面所述的sgrna和cas9mrna共同導(dǎo)入斑馬魚中；

(2)培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的il7r基因缺失斑馬魚突變體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述sgrna的獲得步驟如下：

(1)確定il7r基因敲除的靶位點(diǎn)；

(2)根據(jù)步驟(1)確定的靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，pcr獲得sgrna的體外轉(zhuǎn)錄的模板；

(3)根據(jù)步驟(2)獲得的模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

作為本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述sgrna的獲得步驟如下：

(1)查詢斑馬魚il7r基因的基因組dna序列及其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)crispr/cas9敲除原理，設(shè)計(jì)一對(duì)il7r基因的靶位點(diǎn)。

(2)pcr法獲得sgrna的體外轉(zhuǎn)錄的模板，正向引物序列為：5’taatacgactcactatagactccactcactccagtcacgttttagagctagaaatagc-3’(前18位堿基序列是t7啟動(dòng)子，19-38位堿基序列是sgrna靶序列，小寫字母表示的堿基序列為sgrna上游骨架)；反向引物序列為25bpsgrna下游骨架，序列為5’-aaaaaaagcaccgactcggtgccac-3’，按照下列pcr條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性95℃3min；變性95℃30s，退火54℃30s，延伸72℃20s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再72℃10min；pcr產(chǎn)物回收純化。

(3)以rna體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(maxiscriptt7，ambion，ca，usa)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述cas9mrna是按照以下步驟獲得的：

以t7驅(qū)動(dòng)的人源化的cas9編碼序列為模板，用t7rna聚合酶進(jìn)行cas9體外轉(zhuǎn)錄(mmessagemmachinet7，ambion)，然后戴帽并加尾(polya)。rna經(jīng)無水乙醇法沉淀，用depc處理過的超純水重懸。

作為本發(fā)明的具體實(shí)施例，sgrna和cas9mrna共同導(dǎo)入斑馬魚中，包括：將sgrna8和cas9mrna混合，sgrna終濃度為50ng/μl、cas9mrna終濃度為250ng/μl，在斑馬魚胚胎1-4細(xì)胞期進(jìn)行顯微注射，注射量為1nl。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的il7r基因缺失斑馬魚突變體，包括：

(1)對(duì)經(jīng)過注射的斑馬魚進(jìn)行基因型鑒定，確定il7r基因敲除的初建者f0；

(2)il7r基因敲除的初建者f0個(gè)體進(jìn)行自交獲得f1；

(3)利用基因型鑒定的方法確定il7r基因敲除的f1；

(4)從f1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到f2代；

(5)鑒定為f2代中il7r基因敲除的純合子即為穩(wěn)定遺傳的il7r基因缺失斑馬魚突變體。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了前面所述的il7r基因缺失斑馬魚突變體在制備研究il7r在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用的材料中的應(yīng)用。

本發(fā)明的il7r基因缺失斑馬魚突變體的構(gòu)建動(dòng)機(jī)在于：在斑馬魚幼魚脫髓鞘模型上以基因芯片進(jìn)行了表達(dá)譜分析，在獲得的差異表達(dá)基因中，發(fā)現(xiàn)il7r基因表達(dá)顯著降低，提示il7r基因可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有密切關(guān)系。因此有必要構(gòu)建il7r基因敲除斑馬魚突變體，并以此為模型對(duì)il7r在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及髓鞘形成的作用進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)研究。

本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明基于il7r基因可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有密切關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建了il7r基因缺失斑馬魚突變體，該突變體為國(guó)內(nèi)外首例。

本發(fā)明的構(gòu)建的il7r基因缺失斑馬魚突變體可穩(wěn)定遺傳，方便對(duì)il7r基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及髓鞘形成的作用進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)研究。

附圖說明

圖1顯示利用westernblot檢測(cè)斑馬魚純合突變體il7r^-/-中il7r蛋白表達(dá)情況；

圖2顯示野生型斑馬魚和斑馬魚突變體中il7r基因序列反向?qū)Ρ葓D；

圖3顯示野生型斑馬魚和斑馬魚突變體中il7r基因靶位點(diǎn)附近序列缺失對(duì)比圖；

圖4是cdna基因芯片熱圖顯示的髓鞘脫失斑馬魚模型的差異表達(dá)基因譜；

圖5顯示利用qrt-pcr檢測(cè)髓鞘脫失斑馬魚模型中髓鞘堿性蛋白mbpmrna的表達(dá)情況；

圖6顯示利用qrt-pcr檢測(cè)髓鞘脫失斑馬魚模型中il7r基因mrna的表達(dá)情況；

圖7顯示利用westernblot檢測(cè)髓鞘脫失斑馬魚模型中il7r蛋白的表達(dá)情況；

圖8顯示斑馬魚純合突變體il7r^-/-鑒定，其中，a：電泳圖、b：測(cè)序圖；

圖9顯示斑馬魚純合突變體il7r^-/-檢測(cè)脫靶效應(yīng)的測(cè)序圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1篩選髓鞘脫失斑馬魚模型差異表達(dá)基因

1、步驟

利用基因芯片(affymetrixgenechipzebgene1.0starray)，對(duì)髓鞘脫失斑馬魚模型(構(gòu)建方法同專利文獻(xiàn)：zl2014101092570)的基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)和分析。差異表達(dá)基因判定標(biāo)準(zhǔn)為：≥2倍為上調(diào)；≤0.5倍為下調(diào)。芯片分析發(fā)現(xiàn)1364個(gè)差異基因，包括271個(gè)上調(diào)基因，1093個(gè)下調(diào)基因(圖4)。在眾多下調(diào)基因中，發(fā)現(xiàn)il7r表達(dá)顯著下調(diào)(foldchange＝0.44，*p＝0.0061888)。以實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qrt-pcr)及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(westernblot，wb)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法為：實(shí)驗(yàn)組為5dpftg(mbp:nfsb-egfp)，以0.2％dmso-5mm甲硝唑(mitronidazole，mtz)處理5天至10dpf；對(duì)照組(control，ctrl)為5dpftg(mbp:nfsb-egfp)，以0.2％dmso處理至10dpf。首先，在5、6、8和10dpf分別提取對(duì)照組及mtz處理組的rna，檢測(cè)了髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，mbp)mrna的表達(dá)，以驗(yàn)證髓鞘脫失。mbp(genbanknm_001271459)引物序列為：正向序列5’-gggcagaaagaagaaggc-3’；，反向序列5’-cgggtggaagagtggtg-3’。結(jié)果顯示，mtz處理組的mbpmrna的表達(dá)水平隨藥物作用延長(zhǎng)而下降，在8dpf和10dpf顯著低于對(duì)照組(圖5；student’sttest,*p<0.05)。第二，以qrt-pcr方法對(duì)5、6、8和10dpfil7rmrna的表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)，il7r(genbanknm_001113507)引物序列為：正向序列，5’-ttacaccaaacatcccaca-3’；反向序列，5’-taggcttcttctttacattc-3’。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mtz處理組il7rmrna表達(dá)量亦隨藥物作用時(shí)間而下降，在8dpf和10dpf顯著低于對(duì)照組(圖6；student’sttest,*p<0.05)。第三，在10dpf提取對(duì)照組和mtz處理組的蛋白，檢測(cè)il7r蛋白的表達(dá)情況。10dpfmtz處理組il7r蛋白的表達(dá)量低于對(duì)照組(圖7)。上述結(jié)果證明，在斑馬魚髓鞘脫失時(shí)，il7r的表達(dá)明顯下調(diào)。

實(shí)施例2sgrna的篩選

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

按標(biāo)準(zhǔn)化方案養(yǎng)殖野生型斑馬魚(tu品系)，水溫28.5℃，光照/黑暗周期為14h/10h，成體斑馬魚產(chǎn)卵后收集胚胎，養(yǎng)殖于e3孵化液，以受精的小時(shí)數(shù)(hourspost-fertilization，hpf)或受精的天數(shù)(dayspost-fertilization，dpf)表示胚胎和幼魚的發(fā)育階段。

2、crispr/cas9基因敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

在http://asia.ensembl.org上查詢斑馬魚il7r基因的基因組dna序列及其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)crispr/cas9敲除原理，在http://crispr.mit.edu/上設(shè)計(jì)一對(duì)il7r基因的靶位點(diǎn)，靶位點(diǎn)包含20個(gè)堿基，靶點(diǎn)的選擇標(biāo)準(zhǔn)為：5’-gg-(n)20-ngg-3’；其中5’端的gg二核苷酸是t7啟動(dòng)子的一部分，靶位點(diǎn)的3’端是ngg(n為任意堿基)。

3、sgrna活性檢測(cè)

3.1步驟

針對(duì)il7r基因外顯子3、4、5和6共設(shè)計(jì)合成了12個(gè)sgrna，兩個(gè)sgrna一組，與cas9mrna進(jìn)行共注射。提取胚胎dna選擇直接測(cè)序法進(jìn)行sgrna活性分析。sgrna序列如表1所示。sgrna體外合成步驟、注射步驟、胚胎dna提取步驟同后面實(shí)施例3中提到的相同。

3.2結(jié)果

結(jié)果如表1所示，第四組(sgrna7和8)的活性最高，為5.9％。測(cè)序結(jié)果表明，可導(dǎo)致4個(gè)堿基缺失突變的是sgrna8。因此，以sgrna8和cas9mrna共注射，制備il7r基因缺失斑馬魚突變體。

表1sgrna序列及活性測(cè)試

實(shí)施例3斑馬魚胚胎的顯微注射及靶位點(diǎn)有效性測(cè)定

1、sgrna體外合成

1.1pcr法獲得sgrna的體外轉(zhuǎn)錄的模板

正向引物序列為：5’-taatacgactcactatagactccactcactccagtcacgttttagagctagaaatagc-3’(前18位堿基序列是t7啟動(dòng)子，19-38位堿基序列是sgrna靶序列，小寫字母表示的堿基序列為sgrna上游骨架)；反向引物序列為25bpsgrna下游骨架，序列為5’-aaaaaaagcaccgactcggtgccac-3’，按照下列pcr條件進(jìn)行擴(kuò)增：預(yù)變性95℃3min；變性95℃30s，退火54℃30s，延伸72℃20s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再72℃10min；

1.2pcr產(chǎn)物回收純化；

1.3以rna體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(maxiscriptt7，ambion，ca，usa)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成特異性sgrna。

2、cas9mrna體外轉(zhuǎn)錄

以t7驅(qū)動(dòng)的人源化的cas9編碼序列為模板，用t7rna聚合酶進(jìn)行cas9體外轉(zhuǎn)錄(mmessagemmachinet7，ambion)，然后戴帽并加尾(polya)。rna經(jīng)無水乙醇法沉淀，用depc處理過的超純水重懸，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3、斑馬魚胚胎的顯微注射及靶位點(diǎn)有效性測(cè)定

將sgrna和cas9mrna混合(sgrna終濃度為50ng/μl、cas9mrna終濃度為250ng/μl)，在斑馬魚胚胎1-4細(xì)胞期進(jìn)行顯微注射，注射量為1nl。注射過的受精卵放置于e3培養(yǎng)液中(5mmol/lnacl，0.17mmol/lkcl，0.33mmol/lcacl2，0.33mmol/lmgso4，ph7.2)，28.5℃條件下孵化。待胚胎發(fā)育至7hpf時(shí)，挑選5枚發(fā)育正常的早期胚胎，用一步法pcr痕量基因型鑒定試劑盒(ysybiotech，china)制備基因組dna模板，以引物對(duì)il7r-exon5f(5’-ggtttgaacaccgtcatgatt-3’)和il7r-exon5r(5’-aagtgggatttgaaacaacga-3’)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃3min；變性95℃30s，退火60℃30s，延伸72℃30s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10min，pcr產(chǎn)物克隆至pgem-teasy載體。以引物對(duì)t7和sp6對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增，將pcr產(chǎn)物送測(cè)序，測(cè)序引物為il7r-exon5f，檢測(cè)靶位點(diǎn)的有效性。

實(shí)施例4il7r基因敲除初建者f0的制備

按照實(shí)施例3的方法對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行顯微注射，60dpf后在il7r基因敲除的f0代中隨機(jī)挑選4尾，用無菌剪剪取尾鰭，體積約1mm³即1μl，制備基因組dna模板，按實(shí)施例3的方法對(duì)f0進(jìn)行鑒定，確定初建者f0。

實(shí)施例5f1突變體篩選

1、步驟

收取初建者f0自交的胚胎獲得f1，將f1按常規(guī)飼養(yǎng)至60dpf以上，選取仔魚，剪取部分尾鰭組織進(jìn)行基因型鑒定，確定此突變是否可以遺傳到fl代。

2、結(jié)果

將斑馬魚突變體的f1代養(yǎng)大至2-3月齡，再分別對(duì)每條fl代斑馬魚進(jìn)行剪尾，篩選fl代突變體。圖2為野生型和缺失型基因序列反向?qū)Ρ葓D，該圖說明在外顯子5處缺失4個(gè)堿基，存在移碼突變。圖3為靶位點(diǎn)附近序列缺失比對(duì)圖，顯示敲除成功，有突變型魚出現(xiàn)。

實(shí)施例6獲得可遺傳的f2代斑馬魚純合突變體il7r^-/-

1、步驟

從f1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到f2代，放置于28.5℃培養(yǎng)，于4dpf取部分胚胎，每個(gè)胚胎單獨(dú)提取基因組dna，再以引物對(duì)il7r-4bpwtf1、il7r-4bpmutf1和il7r-exon5r進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列如下：

il7r-4bpwtf1(鑒定野生型)：5’-aactattttgccggtgac-3’；

il7r-4bpmutf1(鑒定突變體)：5’-aactattttgccggtgga-3’；

il7r-exon5r(共用反向引物)5’-aagtgggatttgaaacaacga-3’；

f2代中，野生型個(gè)體在引物對(duì)il7r-4bpwtf1/il7r-exon5r擴(kuò)增下有條帶，il7r-4bpmutf1/il7r-exon5r擴(kuò)增下無條帶，雜合突變體在引物對(duì)il7r-4bpwtf1/il7r-exon5r和il7r-4bpmutf1/il7r-exon5rr擴(kuò)增下均有條帶，純合突變體在il7r-4bpwtf1/il7r-exon5r擴(kuò)增下無條帶，而在il7r-4bpmutf1/il7r-exon5r擴(kuò)增下有條帶。通過pcr條帶分析將電泳條帶鑒定為純合突變的魚以il7r-exon5f為引物進(jìn)行測(cè)序來做進(jìn)一步鑒定。若測(cè)序峰圖為單一條帶且基因缺失4個(gè)堿基，則確定為純合子。如檢測(cè)結(jié)果證明存在純合子，則養(yǎng)大后再單條剪尾鑒定，檢測(cè)是否存在脫靶效應(yīng)。

針對(duì)前10個(gè)脫靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物如下：

表2針對(duì)前10個(gè)脫靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物

震蕩混勻之后，4℃離心，于pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃3min，其中變性95℃20s，退火60℃20s，延伸72℃20s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再72℃10min；待反應(yīng)結(jié)束后，離心pcr產(chǎn)物，取1μl樣品點(diǎn)樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍攝結(jié)果；將pcr產(chǎn)物割膠回收并進(jìn)行純化送測(cè)序，測(cè)序引物為off-targetnf/r，檢測(cè)其是否存在脫靶。

2、結(jié)果

2.1鑒定斑馬魚突變體f2代純合子il7r^-/-

結(jié)果如圖8所示，1、2、3、4號(hào)魚為純合子，5、7、8號(hào)魚為雜合子，6號(hào)魚為野生型(圖8a)。通過pcr條帶分析將電泳條帶鑒定為純合突變的魚以il7r-exon5f為引物進(jìn)行測(cè)序來做進(jìn)一步鑒定。測(cè)序峰圖為單一條帶且基因缺失4個(gè)堿基，則可以確定為純合子il7r^-/-(圖8b)。將檢驗(yàn)結(jié)果證實(shí)的純合子常規(guī)養(yǎng)殖至成體后再單條剪尾鑒定。

2.2f2突變體純合子檢測(cè)脫靶效應(yīng)

在http://crispr.mit.edu/上面輸入sgrna序列，并選取前10個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物鑒定是否存在脫靶效應(yīng)，圖9表明，在靶位點(diǎn)處突變體與野生型序列一致，且無套峰，說明在此純合突變體il7r^-/-中不存在脫靶效應(yīng)。

實(shí)施例7il7r基因缺失斑馬魚突變體在蛋白水平的鑒定

蛋白印跡

對(duì)f2代il7r^-/-進(jìn)行該基因缺失型斑馬魚純系遺傳，得到f3代il7r^-/-。于4dpf，隨機(jī)取野生型與il7r^-/-突變體斑馬魚各30條，按常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)并定量，進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。所用抗體為：anti-il7r多克隆抗體(1:400,sc-662；santacruzbiotechnologyinc.，tx,usa)。anti-β-actin單克隆抗體(1:3000，sc-47778；santacruzbiotechnologyinc.)為內(nèi)參照。

結(jié)果：以蛋白印跡方法檢測(cè)il7r^-/-中il7r蛋白表達(dá)水平，圖1表明，與野生型相比，純合突變體的il7r無表達(dá)，說明，通過crispr/cas9技術(shù)成功構(gòu)建了il7r缺失型斑馬魚突變體。

雖然以上僅描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式范例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對(duì)這些實(shí)施方式做出多種變更或修改，但這些變更或修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>南開大學(xué)

<120>il7r基因缺失斑馬魚突變體的制備及其應(yīng)用

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<170>patentinversion3.5

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