本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年06月24日、申請(qǐng)?zhí)枮?01210408569.2、發(fā)明名稱為“新的β-肌動(dòng)蛋白和rps21啟動(dòng)子及其應(yīng)用”的發(fā)明分案申請(qǐng)的再分案申請(qǐng)(原申請(qǐng)?zhí)?00480017948.2)。本發(fā)明要求2003年6月24日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)no.60/480，768的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)引作參考而并入此文。生物材料的保藏以下生物材料已經(jīng)保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection,atcc)：本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)基因元件，如啟動(dòng)子及其應(yīng)用，例如，在表達(dá)蛋白中的應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明涉及β-肌動(dòng)蛋白和核糖體蛋白s21基因的啟動(dòng)子。技術(shù)背景每種真核基因含有驅(qū)動(dòng)該基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件。該調(diào)節(jié)元件包括典型地直接位于該基因編碼區(qū)上游的啟動(dòng)子。作為轉(zhuǎn)錄機(jī)制的一部分，啟動(dòng)子通過提供轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子通常被用于在細(xì)胞培養(yǎng)中和體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)。很多啟動(dòng)子是已知的并被用于各種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛋白質(zhì)。啟動(dòng)子的例子包括巨細(xì)胞病毒(cmv)立即早期啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒基因組大基因組長(zhǎng)末端重復(fù)(rsv)、猿病毒40(sv40)啟動(dòng)子、干擾素基因啟動(dòng)子、金屬硫因啟動(dòng)子、和胸腺嘧啶激酶啟動(dòng)子及其它，如fernandez等人(1999)在geneexpressionsystem，academicpress中所描述的。然而，在本領(lǐng)仍需要提供一種可以產(chǎn)生高表達(dá)水平和/或在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持表達(dá)的啟動(dòng)子。β-肌動(dòng)蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，其通常在從原核到真核，包括人的所有物種中表達(dá)。先前描述了人和雞的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。一般而言，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子表現(xiàn)出比廣泛被應(yīng)用的cmv啟動(dòng)子更普遍的活性(xu等(2001)gene272：149-156)。僅僅當(dāng)其被連接到cmv增強(qiáng)子序列時(shí)，雞的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子比病毒cmv和sv40啟動(dòng)子具有更高的活性(xu等，supra)。核糖體蛋白s21(rps21)與核糖體40s亞單位有關(guān)。人的rps21基因的啟動(dòng)子已被鑒別(接收號(hào)no.aj250907)。與大多數(shù)核糖體啟動(dòng)子基因相似，其缺少傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄元件，如tata盒和caat序列(smirnova等(2000)bioorg.khim.26(5):392-396)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種新的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，其與前述公知的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子相比具有低水平的序列同源性(如，人或雞)。本發(fā)明還提供了新的rps21啟動(dòng)子，其與前述公知的rps21啟動(dòng)子相比具有低水平的序列同源性(如，人或小鼠)。本發(fā)明部分基于對(duì)中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho)系來源的β-肌動(dòng)蛋白和rps21啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和分離。本發(fā)明進(jìn)一步部分基于倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子比cmv啟動(dòng)子具有顯著的高活性的觀察。本發(fā)明進(jìn)一步部分基于當(dāng)被用于表達(dá)一定基因時(shí)，rps21啟動(dòng)子至少具有與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子相同的活性的觀察。本發(fā)明提供了這些啟動(dòng)子的核酸序列，并包括具有啟動(dòng)子活性的各種核酸序列的變種。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子來源于嚙齒類，如倉鼠、大鼠和小鼠。典型地rps21啟動(dòng)子來源于倉鼠。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有可操作地連接到異源核酸上的本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白或rps21啟動(dòng)子的載體。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的載體包括可操作地連接到異源核酸上的啟動(dòng)子，該異源核酸編碼異源表達(dá)產(chǎn)物，如治療蛋白質(zhì)或其片段。在示例性實(shí)施例中，表達(dá)產(chǎn)物是酸性鞘磷脂酶(asm)、α-葡萄糖苷酶(gaa)、或組織血漿酶原激活劑(tpa)。本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。在描述性實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如cho、hek和bhk。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法包括，例如，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，該細(xì)胞用含有可操作地連接到編碼蛋白質(zhì)的異源核酸上的本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和/或rps21啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以及回收蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，異源表達(dá)產(chǎn)物是分泌蛋白，其從培養(yǎng)基中被回收。在描述性實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是asm、gaa、或tpa。本發(fā)明還涉及下述實(shí)施方案：1.一種選自seqidnos：1、2、3的核苷酸序列的分離的嚙齒動(dòng)物β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或其具有啟動(dòng)子活性的變種。2.一種seqidno：1中列出的分離的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。3.一種seqidno：2中列出的分離的大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。4.一種seqidno：3中列出的分離的小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子核苷酸序列，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。5.一個(gè)包括seqidno：1中列出的核苷酸序列的分離的核酸，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。6.一個(gè)包括seqidno：2中列出的核苷酸序列的分離的核酸，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。7.一個(gè)載體，其包括seqidno：1中的啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。8.一個(gè)載體，其包括seqidno：2中的啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。9.一個(gè)載體，其包括seqidno：3中的啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。10.根據(jù)實(shí)施方案7-9的任何一項(xiàng)所述的載體，其中啟動(dòng)子被可操作地連接到異源核酸上。11.根據(jù)實(shí)施方案10所述的載體，其中異源核酸編碼治療性蛋白。12.根據(jù)實(shí)施方案11所述的載體，其中治療性蛋白選自酸性鞘磷脂酶、α-葡萄糖苷酶或組織血漿酶原激活劑。13.用實(shí)施方案7-12的任何一項(xiàng)的所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。14.根據(jù)實(shí)施方案13的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞是cho細(xì)胞。15.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括：(a)培養(yǎng)用含有倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或其變種的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該啟動(dòng)子或其變種被可操作地連接到編碼該蛋白質(zhì)的核酸上，和；(b)回收蛋白質(zhì)。16.根據(jù)實(shí)施方案15所述的方法，其中蛋白質(zhì)是抗體。17.根據(jù)實(shí)施方案16所述的方法，其中抗體結(jié)合tgf-β族成員。18.根據(jù)實(shí)施方案15所述的方法，其中蛋白質(zhì)是治療性蛋白。19.根據(jù)實(shí)施方案18所述的方法，其中治療性蛋白選自酸性鞘磷脂酶、α-葡萄糖苷酶或組織血漿酶原激活劑。20.含有實(shí)施方案1-6的任何一項(xiàng)所述的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。21.根據(jù)實(shí)施方案20所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。22.具有seqidno：39的核苷酸序列的分離的rps21啟動(dòng)子，或其具有啟動(dòng)子活性的變種。23.含有seqidno：39的核苷酸序列或其具有啟動(dòng)子活性的變種的載體。24.根據(jù)實(shí)施方案23所述的載體，其中核苷酸序列被可操作地連接到異源核酸上。25.根據(jù)實(shí)施方案24所述的載體，其中異源核酸編碼治療性蛋白。26.根據(jù)實(shí)施方案25所述的載體，其中治療性蛋白是α-葡萄糖苷酶或酸性鞘磷脂酶。27.用實(shí)施方案23-26的任何一項(xiàng)所述的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。28.根據(jù)實(shí)施方案27所述的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞是cho細(xì)胞。29.一種生產(chǎn)蛋白的方法，其包括：(a)培養(yǎng)用含有倉鼠rps21啟動(dòng)子或其變種的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該啟動(dòng)子或其變種被可操作地連接到該編碼蛋白質(zhì)的核酸上，和；(b)回收蛋白質(zhì)。30.根據(jù)實(shí)施方案29所述的方法，其中蛋白是抗體。31.根據(jù)實(shí)施方案29所述的方法，其中蛋白是治療性蛋白。32.根據(jù)實(shí)施方案31所述的方法，其中治療性蛋白是α-葡萄糖苷酶或酸性鞘磷脂酶。33.一種含有實(shí)施方案22所述的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。34.根據(jù)實(shí)施方案33所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。35.一種分離的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，其核苷酸序列作為atcc參考號(hào)pta-5309被保藏，其分類命名為：含有克隆到噬菌粒載體pbluescriptiiks+的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的倉鼠基因組克隆:pblueβ-肌動(dòng)蛋白/avr(hamstergenomicclonecontainingβ-actinpromoterclonedinphagemidvectorpbluescriptiiks+:pblueβ-actin/avr)，保藏單位為美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection,atcc)，保藏日為2003年7月3日。36.一種分離的rps21啟動(dòng)子，其核苷酸序列作為atcc參考號(hào)____被保藏。附圖說明圖1a顯示了倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子部分核苷酸序列(seqidno：1)與大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：2)的比對(duì)，顯示出seqidno：1中的核苷酸487-893與seqidno：2中的核苷酸1-417具有79％的同一性。大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：2)與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：1)的全長(zhǎng)相比具有67％的同一性。圖1b顯示了倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子部分核苷酸序列(seqidno：1)與大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：2)的比對(duì)，顯示出seqidno：1中的核苷酸1047-3006與seqidno：2中的核苷酸546-2493具有83％的同一性。圖2a顯示了倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子部分核苷酸序列(seqidno：1)與小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：3)的比對(duì)，顯示出seqidno：1中的核苷酸33-487與seqidno：3中的核苷酸1-449具有84％的同一性。小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：3)與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：1)的全長(zhǎng)相比具有80％的同一性。圖2b顯示了倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子部分核苷酸序列(seqidno：1)與小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：3)的比對(duì)，顯示出seqidno：1中的核苷酸996-3006與seqidno：1中的核苷酸921-2953具有83％的同一性。圖3顯示了倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子部分核苷酸序列(seqidno：1)與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因(接收號(hào)no.u20114；seqidno：4)的比對(duì)，顯示出seqidno：1中的核苷酸1775-3006與seqidno：4中的核苷酸1-1232具有98％的同一性。倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因序列與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列(seqidno：1)的全長(zhǎng)相比具有40％的同一性。圖4顯示了倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子部分核苷酸序列(seqidno：1)與在先已知的人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(接收號(hào)no.gi28337；seqidno：5)的比對(duì)，顯示出seqidno：1中的核苷酸113-148與seqidno：5中的核苷酸38-73具有94％的同一性，seqidno：1中的核苷酸362-433與seqidno：5中的核苷酸303-374具有83％的同一性，seqidno：1中的核苷酸1728-1764與seqidno：5中的核苷酸1791-1830具有90％的同一性，seqidno：1中的核苷酸1797-1966與seqidno：5中的核苷酸1840-2007具有91％的同一性。倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列(seqidno：5)與人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：1)的全長(zhǎng)相比具有10％的同一性。圖5顯示了倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子核苷酸序列(seqidno：1)與先前已知的雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(接收號(hào)no.gi217043；seqidno：6)的比對(duì)，顯示出seqidno：1中的核苷酸1878-1919與seqidno：6中的核苷酸186-227具有83％的同一性。雞的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列(seqidno：6)與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：1)的全長(zhǎng)相比具有1％的同一性。圖6a描述了cho-k1細(xì)胞中的半乳糖結(jié)合蛋白、鐵蛋白和β-肌動(dòng)蛋白的rna斑點(diǎn)印跡。mrnas分別分離自放射菌素d處理后0、4、8、10和15小時(shí)后的細(xì)胞。圖6b描述了半乳糖結(jié)合蛋白、鐵蛋白和β-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)mrna表達(dá)水平。mrnas分別分離自放射菌素d處理后的cho-k1細(xì)胞10、4、8、10和15小時(shí)后的細(xì)胞。圖7a描述了在cho-k1細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析檢測(cè)下列啟動(dòng)子的相對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度：cmv、人ef-1、倉鼠gapdh、倉鼠rps21_和倉鼠β-肌動(dòng)蛋白。在pdsred-1質(zhì)粒中啟動(dòng)子分別被克隆到紅色熒光蛋白(rfp)基因的上游。用facs檢測(cè)熒光。圖7b描述了在cho-k1細(xì)胞中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分析檢測(cè)中下列啟動(dòng)子的相對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度：cmv、人ef-1、倉鼠gapdh、倉鼠rps21_和倉鼠β-肌動(dòng)蛋白。在pdsred-1質(zhì)粒中分別將啟動(dòng)子被克隆到紅色熒光蛋白(rfp)基因的上游。用facs檢測(cè)平均熒光。圖8a描述了在來源于三個(gè)被含有可操作地連接到cmv啟動(dòng)子或倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上的asmcdna的載體轉(zhuǎn)染的cho-dxb11細(xì)胞池的培養(yǎng)基中酸性鞘磷脂酶(asm)蛋白的表達(dá)。用分析asm酶活性的分析方法分析asm的表達(dá)。圖8b描述了在來源于三個(gè)被含有可操作地連接到cmv啟動(dòng)子或倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上的gaacdna的載體轉(zhuǎn)染的cho-dxb11細(xì)胞池的培養(yǎng)基中α-葡萄糖苷酶(gaa)蛋白的表達(dá)。用分析α-葡萄糖苷酶(gaa)蛋白酶活性的分析方法分析gaa的表達(dá)。圖9描述了在來源于被含有可操作地連接到倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子上的tpacdna的載體轉(zhuǎn)染的cho-dxb11細(xì)胞池的培養(yǎng)基中tpa蛋白的表達(dá)。用elisa方法分析tpa的表達(dá)。具體實(shí)施方式為了更容易地理解本發(fā)明，首先對(duì)術(shù)語進(jìn)行定義。另外的定義在貫穿說明書的詳細(xì)說明中列出。術(shù)語“啟動(dòng)子”指調(diào)節(jié)元件，其指導(dǎo)與其可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以調(diào)節(jié)可操作地連接到其上的核酸的轉(zhuǎn)錄速率和效率。啟動(dòng)子還可以被可操作地連接到其它的調(diào)節(jié)元件上，其可增強(qiáng)(“增強(qiáng)子”)或抑制(“抑制子”)啟動(dòng)子依賴的的核酸轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“可操作地連接”指處于與其它核酸有功能關(guān)系的位置的核酸。啟動(dòng)子通常位于核酸轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5’端(即，上游)。然而，啟動(dòng)子可以包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的3’端(即，下游)。啟動(dòng)子還可以包括可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5’和3’端。術(shù)語“啟動(dòng)子活性”指啟動(dòng)子啟動(dòng)與其可操作連接的核酸轉(zhuǎn)錄的能力?？梢詰?yīng)用本領(lǐng)域公知的或?qū)嵤├忻枋龅姆椒z測(cè)啟動(dòng)子活性。例如，可以通過測(cè)量被轉(zhuǎn)錄的mrna的量測(cè)量啟動(dòng)子的活性，例如，rna印跡或聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)?？晒┻x擇地，可以通過測(cè)量被翻譯的蛋白產(chǎn)物的量測(cè)量啟動(dòng)子的活性，例如，蛋白印跡、elisa、如bradford分析(bradford(1976)anal.biochem.,72:248)的色比色分析和各種活性分析，包括報(bào)告基因分析和其他本領(lǐng)域公知的或?qū)嵤├忻枋龅姆椒?。術(shù)語“載體”指可以攜帶其他核酸的病毒或非病毒、原核或真核、脫氧核糖核酸、核糖核酸或核酸類似物。載體可攜帶核酸進(jìn)入被稱為“宿主細(xì)胞”的細(xì)胞，從而使核酸的全部或部分被轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。可供選擇地，載體可被用于體外轉(zhuǎn)錄分析中。載體通常來源于不同病毒、細(xì)菌或哺乳動(dòng)物基因元件的組合物裝配而成。載體含有各種包括編碼選擇性標(biāo)記(如，抗生素抗性基因)、有助于其在細(xì)菌中增殖的序列、或僅在某些細(xì)胞類型中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的編碼和非編碼序列。例如，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體通常即含有有助于載體在細(xì)菌中增殖的原核序列，又含有僅在真核細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)真核轉(zhuǎn)錄單位。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解載體的設(shè)計(jì)取決于如所選擇的被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等因素。載體包括例如，質(zhì)粒、噬菌粒和病毒載體。對(duì)于已具有啟動(dòng)子的載體，可以使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)對(duì)載體進(jìn)行修飾，從而用任何seqidnos：1、2、3或39或其變種列出的啟動(dòng)子序列取代已存在的啟動(dòng)子序列，。一般而言，合適的載體或者可以選自商售的那些，也可以應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)重組dna技術(shù)構(gòu)建。(見，如molecularcloning:alaboratorymanual:2ndedition,sambrooketal.,1989,coldspringharborlaboratorypress.)術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入核酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法或此處描述的方法將核酸導(dǎo)入植物或動(dòng)物細(xì)胞，或原核或真核細(xì)胞。術(shù)語“分離的”指使用不是自然發(fā)生的方式，從其他核酸序列中分離的脫氧核糖核酸、核糖核酸、或多聚核苷酸的核酸類似物。分離的核酸包括使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)部分或全部化學(xué)地或重組地合成和/或純化的核酸。涉及啟動(dòng)子的術(shù)語“變種”指如果變種具有啟動(dòng)子活性，則與啟動(dòng)子序列全長(zhǎng)或其互補(bǔ)鏈全長(zhǎng)基本上具有同一性的核苷酸序列。只要其長(zhǎng)度至少有1250個(gè)核苷酸β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變種可以與seqidnos：1、2或3的核苷酸序列同樣長(zhǎng)、或短。只要其具啟動(dòng)子活性rps21啟動(dòng)子的變種可以與seqidnos：39的核苷酸序列同樣長(zhǎng)、或短。β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變種可以是自然發(fā)生的，如從除人和雞以外的物種分離的自然發(fā)生的β-肌動(dòng)蛋白，或人工生成的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。當(dāng)被最優(yōu)比對(duì)時(shí)，在seqidno：1序列的核苷酸1-3007的全長(zhǎng)上，seqidno：1列出的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子與其變種之間的同一性至少為45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似地，在seqidno：2列出的序列的核苷酸1-2493的全長(zhǎng)上，seqidno：2的大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子與其變種之間的同一性至少為60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。seqidno：3序列的核苷酸1-2953的全長(zhǎng)上，seqidno：3的小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子與其變種之間的同一性至少為55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。相似地，在seqidno：39列出的序列的核苷酸1-1958的全長(zhǎng)上，seqidno：39的倉鼠rps21啟動(dòng)子與其變種之間在最優(yōu)比對(duì)時(shí)的同一性，至少為40％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變種可以，例如，包括其他物種中的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的同源物(orthologs)，其他物種包括嚙齒動(dòng)物和其他哺乳動(dòng)物，但除外人和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子及其已知的變種。本發(fā)明的啟動(dòng)子的變種還可以在其他嚙齒動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，如豚鼠、花白旱獺、麝鼠、沙鼠、松鼠、花栗鼠、土撥鼠、海貍、豪豬和野鼠。術(shù)語“變種”進(jìn)一步包括具有啟動(dòng)子活性的任何一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明啟動(dòng)子的片段。β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變種具有至少1250核苷酸的長(zhǎng)度。例如，可通過5’端切斷seqidno：1中列出的的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的而衍生出本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變種包括seqidno：1的核苷酸50-3000、100-3000、150-3000、200-3000、250-3000、500-3000、1000-3000、或1500-3000的序列。在另一些實(shí)施例中，可通過5’端切斷seqidno：2中序列而衍生出β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，例如包括seqidno：2的核苷酸50-2490、100-2490、150-2490、200-2490、250-2490、500-2490、或1000-2490的序列。還可通過5’端切斷seqidno：3中序列而衍生出β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，其包括例如，seqidno：3的核苷酸50-2950、100-2950、150-2950、200-2950、250-2950、500-2950、1000-2950或1500-2950的序列。例如，可以通過切斷seqidno：7中較長(zhǎng)的倉鼠啟動(dòng)子核苷酸序列的5’端而衍生出倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的長(zhǎng)片段。此種變種包括，如，核苷酸50-3668、100-3668、150-3668、200-3668、250-3668、500-3668或600-3668的序列。可以通過5’和/或3’端的切斷seqidno：39的序列來衍生rps21啟動(dòng)子的變種。此變種包括，例如，核苷酸50-1958、100-1958、150-1958、200-1958、250-1958、500-1958、1000-1958、1-1900、1-1850、1-1800、1-1750、1-1700、1-1600或1-1500的序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子包括來自于seqidnos：1、2或3的至少1250、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2500或3000個(gè)核苷酸的相鄰的分支。此seqidnos：1、2和3的相鄰分支還可以包括一個(gè)突變(插入或缺失)，前提是突變序列保留了至少原始序列的一些功能以及在低、中等或高度嚴(yán)格的條件下可以分別與seqidnos：1、2或3雜交的能力?？梢酝ㄟ^5’切斷seqidnos：1、2、3或7或上述其變種的任何序列的而衍生出β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的相鄰分支。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的rps21啟動(dòng)子包括來自seqidno：39的至少500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1850或1900個(gè)核苷酸的相鄰分支。本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變種進(jìn)一步包括可以和seqidnos：1、2或3中所示的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或其互補(bǔ)序列全長(zhǎng)雜交的核苷酸序列，兩者具有最多0、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45％的堿基對(duì)錯(cuò)配。本發(fā)明的rps21啟動(dòng)子序列包括可與seqidnos：39中所示的全長(zhǎng)rps21啟動(dòng)子序列或其互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，兩者具有最多0、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、45、50、55、60％的堿基對(duì)錯(cuò)配?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的或此處描述的技術(shù)測(cè)定堿基對(duì)的錯(cuò)配率。在此處用于修飾核酸的術(shù)語“異源的”是指除可操作地連接到自然發(fā)生的基因組的啟動(dòng)子核酸以外的核酸。例如，術(shù)語“異源的”指當(dāng)此核酸被可操作地連接到倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子時(shí)，除倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因以外的任何核酸。同樣地，當(dāng)此核酸被可操作地連接到大鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“異源的”指除大鼠β-肌動(dòng)蛋白基因以外的任何核酸。相似地，當(dāng)此核酸被可操作地連接到小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“異源的”指任何核酸。類似地，當(dāng)此核酸被可操作地連接到倉鼠rps21啟動(dòng)子時(shí)，此術(shù)語可以指除倉鼠rps21基因以外的任何核酸。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指含有基因操作細(xì)胞的任何動(dòng)物，其中本發(fā)明的啟動(dòng)子不再被可操作地連接如天然發(fā)生的基因組中的相同的核酸上。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”包括，例如，含有具有整合到動(dòng)物染色體中的本發(fā)明的啟動(dòng)子或其變種的細(xì)胞的動(dòng)物。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”還包括含有在染色體外具有由本發(fā)明的啟動(dòng)子或其變種組成的復(fù)制的dna序列的細(xì)胞的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是如嚙齒動(dòng)物或人的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明部分基于新的β-肌動(dòng)蛋白和rps21基因的啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和分離。特別地，本發(fā)明的特征為包括但不局限于倉鼠、大鼠和小鼠的嚙齒動(dòng)物β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，以及倉鼠rps21啟動(dòng)子。如實(shí)施例中所描述的，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)和證實(shí)本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子具有高于cmv的啟動(dòng)子活性的基礎(chǔ)上。本發(fā)明進(jìn)一步基于當(dāng)用于表達(dá)某些基因時(shí)，倉鼠rps21啟動(dòng)子的活性至少與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的活性相同的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上。本發(fā)明提供了包括倉鼠、大鼠和小鼠的嚙齒動(dòng)物β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的核苷酸序列，以及其應(yīng)用方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒別和分離本發(fā)明的啟動(dòng)子變種的方法，包括具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子的同源物或片段。另外，本發(fā)明提供了用于倉鼠rps21啟動(dòng)子的核苷酸序列及其使用方法。在導(dǎo)致本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的基因克隆被稱為基因表達(dá)的系列分析技術(shù)或“sage”(valculescoetal.(1995)science,270:484-487和valculescoetal.(1987)cell,88:243-251)鑒定為活性啟動(dòng)子在識(shí)別后從cho細(xì)胞中分離出來。sage技術(shù)可被用于整個(gè)基因組的轉(zhuǎn)錄圖譜中。使用sage技術(shù)，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子被鑒定為是cho細(xì)胞中最具活性的啟動(dòng)子之一。因此從cho細(xì)胞中克隆β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子?？蓱?yīng)用相似的方法從cho細(xì)胞中克隆倉鼠rps21啟動(dòng)子。該方法可被用于其他基因組的轉(zhuǎn)錄圖譜以確認(rèn)在其他基因組中相應(yīng)的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或rps21啟動(dòng)子的活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或此處描述的技術(shù)克隆這些啟動(dòng)子。可以通過將其與一個(gè)或多個(gè)seqidnos：1、2、3或39列出的啟動(dòng)子序列雜交的方法鑒別本發(fā)明的啟動(dòng)子的變種。同源性每降低1％，雙鏈核酸的熔點(diǎn)(tm)就降低1-1.5℃是公知的(見，如bonneretal.(1973)j.mol.biol.,81:123)。因此，例如可以將公認(rèn)的核苷酸序列與seqidnos：1、2、3或39或其變種序列雜交，并將此雜化物的熔點(diǎn)和seqidnos：1、2、3或39或其變種序列與其互補(bǔ)序列的雜化物的熔點(diǎn)相比較，從而鑒定物種間的同源性。然后可以計(jì)算待測(cè)雜化物的堿基對(duì)錯(cuò)配數(shù)。因此，待測(cè)雜化物的熔點(diǎn)與含有任何seqidnos：1、2、3或39的公認(rèn)同源物的雜化物的熔點(diǎn)的差別越小，表明公認(rèn)的核苷酸序列與本發(fā)明的啟動(dòng)子序列之間的同源性越大。例如，在其他嚙齒動(dòng)物如，豚鼠、花白旱獺、麝鼠、沙鼠、松鼠、花栗鼠、土撥鼠、海貍、豪豬和野鼠中的變種可以表現(xiàn)為與本發(fā)明的啟動(dòng)子及其變種具有更高的同源性。已知多種因子影響核酸雙鏈的雜交效率。其包括，例如，核酸序列的長(zhǎng)度，鹽濃度和序列的g/c含量。例如，為了雜交dna的長(zhǎng)片段，howleyetal.(1997)j.biol.chem.,254:4876,確定了使50％dna與互補(bǔ)鏈雜交的熔點(diǎn)為：tm＝81.5+16.6logm+41(％g+％c)-500/l-0.62f,其中，m是單價(jià)陽離子的摩爾濃度；(％g+％c)是序列中g(shù)和c核苷酸各自的份額，l是雜合dna的長(zhǎng)度；f是甲酰胺的摩爾濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以如ausubeletal.(1995)currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,的第2、4和6部分列舉的通過最少的實(shí)驗(yàn)來選擇恰當(dāng)?shù)碾s交條件。另外，嚴(yán)格的雜交條件在sambrooketal.(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,coldspringharborpress,第7、9和11章中描述。低嚴(yán)格的雜交條件的非限制性的例子如下。含有dna的濾紙?jiān)?0℃下，在含有35％甲酰胺、5xssc、50mmtris-hcl(ph7.5)、5mmedta、0.1％pvp、0.1％ficolitm、1％bsa、和500ug/ml變性的鮭魚精子dna的溶液中預(yù)處理6小時(shí)。雜交在具有以下變動(dòng)的相同的溶液中進(jìn)行：0.02％pvp、0.02％ficolitm、0.2％bsa、100ug/ml變性的鮭魚精子dna、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖以及使用5-20x10632p-標(biāo)記的探針。濾紙?jiān)?0℃下，在雜交混合液中孵育18-20小時(shí)，然后在55℃的含2xssc、25mmtris-hcl(ph7.4)、5mmedta和0.1％sds的溶液中洗脫1.5小時(shí)。用新鮮溶液替換洗脫液并在60℃下繼續(xù)賦育1.5小時(shí)。吸干濾紙，使其暴露于射線自顯儀。也可以使用本領(lǐng)域公知的其他的低嚴(yán)格條件(如，種間雜交所用的)。一個(gè)高度嚴(yán)格的雜交條件的非限制性的示例如下所述。含有dna的濾紙的預(yù)雜交在含有6xssc、50mmtris-hcl(ph7.5)、1mmedta、0.02％pvp、0.02％ficolltm、0.02％bsa和500ug/ml變性的鮭魚精子dna的緩沖液中，在65℃處理8小時(shí)至過夜。濾紙?jiān)?5℃下，含有100ug/ml變性的鮭魚精子dna和5-20x106cpm的32p-標(biāo)記的探針的雜交液中雜交48小時(shí)。在37℃下，含有2xssc、0.01％pvp、0.01％ficolltm和0.01％bsa的溶液中洗脫濾紙1小時(shí)，之后在50℃，0.1×ssc溶液中洗脫45分鐘。一個(gè)中度嚴(yán)格的雜交條件的非限制性的例子包括在5xssc、0.5％sds、1.0mmedta，ph8.0的溶液中預(yù)洗脫；在50％甲酰胺、6xssc的溶液中42℃進(jìn)行雜交；在0.5xssc、0.1％sds的條件下，60℃進(jìn)行洗脫。還可以通過公認(rèn)變種的核苷酸序列和seqidnos：1、2、3或39中的序列或其互補(bǔ)鏈間同一性的百分比鑒定本發(fā)明啟動(dòng)子的變種。同一性百分比可以通過，例如，可見觀測(cè)或本領(lǐng)域公知的或?qū)嵤├忻枋龅母鞣N計(jì)算機(jī)程序來確定。例如，可以通過使用devereux等(1984)nucl.acids.res.,12:387中描述的并從威斯康星州大學(xué)的基因計(jì)算機(jī)組(uwgcg)中可獲得的gap計(jì)算機(jī)程序比較序列信息來確定兩核苷酸序列的同一性百分比。還可以通過使用如tatusoveetal.(1999)femsmicrobiol.lett.,174:247中描述的程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比對(duì)兩核苷酸序列以確定同一性百分比。例如，使用程序進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)時(shí)，默認(rèn)參數(shù)設(shè)定如下：匹配回報(bào)為2,不匹配懲罰為-2，開口間隙和延伸間隙懲罰分別為5和2，間隙xdropoff為50，預(yù)期值為10，字大小為11，過濾器關(guān)閉。通過序列同一性鑒別的本發(fā)明的啟動(dòng)子包括，例如，seqidnos：2和3序列分別列出的大鼠和小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的序列，顯示出與seqidno1列出的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列的1-3007核苷酸相比具有67％和80％的同一性。應(yīng)用此處描述的和本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)可以很容易地鑒別其他變種?？梢酝ㄟ^所描述的方法確定倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno1)與已知的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子間的同一性百分比。例如，當(dāng)用默認(rèn)參數(shù)的序列比對(duì)對(duì)seqidno1與人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno5)進(jìn)行對(duì)比時(shí)，顯示出在seqidno1的全長(zhǎng)上僅有大約10％的同一性。相似地，當(dāng)seqidno1與雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno6)對(duì)比時(shí)，顯示出在seqidno1的全長(zhǎng)上僅有大約1％的同一性。由于同源性的水平如此低，因此不認(rèn)為人和雞的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是seqidno1列出的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的變種。而且，seqidno1的3’部分顯示出與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因序列的5’部分(接收號(hào)no。u20114；seqidno4)具有顯著的同源性。特別地，如圖3所示，seqidno4的前1232個(gè)核苷酸顯示出與seqidno1的3’部分具有98％的同一性。此同一性位于倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因的第一內(nèi)含子區(qū)內(nèi)。整體上看，在seqidno1的全長(zhǎng)上，seqidno4僅顯示出40％的同源性。而且，seqidno4或其片段并不具有啟動(dòng)子活性。應(yīng)用具有默認(rèn)參數(shù)的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在先前知道的人rps21啟動(dòng)子(接收號(hào)noaj250907的核苷酸1-2344)與seqidno39的倉鼠rps21啟動(dòng)子的核苷酸1-1958之間沒有同一性。在seqidno39的倉鼠rps21啟動(dòng)子和跨越小鼠rps21基因的小鼠基因組dna(接收號(hào)nont_039212)之間有很低的同一性。在小鼠的序列中有兩個(gè)具同源性的區(qū)域。第一個(gè)是seqidno39的核苷酸1775-1945(172個(gè)核苷酸中有137個(gè)相匹配)。第二個(gè)是seqidno39的核苷酸580-851(274個(gè)核苷酸中有208個(gè)相匹配)。這兩個(gè)具同一性的區(qū)域在倉鼠序列(seqidno39)中被923個(gè)核苷酸分開，在小鼠基因組序列(nt_039212)中被1745個(gè)核苷酸分開。在一些實(shí)施方案中，具有啟動(dòng)子活性的分離的啟動(dòng)子或其變種包括seqidno39中的核苷酸1775-1945和/或seqidno39中的核苷酸580-851的核苷酸序列?？蛇x擇的，此啟動(dòng)子或變種進(jìn)一步包括從seqidno39的全部或如核苷酸852-1774所示的部分序列。seqidnos：1、2、3或39所示的核苷酸序列或其變種可用作探針以用于篩選基因組庫的，以便分離與一個(gè)或多個(gè)seqidnos：1、2、3或39所示序列或其變種的基因組序列。根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子或其變種被可操作地連接到被其所表達(dá)的異源核酸上。啟動(dòng)子既可單獨(dú)使用，也可以與其他調(diào)節(jié)元件，如增強(qiáng)子和抑制子聯(lián)合使用。可供選擇地，此啟動(dòng)子可被整合到宿主細(xì)胞或動(dòng)物的基因組上，從而在宿主細(xì)胞中表達(dá)內(nèi)源性基因。根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子可被用在表達(dá)異源核酸的載體中。在某些實(shí)施方案中，異源核酸編碼治療性蛋白。治療性蛋白的例子包括，但不局限于α-葡萄糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、胰島素、組織血漿酶原激活劑、促甲狀腺素α注射液刺激的激素(thyrogenstimulatinghormon)、紅細(xì)胞生成素、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶和各種抗體?？贵w的例子包括但不局限于結(jié)合如tgf-β-1、2和3tgf-β族成員的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的啟動(dòng)子或其變種的載體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體包括位于啟動(dòng)子下游的合適的限制性酶切位點(diǎn)，其可用于插入異源的核酸。該限制性酶切位點(diǎn)可以包括用于一種限制性酶的一個(gè)限制性位點(diǎn)或其可包括用于多種限制性酶的多個(gè)限制性位點(diǎn)，從而有助于插入多個(gè)不同異源的核酸。本發(fā)明的載體還可以包括異源核酸插入點(diǎn)下游的一個(gè)多腺苷序列。含有本發(fā)明啟動(dòng)子的載體還可以含有用于細(xì)菌復(fù)制的原核dna元件和用于載體在細(xì)菌細(xì)胞中生長(zhǎng)和選擇的抗生素選擇標(biāo)記，以及一個(gè)控制轉(zhuǎn)錄過程的另外的dna元件，如終止信號(hào)。載體可以進(jìn)一步包含指導(dǎo)蛋白質(zhì)向細(xì)胞外分泌的dna序列。在某些實(shí)施方案中，含有本發(fā)明的啟動(dòng)子序列的載體是雙順反子載體。設(shè)計(jì)成雙順反子載體可以使兩個(gè)核酸被轉(zhuǎn)錄而生成一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通常含有翻譯成一個(gè)蛋白的第一部分和翻譯成另一個(gè)蛋白的第二部分。一個(gè)蛋白可以是興趣蛋白，如治療蛋白，另一個(gè)蛋白可以被用作可供選擇的標(biāo)記。雙順反子載體通常含有一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)內(nèi)部的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或位于兩個(gè)核酸間的ires。這使得兩個(gè)核酸轉(zhuǎn)錄為一個(gè)雙順反mrna。在這種方式下，可將載體構(gòu)建成含有本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或其變種和在兩個(gè)異源核酸間的ires。含有本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或其變種的雙順反子載體可被用于表達(dá)連接報(bào)告基因的治療蛋白，例如，酸性鞘磷脂酶或α-葡萄糖苷酶。本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的β-肌動(dòng)蛋白和rps21啟動(dòng)子的變種的方法。例如，將本發(fā)明的啟動(dòng)子或其變種插入合適載體的報(bào)告基因的上游，并且報(bào)告基因的表達(dá)，擇確定啟動(dòng)子活性的鑒定。例如，為鑒定本發(fā)明的具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子變種，則將此變種克隆到報(bào)告基因的上游。報(bào)告基因可以編碼能催化產(chǎn)生視覺可辨別信號(hào)的反應(yīng)的酶。此種信號(hào)基因的例子包括β-半乳糖苷酶和熒光素酶。其他信號(hào)基因的例子包括堿性磷酸酶、胭脂堿合成酶、章魚堿合成酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(chloremphenicolacetyltransferase)。在下列實(shí)施例中，編碼?？?discosomastriata)紅色熒光蛋白(rfp)的報(bào)告基因被用于檢測(cè)啟動(dòng)子活性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任何適當(dāng)?shù)膱?bào)告基因和分析技術(shù)檢測(cè)啟動(dòng)子活性。可以在體外表達(dá)系統(tǒng)或細(xì)胞內(nèi)(如體內(nèi))分析啟動(dòng)子啟動(dòng)的報(bào)告基因的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了被含有可操作地連接到異源基因的啟動(dòng)子的本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。此宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是培養(yǎng)的，也可以是動(dòng)物中的細(xì)胞。培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的例子包括，但不局限于hela細(xì)胞、cho細(xì)胞、nso、hek細(xì)胞、bhk細(xì)胞、nih-3t3、mdck細(xì)胞和cos細(xì)胞。如實(shí)施例中所述的，培養(yǎng)中的宿主細(xì)胞可以懸浮或在微載體中生長(zhǎng)。可以使用許多恰當(dāng)?shù)姆椒▽⒈景l(fā)明的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞。含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的載體可以被導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞?？梢詫⒑怂釋?dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)的例子包括，例如，磷酸鈣沉淀、deae-右旋糖苷轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、應(yīng)用病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)等?？梢杂迷S多恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)來生成使用本發(fā)明的啟動(dòng)子的蛋白質(zhì)。一個(gè)此種表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用了二氫葉酸還原酶(dhfr)基因，該基因被導(dǎo)入含有可操作地連接到異源核酸的本發(fā)明啟動(dòng)子或其變種的載體?？晒┻x擇地，如果使用dfhr缺陷細(xì)胞作表達(dá)，可將表達(dá)dhfr的表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞。當(dāng)增加甲氨蝶呤(mtx)，一種主要的酶dhfr的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的濃度被施加到轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，僅僅具dhfr較高表達(dá)水平的細(xì)胞存活。進(jìn)一步增加mtx水平時(shí)，僅僅那些dhfr基因的拷貝數(shù)增幅的細(xì)胞存活。在這種方式下，通過增加含啟動(dòng)子的載體的拷貝數(shù)，可以增加異源核酸的表達(dá)，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。第二個(gè)表達(dá)系統(tǒng)使用了谷氨酸合成酶(gs)基因，該基因被導(dǎo)入含有被可操作地連接到異源核酸的本發(fā)明的啟動(dòng)子或其變種的載體中。使用另外gs的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如，硫代甲硫氨酸(methioninesulphoximine)(msx)，以增加載體的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。任何恰當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧吮磉_(dá)系統(tǒng)可被用來表達(dá)應(yīng)用本發(fā)明的啟動(dòng)子蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)的例子包括，但不局限于，植物、桿狀病毒、酵母、細(xì)菌、果蠅、哺乳動(dòng)物或無細(xì)胞(cellfree)表達(dá)系統(tǒng)。例如，在ausubel(1995)，supra中提供了將表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子及其變種被用于基因治療的方法中。例如，本發(fā)明的啟動(dòng)子及其變種被克隆到病毒或非病毒基因治療載體中，使其被可操縱的連接到興趣基因上。當(dāng)載體被運(yùn)送到目的物，如人類病人時(shí)，啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼治療蛋白的基因表達(dá)。以下實(shí)施例提供了本發(fā)明的說明性實(shí)施方案。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將意識(shí)到在不改變本發(fā)明的主旨和范圍時(shí)，可進(jìn)行多種修飾和改動(dòng)。這些修飾和改動(dòng)仍包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例以下描述了實(shí)施例中所用的物質(zhì)和方法a.cho-k1細(xì)胞的培養(yǎng)cho-k1細(xì)胞從americantypeculturecollection(manassas,va)(atccno.crl-9618)獲得。在250ml含有15g/lde-52微載體(whatman,kent,uk)、和10％供體小牛血清(dcs)(invitrogen)的925細(xì)胞培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞在37℃下，使用20-40％o2和5％co2、并在大約60rpm下晃動(dòng)6天。細(xì)胞在血清存在下生長(zhǎng)后，每天用不含血清的925培養(yǎng)基更換80％(v/v)培養(yǎng)基。細(xì)胞在不含血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)11天后從細(xì)胞中提取rna。為了確定mrna的半衰期，將7mg/l的放射菌素d加入不含血清相中。b.rna的提取和分析使用promega(madison，wi)的rnagents試劑盒從cho-k1細(xì)胞中分離rna。用rna印記法分析基因表達(dá)。為進(jìn)行rna印記分析，應(yīng)用試劑盒(ambion，ausein，tx)在變性的glycoxal/二甲基亞砜凝膠上電泳分離5ugrna。而后將rna轉(zhuǎn)到尼龍膜上(schleiche&schuell,dassel,德國)。用通過pcr擴(kuò)增的下述基因探針雜交斑點(diǎn)：半乳糖結(jié)合蛋白(接收號(hào)no.m96676，核苷酸14-383)；β-肌動(dòng)蛋白(接收號(hào)no.u20114，核苷酸238-381)；ef-1(接收號(hào)no.d00522，核苷酸7-192)；rps21(接收號(hào)no.x79059，核苷酸68-340)；鐵蛋白(接收號(hào)no.m99692，核苷酸182-303)或商業(yè)上可購得的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)片段(ambion，austin，tx)。使用隨機(jī)引物將每種pcr產(chǎn)物放射標(biāo)記。用于擴(kuò)增每種基因的pcr引物在表一中列出。表1c.cho-k1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染為了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，cho-k1細(xì)胞被鋪在含10％胎牛血清(fbs)(invitrogen)的925培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)平板中。在用lipofectaminetm(invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染之前，細(xì)胞生長(zhǎng)至50-75％融合度。pdsred-1質(zhì)粒(clontech，paloalto，ca)與編碼用于鑒別轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞表面cd20標(biāo)記的psv40-cd20質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染。pdsred-1質(zhì)粒編碼海葵紅色熒光蛋白(rfp)，可通過fasc檢測(cè)其表達(dá)。根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞與脂質(zhì)體-dna復(fù)合物在不含血清的opti-memtm培養(yǎng)基(invitrogen)中孵育16小時(shí)。用含10％fbs的925培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞。d.熒光活化細(xì)胞挑選分析為進(jìn)行facs分析，用胰蛋白酶處理1x106個(gè)細(xì)胞，并用含2％fbs的冷pbs沖洗。隨后用fitc標(biāo)記的抗cd20抗體(pharmingen，sandiego，ca)在冰上孵育細(xì)胞30分鐘。然后用含2％fbs的冷pbs沖洗，并用1ml冷的pbs/2％fbs將細(xì)胞懸浮。使用facscaliburtm(bdbiosciences，sandiego，ca)進(jìn)行facs分析。評(píng)估所有的cd20陽性物的紅色熒光蛋白的平均熒光強(qiáng)度，以分析啟動(dòng)子強(qiáng)度。e.asm分析將由編碼酸性鞘磷脂酶(asm)的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)物在37℃下，與在250mm的醋酸鈉中，濃度為12.5mm的合成底物2-(n-六癸?；被?-4-硝基苯基磷?；?calbiochem，sandiego，ca)、ph5.5、0，含有1m醋酸鋅、0.25mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)和0.15％的吐溫20中孵育。通過加入含50％乙醇的0.2m的甘氨酸-氫氧化鈉終止反應(yīng)。通過使用比色儀測(cè)量415nm下的光密度，測(cè)量所產(chǎn)生的2-(n-六癸?；被?-4-硝基酚鹽的量來測(cè)定asm的活性。f.gaa分析將被編碼α-葡萄糖苷酶(gaa)的載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃下，與在50mm的醋酸鈉中濃度為40mm的合成底物p-硝基苯基-d-a-吡喃葡萄糖酯(sigma，stlouis，mo)、ph4.3，并含有0.1％的胎牛血清(bsa)中孵育。通過加入0.3m的甘氨酸，ph10.6終止反應(yīng)。通過使用比色儀測(cè)量400nm的光密度，測(cè)量所產(chǎn)生的p-硝基苯基的量來測(cè)定gaa的活性或量。實(shí)驗(yàn)例1：cho-k1細(xì)胞中β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的鑒別應(yīng)用基因表達(dá)的系列分析(sage)分析在不含血清的完全覆蓋旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(perfusedspinnerculture)上生長(zhǎng)的cho-k1細(xì)胞的完整的轉(zhuǎn)錄圖譜。sage的第一步包括使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從分離的cho-k1細(xì)胞mrna中合成雙鏈dna。隨后用限制性內(nèi)切酶nlalll，又稱錨定酶切斷該cdna，預(yù)期至少一次可切出最多的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過結(jié)合到鏈霉親和素的磁珠而將每一個(gè)被切斷的cdna的3’部分分離。然后將cdna分成兩部分，通過將其限制性位點(diǎn)錨定連接到含有ii型限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(例如，foki)的連接物上。ii型限制性內(nèi)切酶在離其不對(duì)稱的識(shí)別位點(diǎn)最多20個(gè)堿基對(duì)的指定位置切斷。ii型酶典型地被稱為標(biāo)記酶。用標(biāo)記酶切段連接物產(chǎn)物可以使連接物與短的cdna片段被釋放出來。錨定和標(biāo)記酶的聯(lián)合使用可產(chǎn)生對(duì)于一個(gè)基因是唯一的10個(gè)堿基對(duì)的標(biāo)記。應(yīng)用這種方法，每個(gè)基因的標(biāo)記序列可以用3’最多的nlalll位點(diǎn)及其后的獨(dú)特的10bp的序列代表。在標(biāo)記不能別指定到已知基因的例子中，可以使用sage標(biāo)記和常用是m13正向引物(gttttcccagtcacgac,seqidno:18)對(duì)sage庫的cdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增。隨后將pcr產(chǎn)物克隆到pcr2.1載體(invitrogen)，并用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)測(cè)序?；虻蔫b定是以pcr產(chǎn)物的序列與(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中已知序列的同源性為基礎(chǔ)的。使核酸序列與小鼠和/或大鼠的相對(duì)物進(jìn)行比對(duì)(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)以確定標(biāo)記來源的序列。在分析鑒定出來的16個(gè)最豐富標(biāo)記中，(表2)，除一個(gè)標(biāo)記外，其余的標(biāo)記基因都被鑒定出來。在這15個(gè)被鑒定出來的基因中，5個(gè)是線粒體來源，3個(gè)是核重復(fù)元件。在每個(gè)細(xì)胞中，這些基因有多重拷貝發(fā)生，可能是其在sage的輸出中豐富的原因。這些序列不能進(jìn)行下一步的評(píng)估。表2應(yīng)用此種方法，作為cho-k1細(xì)胞中最活躍的四個(gè)基因的啟動(dòng)子被鑒別出來。這些啟動(dòng)子是：β-肌動(dòng)蛋白、核糖體蛋白s21(rps21)、延伸因子1(ef-1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)。在cho-k1細(xì)胞中這些mrna高水平的表達(dá)即歸功于其各自啟動(dòng)子的活性，又歸功于mrnas的內(nèi)在穩(wěn)定性。盡管sage分析提供了基因mrna的總體穩(wěn)定狀態(tài)的定量，其并不能區(qū)分基因的啟動(dòng)子活性和mrna的穩(wěn)定性哪一個(gè)是高表達(dá)水平基礎(chǔ)的。因此，為了區(qū)分這兩種可能性，測(cè)定了mrnas的半衰期。簡(jiǎn)言之，通過對(duì)放射菌素d處理后的不同點(diǎn)的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)中的cho-k1細(xì)胞的rna印記分析評(píng)估了候補(bǔ)基因的表達(dá)。最初，分析了rps21、gapdh和ef-1基因，發(fā)現(xiàn)這所有的基因都具有相對(duì)穩(wěn)定的mrnas，其半衰期大于8個(gè)小時(shí)。這表明這些mrnas的豐富來自于mrnas穩(wěn)定，而不是各自啟動(dòng)子較高的活性。同樣如上所述的在放射菌素d處理后的0、4、8、10和15小時(shí)后使用rna印記方法測(cè)量半乳糖結(jié)合蛋白、鐵蛋白、和β-肌動(dòng)蛋白mrna的半衰期。各自的rna印記的結(jié)果在圖6a中表示。相對(duì)mrna水平在圖6b中以曲線說明。這些數(shù)據(jù)表明雖然半乳糖結(jié)合蛋白和鐵蛋白的半衰期大于8小時(shí)，β-肌動(dòng)蛋白mrna變化的更快，其半衰期為大約6小時(shí)。因此，對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白，啟動(dòng)子強(qiáng)度在總的穩(wěn)定狀態(tài)的mrna水平中的貢獻(xiàn)大于cho-k1細(xì)胞中的其他候選。因此，在這些條件下，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子具有強(qiáng)啟動(dòng)子特點(diǎn)。實(shí)施例2：倉鼠β-肌動(dòng)蛋白和rps21啟動(dòng)子的分離和其特征根據(jù)實(shí)施例1中描述的結(jié)果，選擇具有最高豐富度的候選(rps21)和具有最快mrna變化(β-肌動(dòng)蛋白)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。篩選λfixiicho-k1基因組文庫(stratagene，lajolla，ca)以分離倉鼠的β-肌動(dòng)蛋白和rps21啟動(dòng)子的基因組dna。為了分離β-肌動(dòng)蛋白和rps21基因克隆，將大腸桿菌株，xl1-bluemra(p2)培養(yǎng)在含10mm硫酸鎂和0.2％麥芽糖的lb培養(yǎng)基中。使600nm處的吸光度為0.5時(shí)收集細(xì)菌，而后再重新懸浮在10mm硫酸鎂中，。從庫中取大約100萬噬菌體，將其與細(xì)菌細(xì)胞在37℃中孵育15分鐘。將熔化的瓊脂糖凝膠加入噬菌體/細(xì)菌混合物，將細(xì)菌平鋪在含瓊脂的bioassay平板(nunc，rochester，ny)。瓊脂糖表面變硬后，將平板倒置，在30℃中過夜生長(zhǎng)。而后將平板冷卻，用genescreenplustm(perkelmerlifescience，wellesley，ma)尼龍濾紙覆蓋兩次。在具有1.5m的氯化鈉的0.1m的氫氧化鈉中將濾紙變性2分鐘，隨后中和。用uv交聯(lián)濾紙，并標(biāo)記。用于分離倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的探針通過β-肌動(dòng)蛋白5’末端(接收號(hào)nou20114的核苷酸238-381)的隨機(jī)pcr產(chǎn)生。用于分離倉鼠rps21啟動(dòng)子的探針通過使用seqidnos：12和13中的引物的pcr產(chǎn)生。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)純化雜交β-肌動(dòng)蛋白和rps21啟動(dòng)子的噬菌體。通過氯仿，酚，酚/氯仿(1：1)以及最后氯仿一系列抽提從噬菌體裂解液中分離噬菌體dna。為了分離倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子，在乙醇沉淀后，用在倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因的5’部分有切點(diǎn)的內(nèi)切酶消化dna，并用與篩選基因組庫相同的探針進(jìn)行dna印記雜交。應(yīng)用此方法，產(chǎn)生了大約7kb的avrll片段和大約5.5kb的sall片段，兩者均可與探針雜交。隨后將其克隆到pbluescriptiiks質(zhì)粒(stratagene)。7kb的avrll片段的atcc參考號(hào)no----，保藏----，200----，美國組織培養(yǎng)中心，郵政信箱1549，manassas，va20108，美國。含有avrll和sall片段的質(zhì)粒被sfol消化，除去片斷包含β-肌動(dòng)蛋白開放閱讀框的片段的3’端。然后將這些片斷克隆到pdsred-1質(zhì)粒(clontech)以產(chǎn)生稱為pdsred-avr(6.5kb)和pdsred-avr(5.1kb)的構(gòu)建體。為了生成含有β-肌動(dòng)蛋白基因內(nèi)含子1全部的構(gòu)建，使用以下引物作pcr：正向：aggcccagcttgggaccaagacagaa(seqidno:35)反向：cgcggatccggcgaactatatcagggc(seqidno:36)pcr片段產(chǎn)生兩種產(chǎn)物：一個(gè)預(yù)期的大約7kb的產(chǎn)物和一個(gè)小點(diǎn)的3kb的非預(yù)期產(chǎn)物。兩種pcr產(chǎn)物均被克隆到pdsred-1質(zhì)粒(clontech)以產(chǎn)生pdsred-avr(1)-7和pdsred-avr(1)-3構(gòu)建體。將克隆到pdsred-1質(zhì)粒(clontech)的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子每一個(gè)片段都被轉(zhuǎn)染到cho-k1細(xì)胞。使用上述的facs測(cè)定每一個(gè)倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子片段的相對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度?；钚苑治龅慕Y(jié)果將在下面總結(jié)?？缭胶塑账?1970至+1037的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的avr(1)-3片段表現(xiàn)出最高的啟動(dòng)子活性?？缭胶塑账?6000至+1037的avr(1)-7片段表現(xiàn)出avr(1)-3活性的47％的活性。avr(6.5kb)、sal(5.1kb)、肌動(dòng)蛋白(3kb)和肌動(dòng)蛋白-p(2.8kb)片段分別僅表現(xiàn)出avr(1)-3活性的2％、2％、2％和0％的啟動(dòng)子活性。隨即對(duì)avr(1)-3片段測(cè)序，序列為seqidno：1中的序列。另外，也對(duì)avr(1)-3的5’上游區(qū)域的660核苷酸進(jìn)行測(cè)序。這個(gè)從-2622到+1037的相對(duì)長(zhǎng)的序列在seqidno：7中列出。從雜交的噬菌體中分離出dna后，為了分離rps21啟動(dòng)子，使用下列引物通過pcr對(duì)dna擴(kuò)增：正向：agctctaatacgactcactatagggc(seqidno:40)反向：ctctaggccagcggagcgcag(seqidno:41)。將pcr產(chǎn)物克隆到pcr2.1載體(invitrogen)中，隨后測(cè)序。倉鼠rps21啟動(dòng)子的核苷酸序列為seqidno：39中的序列。使用在克隆點(diǎn)側(cè)面的ecori位點(diǎn)切下啟動(dòng)子，將其克隆到pdsred1-1載體(clontech)。2kb的倉鼠rps21啟動(dòng)子序列的atcc參考號(hào)nopta-6194,保藏于2005年8月5日,美國組織培養(yǎng)中心，郵政信箱1549，manassas，va20108，美國。實(shí)施例3：倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子與cmv啟動(dòng)子的功能對(duì)比將avr(1)-3的啟動(dòng)子活性與cmv立即早期啟動(dòng)子(invitrogen)和人ef-1啟動(dòng)子(invitrogen)的活性進(jìn)行比較。用含有avr(1)-3、cmv立即早期啟動(dòng)子上游、或人ef-1啟動(dòng)子的pdsred-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cho-k1細(xì)胞，每一個(gè)啟動(dòng)子都可操作地連接有rfp基因。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用facs檢測(cè)rfp的表達(dá)。如圖7a所示，在avr(1)-3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列(seqidno:1)與cmv或ef-1啟動(dòng)子相比，表現(xiàn)出較高水平的rfp表達(dá)。特別地，avr(1)-3轉(zhuǎn)染的表達(dá)大約比cmv啟動(dòng)子的高2倍。為了確定觀察到的表達(dá)情況在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染中是否保留，用g418tm篩選轉(zhuǎn)染的cho-k1細(xì)胞，共兩周。然后分析存活的細(xì)胞中的rfp的表達(dá)。如圖7b中所示，與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相似，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列在seqidno：1中列出的avr(1)-3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到最高的rfp表達(dá)，。實(shí)施例4：bhk-21和hek293細(xì)胞中倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的活性在應(yīng)用實(shí)施例3所述的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的bhk-21(atccno.ccl10)和hek293(atccno.crl-1573)細(xì)胞中比較倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和cmv啟動(dòng)子的活性。如在cho-k1細(xì)胞中所見到的，當(dāng)用β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子而不是cmv啟動(dòng)子時(shí)，在bhk-21細(xì)胞中的rfp的表達(dá)顯著較高(表3)。在hek293細(xì)胞中，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子啟動(dòng)的rfp的表達(dá)大體上與cmv啟動(dòng)子所引起的表達(dá)相同。表3細(xì)胞系cmv啟動(dòng)子β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子bhk-218.3±0.4121±99.8hek293139±9.9102±8.3實(shí)施例5：大鼠和小鼠的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子使用默認(rèn)參數(shù)檢索了公開的核苷酸序列數(shù)據(jù)庫，以查找seqidno：1的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列的同源序列。倉鼠β-肌動(dòng)蛋白基因的5’部分(接收號(hào)no.u21104；seqidno：4)顯示出與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子3’部分的98％的同一性?？墒牵趕eqidno：1的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列的全長(zhǎng)上，此同一性僅為40％。這部分沒有啟動(dòng)子活性。應(yīng)用默認(rèn)的參數(shù)和程序?qū)ο惹耙阎娜?接收號(hào)nogi28337a)和雞(接收號(hào)nogi2170437)β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子：與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子進(jìn)行比對(duì)，以確定同源性。與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：1)相比，人和雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子僅分別具有10％和1％的同一性。大鼠(rattusnorvegcus)基因組超重疊群(接收號(hào)no.nw_042778)被鑒定為在大鼠12號(hào)染色體上，其含有與seqidno：1序列全長(zhǎng)有67％同一性的核苷酸序列。相似地，在小鼠(musmusculus)基因組第5號(hào)染色體上鑒別出一個(gè)重疊群(接收號(hào)no.nt_039324),其與seqidno：1序列全長(zhǎng)有80％同一性。倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：1)與倉鼠基因序列、人、雞、大鼠、和小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的比對(duì)分別在圖3、4、5、1a-1b和2a-2b中說明。實(shí)施例6：大鼠和小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的活性分別在seqidnos：1和2中列出的大鼠和小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子序列，并被克隆到pdsred-1質(zhì)粒(clontech)。cmv啟動(dòng)子也被克隆到pdsred-1質(zhì)粒中rfp基因的上游。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到cho-k1細(xì)胞，或其他細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用facs分析rfp的表達(dá)。用大鼠或小鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞預(yù)期比相似的條件下cmv啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染的rfp的表達(dá)高。實(shí)施例7：使用倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)蛋白質(zhì)為了進(jìn)一步評(píng)估倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的活性，使用二氫葉酸還原酶(dhfr)選擇和甲氨蝶呤(mtx)擴(kuò)增的表達(dá)系統(tǒng)。載體pgz6衍生自pclhaxsv2dhfr質(zhì)粒，因而除含有sv40早期啟動(dòng)子控制的dhfr基因外，還含有3kb的倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno：1)。pclhaxsv2dhfr質(zhì)粒先前曾被coleetal.(1993)biotechnology,11:1014-1024描述。簡(jiǎn)言之，pclhaxsv2dhfr載體中的金屬硫因啟動(dòng)子(mt)被β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子替換而生成pgz6載體。治療目的的兩種蛋白的cdna，酸性鞘磷脂酶(asm)和α-葡萄糖苷酶(gaa)被可操作地連接到倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。asmcdna從imagetm協(xié)會(huì)(接收號(hào)no.a1587087)獲得。gaa的cdna從紐約醫(yī)科大學(xué)的drmartinuik處獲得。asm和gaacdna的核苷酸序列分別在seqidnos：37和38中列出。相似地，兩個(gè)cdna也被克隆到含有dhfr表達(dá)卡盒的載體中的cmv啟動(dòng)子的下游。dhfr缺陷cho-k1細(xì)胞系dxb11被兩套表達(dá)載體一式三份的轉(zhuǎn)染。在兩周后，含有20nmmtx的核酸缺陷培養(yǎng)基中，用pbs沖洗異源未被克隆的細(xì)胞池，并將其轉(zhuǎn)入不含血清的介質(zhì)。24小時(shí)后，測(cè)量介質(zhì)中的asm或gaa的量。此試驗(yàn)的結(jié)果在圖8a和8b中表示。在穩(wěn)定的細(xì)胞池中，倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子產(chǎn)生的asm的水平比cmv啟動(dòng)子多2到15倍，而在gaa的細(xì)胞中，多2到5倍。進(jìn)一步應(yīng)用穩(wěn)定的細(xì)胞池來評(píng)估β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子維持長(zhǎng)期蛋白表達(dá)的能力。典型地，為了產(chǎn)業(yè)上生產(chǎn)蛋白，通過增加選擇步驟的次數(shù)和/或mtx濃度的方法選擇具有較高基因拷貝的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)高表達(dá)。為了確定能否通過β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(seqidno:1)實(shí)現(xiàn)較高表達(dá)，將早期在20nmmtx下選擇的asm細(xì)胞池放大，使用高于10倍的mtx(200nm)選擇兩周。如表4中所總結(jié)的，3個(gè)被測(cè)β-肌動(dòng)蛋白池中的兩個(gè)在放大后顯示出相對(duì)起始20nm細(xì)胞池的asm水平高2-3倍。相反地，僅有一個(gè)被檢測(cè)的cmv池顯示比其來源的20nm池高的水平。在兩個(gè)啟動(dòng)子產(chǎn)生的六個(gè)細(xì)胞池中，β-肌動(dòng)蛋白產(chǎn)生的最高表達(dá)是cmv啟動(dòng)子產(chǎn)生的最高表達(dá)的6倍。這表明，至少在檢測(cè)條件下，倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子優(yōu)于cmv啟動(dòng)子。表4在另一個(gè)試驗(yàn)中，倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子被用來表達(dá)組織血漿酶原激活劑(tpa)蛋白，該蛋白是一種溶解血栓劑，可解決病人的凝血問題。用在該載體中倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子被可操作地連接到tpa基因的pgz6-tpa表達(dá)載體轉(zhuǎn)染cho-dxb11細(xì)胞，。通過在含有200nmmtx的核酸缺陷培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。然后將得到的未克隆細(xì)胞池中加入500nmmtx以放大轉(zhuǎn)染基因的拷貝數(shù)。從細(xì)胞中除去mtx，在1l的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)中放大細(xì)胞池并種植到cytoporetm2微載體上。細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7天，以后的4天，每天用不含血清的培養(yǎng)基替換80％的血清。然后用15天收集培養(yǎng)基并用可買到的elisa試劑盒(tpa試劑盒,biopoolinternational,inc.,ventura,ca)分析tpa表達(dá)。如本的圖9所示，使用倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子導(dǎo)致tpa的表達(dá)濃度為每天30mg/l。此結(jié)果可以與最近發(fā)表的報(bào)道相比，用其他啟動(dòng)子4-8天后可產(chǎn)生30-40mg/ltpa(sengeretal.(2003)biotechnologyprogress19:1199-1209；dowd等人(2000)biotechnologyprogress16:786-794)。實(shí)施例8：應(yīng)用倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子制備抗體產(chǎn)量為了生成抗tgf-β族抗體，在兩個(gè)分別的pgz6表達(dá)載體中，編碼抗tgf-β抗體輕鏈或抗tgf-β抗體重鏈的核酸被克隆到β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的下游。用兩種表達(dá)載體轉(zhuǎn)染dhfr缺陷cho-k1細(xì)胞系dxb11。在含有mtx的核酸缺陷培養(yǎng)基中選擇兩個(gè)星期后，測(cè)定培養(yǎng)基中輕鏈和重鏈的抗tgf-β抗體水平。實(shí)施例9：使用倉鼠rps21啟動(dòng)子的蛋白表達(dá)在cho-dxb11細(xì)胞中比較了倉鼠rps21啟動(dòng)子與倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)活性。用含有可操作地連接到倉鼠rps21啟動(dòng)子seqidno：39(pgz31c-gaa)或倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子seqidno：1(pgz61c-gaa)的人α-葡萄糖苷酶(rhgaa)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到cho-dxb11細(xì)胞。在兩種情況下，rhgaa通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入點(diǎn)(ires)序列被連接到編碼細(xì)胞表面標(biāo)記(cd20)的基因。在核酸缺陷培養(yǎng)基中，用0.2um的mtx選擇細(xì)胞后，用fitc連接的抗cd20抗體標(biāo)記細(xì)胞，并用過facs分離高表達(dá)的克隆。將被選出的細(xì)胞鋪到96孔平板上，放大以分析rhgaa的表達(dá)。分析了倉鼠rps21啟動(dòng)子的38個(gè)克隆和倉鼠β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的29個(gè)克隆。表5顯示了所得兩種啟動(dòng)子克隆的表達(dá)范圍分布。表5在另一個(gè)試驗(yàn)中，倉鼠rps21啟動(dòng)子被用于在cho-dxb11細(xì)胞中表達(dá)asm。對(duì)rps21啟動(dòng)子與β-肌動(dòng)蛋白和cmv啟動(dòng)子的活性進(jìn)行了比較。cho-dxb11細(xì)胞分三分轉(zhuǎn)染，直接在200nmmtx中選擇，或先在20nmmtx而后在200nmmtx中放大兩周，如實(shí)施例7中所述的。如所述測(cè)量培養(yǎng)基中的asm水平。在未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中測(cè)不到asm表達(dá)。如表6所總結(jié)的，三份rps21細(xì)胞池在放大后均顯示出相對(duì)其來源的初始20nm細(xì)胞池大2-3倍的asm表達(dá)水平。另外，所產(chǎn)生的asm水平比cmv啟動(dòng)子所產(chǎn)生的asm水平高(實(shí)施例7)。表6在直接用200nmmtx選擇的細(xì)胞所產(chǎn)生的asm表達(dá)水平在表7中總結(jié)。表7倉鼠rps21啟動(dòng)子在200nmmtx中產(chǎn)生的asm水平比cmv所產(chǎn)生的平均高大約1-2倍。在另一方面，β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子產(chǎn)生的asm水平比cmv所產(chǎn)生的平均高大約3-4倍。因此，當(dāng)用于表達(dá)gaa時(shí)，rps21啟動(dòng)子至少具有與β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子一樣的活性，然而，當(dāng)用于asm表達(dá)時(shí)，其表現(xiàn)出低于β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的活性。然而，兩種啟動(dòng)子的活性均大于cmv啟動(dòng)子。根據(jù)在此引作參考的說明書中的對(duì)比文獻(xiàn)，可以充分理解書明書。說明書中的實(shí)施分案為本發(fā)明的實(shí)施方案提供了解釋，但并不限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到許多其他的實(shí)施方案也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在此引用的所有的出版物和專利和在此公開通過接收號(hào)和數(shù)據(jù)庫參考而鑒別的序列被作為整體通過參考而并入此文。在一定程度上被引入作參考的內(nèi)容與本說明書相矛盾或不一致的程度，本說明將取代這些內(nèi)容。在此引用的任何參考文獻(xiàn)并非是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。除非特別指出，應(yīng)該認(rèn)為所有在本說明書，包括權(quán)利要求中的用于表示成分、細(xì)胞培養(yǎng)、處理?xiàng)l件等的數(shù)字都用術(shù)語“大約”限定。從而，除非特別指出是相反的，數(shù)字參數(shù)是大概的，可以依據(jù)本發(fā)明所要獲得的特性的不同而不同。除非特別指出，在一系列成分前的術(shù)語“至少”應(yīng)當(dāng)被理解成指系列中的每一個(gè)成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用不超出常規(guī)的實(shí)驗(yàn)認(rèn)識(shí)到或者可以確定此處描述的發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多等同方案。這些等同方案包括在權(quán)利要求中?！　⌒蛄斜怼　?lt;110>s·埃斯蒂斯　　w·q·張　　建新公司　　<120>新的β-肌動(dòng)蛋白和rps21啟動(dòng)子及其應(yīng)用　　<130>7680.27-304　　<140>　　<141>　　<150>60/480,768　　<151>2003-06-24　　<160>41　　<170>patentinversion3.2　　<210>1　　<211>3007　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>分離自cho細(xì)胞的β-激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子　　<400>1　　gggaccaagacagaaccataagccagtgggatagatcagaaatgttccagaggtgggatg60　　gggccagagtgcctgccccttgaaccgtcccagggaccagaggtgacaaagtggcaacac120　　aggtcctgcctgggaatctggtctgctcctacttagtaaagctgcctggtgtcacacaag180　　aggcccccacttattcctgcacccctggtggtaggtggcgtcttctcccctgcagccacc240　　aggctcccctgagaacactgccggcagtcctcattgacaggcagtattcgctctgcccca300　　cccccacctgtgaattgcagggctggcaggtcctcaggcagctggcaaaccgcctgaaca360　　actgagagatacagggccagggccagggcagtcccgtcccccggaggcagggaggggacg420　　tgctgggaaagttctctctctcaggcccaggttggtgactgcagaaggcttctgtcaaat480　　ctcttttgtgggaaccacagagtagccctgaacgtgggggtgtgcttccagtatactctg540　　gggtcaccctttccatactggaggcctctgcaacttcaaaatgctctgctaccaacctag600　　cacaaggaagttggtccagcctccccacgcagggccactgctgcagtccatatatggact660　　aagccttccttggtttcaacacctacactcactgagcccctactatgtgtatgcagagcc720　　gagacaggcccgagcatctcatctgaagcacccttcttgcctaaattcagttttctgtca780　　ctttctcccaggaggtgtgtgtccctctaagctaagccaggggtccctcacccctgcccc840　　actcccatccctagtgtaggtatcagctgaagagcttcctgagcagaacactcttgggtg900　　ctgacattttgataaataggcccatgtttaggagagcaggggtccgggggcgggagatct960　　tctctggtggattgagggctccaagaactactctttgagcacgctgcccctcccagagtc1020　　cccacagcctccagatggactagaacacagttcggctgtggctgcacataactaacagag1080　　gatagatggtgggtcccagcccaacagtgcctggcaatcacccagagccaccagctaacg1140　　gccttggcttagttttttgcctgggtgtgatcaggcagccctccaaaactgcccggactc1200　　catgacaagttttgcttgttctatagagcacagttcctttctaggtctggggcaagggac1260　　atcgggagacatcttcctgcaacagctccagtcactggaccaccaggctcgccctgtctt1320　　tggtgtgtggccctgagtctcctaagtggcccaaacctgtgaagacccctccaaccacag1380　　ttttgcttctaaattgtaccccaacacacctagcaaattgaaaccccaccagaagtcccc1440　　cagatctggctttccggctattgctggcaagggggagtgactcccggcccattcaatcca1500　　ggccccgcgtgttcctcaaacaagaagccacgtaaacataaaccgagcctccatgctgac1560　　ccttgcccatcgaggtactcaatgttcacgtgatatccacacccagagggtcctggggtg1620　　ggtgcatgagccccagaatgcaggcttgataaccgagaccctgaatcgggcagtgtccac1680　　aagggcggaggcccagtcatgcatgttcgggcctatggggccagcacccaacgccaaaac1740　　tctccatcctcttcctcaatctcggctttctctctctctctctttttttttttttatttt1800　　ttttttttgcaaaaggaggggagagggggtaaaaaaatgctgcactgtgcggctaggccg1860　　gtgagtgagcggcgcggagccaatcagcgctcgccgttccgaaagttgccttttatggct1920　　cgagtggccgctgtggcgtcctataaaacccggcggcgcaacgcgcagccactgtcgagt1980　　ccgcgtccacccgcgagcacaggcctttcgcagctctttcttcgccgctccacacccgcc2040　　accaggtaagcagggacaacaggcccagccggccacagccctcccgtgggcagtgaccgc2100　　gctgcagggtcgcgggggacactcggcgcggacaccggggaaggctggagggtggtgccg2160　　ggccgcggagcggacactttcagatccaactttcagtccagggtgtagaccctttacagc2220　　cgcattgccacggtgtagacaccggtggacccgctctggctcagagcacgcggcttgggg2280　　gaacccattagggtcgcagtgtgggcgctatgagagccgatgcagctttcgggtgttgaa2340　　ccgtatctgcccaccttggggggaggacacaaggtcgggagccaaacgccacgatcatgc2400　　cttggtggcccatgggtctttgtctaaaccggtttgcccatttggcttgccgggcgggcg2460　　ggcgcggcgggcccggctcggccgggtgggggctgggttgccactgcgcttgcgcgctct2520　　atggctgggtattggggcgcgtgcacgctggggagggagcccttcctcttccccctctcc2580　　caagttaaacttgcgcgtgcgtattgagacttggagcgcggccaccggggttgggcgagg2640　　gcggggccgttgtccggaaggggcggggtcgcagcggcttcggggcgcctgctcgcgctt2700　　cctgctgggtgtggtcgcctcccgcgcgcgcactagccgcccgccggcggggcgaaggcg2760　　gggcttgcgcccgtttggggagggggcggaggcctggcttcctgccgtggggccgcctcc2820　　ggaccagcgtttgcctcttatggtaataacgcggccggcctgggcttcctttgtcccctg2880　　agtttgggcgcgcgccccctggcggcccgaggccgcggcttgccggaagtgggcagggcg2940　　gcagcggctgcgcctagtggcccgctagtgaccgcgaccctcttttgtgccctgatatag3000　　ttcgccg3007　　<210>2　　<211>2493　　<212>dna　　<213>大鼠　　<400>2　　tgtgggaaagataaagtcgctctgaacctgggggtgtgtttccagtatgctggagtggtg60　　gtcaccct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　　catgataatacgta14　　<210>25　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>b-1重復(fù)sage標(biāo)簽　　<400>25　　catgcctttaatcc14　　<210>26　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>線粒體細(xì)胞色素bsage標(biāo)簽　　<400>26　　catgaatcggaggc14　　<210>27　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>ef-1sage標(biāo)簽　　<400>27　　catgaggcagacag14　　<210>28　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>半乳糖結(jié)合蛋白sage標(biāo)簽　　<400>28　　catggcggcagacg14　　<210>29　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>alu重復(fù)sage標(biāo)簽　　<400>29　　catggtggctcaca14　　<210>30　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>鐵蛋白重鏈sage標(biāo)簽　　<400>30　　catgttggctgccg14　　<210>31　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>未知sage標(biāo)簽　　<400>31　　catgccctgtgccg14　　<210>32　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>核糖體蛋白l41sage標(biāo)簽　　<400>32　　catgagagcgaagt14　　<210>33　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>線粒體脫氫酶sage標(biāo)簽　　<400>33　　catgaggaggccta14　　<210>34　　<211>14　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>β-肌動(dòng)蛋白sage標(biāo)簽　　<400>34　　catgccctgagtcc14　　<210>35　　<211>26　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>擴(kuò)增含有內(nèi)含子1的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的正向引物　　<400>35　　aggcccagcttgggaccaagacagaa26　　<210>36　　<211>27　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>擴(kuò)增含有內(nèi)含子1的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的反向引物　　<400>36　　cgcggatccggcgaactatatcagggc27　　<210>37　　<211>1884　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>編碼酸性鞘磷脂酶的cdna　　<400>37　　atggcccgctacggagcgtcactccgccagagctgccccaggtccggccgggagcaggga60　　caagacgggaccgccggagcccccggactcctttggatgggcctggcgctggcgctggcg120　　ctggcgctggctctgtctgactctcgggttctctgggctccggcagaggctcaccctctt180　　tctccccaaggccatcctgccaggttacatcgcatagtgccccggctccgagatgtcttt240　　gggtgggggaacctcacctgcccaatctgcaaaggtctattcaccgccatcaacctcggg300　　ctgaagaaggaacccaatgtggctcgcgtgggctccgtggccatcaagctgtgcaatctg360　　ctgaagatagcaccacctgccgtgtgccaatccattgtccacctctttgaggatgacatg420　　gtggaggtgtggagacgctcagtgctgagcccatctgaggcctgtggcctgctcctgggc480　　tccacctgtgggcactgggacattttctcatcttggaacatctctttgcctactgtgccg540　　aagccgccccccaaaccccctagccccccagccccaggtgcccctgtcagccgcatcctc600　　ttcctcactgacctgcactgggatcatgactacctggagggcacggaccctgactgtgca660　　gacccactgtgctgccgccggggttctggcctgccgcccgcatcccggccaggtgccgga720　　tactggggcgaatacagcaagtgtgacctgcccctgaggaccctggagagcctgttgagt780　　gggctgggcccagccggcccttttgatatggtgtactggacaggagacatccccgcacat840　　gatgtctggcaccagactcgtcaggaccaactgcgggccctgaccaccgtcacagcactt900　　gtgaggaagttcctggggccagtgccagtgtaccctgctgtgggtaaccatgaaagcaca960　　cctgtcaatagcttccctccccccttcattgagggcaaccactcctcccgctggctctat1020　　gaagcgatggccaaggcttgggagccctggctgcctgccgaagccctgcgcaccctcaga1080　　attggggggttctatgctctttccccataccccggtctccgcctcatctctctcaatatg1140　　aatttttgttcccgtgagaacttctggctcttgatcaactccacggatcccgcaggacag1200　　ctccagtggctggtgggggagcttcaggctgctgaggatcgaggagacaaagtgcatata1260　　attggccacattcccccagggcactgtctgaagagctggagctggaattattaccgaatt1320　　gtagccaggtatgagaacaccctggctgctcagttctttggccacactcatgtggatgaa1380　　tttgaggtcttctatgatgaagagactctgagccggccgctggctgtagccttcctggca1440　　cccagtgcaactacctacatcggccttaatcctggttaccgtgtgtaccaaatagatgga1500　　aactactccgggagctctcacgtggtcctggaccatgagacctacatcctgaatctgacc1560　　caggcaaacataccgggagccataccgcactggcagcttctctacagggctcgagaaacc1620　　tatgggctgcccaacacactgcctaccgcctggcacaacctggtatatcgcatgcggggc1680　　gacatgcaacttttccagaccttctggtttctctaccataagggccacccaccctcggag1740　　ccctgtggcacgccctgccgtctggctactctttgtgcccagctctctgcccgtgctgac1800　　agccctgctctgtgccgccacctgatgccagatgggagcctcccagaggcccagagcctg1860　　tggccaaggccactgttttgctga1884　　<210>38　　<211>2859　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>編碼a-葡萄糖結(jié)合蛋白的cdna　　<400>38　　atgggagtgaggcacccgccctgctcccaccggctcctggccgtctgcgccctcgtgtcc60　　ttggcaaccgctgcactcctggggcacatcctactccatgatttcctgctggttccccga120　　gagctgagtggctcctccccagtcctggaggagactcacccagctcaccagcagggagcc180　　agcagaccagggccccgggatgcccaggcacaccccggccgtcccagagcagtgcccaca240　　cagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccag300　　gaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcc360　　cagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaac420　　ctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttc480　　cccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccac540　　ttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtc600　　cacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtg660　　atcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttc720　　tttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctc780　　gccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaac840　　cgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcg900　　ctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtg960　　gtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctac1020　　atcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatac1080　　ccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctcc1140　　accgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtc1200　　caatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggc1260　　ttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatg1320　　atcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgag1380　　ggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggta1440　　tggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggag1500　　gacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaac1560　　gagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaac1620　　ccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggccaccatctgtgcctcc1680　　agccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagcc1740　　atcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgc1800　　tcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcc1860　　tgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcct1920　　ctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgc1980　　tggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctg2040　　ccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcacc2100　　ctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggg2160　　gagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtg2220　　gaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaag2280　　gccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaata2340　　gaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagc2400　　gaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggct2460　　gggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagccc2520　　atggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggac2580　　gatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggcc2640　　aggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcag2700　　ctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggt2760　　gtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcg2820　　ctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttaa2859　　<210>39　　<211>1958　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>倉鼠rps21啟動(dòng)子　　<400>39　　gatcaacatttacgctggctgttttaatgagagcaccggtcttgggtcacctcactgtca60　　cattggatgaggacccagtaagtgctgagagccgcagatgtagccggtgtgggtgaatgc120　　tgggctggtgtctgctggtcaaggtaccagaggctgcctcagcttcctcagagggacaaa180　　gggtcattaacactgaggaggcttgtttattagtttactcttttctttccacctaaaagt240　　ttgagcttttctattagtgctacaagtatgcatcatggtctgcttctcgtgaaggttttg300　　agcagatggaacacattctatgaaaacccctatcacaaccctgtctactaattctaaact360　　ctgagtcagtcctgggtcagtttcaacgggctgttctttctctcattagtggccatattc420　　ccttgctgttggatttggcagtctctgagtggataccagaaaatacgattttttcctttg480　　ttgtgggcttcatgctgcctttgtgttccgtttttttttttttggggggggggatgtggt540　　ggagttatttggtaatactttgacccttgcaggccctgtttttatgatgttagggggccc600　　taggcattgttcagggcagttactggaggctagacctttctcaacactctaacccagtgc660　　tatgtgcactaaactttttcacctgtttccagtccctgccctttttaggactgctgaatt720　　tgctgagtagagctactgcaaatttctggggttttccttggccactttctccttactggc780　　actctgggtgtgctccatctctggccactaaagagaccttcagggttcaactcaacacac840　　acaggtgcagctctcaaagctaaaacacaaacaaaccacccttgtacacaggcctcatgg900　　ccttccaagggcagtggctatggttcttgtttctgatgcacagaaagggtctagtggaaa960　　ttccagacacaatgcccacacctgctttcccaggcgtgaggagggtttcagcagacctca1020　　tgacagtcctgggaaggtgtcgggtgcgcgtggcagggaggggagagctctccccaagat1080　　catttaactgggtgtgcacacctgaggcaccagtctgcccagagagacatcaggtgcaca1140　　gttctacagataagcgagacaagcggtccctatgtgaagaatgtaacggtaggaaaacca1200　　acagtgtagactgggagtcttgtgtccgggctggtttgcagcctcttcaacagggggctg1260　　cctgagcgttaggggcattttcctcctggtttttaaagattttatttgttatgtagacag1320　　tgtactgcaccctctgggcagactcacaacactgggcggccggatgccgtgctggccaga1380　　gcaggagagggcagggcctgggtggagacgccgcaggggagcgcgccggcccggacgcct1440　　ggctggtctcggcggttcccactggactgccgctctgctgacacccgtgcccgcctccct1500　　ccgccgcgactggcggcggcttccggggagcgatttccaggtgcaggtctggggtgtcgg1560　　cgtccccgcaggcgagccggctcccttcgacgtccttcctatcccgcgcccccgccgccc1620　　cccgccgccccctcaacctcaagcaggggagacccggccggggcggggcacgaagagcgc1680　　ggcggctcctgctgtgggcggagctctcctgctatgggcggagctgggggcggagccgcc1740　　ttggtagggtagagccaggctccagtgtctgagcctttgtgcggaagagccggggcttct1800　　ttgcaccggaagcggaagaaaagactcccaagccggcctccggaacggtggatacgagca1860　　tcgtgacccggaagtattcaccacacgcaccgcccctcccgcccaagagagctgcctggg1920　　gacgacccacttcctttctgcgctccgctggcctagag1958　　<210>40　　<211>26　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>人造序列的說明:合成引物　　<400>40　　agctctaatacgactcactatagggc26　　<210>41　　<211>21　　<212>dna　　<213>人造序列　　<220>　　<223>人造序列的說明:合成引物　　<400>41　　ctctaggccagcggagcgcag21當(dāng)前第1頁12